Стихия гт: Stihiya.gt, Магазин автотюнинга, Благовещенск — телефоны и режим работы, отзывы и расположение на карте

Содержание

Nissan GT-R. Точка GT

Настоящая гоночная трасса, серьезные мужчины в шлемах, породистый рокот заведенных моторов — вот она, стихия Nissan GT-R. Максимальная скорость болида, только вдумайтесь в эту цифру, превышает триста километров в час. Совсем скоро продажа суперкара начнется в нашей стране

Станислав Павлов

Nissan GT-R. Цена: от €80 000*. В продаже: нет данных

Настоящая гоночная трасса, серьезные мужчины в шлемах, породистый рокот заведенных моторов — вот она, стихия Nissan GT-R. Максимальная скорость болида, только вдумайтесь в эту цифру, превышает триста километров в час. Совсем скоро продажа суперкара начнется в нашей стране
 

Компания Nissan всерьез изучает возможность официальных поставок в Россию супер-кара GT-R. «Ну и что, — заворчит обыватель, — что мы, автомобилей не видели?» Вот именно, не видели. В нашей стране чуть ли не единственным будущим соперником японца можно считать Porsche.

Nissan GT-R — это автомобиль-мечта, способный учащать пульс и де­лать влажными глаза самых суровых мужчин. Еще бы, речь идет о машине, которая разгоняется быстрее 300 км/ч. Среднестатистический обыватель засомневается, дескать, кому нужна такая ракета. Конечно, GT-R не является массовым продуктом, но чудаков, поверьте, хватает. Это подтверждает европейский опыт. Причем популярным дебютант стал до появления первых образцов. Всего за один месяц европейские покупатели исчерпали годовую квоту в 1500 экземпляров. Наибольшее количество заказов, а точнее 950, поступило из Англии. Правда, первые автомобили попадут в руки владельцев только весной будущего года. Но это никого не пугает, все готовы ждать.

Говорят, что когда Nissan GT-R дебютировал в 2007 г. на токийском автосалоне, жизнь на других стендах замерла. Что же так поразило посетителей? Прежде всего невероятные, чудовищные технические характеристики, которые достигаются благо- даря инновационному мотору. Под капотом монстра скрыт двигатель VR38 объемом 3,8 л и мощностью — внимание! — 473 л.с., которые достигаются при 6400 мин-1. Речь идет о V-образной «шестерке», оснащенной двумя турбинами. Для наиболее эффективного использования мощности GT-R оснащен полноприводной трансмиссией ATTESA и 6-ступенчатой КП Borg Warner с двойным сцеплением, помощь которой неоценима при разгоне.

 

Выдающаяся схема с разнесенным двигателем и трансмиссией вместе с полным приводом привела к оригинальному решению. У Nissan GT-R — два карданных вала. Один, из углепластика, передает крутящий момент от мотора к коробке передач. Далее тяга через один из двух пакетов «мок­рых» фрикционов и преселективную коробку передач подается к задним колесам с помощью самоблокирующегося дифференциала. Вдобавок внутри коробки предусмотрен отбор мощности и многодисковая электромагнитная муфта. В нормальных усло­виях муфта разомкнута, и Nissan GT-R — заднеприводный. Но при пробуксовке задних колес, в поворотах и при разгоне электроника частично или полностью замыкает муфту, и часть тяги подается через двойной стальной карданный вал к передним колесам (дифференциал — «свободный», без блокировки). Продолжительность и степень блокировки муфты электроника выбирает на основе анализа поперечных и продольных ускорений, угла поворота руля, пробуксовки колес. Главное новшество, которое получил GT-R, — дополнительный yaw-сенсор, определяющий разницу между фактическим моментом, поворачивающим автомобиль вокруг вертикальной оси, и его желаемой величиной, которую задает водитель углом поворота руля.Но хватит теории. Ездить на Nissan GT-R по городу и даже по обычным трассам с максимальной скоростью в 120 км/ч — занятие абсолютно бессмысленное. Именно поэтому руководство японской компании решилось на аренду легендарного португальского автодрома «Эшторил», известного многочисленными авто- и мотогонками.

 

Когда садишься за руль, то первой возникает ассоциация с кабиной истребителя: шкалы, циферблаты, тумблеры. С этим надо разбираться не один час. На дисплей можно выводить различные па­раметры движения, например угол поворота колес или уровень продольных и поперечных ускорений. А три рычажка на центральной консоли управляют работой трансмиссии, амортизаторов и системы стабилизации. Однако насладиться обилием занимательной информации так и не пришлось. После взмаха клетчатого флага взгляд упорно ищет следующий поворот, скорость приближения к которому вызывает у неподготовленного человека неподдельный ужас.

С ростом скорости спортивный Nissan слов­но врастает в асфальт. В этом немалая заслуга отличной аэродинамики. Как сообщили японские специалисты, прижимная сила достаточна для любых условий. А низкий коэффициент сопротивления воздуху (0,27) положительно сказывается на максимальной скорости и экономии бензина.

К слову сказать, в официальных материалах, розданных во время теста, нам не удалось найти данные о динамике разгона. Говорят, сотню GT-R набирает за 3,5 с. А может, быстрее? Что касается управляемости, то и тут трудно к чему-то придраться. На то он и суперкар.

Знаменитый автомобиль на знаменитом автодроме

 

Португальский автодром «Эшторил» известен прежде всего тем, что здесь с 1984 по 1996 гг. проводили Гран-при Португалии «Формулы-1». Знаменитую трассу Autоdromo Fernanda Pires da Silva построили в 1972 году на горном плато недалеко от Эшторила — пригорода Лисабона. Автодром состоит из длинной прямой и двух комплексов поворотов с изменяемой конфигурацией (он напоминает барселонскую трассу «Каталунья»). В первые годы после открытия на автодроме проводились клубные гонки и соревнования в классе «Формула-2». В 1984 г. после четвертьвекового перерыва Гран-при «Формулы-1» вернулись в Португалию и именно на «Эшторил». На первом же после перерыва португальском этапе, завершавшем чемпионат мира, решилась судьба титула. Ален Прост выиграл гонку, но уступил пол-очка в финальном зачете Ники Лауде. В 1996 г. в Эшториле состоялся последний португальский Гран-при Ф-1. В 1995–1996 гг. на трассе проходили выездные этапы ITC, а после реконструкции в 2004 г. — этап DTM. Сейчас на автодроме проводят множество гонок в младших формулах и соревнования MotoGP.

 

Вождение
Автомобиль буквально вгрызается в асфальт. Отточенная управ­ляемость, супер-надежные тормоза и великолепная аэродинамика.
   
Салон
Множество приборов, кнопок и тумблеров дают понять водителю: шутки в сторону.
   
Комфорт
Удобство спортивных автомобилей — это не приоритет. Однако и по комфорту GT-R заслуживает 5 с поправкой на то, что это гоночная машина.
   
Безопасность
С точки зрения безопасности Nissan GT-R защищен даже очень хорошо. Но если на спидометре 300…
   
Цена
За такой автомобиль никаких денег не жалко.

 

 

Достоинства и недостатки

+ Отличная управляемость, великолепная динамика.
— Невозможность оценить потенциал автомобиля в условиях обычных дорог. 

Технические характеристики

Марка и модель — Nissan GT-R
Габариты — 4655х1895х1370 мм
Двигатель — бензиновый, 3799 см3, 480 л.с/мин-1
Трансмиссия — механическая, 6-ступенчатая
Динамика — max — более 300 км/ч; 3,5 с до 100 км/ч
Конкуренты — Porsche 911

Наше мнение

Nissan GT-R способен подарить автомобилисту по-настоящему сильные эмоции. один совет: если вы решились на покупку GT-R, возьмите несколько уроков у профессиональных автогонщиков. 480 «лошадей» под капотом — это не шутка. Тем не менее мы двумя руками голосуем за скорейшее появление знаменитого автомобиля в России.

 

 

 

Редакция рекомендует:






Хочу получать самые интересные статьи

Названа дата премьеры необычной модели McLaren GT — ДРАЙВ

Что получится, если скрестить внутренний простор и высокую максималку Спидтейла с заводным характером Сенны? Что-то вот такое.

Суперкар, ранее условно именовавшийся Grand Tourer, в последнем пресс-релизе британского производителя называется просто McLaren GT. Если обозначение таким и сохранится, возникнут вопросы у Форда GT. Правда, эти машины идеологически противоположны. Стихия Форда — трек, а путешествовать на континентальные расстояния на нём едва ли кому придёт в голову. Купе McLaren GT, напротив, нацелено на дальние поездки в первую очередь, а на всё остальное — во вторую.

На опубликованных ранее снимках модель была одета в камуфляжную плёнку, расписанную цифрами #1, #2 и так далее. Британцы хотели сказать, что «устанавливают новые правила игры». В ролике-тизере всплывает первое: Never let tradition hold you back («Никогда не позволяйте традиции сдерживать вас»).

Тем не менее динамика и управляемость нового Макларена должны быть сопоставимы с параметрами его собратьев. Авторы модели так и говорят: «Старое правило — «вы не можете совместить трансконтинентальный комфорт с острыми ощущениями от сверхлёгкого высокопроизводительного спорткара». Теперь оно в прошлом». Никакими параметрами эту лирику McLaren пока не подтверждает. Надеемся, больше данных фирма раскроет во время премьеры модели. А она состоится 15 мая в 15:00 по московскому времени.

Bentley Continental GT Speed: скорость – его стихия — АвтоТема

Выхлопные трубы увеличили в диаметре

Салон отделан кожей и деревом

На порогах кузова установлена эмблема Speed

Вслед за презентацией более мощной версии купе Bentley Continental GT Speed такой же модификацией обзавелся и седан  Flying Spur. Название Speed известно еще с начала прошлого века: именно так называли наиболее мощные и скоростные варианты моделей Bentley.

На первый взгляд это обычный Continental GT Flying Spur, но все же некоторые детали подчеркивают особенность этой модели. Так, радиаторная решетка отделана черным хромом, а в переднем бампере увеличен воздухозаборник. Хотя по желанию покупателя решетку радиатора могут окрасить и в серебристый цвет. Кузов седана понижен на 10 мм. Стандартными теперь являются 20-дюймовые спицованные диски с шинами Pirelli P Zero. Сзади видны хромированные выхлопные трубы увеличенного размера.

Претерпел изменения и салон Flying Spur. Наиболее заметное новшество – трехспицевое спортивное рулевое колесо. Оно, как и весь салон, отделано кожей и ореховым или каштановым деревом. Альтернатива дереву – полированный алюминий. На выбор предлагают 16 различных цветов кожи. На педалях также появились алюминиевые накладки с гравированными логотипами Bentley. А на дверных порогах установили шильдики с надписями Speed.

Список опций пополнился адаптивным круиз-контролем и USB-портом в перчаточном ящике. Кроме того, отныне можно заказать аудиосистему Naim с 15 динамиками мощностью 1100 Вт.

Как и купе Speed, Flying Spur оснащен новым 6,0-литровым W12 с двойным турбонаддувом. Мощность увеличилась на 9% – до 600 л. с. при 6000 об/мин. А максимальные 750 Н•м крутящего момента доступны уже с 1750 об/мин. Неудивительно, что время разгона до 100 км/ч сократилось до 4,8 с, а за 10,5 с седан разгоняется до 160 км/ч. Максимальная скорость составляет 322 км/ч. При этом на 3,5% уменьшен расход топлива. Модифицировали и 6-ступенчатую автоматическую трансмиссию.

Новый двигатель дополнен и усовершенствованным шасси. Усилитель руля Servotronic перенастроили, и он стал более резким. Пружины подвески стали жест-че, а передний и задний стабилизаторы поперечной устойчивости увеличили в диаметре. Но для приверженцев комфорта есть активная пневмоподвеска, которая устанавливается по умолчанию. Изменили и настройки системы стабилизации ESP и добавили новый спортивный режим Dynamic.

С лета самый мощный седан Continental GT Flying Spur  поступает в продажу.

Последние обсуждения пользователя GT | Интернет-журнал Сергиев.ru – r. Сергиев Посад

Запись в блоге 28 марта 2009 года ровно в 20:30 по местному времени сотни миллионов человек на всей Земле выключат свет на один час zorky 11 30/03/2009 — 17:44
Фото .. kotanika 22 30/03/2009 — 14:06
Фото .. kotanika 9 30/03/2009 — 13:38
Фото В продолжение алкогольной темы Gobencheg 8 30/03/2009 — 08:31
Фото Городское кафе. Mansun 8 30/03/2009 — 07:31
Фото pugovka 3 29/03/2009 — 18:56
Фото И даже пень в весенний день… Главный редактор 3 29/03/2009 — 17:47
Фото дома… pugovka 6 29/03/2009 — 17:37
Фото Очередной закат Главный редактор 1 28/03/2009 — 14:09
Запись в блоге Мысль! molchynn 23 28/03/2009 — 14:06
Запись в блоге В продолжение алкогольной темы Gobencheg 9 28/03/2009 — 12:31
Запись в блоге Духовный супермаркет zorky 22 26/03/2009 — 21:50
Фото Темные ели Главный редактор 2 25/03/2009 — 11:19
Фото Русско-немецкая карта 1932 г. издания Главный редактор 2 24/03/2009 — 21:05
Фото Хоженными тропами II Сергей Добка 7 24/03/2009 — 19:02
Запись в блоге Заметки таксиста: «Два взгляда на ситуацию» sptaxi 12 24/03/2009 — 13:25
Запись в блоге Заметки таксиста: «Шел снег» sptaxi 7 23/03/2009 — 20:26
Запись в блоге Впечатление от лекции: ТЕЛЕВИДЕНИЕ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ЧЕЛОВЕКА… Андрей ТРОФИМОВ 9 23/03/2009 — 20:02
Запись в блоге Жить станет светлее Сергиевские вед… 4 23/03/2009 — 19:47
Запись в блоге Не дойти мне до дому…и не доехать. Dupel 6 23/03/2009 — 19:42
Запись в блоге Про водку Gobencheg 22 23/03/2009 — 13:07
Фото рыбак рыбака 🙂 Mansun 6 23/03/2009 — 11:34
Фото Ледышка) monax 10 23/03/2009 — 11:23
Запись в блоге Зима, весна, зима, весна. xAn 6 21/03/2009 — 20:35
Фото Сегодня была весна Главный редактор 3 19/03/2009 — 09:34

Последние обсуждения пользователя GT | Интернет-журнал Сергиев.ru – r. Сергиев Посад

Фото Для Екатерины Колос, на южной стороне зацвела черемуха. GT 1 12/05/2021 — 21:51
Фото Скворец прилетел кормить птенчиков… GT 1 12/05/2021 — 20:13
Фото Просёлочная дорога Виталий Коршунов 2 09/05/2021 — 21:16
Фото С Днём Победы ! GT 1 09/05/2021 — 18:55
Фото май 2021, тест Дамир 7 08/05/2021 — 23:25
Фото Ваулино Виталий Коршунов 2 08/05/2021 — 19:59
Фото Утро в деревне Колос 2 08/05/2021 — 18:59
Фото Пристань Виталий Коршунов 2 08/05/2021 — 12:18
Фото Майская веточка Grblzly 2 07/05/2021 — 23:51
Фото #ПОБЕДАНАУСТАХ Эллиска 2 07/05/2021 — 23:49
Запись в блоге Мои герои большой войны GT 0 07/05/2021 — 23:44
Фото К вопросу о Звездах GT 0 06/05/2021 — 09:01
Запись в блоге Ярмарка вакансий или пиар на безработных Владислав Попов 3 05/05/2021 — 22:54
Фото Такой вот привет из 50-х можно еще найти в нашем городе савл 2 05/05/2021 — 22:01
Запись в блоге Зачем в городе такие звёзды Владислав Попов 4 05/05/2021 — 12:44
Фото Закат Павел Купцов 1 04/05/2021 — 13:05
Фото Зеленеет Hornet 1 04/05/2021 — 13:04
Фото Рассвет над Лесным Hornet 6 03/05/2021 — 20:37
Фото Пасхальное поздравление. Колос 2 02/05/2021 — 20:28
Фото Во время ночной Пасхальной службы савл 4 02/05/2021 — 17:15
Фото Великая суббота 2 савл 3 02/05/2021 — 15:39
Запись в блоге Прайс продукции довоенной Германии. GT 5 02/05/2021 — 15:37
Фото Рожь зеленеет Колос 2 02/05/2021 — 11:14
Фото Великая суббота савл 1 01/05/2021 — 22:09
Фото Начало МВ 6 01/05/2021 — 16:15

Страница не найдена

вид спортаБегВелосипедыЙогаКоньки ледовыеКоньки роликовыеЛыжи беговыеЛыжи горныеСамокатыСёрфингСкейтбордыСноубордыТуризм

категорияснаряжениеодеждаобувьоптиказащитааксессуарызапчастиинструменты

адаптерадаптерыадаптеры для крепления чехлаадаптеры для накачки колесаамортизаторы задние для велосипедааптечкибагажники автобагажники для велосипедабазыбалаклавыбаллоны газовые туристическиебаллоны для накачки колесабанданыбанданы многофункциональныебатареи аккумуляторныеблины вратаряблоки для йогиболты комплектботинки внутренниеботинки для беговых лыжботинки для горных лыжботинки для сноубордаботинки зимниеботинки с кошкамиботинки треккинговыебрюкибрюки короткиебрюки легкиебрюки спортивныебрюки термобельебрюки утепленныеварежкиварежки с подогревомвёдра складныевелосипеды BMXвелосипеды беговелывелосипеды горныевелосипеды горные с электроприводомвелосипеды круизерывелосипеды прогулочныевелосипеды прогулочные с электроприводомвелосипеды складныевелосипеды складные с электроприводомвелосипеды шоссейныеверевки динамическиеверевки статическиевизоры для шлемавизоры игрокавилкивилки для велосипедавинтывинты комплектвкладыши для спального мешкавтулки для велосипедавтулки комплектвыжимки для цепивыносы рулягамакигамашигерметики для колёсгермоупаковкигетрыгидраторыгиророторыгорелки туристическиегребёнкидатчики для велокомпьютерадатчики сердцебиениядатчики скорости педалированиядержателидержатели для велокомпьютеровдержатели для велосипедовдержатели для флягидержатели для щеткидержатели переключателядержатели ручки переключателядержатели тормозовдетали для крепленийдиски для балансадиски для крепленийдиски тормозные для велосипедадоски тренировочныедоски тренировочные для скалолазаниядуги комплект ремонтныйдуши походныеемкости для водыжилетыжилеты защитныежилеты с подогревомжилеты спасательныезаглушки рулязажимы для верёвкизажимы для самокатовзакладки альпинистскиезаклепкизамкизамки для багажазамки для велосипедазамки для цепизатяжки для коньковзацепки комплектзацепки подвесныезащита голенизащита голеностопазащита грудизащита для втулкизащита дна палаткизащита звездызащита коленазащита колена и голенизащита комплектзащита локтязащита на запястьезащита на палкизащита перазащита плечзащита подбородказащита предплечьязащита рамы комплектзащита спинызащита шатуназащита шеизвезды для велосипедазвонкизеркала на рульинструменты комплекткабели для велокомпьютеровкамеры для велосипедакамни абразивныекамусы для лыжкамусы для сплитбордовканторезыкарабины альпинистскиекаретки для велосипедакарманы дополнительные для палаткикартриджи комплект для заправкикартриджи многоразовыекартриджи одноразовые комплекткассетыкассеты для велосипедакастрюликедыкепкиклинья для фиксации ремешкаклипсыключиключи комплектключи комплект для велосипедаклюшки хоккейныековрики для йогиковрики комплект ремонтныйковрики надувныековрики туристическиекозырек для шлемакозырьки для шлемаколёса велосипедныеколёса велосипедные комплектколёса для лонгборда комплектколёса для лыжероллеровколёса для роликовых коньков комплектколёса для самоката комплектколёса для самокатовколёса для скейтборда комплектколодки тормозные дисковые велосипедныеколодки тормозные ободныеколонки рулевые велосипедаколпачки на ниппельколышкикольца для палоккольца для пилатесакольца проставочныекомплект ремонтныйкомплекты для йогикомплекты для накачки колесакомплекты для пилатесакомплекты для сплитбордовкомплекты мячиков для терапии руккомплекты ремонтныекомплекты трансмиссии для велосипедакомплекты тросиков и рубашек тормозакомпьютеры для велосипедаконьки мягкиеконьки роликовыеконьки фигурныеконьки хоккейныекорзины для велосипедакосметика велосипедная комплекткостюмыкостюмы гоночныекостюмы для плаваниякостюмы спортивныекофтыкофты термобельекофты флисовыекошелькикошки ледовыекрепежи для плавниковкрепления для беговых лыжкрепления для горных лыжкрепления для сноубордакрепления для сплитбордакрепления для шлема на рюкзаккрепления для экшн-камерыкровати надувныекроссовкикружкикрылья велосипедныекрылья велосипедные комплекткрылья комплекткрышки для кассетыкрышки для рулевой колонкикупальники пляжныекурткикуртки ветрозащитныекуртки защитныекуртки легкиекуртки пуховыекуртки с подогревомкуртки утепленныелампа туристическаялапки для палоклеггинсыледобуры альпинистскиеледорубы альпинистскиелезвие для коньковлезвия для коньковленты для клюшекленты ободныелесенкилинзы для очков маскалинзы для солнечных очковлипучкилишиложкилонгбордылонгборды минилопаты лавинныелыжи беговыелыжи беговые комплектлыжи горныелыжи горные комплектмагнезия для скалолазаниямагниты для велокомпьютерамази лыжныемайкимаскимаски ветрозащитныемасла для амортизаторовмасла для вилокмасла для тормозных системмебель кемпинговая комплектмешки для магнезиимешки компрессионныемешки спальныемискимолотки скальныемонтажкимонтажки комплектмячи для балансанакидки от дождянакладки для скольжениянакладки защитные для шлеманакладки сменные для подошвынаконечники для палокнаконечники рубашки переключателянаконечники рубашки тормозанаконечники тросика переключателянаконечники тросика тормозанапильникинарукавникинасосынасосы для велосипеданатяжители цепиниппелиноскиноски с подогревомобмотки руляобода для велосипедаоселки для коньковосиоси для втулкиоси комплектотверткиоттяжки альпинистскиеоттяжки для палаткиочистителиочистители для велосипедаочистители для цепиочки маскиочки солнцезащитныепалатки туристическиепалки для беговых лыжпалки для горных лыжпалки для лыжероллеровпалки для скандинавской ходьбыпалки треккинговыепегипедали для велосипедапереключатели скоростей велосипедаперчаткиперчатки велосипедныеперчатки для беговых лыжперчатки с подогревомперчатки хоккейныепетли страховочныеплавкиплавникипластыриплатформы для крепленийплатьяплиты газовые туристическиеповязки на лобподножки для велосипедаподушки туристическиеподшипники комплектпокрышки для велосипедаполиролиполотенцаполотенца для коврикапосуда для туризма комплектприборы столовые для туризма комплектпропитки водоотталкивающиепропитки дезодорантыпропитки комплектпрофили для беговых лыжпружины заднего амортизаторапряжкиразвескирамы велосипедныерамы для роликовых коньковрастиркарастиркиремешкиремешки для гамашремешки для ковриковремешки для ледового инструментаремешки для палокремниремни для креплениярепшнурырога на рульроликироллы для терапии стопрубашкирубашки переключателярубашки с коротким рукавомрубашки тормозарули для велосипедаручки дистанционного управленияручки для палокручки переключателяручки руляручки тормозарюкзакирюкзаки для роликовых коньковрюкзаки лавинныесалфетки для очковсамокатысандалиисанки ледянкисвязки для беговых лыжседла для велосипедасетка для крепления багажасетки для лампсетки москитныесиденья для перевозки детейсиденья надувныесиденья пенныесистемы страховочныесистемы шнуровкискакалкискейтбордыскребкисланцысмазки для цепи велосипедасмазки консистентныесмывкисноубордыспицы для велосипедасплитбордыспреи против запотеваниястаканыстаканы хоккейныестекла для лампстелькистельки с подогревомстенды для сборки велосипедастойки для тентастолы туристическиестропы универсальныестулья туристическиестяжки эксцентриковыестяжки эксцентриковые комплектсумкисумки для аптечкисумки для ботиноксумки для веревкисумки для коньковсумки на багажниксумки на пояссумки на рамусумки на рульсумки подседельныесумки хоккейныетарелкитенты туристическиетермобелье комплекттермосытопытормоза дисковые для велосипедатормоза для коньковтормоза для крепленийтормоза ободныетрещоткитросики гиророторатросики переключателятросики тормозатрубкитрусы термобельетрусы хоккейныетуфли велосипедныетуфли скальныеудлинители ремня для очковуплотнители для визораупоры для ледового инструментаупоры резиновые для крепленияуспокоители цепиустройства для чистки цепиустройства зарядныеустройства переговорные комплектустройства страховочныеутюгиутяжелители для рукфиксаторы для карабиновфиксаторы для колецфиксаторы для палокфляги питьевыефонарифонари для велосипедафонари туристическиефутболкифутболки с воротникомфутболки с длинным рукавомхомуты подседельныецепи для велосипедачайникичехлы для беговых лыжчехлы для велосипедачехлы для горных лыжчехлы для коврикачехлы для лыжероллеровчехлы для очковчехлы для рюкзакачехлы для сноубордачехлы для телефоначехлы для шлемачехлы на ботинкичехлы на велотуфличехлы на лезвия коньковшайбышайбы хоккейныешапкишапки для плаванияшарфышатунышатуны комплектшезлонгишипы для обувишипы для обувных насадокшипы для педалей комплектшкуркишлемышлемы велосипедныешлемы для катания на роликовых конькахшлемы хоккейныешнур для дугшнуркишнурки для коньковшнурки для очковшнурок для очковшортышорты велосипедныешорты защитныештыри подседельныещеткищетки комплектыщиткищупы лавинныеэкраны ветрозащитныеэкшн-камерыэлементы питанияэспандерыюбкиякоря

30 seven360 DegreesActive LeisureAdidasAlexrimsAll TerraAlpinaAreaArisunAsicsATIAtomicAvidAxiomBakodaBataleonBauerBickertonBionBlackspireBladerunnerBlizzardBluesportBorealBraveBrikoBrooksBuffBulaBulletBurtonCane CreekCannondaleCarreraCCMChanexChargeChilliChinookCicloCleaveClimb XClimbing TechnologyCloudveilCodebaCombatCorratecCouloirCraghoppersCrankBrothersCrowCSTCycledesignD2bDalbelloDCDia-CompeDiamondDiatechDRDrakeDT SwissDuffsDynastarE ThirteenEagleEasternEastonEclatEclipticEdeaEiderElementEmmegiEndeavorEnduraEskaEurotrailEVFExelFabricFerlandFirst StrideFischerFive TenFlashFOXFreetimeFSAFunscooFuseGaiamGarmontGlobeGonsoGordiniGoSystemGroovstarGTHADHayesHeadHell is for HeroesHuckeIcebreakerIndependentIndianaInnesIo BioIzjevskie KovrikiJamisJoytechK2KarrimorKEDKefasKendaKermaKidneykarenKMCL1LafumaLangeLazerLekiLelumiaLevelLicornLineLoefflerLolёLookLooplineLowaMaceMach 1MadridMammutMangoManitouMankindMarkerMarzocchiMDCMedalistMerinopowerMetoliusMetropolisMichelinMicroSHIFTMilletMongooseMons RoyaleMotorexMRPNecoNHSNikeNirveNitroNomisNorcoNordicaNorthcapeNorthwaveO-SynceObermeyerOktosONE IndustriesOne WayOntarioOptiwaxOrageOutleapPallasPillarPOCPolaroidPowderhornPranaPremiumPrinceton TecPro FeetPro WheelPromaxPure FixQloomRadioRaidenRebel KidzReebokRegattaReverseRexRichmanRideRiedellRisportRitcheyRockRockShoxRodeRoecklRollerbladeRome SDSRossignolRottefellaRoxyRSTRustySalomonSaltSamoxSauconySaxifragaSchoeffelSchwalbeScreamerSDGSea to SummitShimanoSinnerSixSixOneSkullcandySlegarSlideSmartscoo+SmithSnoliSombrioSpeed StuffSpineSportalmSPRISpringyardSpyderSR SuntourSramStarStencilStormSun ValleySunRaceSuper.NaturalSupraSwitchbackSwixTakeyaTechnineTektroTempestaTevaThawTiogaTisaTokoTorspoTouristTrailsideTravelSafeTrekkoTrial-SportTruvativTSGTurtle FurTwentyTyroliaUbikeUFOUSD ProVansVettaVokulVPWall ActiveWarriorWASPcamWellgoWestbeachWeThePeopleWoodmanWTBX-FusionXposureYokoZeropointZippZootZycle FixZZYZX

2021/202220212020/202120202019/202020192018/201920182017/201820172016/201720162015/201620152014/201520142013/201420132012/201320122011/201220112010/201120102009/201020092008/200920082007/200820072006/200720062005/200620052004/200520042003/200420032002/200320022001/200220012000/200120001999/20001999

Обзор Asics GT 1000 4

Корпорация Asics известна производством беговой обуви, которая способна прослужить много километров, при этом являясь не самой лёгкой по весу на рынке. Новые кроссовки GT 1000 4 — не исключение. Главным отличием от предшественника является новая конструкция верха, с минимальным числом наложений и инженерной сеткой. В конструкции GT 1000 4 использованы старые и проверенные технологии Asics. Что снижает стоимость пары, но не сказывается на великолепной посадке и ощущениях при беге для людей с умеренной гиперпронацией.

Общий комфорт — 10

Asics GT 1000 4 — очень комфортные кроссовки. Стопа удерживается в правильном положении, межподошва кроссовок не такая мягкая, как в Cumulus 17, пятка имеет хорошую гелевую амортизацию. Дышащая конструкция верха не дает стопе скользить внутри во время бега.

Посадка — 8 

На мою стопу кроссовки хорошо сели в размере, который я обычно ношу в беговой обуви.

Скорость — 5

Данные кроссовки не созданы для скоростных тренировок. Стихия GT 1000 4 — поддерживать комфорт и мягкость для стопы спортсмена на длительных тренировках в течении большого промежутка времени.

Отзывчивость — 5 

Кроссовки GT 1000 4 имеют очень плавный и комфортный перекат от момента постановки стопы на поверхность до момента отталкивания. Не такой энергичный или лёгкий, как в марафонках. После нескольких пробежек вы отметите ощущение тяжести кроссовок, почувствуете комфорт и хорошую поддержку.

Вес — 6

Как и другие кроссовки Asics, данная модель не является самой лёгкой в своём классе. Традиционный перепад пятка-носок придётся по душе любителям бега с пятки или средней части. Мужская версия GT 1000 4 весит 320гр (размер 9US), женская 265гр (размер 7US). Высота пятки: 28мм. Высота передней части: 18мм.

Лучше всего GT 1000 4 подойдут бегунам с умеренной гиперпронацией для бега на длительные и объёмные тренировки в спокойном темпе.

 

Лучшие спортивные кроссовки для бега в интернет-магазине

О нас | Группа реагирования элемента

Служба экстренного восстановления

Группа реагирования

Element находится в собственности и под управлением местных жителей. Мы понимаем, что когда у наших соседей есть повреждения, им нужно, чтобы их услуги были быстрыми, а также профессиональными. Вот почему мы стремимся ставить потребности наших клиентов на первое место и относиться к ним так, как если бы они были нашей семьей. Мы не только стремимся вернуть вашу собственность в первоначальное состояние, но и надеемся восстановить вашу жизнь.Element Response Team — это одобренная страховкой компания по восстановлению большинства видов повреждений, которые могут возникнуть в вашем доме. Мы с гордостью обслуживаем наше сообщество на севере Нью-Джерси и его окрестностях.

Element Response Team — сертифицированная страховая компания по восстановлению всех типов повреждений, которые могут возникнуть в вашей собственности. Мы с гордостью обслуживаем наше сообщество в Северном Нью-Джерси и его окрестностях.

Element Response Team была основана в 2013 году Джоном Иганом, морским пехотинцем США, который проработал в клининговой индустрии 22 года.Джон гордится тем, что обеспечивает отличное обслуживание клиентов. Его девиз — заботиться обо всех, никого не оставляя без внимания… несмотря ни на что. Только после того, как Джон объединился с партнером Кэмероном Миллером, ERT перешла на новый уровень. Камерон обладает более чем 20-летним бесценным опытом и знаниями во всех областях реставрации. Он привносит в команду непревзойденное упорство и не оставляет камня на камне. Вместе Джон и Кэмерон очень рады показать вам, почему вы должны выбрать Element Response Team в качестве вашей надежной реставрационной компании; восстанавливает здоровье после потери воды, огня или плесени.

В их услуги входит координатор проекта для каждой работы, чтобы обеспечить плавный процесс от начала до конца. Полевую группу возглавляет супервайзер Цезарь Андраде, который гарантирует, что вы получите индивидуальный подход, находясь здесь как физически, так и эмоционально. Вы можете быть уверены, что это единственная компания, в которую вам когда-либо нужно будет позвонить, потому что они каждый раз выполняют свою работу правильно с первого раза. Позвоните сегодня, чтобы получить бесплатную оценку, чтобы мы могли начать свой путь к Easy Restoration Together, E.R.T. прямо как в нашем имени!

Очистка формы

Мы стоим за нашу работу на 100% — мы никогда не пойдем на компромисс с качеством, здоровьем и безопасностью наших клиентов, чтобы сэкономить время или сократить расходы.
Мы выполнили сотни работ по изготовлению пресс-форм всех размеров и для любого типа зданий. Мы уверены, что сможем определить источник влаги, позволяющий плесени расти, исправить ее и составить план устранения недостатков, соответствующий требованиям отраслевого стандарта IICRC S 520.

Услуги радиографического контроля (RT) | Элемент

Лаборатории радиографического контроля

Element оснащены новейшими технологиями для проведения радиографических испытаний для аэрокосмического, энергетического и энергетического секторов. Наши глобальные эксперты посоветуют наиболее подходящие методы испытаний, чтобы убедиться, что ваши материалы и продукты подходят для использования.

Радиографический контроль (RT) — один из самых популярных методов неразрушающего контроля, используемых для обнаружения дефектов в широком спектре продуктов.Он использует рентгеновские лучи или гамма-лучи для выявления дефектов качества сварных швов, отливок, конструкций и композитов. Он используется преимущественно в обрабатывающей и литейной промышленности для контроля качества, где выявляет такие дефекты, как пористость, включения и трещины.

Радиографический контроль использует изотоп или рентгеновскую трубку для создания изображения. Объемный контроль обнаруживает дефекты, которые не открываются на поверхности и которые иначе невозможно обнаружить.

Возможности радиографического контроля Element

Наши ведущие в отрасли возможности радиографического контроля включают ряд традиционных и более совершенных цифровых методов радиографического контроля:

Традиционная радиография

Персонал радиографического контроля Element сертифицирован по Центральной программе сертификации ASNT (ACCP ), PCN (соответствует ISO 9712), EN 4179 и NAS 410.Наши специалисты уровня II и III могут выполнять обычную пленочную рентгенографию, портативный метод, который способен выявить самые микроскопические трещины в металлических материалах.

Компьютерная радиография (CR)

Наши лаборатории неразрушающего контроля также проводят компьютерную рентгенографию — метод, позволяющий получать изображение в цифровом формате, которое можно просматривать на любом ноутбуке или компьютере, устраняя необходимость в химической обработке и дорогостоящем хранении пленки.

Цифровая рентгенография (DR)

У нас также есть новейшее цифровое рентгенографическое оборудование, где изображения отображаются непосредственно на экране компьютера и могут быть быстро и легко переданы.

Рентгенография с близким расстоянием (CPR)

В дополнение к традиционной и цифровой рентгенографии Element предлагает рентгенографию с близким расстоянием (CPR). Система CPR, также известная как «Радиография в малой контролируемой зоне» (SCAR), была разработана как уникальный процесс промышленной радиографии, не требующий эвакуации персонала. Рентгенография в непосредственной близости может производить как пленочные, так и цифровые изображения.

Компьютерная томография (КТ)

Компьютерная томография — это самый продвинутый метод радиографического тестирования, в котором используется автоматический детектор движения для сбора тысяч изображений под разными углами для создания трехмерного изображения.Изображение можно просмотреть на экране и обработать с помощью программы CAD или программного обеспечения для анализа.

Преимущество элемента

Независимо от того, требуются ли вам полевые услуги на месте или лабораторный анализ RT в лаборатории, наша глобальная платформа экспертов и ресурсов обеспечит уверенность, необходимую для ваших проектов радиографического контроля.

Чтобы узнать больше о наших услугах по радиографическому контролю или запросить ценовое предложение, свяжитесь с нами сегодня.

элемент RT

Описание

Элемент rt обеспечивает рубиновую аннотацию для всего неаннотированного текста, который предшествует ему внутри элемента ruby ​​, в котором он находится.Элемент rt обычно сопровождается элементом rp , который предоставляет средства для скрытия дополнительной информации, используемой для улучшения читаемости в неподдерживаемых браузерах. Содержимое элемента rp невидимо в браузерах, поддерживающих рубиновые аннотации .

Элемент rt предоставляет аннотации для всех символов слева от него, которые еще не имеют аннотаций.

Браузер поддерживает элементы ruby ​​( ruby ​​, rt и rp ).Авторам, возможно, придется полагаться на методы стилизации ( CSS ), чтобы сделать рубиновых аннотаций и работать в кроссбраузере.

Аннотации Ruby обычно отображаются с меньшим размером шрифта и поверх основного текста. Чтобы лучше понять, как все работает в поддерживающих и не поддерживающих браузерах, мы рассмотрим следующий код и его приблизительную визуализацию в обоих случаях. Круглые скобки находятся внутри элемента rp , чтобы облегчить работу с браузерами, не поддерживающими его.

Вот как должна выглядеть аннотация в поддерживающем браузере. Обратите внимание, что весь текст внутри элементов rp полностью игнорируется.

   Базовый текст  (  Аннотация  )  
  

Вот как не поддерживающие браузеры отображают текст, игнорируя все элементы и просто отображая информацию в виде простого прогона текста.

   Базовый текст  (  Аннотация  )  
  

Примечание: помните, что это только эмуляции, достигнутые с помощью других поддерживаемых элементов и базового стиля CSS .

Примеры

Первый пример показывает базовый грамматический анализ предложения. Внутри каждого элемента ruby ​​ объявляется только одна аннотация. Помните, что элементы rt предоставляют аннотации для предшествующих символов, которые еще не аннотированы.

Элемент rp используется вместе с rt для улучшения читаемости в не поддерживающих браузерах.

  

Книга ( Существительное ) - это ( Глагол ) на таблице ( Существительное ) .

Книга ( Существительное ) ( Глагол ) в таблице ( Существительное ) .

Второй пример содержит слово «Токио», написанное на японском языке. На этот раз две аннотации присутствуют в одном элементе ruby ​​, обе предоставляют фонетическую помощь с символами хираганы для каждого символа (кандзи).Аннотации такого типа представляют собой одно из наиболее распространенных применений этих элементов.

  

( と う ) ( き ょ う )

( と う ) ( き ょ う )

RT m элементов: Примеры элементов Raviart-Thomas порядка m.

Контекст 1

… Обозначим эту схему Спектральная разность на основе RT m, чтобы выделить новое представление потока. Обратите внимание, однако, что представление решения по-прежнему дается уравнением. (3), т.е. стандартный базис Лагранжа в P m. Выбор узлов интерполяции ξ k и направлений s k априори не ясен. Мы не пытались оптимизировать размещение узлов в соответствии со свойствами интерполяции, но мы показываем в разделе 4, что линейная стабильность может зависеть от этого выбора.Из стандартной теории ясно, что элемент RT m имеет m + 1 степень свободы на каждом ребре и 2N m − 1 степеней свободы внутри [1]. В данной статье мы используем N m − 1 точек внутри, каждая из которых имеет два ортогональных единичных вектора. На рисунке 1 показаны примеры RT-элементов порядков с 1 по 3, где точки на границе были размещены в точках интегрирования Гаусса-Лежандра, а внутренние точки были помещены в квадратурные точки высокого порядка для треугольника. Эти точки будут указаны в разделе 4, где показано, что по крайней мере выбор внутренних точек может быть основан на соображениях линейной устойчивости.Степени свободы на границе определяют, сколько числовых потоков необходимо вычислить для внутренних элементов. Стоимость численных расчетов потока намного выше, чем аналитическая оценка потока, даже с учетом того, что один числовой поток может использоваться для двух элементов, которые имеют общий граничный узел. На границе для элементов RT m имеется m + 1 узлов, в то время как для стандартной схемы спектральной разности наиболее популярные узлы интерполяции для P m + 1, такие как узлы Хестхэвена [7] или точки Фекете [15], имеют m + 2 точки. на границе, которые фактически являются узлами Чебышева-Лобатто соответствующего порядка.В любом случае, разница между элементами RT m и элементами [P m + 1] 2 является фиксированным числом, не зависящим от …

Контекст 2

… RT 1 интерполяция потока, есть две внутренние степени свободы, которую мы оба помещаем в центр тяжести треугольника, и используем единичные векторы в осях x и y для интерполяции, см. рисунок 1 (a). Из соображений симметрии мы не меняем этот момент …

«В политике США в отношении Эдварда Сноудена есть элемент паники» — RT Op-ed

Поскольку различные страны заявляют, что не могут рассматривать просьбу Эдварда Сноудена о предоставлении убежища, активист за гражданские права США Норман Соломон говорит RT, что вряд ли какое-либо правительство захочет бросить вызов США таким образом.

Соломон считает, что попытки США схватить Сноудена и доставить его в США — признак паники. Никто, включая Сноудена, способен остановить дальнейшие утечки, так как документы были передаются журналистам или другим людям, которые могут обнародовать их.

Норман Соломон — один из организаторов акции «Руки прочь от Эдварда». Сноуден! », Призывающая граждан США индивидуальное электронное письмо президенту Обаме с просьбой не вмешиваться в Попытки Сноудена просить убежища.46 000 подписавших имеют уже отправленные электронные письма.

RT: В письме правительству Эквадора, Сноуден подчеркнул, что он может публиковать новые утечки информации. Почему сделал ли он такое заявление сразу после того, как президент России Владимир Путин сказал, что может остаться в России при условии, что он прекращает свою деятельность по разоблачению правонарушений? Означает ли это его отказ принять предложение Путина?

Норман Соломон: Не особо. Потому что лошади уже из сарая.С тех пор, как он появился в Гонконге Конг несколько недель назад Эдвард Сноуден очень ясно дал понять, что есть много документов, показывающих степень и методы и досягаемости США наблюдения, которые уже были предоставлены журналисты и, возможно, другие лица, которые могут их доступный для мира, который должен быть доступным сделал. Я думаю, это было решено задолго до Эдварда Сноудена. доехали до аэропорта в Москве.

RT: Выпуская это письмо сейчас, пытается ли он повлиять на решение правительства Эквадора о предоставлении ему политическое убежище?

NS: Ну немного непонятно, конечно, это в целом очень тёплое письмо в адрес правительства Эквадора, и признавая, что очевидно, как нам сообщили, были ли проездные документы доступны г-ну?Сноуден и сделал это возможно для него вылететь из Гонконга, сесть на самолет и приедем в Москву. При этом неясно, есть ли сингл правительство на планете прямо сейчас готово бросить вызов Соединенные Штаты эффективно предлагают убежище Эдварду Сноудену. Что грустный комментарий о глобальной мощи Соединенных Штатов. Состояния.


RT: Угрозы Сноудена о дополнительных утечках при его нынешнем ситуации, а это означает, что он лицо без гражданства, неспособное искать убежище где угодно, не похоже на отчаянный поступок, не так ли?

NS: Я бы сказал, что Эдвард Сноуден не угрожает отпустить что-нибудь.Он уже дал понять в последних нескольких недель, начиная с его выхода на поверхность и первого интервью с Газета Гардиан по видео, что те документы, которые у него есть из США находятся в процессе выпуска. Мы можем ясно сделать вывод, что они были предоставлены в больших количествах Газета Guardian и, возможно, другие издания, такие как Der Spiegel в Германии. Так что я не думаю, что он что-то делает кроме выполнения того, что он сказал несколько недель назад, что он уже начал делать, а именно поделиться этой документацией с миром.

RT: В заявлении Сноуден обвиняет США в попытке лишить его основных прав, в том числе права искать убежище. Считаете ли вы его обвинения оправданными? И если Америка понимает, что информация выйдет наружу в любом случае, почему он в такой панике схватил Сноудена?

NS: Да, информация, которая не ушла сейчас, уже есть очевидно, в разработке. Я думаю, что то, что сказал Сноуден, было вполне оправдано — США пытаются использовать свои экономические и политические и наблюдения стремятся схватить его, чтобы вернуть его в США.В политике США в отношении Эдвард Сноуден и весь этот вопрос, и усилия большой мировой гигант пытается подавить любой голос в этом деле от Эдварда Сноудена, который мог авторитетно, с большим информация, продолжайте сообщать миру. Так что я думаю, что из с точки зрения демократии, правительство США продолжает попытаться преследовать г-на Сноудена, сначала действуя так, как будто судья и присяжных, а затем притворился, что хочет пройти юридический процесс.Подавление Брэдли Мэннинга, его девять месяцев в одинокий в условиях, близких к пыткам, а возможно, и за их пределами. являются предупреждением, и это касается последней части вашего вопроса. Правительство США хочет воспрепятствовать разоблачению со стороны тех, кто в таких агентствах, как АНБ. США, конечно, далеко не единственный правительство, которое занимается слежкой за своими гражданами, неправильно, в том числе правительства Китая и России. Тем не мение, правительство США является сверхдержавой, когда дело касается не только военные, но также возможности наблюдения и их фактические реализация.И как американец я нахожу это постыдным. То есть почему на RootsAction.org уже 46 000 человек заходил на наш сайт в последние несколько дней, отправляя отдельные электронные письма президенту Обаме со словами: «Руки прочь от Эдварда Сноудена!»

экспрессированных повторяющихся элементов улучшают нормализацию RT-qPCR в широком диапазоне исследований экспрессии генов у рыбок данио

Abstract

Выбор и проверка стабильно экспрессируемых референсных генов является критическим вопросом для правильной нормализации данных RT-qPCR.В исследованиях экспрессии рыбок данио многие обычно используемые эталонные гены обычно не применимы из-за их изменчивости уровней экспрессии в различных экспериментальных условиях. Неправильное использование этих эталонных генов может привести к ложной интерпретации данных экспрессии и ненадежным выводам. В этом исследовании мы оценили новый метод нормализации у рыбок данио с использованием экспрессируемых повторяющихся элементов (ERE) в качестве эталонных мишеней вместо специфических белков-мишеней мРНК. Мы оценили и сравнили стабильность экспрессии ряда ERE со стабильностью экспрессии обычно используемых эталонных генов рыбок данио в разнообразных экспериментальных условиях, включая временной ряд развития, набор различных органов взрослых рыб и различные методы лечения эмбрионов рыбок данио, включая инъекции морфолино. и введение химикатов.Используя geNorm и анализ агрегации рангов, мы продемонстрировали, что ERE имеют более высокую общую стабильность экспрессии по сравнению с обычно используемыми референсными генами. Кроме того, мы предлагаем ограниченный набор эталонных целей ERE ( hatn10 , dna15ta1 и loopern4 ), которые демонстрируют стабильную экспрессию в широком диапазоне экспериментов в этом исследовании, как сильные кандидаты для включения в качестве эталонных целей для нормализации qPCR. в будущих исследованиях экспрессии рыбок данио. Наша прикладная стратегия поиска и оценки возможных экспрессируемых повторяющихся элементов для нормализации данных RT-qPCR имеет высокий потенциал для использования также для других видов.

Образец цитирования: Vanhauwaert S, Van Peer G, Rihani A, Janssens E, Rondou P, Lefever S, et al. (2014) Экспрессированные повторяющиеся элементы улучшают нормализацию RT-qPCR в широком спектре исследований экспрессии генов рыбок данио. PLoS ONE 9 (10): e109091. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091

Редактор: Николас С. Фоулкс, Технологический институт Карлсруэ, Германия

Поступила: 11 марта 2014 г .; Одобрена: 1 сентября 2014 г .; Опубликован: 13 октября 2014 г.

Авторские права: © 2014 Vanhauwaert et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке Гентского университета (грант Метусалема BOF08 / 01M01108 на имя А.Д.П., ГОА-Угент, грант № 12051203 для FS), Фондом научных исследований — Фландрия (FWO) (грант № G.0574.13 для PC), Бельгийской программой межвузовских полюсов притяжения IUAP (для FS) и «Stichting tegen kanker» ( грант № 365O9110 в ФС). С.В. поддерживается стипендией PhD Фонда научных исследований Фландрии (FWO). Г.В.П. и А. поддерживаются стипендией PhD из исследовательского фонда Гентского университета (BOF). П.Р. имеет грант на постдокторское исследование от Фонда научных исследований Фландрии (FWO).A.W. и С.Л. являются докторантами при поддержке Специального исследовательского фонда (BOF) Гентского университета. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) в настоящее время считается золотым стандартом для эффективного измерения экспрессии гена мРНК, особенно из-за ее высокой чувствительности, специфичности, точности и точности, а также из-за ее практической простоты и обработки скорость.Однако переменный выход экстракции РНК и обратной транскрипции, а также переменная эффективность амплификации могут влиять на результаты RT-qPCR [1], [2]. Чтобы скорректировать технически обусловленную вариацию и, таким образом, измерить истинную биологическую вариацию в образцах, важно применять хорошую стратегию нормализации. Использование нескольких референсных генов в качестве внутреннего контроля является наиболее часто применяемой и рекомендуемой процедурой для нормализации данных RT-qPCR [3] — [7]. В этом отношении особое внимание следует уделить правильному выбору и проверке эталонных генов для нормализации, как указано в рекомендациях MIQE (Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени) [1].Выбранные эталонные гены должны стабильно экспрессироваться в исследуемых образцах и, таким образом, должны иметь сильную корреляцию с общим количеством мРНК, присутствующей в образцах. Важно отметить, что многие обычно используемые референсные гены обычно неприменимы, поскольку стабильность их экспрессии сильно варьируется в различных экспериментальных условиях [8] — [11]. Поэтому важно определить оптимальное количество и выбор эталонных генов для конкретных экспериментальных условий в каждом исследовании. В ряде исследований измерялась и сравнивалась стабильность экспрессии набора часто используемых эталонных генов в образцах, полученных от разных видов, органов, клеток, стадий развития и обработок, с использованием одного из доступных инструментов, который автоматически рассчитывает значения стабильности экспрессии (geNorm , BestKeeper, Normfinder) [8] — [11].Эти исследования предлагают набор эталонных генов с наиболее стабильной оценкой как наиболее подходящий для нормализации данных по экспрессии генов. Однако определение стабильных эталонных генов происходит только сравнительным образом, и обнаружение «наиболее стабильно» экспрессируемых генов не обязательно означает, что они стабильно экспрессируются в других условиях. В частности, временные ряды развития и сравнение различных тканей являются сложными экспериментальными условиями для нормализации [8], [11], [12]. Таким образом, идеальная ситуация с использованием только одного набора референсных генов для охвата всех экспериментальных условий на конкретном виде до сих пор не представлялась возможной.

Для решения вышеупомянутых проблем мы основываемся на новой концепции, впервые предложенной для образцов человека [13] — [15]. Этот новый метод нормализации использует экспрессированные повторяющиеся элементы (ERE) в качестве эталонных мишеней вместо мРНК, кодирующих белок. Здесь мы проиллюстрируем полезность этого подхода для данных экспрессии рыбок данио. Рыбка данио ( Danio rerio ), маленькая костистая рыба, является популярным модельным организмом позвоночных по ряду причин, включая низкие затраты на обслуживание, короткий репродуктивный цикл, внешнее оплодотворение и развитие, производство большого количества синхронных и быстро развивающихся возможность спаривания эмбрионов и оптическая прозрачность эмбрионов рыбок данио.Более того, доступность широкого спектра молекулярных методов, таких как методы сверхэкспрессии / нокдауна, трансгенез, крупномасштабный мутагенез генома, а в последнее время также высокоэффективный целевой мутагенез (с использованием технологии ZFN, TALEN и CRISPR-Cas) делают рыбок данио отличным инструментом для высокопроизводительное моделирование заболеваний. Наконец, молекулярно-генетические механизмы и клеточная физиология очень похожи у рыбок данио и других позвоночных, что подчеркивает важность рыбок данио для моделирования заболеваний человека.

Мы оценили и сравнили стабильность экспрессии ряда ERE в транскриптоме рыбок данио с набором обычно используемых эталонных генов рыбок данио во временном ряду развития, в различных органах взрослых рыб и при различных обработках эмбрионов рыбок данио, включая инъекции и введение морфолино. химикатов. Здесь мы демонстрируем, что ERE превосходят по эффективности классически используемые эталонные гены, и выдвигаем ряд ERE в качестве сильных кандидатов для включения в качестве эталонных мишеней для нормализации qPCR в разнообразных экспериментах с рыбками данио.Процедура, описанная здесь для идентификации эталонных ERE рыбок данио, также может быть легко применена к другим видам.

Материалы и методы

Уход за рыбками данио и визуализация

Данио дикого типа AB, полученные из Международного ресурсного центра по рыбам данио (ZIRC), содержались в 3,5-литровых резервуарах в полузакрытых рециркуляционных системах содержания Zebtec (Tecniplast, Италия) при постоянной температуре 28 ° C и 14-часовом освещении. h темный фотопериод. Рыбу кормили 4 раза в день как сухим кормом (SDS, Великобритания), так и креветками из рассола (Ocean Nutrition, Бельгия).После оплодотворения in vitro с помощью мертвые эмбрионы удаляли через 8 часов после оплодотворения, а через 24 часа после оплодотворения выжившие эмбрионы подвергали дехорионированию проназой (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Через 48 часов после оплодотворения или 72 часов после оплодотворения эмбрионы анестезировали 0,016% метансульфонатом трикаина (трикаин), помещали в 2% метилцеллюлозу и отображали с помощью стереомикроскопа Leica M165FC. Это исследование было одобрено местным комитетом по этике экспериментов на животных (Университетская больница Гента, Гент, Бельгия; номер разрешения: ECD 11/37).Были приложены все усилия, чтобы минимизировать боль и дискомфорт.

Морфолино для инъекций

Морфолино (МО) представляют собой небольшие антисмысловые олигонуклеотиды, которые связывают интересующую мРНК, что приводит к подавлению экспрессии гена. На этом экране были введены МО, нацеленные на хордин и slc2a10 . Смешанный МО также был включен в качестве отрицательного контроля. Chordin кодирует секретируемый белок, который дорсализирует ткани ранних эмбрионов позвоночных и часто используется в качестве положительного контроля в экспериментах с МО [16].Эмбрионы, инъецированные Chordin-MO, демонстрируют аномальные U-образные сомиты, расширенный островок крови и аномальный хвостовой плавник с множественными складками. Slc2a10 кодирует GLUT10, член семейства переносчиков глюкозы. Рецессивные мутации в этом гене вызывают синдром извилистости артерий (САР) [17]. У эмбрионов рыбок данио нокдаун slc2a10 с помощью инъекции MO вызывает волнистую хорду и сердечно-сосудистые аномалии с пониженной частотой сердечных сокращений и кровотоком, которые сочетаются с неполным и нерегулярным формированием сосудистого паттерна [18].Морфолиноолигонуклеотиды были получены от Gene Tools, LLC (Philomath, OR, США). MO против slc2a10 (5′-CAAATAAAGTCCACTTACTTGGTCC-3 ‘) направлен против сайта сплайсинга экзон 2-интрон 2 пре-мРНК slc2a10 [18]. Для хордин, MO направлен против стартового кодона (5′-ATCCACAGCAGCCCCTCCATCATCC – 3 ‘) [16]. Контрольный MO (5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 ‘) использовали в качестве отрицательного контроля в каждом эксперименте. МО вводили микроинъекциями в объеме 1,5 нл в эмбрионы на стадии 1-2 клетки в возрасте 7 лет.5 нг для slc2a10 , 2 нг для chordin и 5 нг для контрольной МО. Все МО растворяли в 0,1% феноловом красном и 1 × буфере Даньё [58 мМ NaCl, 0,7 мМ KCl, 0,4 мМ MgSO4, 0,6 мМ Ca (NO3) 2, 5,0 мМ HEPES (pH 7,6)]. Процедуры микроинъекции выполнялись с использованием стереомикроскопа Leica M80. Через 48 часов после оплодотворения эмбрионы были подвергнуты дехорионированию, эвтаназии с 0,4% трикаином, и три пула из 20 эмбрионов были собраны в RNAlater (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США).

Комплексные процедуры

Были выполнены две различные химические обработки: эмбрионы обрабатывали 40 мкМ ингибитора киназы рецептора TGFβ типа 1 (TGFBRI, LY-364947, # L6293, Sigma, St.Луис, США) или 194 мкМ варфарина (Coumadin, # 45706 Sigma, Сент-Луис, США). TGFBRI специфически нацелен на функцию киназы TGFBR1, что приводит к ингибированию фосфорилирования SMAD2 и SMAD3 и подавлению передачи сигналов TGFβ. Лечение ранних эмбрионов этим ингибитором приводит к сердечно-сосудистым нарушениям, включая уплотнение сплетения хвостовых вен, низкую частоту сердечных сокращений и снижение кровотока [18]. Варфарин — пероральный антикоагулянт, применяемый при лечении тромбоэмболических заболеваний [19].Варфарин действует как антагонист витамина К, а витамин К необходим в качестве кофактора для карбоксилирования остатков глутамата нескольких факторов свертывания крови. Введение варфарина ранним эмбрионам вызывает тератогенные эффекты, включая задержку развития, задержку роста, дефекты глаз, сколиоз и дефекты уха [20].

TGFBRI и варфарин получали в виде 20 мМ и 80 мМ маточного раствора в ДМСО соответственно. Рабочие растворы 0 и 40 мкМ для TGFBRI и 0 и 194 мкМ для варфарина были приготовлены в среде для химического скрининга E3 [21], и, как описано ранее [18], [20], эмбрионы инкубировали в соединениях, начиная с 8 часов после оплодотворения ( TGFBRI) и 2.5 hpf (варфарин), дехорионирован через 24 hpf, умерщвлен 0,4% трикаина и собран в трех экземплярах пулов из 20 эмбрионов в RNAlater через 48 hpf (TGFBRI) или 72 hpf (варфарин).

Эмбрионы / личинки временных рядов развития и вскрытие органов у взрослых рыбок данио

В несколько моментов времени (0 hpf, 8 hpf, 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, 96 hpf, 6 dpf, 8 dpf, 10 dpf и 12 dpf) были собраны пулы в трех экземплярах из 20 эмбрионов / личинок, подвергнутых эвтаназии с 0,4 % трикаина и хранится в RNAlater.Вскрытие глаза, мозга, кожи, семенников, печени, кишечника и яичников у двух взрослых рыб выполняли, как описано ранее [22]. После вскрытия органы немедленно замораживали жидким азотом. Впоследствии они были разделены (50 мкм) с помощью криотома Leica CM1900 и лизированы в 700 мкл Qiazol (Qiagen, Germantown, США).

RT-qPCR

Было проведено

реакций RT-qPCR, о которых было сообщено в соответствии с рекомендациями MIQE [1]. При необходимости сначала удаляли RNAlater из образцов с помощью стеклянной пипетки Пастера, а выделение РНК выполняли с помощью мини-набора miRNeasy (Qiagen) в сочетании с обработкой ДНКазой I на колонке с использованием набора без РНКазы (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. руководящие указания.Индекс качества РНК (все RQI> 8) измеряли для всех образцов с помощью автоматической системы электрофореза Experion (версия программного обеспечения 3.2, Bio-Rad). Поскольку концентрация РНК в образцах ткани взрослого человека была низкой, амплификацию полного транскриптома для этих образцов выполняли, как описано ранее (NuGEN) [23]. кДНК синтезировали из 1 мкг РНК в 20 мкл реакции с помощью набора iScript (Bio-Rad), используя смесь праймеров oligodT и случайных гексамеров. Реакции КПЦР проводили в общем объеме 5 мкл, включая 2.5 мкл SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 5 нг (эквиваленты общей РНК) кДНК и 250 нМ (конечная концентрация) каждого праймера на приборе для кПЦР LightCycler 480 (Roche) в 384-луночных белых планшетах (Bio-Rad) . Условия термоциклирования были следующими: 95 ° C в течение 2 минут, затем 44 цикла 95 ° C в течение 5 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 1 секунды и, наконец, анализ кривой плавления был выполнен при 95 ° C. в течение 5 с, затем 60 ° C в течение 1 минуты, постепенное нагревание до 95 ° C со скоростью 0,11 ° C / с с последующим охлаждением до 37 ° C в течение 3 минут.Праймеры для bactin2 , elfa , cyp19a1b , hprt1 , rps18 , tbp , rpl13a , tuba1 и b2 были созданы с использованием программного обеспечения primer /). Последовательности праймеров для gapdh были взяты из литературы [11]. Праймеры для вновь идентифицированных экспрессированных повторов были сконструированы с помощью программного обеспечения primer3 (http://primer3.ut.ee/) с использованием настроек по умолчанию [24]. Эффективность праймеров была протестирована с использованием стандартной серии разведений: РНК, выделенная из различных стадий развития эмбрионов рыбок данио (8, 24, 30, 48, 72, 96 hpf), была объединена и преобразована в кДНК для получения стандартной серии разведений в диапазоне от 16 нг до 0.0625 нг (рисунок S1A). Специфичность праймера оценивали с помощью анализа кривой плавления (рисунок S1B). Эффективность праймеров также определяли с помощью программного обеспечения LinRegPCR [25]. Для этого необработанные данные qPCR, не скорректированные по базовой линии, были экспортированы из программного обеспечения LightCycler 480 и импортированы в программное обеспечение LinRegPCR. Полный обзор всех последовательностей праймеров и сопутствующих эффективности ПЦР, использованных в этом исследовании, можно найти в Таблице 1 и S1.

Статистика и анализ данных

Модуль geNorm в qbase + версия 2.5 (Biogazelle, http://www.qbaseplus.com) использовали для вычисления значений стабильности экспрессии для всех контрольных мишеней. В качестве входных данных для анализа geNorm использовались либо значения Cq, экспортированные непосредственно из программного обеспечения LightCycler 480, либо значения Cq с поправкой на эффективность из LinRegPCR, которые были рассчитаны на основе необработанных данных кПЦР LightCycler 480 без коррекции базовой линии. GeNorm вычисляет показатель стабильности экспрессии гена M (значение M) для эталонного гена как среднюю попарную вариацию V для этого гена со всеми другими протестированными эталонными генами.Поэтапное исключение гена с наивысшим значением M позволяет ранжировать тестируемые гены по стабильности их экспрессии. GeNorm также использовался для определения оптимального количества эталонных целей для каждого эксперимента. Алгоритм geNorm определяет попарную вариацию Vn / n + 1 между двумя последовательными факторами нормализации, содержащими увеличивающееся количество генов. Большой разброс означает, что добавленный ген имеет значительный эффект и предпочтительно должен быть включен для расчета надежного коэффициента нормализации.Vandesompele et al. (2002) [7] использовал 0,15 в качестве порогового значения, ниже которого включение дополнительного контрольного гена не требуется.

Анализ агрегации

Rank был выполнен в среде статистического программирования R (версия 3.0.2) с использованием пакета Rankaggreg (версия 0.4–3) [26] для определения лучших ранжированных эталонных генов во всех экспериментах.

Результаты

Идентификация референсных мишеней экспрессируемых повторяющихся элементов-кандидатов (ERE) в геноме рыбок данио

потенциальных референс-мишеней ERE в геноме рыбок данио были извлечены из Repbase (http: // www.girinst.org/repbase), база данных повторяющихся элементов ДНК от разных организмов [27] (рис. 1). Из начального набора из 1172 повторяющихся элементов, присутствующих в геноме рыбок данио, были сохранены только те, которые имеют более 100 копий в геноме, в результате чего осталось 74. Чтобы определить количество экспрессируемых локусов на повторяющийся элемент, выполняется быстрый поиск по всем RefSeq и Аннотированные транскрипты без RefSeq, известные для рыбок данио, были получены с использованием согласованной повторяющейся последовательности, указанной в Repbase. Были сохранены только повторы с общим количеством комбинированных ударов RefSeq и non-RefSeq выше 30 и со средней степенью сохранения выше 85% (указано Repbase), что привело к 10 кандидатам ERE для дальнейшего анализа ( tc1n1, dna11ta1, tdr7 , dna15ta1, cr1-1, hatn8, hatn10, hatn4, loopern4, sine3 ).Пороговые значения 30 и 85% были определены эмпирически, чтобы получить список с самым высоким рейтингом, содержащий управляемое количество выраженных кандидатов повторяющихся элементов. Затем были разработаны анализы qPCR для нацеливания на наиболее консервативную область выбранных ERE (таблица 1 и рисунок S2). Взрыв последовательностей праймеров против базы данных РНК RefSeq рыбок данио с использованием primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) выявил, что амплифицированные фрагменты ERE расположены исключительно в нетранслируемых областях генов. , преимущественно 3′UTR.

Чтобы исследовать потенциал ERE для нормализации qPCR, мы стремились сравнить стабильность экспрессии 10 кандидатов ERE со стабильностью 10 обычно используемых эталонных генов в исследованиях на рыбках данио. Эталонные гены bactin2 , elfa , cyp19a1b , hprt1 , rps18 , tbp , rpl13a , tuba1 , gap h и b2m были выбраны из-за частого их использования исследования экспрессии рыбок данио.Эффективность амплификации всех пар праймеров оценивали с использованием серии разведений кДНК рыбок данио в качестве матрицы, при этом эффективность между 90 и 110% была достигнута, что указывает на достаточную эффективность реакции (таблица 1 и S1).

Определение стабильности экспрессии эталонной мишени в широком диапазоне условий

Для 20 кандидатов референсных мишеней (10 ERE и 10 обычно используемых референсных генов) уровни экспрессии мРНК были измерены в широком диапазоне экспериментальных условий, включая временной ряд развития рыбок данио (от 0 hpf до 12 dpf), набор различных органов иссечен от взрослых рыб и набор различных методов лечения эмбрионов рыбок данио, включая введение химикатов и инъекции морфолино (МО) (см. Методы).Средняя стабильность экспрессии для каждой из эталонных целей в 4 различных типах экспериментов была рассчитана с использованием алгоритма geNorm. Эталонные гены ранжируются в соответствии со значением стабильности их экспрессии (называемым M-значением) [7]; Кроме того, для каждого эксперимента определяется оптимальное количество генов для нормализации. Референсные мишени со значениями M ниже 0,5 и 0,2 считаются имеющими «высокую» и «очень высокую» стабильность экспрессии соответственно [12]. В экспериментах, в которых эмбрионы обрабатывали соединениями или инъецировали МО, почти все контрольные мишени имели «высокую» стабильность экспрессии, а значительное количество контрольных мишеней демонстрировало «очень высокую» стабильность экспрессии (рис. 2A – D).В целом, ERE показали более высокую стабильность экспрессии (более низкие значения M) по сравнению с контрольными генами, хотя различия в значениях M невелики. Во временных рядах развития и сравнении различных органов рыбок данио распределение M-значений было более рассредоточенным с относительно низкой стабильностью экспрессии (M> 0,5) для эталонных генов и стабильностью экспрессии от «высокой» до «очень высокой» для значительного количество ERE (рис. 2E, F). Во временном ряду ERE hatn10, был определен как лучшая эталонная цель со значением M около 0.3, в то время как наиболее эффективным эталонным геном мРНК был rps18 с M-значением около 0,6 (рис. 2E). Следует отметить, что gapdh , часто используемую эталонную цель у рыбок данио, имел M-значение 1,5, что считается крайне нестабильным. В различных органах рыбок данио (рис. 2F) лучшей эталонной мишенью является ERE hatn10 с M-значением 0,3, в то время как лучший классически используемый эталонный ген, bactin2 , имел M-значение только 0,8. Сходные результаты были получены при выполнении анализа geNorm для 6 различных экспериментов с использованием скорректированных по эффективности значений Cq, которые были определены с помощью линейного регрессионного анализа данных флуоресценции qPCR с использованием программного обеспечения LinRegPCR (рисунок S3) [25].Чтобы определить оптимальное количество эталонных мишеней, которые будут использоваться в различных экспериментах, значение V n / n + 1 было рассчитано с использованием geNorm (см. Материалы и методы). Этот анализ показал, что для каждого экспериментального условия включения двух лучших эталонных целей достаточно для адекватной нормализации, как указано значениями V 2/3 ниже 0,15 (Рисунок S4, порог 0,15 согласно Vandesompele et al. (2002)) [7]). В 5 из 6 условий лучшими двумя эталонными целями были ERE.

Рисунок 2. Средняя стабильность экспрессии общих референсных генов и экспрессируемых повторяющихся элементов.

Ранжирование эталонных целей в зависимости от их M-значений, рассчитанных geNorm. Референсные мишени со значениями M ниже 0,5 и 0,2 считаются имеющими «высокую» и «очень высокую» стабильность экспрессии соответственно. ERE обозначены черным цветом, обычно используемые эталонные мРНК серым цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091.g002

Наконец, мы стремились идентифицировать наиболее стабильно выраженные эталонные цели в различных проведенных экспериментах.Метод рангового агрегирования, основанный на теории голосования (подсчет Борда), использовался для объединения 6 ранжированных списков контрольных целей, созданных для 6 различных экспериментов. Этот метод пытается найти упорядоченный список эталонных анализов как можно ближе ко всем индивидуальным упорядоченным спискам, вычисляя взвешенное расстояние по методу Спирмена и используя кросс-энтропийный алгоритм Монте-Карло или генетический алгоритм. Анализ 6 упорядоченных эталонных целевых списков четко продемонстрировал, что большинство ERE показали более высокую общую стабильность экспрессии по сравнению с большинством обычно используемых эталонных генов, о чем свидетельствуют более низкие ранги и более низкое медианное значение M (t- тест; p <0.001) и меньший разброс M-значения (t-критерий Стьюдента; p <0,001) (рис. 3A, B) с самой высокой стабильностью для ERE hatn10 . В каждом из 6 экспериментов hatn10 имел значение M ниже 0,5, и было обнаружено, что этот ERE является наиболее стабильно выраженной эталонной целью в 4 из 6 экспериментов, что указывает на то, что hatn10 является интересным кандидатом для включения в качестве эталонная мишень в широком диапазоне экспериментов.

Рисунок 3. Агрегационный анализ рангов.

A: Ранговый анализ агрегации, упорядочивающий референсные гены на основе их ранжирования в соответствии с каждым измерением стабильности (серые линии) от наиболее стабильных (слева) к наименее стабильным (справа). Среднее ранговое положение каждого гена показано черным цветом, а также модель, рассчитанная с помощью алгоритма Монте-Карло (красная линия). Все ERE, за исключением sine3 , оцениваются лучше, чем обычно используемые эталонные гены. B: Коробчатая диаграмма, представляющая дисперсию M-значения.Прямоугольники отображают первый и третий квартили, а медиана обозначается линией в середине прямоугольника, выбросы — кружками. Контрольные цели ранжируются в соответствии с результатом агрегирования рангов (наиболее стабильные контрольные цели слева).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091.g003

Оценка достоверности эталонных мишеней ERE по сравнению с общими эталонными генами для нормализации представляющих интерес генов

Для проверки точности результатов кПЦР после нормализации либо с часто используемыми эталонными генами ( gapdh , bactin2 и elfa ) или эталонными мишенями ERE ( hatn10 , dna15ta1 и loopern4 ), экспрессия Известные дифференциально экспрессируемые гены измеряли в разнообразных экспериментальных условиях (временные ряды развития, различные органы, морфолино и комбинированные методы лечения).

Согласно более ранним сообщениям, транскрипты zorba присутствуют только в эмбрионах рыбок данио до перехода в середину бластулы (MBT) примерно через 3.5 hpf, после чего инициируется зиготическая транскрипция [28], [29]. Это означает, что транскрипты zorba происходят строго по материнской линии и почти не имеют зиготической транскрипции. Это было подтверждено данными микроматрицы, сообщенными Yang et al. (2013) [30], где транскриптомы сравнивали между разными стадиями развития у эмбрионов рыбок данио.Мы рассмотрели экспрессию zorba во временном ряду развития с использованием RT-qPCR и нормализовали данные либо с часто используемыми эталонными генами, либо с эталонными мишенями ERE. При использовании ERE в качестве эталонных мишеней была отмечена более чем 20-кратная разница в экспрессии между точками времени 0 hpf (материнская) и 8 hpf (зиготическая), подтверждая, что транскриптов zorba почти исключительно материнского происхождения (рис. 4A). При применении классических эталонных генов для нормализации наблюдалась только трехкратная разница в экспрессии, что ложно указывает на относительно небольшую разницу экспрессии для zorba между материнской и зиготической стадиями транскрипции.

Рисунок 4. Изменение экспрессии выбранных генов, представляющих интерес, после нормализации с общими эталонными генами (эталонные гены) и эталонными мишенями ERE (ERE).

A: Выражение кратного изменения zorba между 0 hpf и 8 hpf. B: Экспрессия складчатого изменения pax6a между глазом взрослых рыбок данио и тканями мозга. C: Fold изменяет экспрессию acta2 между инъекциями slc2a10 MO и скремблированными инъекциями MO. D: Кратковременное изменение экспрессии acta2 между соединением TGFBRI и обработкой средой для скрининга.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091.g004

Во время раннего эмбриогенеза ген pax6a экспрессируется в определенных частях развивающегося мозга, хотя с личиночных стадий экспрессия становится более ограниченной глаз [31]. Преобладающая глазная экспрессия pax6a дополнительно подтверждается анализом экспрессии микроматрицы (собственные данные, не показаны), показывающим на 25% более высокую экспрессию pax6a в глазу взрослых рыбок данио по сравнению с мозгом.Мы изучили уровни экспрессии pax6a RT-qPCR в различных органах взрослых рыбок данио. Когда уровни экспрессии были нормализованы до эталонных целей ERE, можно было подтвердить более высокую экспрессию pax6a в глазу по сравнению с мозгом (рис. 4B). Напротив, нормализация общих референсных генов привела к неожиданно более высокой экспрессии pax6a в мозге по сравнению с глазом.

У эмбрионов рыбок данио нокдаун slc2a10 с использованием инъекции MO влияет на экспрессию ряда генов, участвующих в развитии сердечно-сосудистой системы, что подтверждается анализом экспрессии микрочипов [18].Один из этих прототипов затронутых генов — acta2 , демонстрируя небольшую активацию при нокдауне slc2a10 . Мы провели анализ экспрессии RT-qPCR для acta2 и обнаружили, что как общий референсный ген, так и нормализация ERE привели к аналогичной небольшой повышающей регуляции гена acta2 после инъекции slc2a10 MO (рис. 4C). Также известно, что ген acta2 активируется при лечении соединением TGFBRI в большей степени, чем после инъекций slc2a10 MO [18].Мы подтвердили трехкратную сверхэкспрессию acta2 после введения соединения TGFBRI, как после нормализации общего референсного гена, так и после нормализации ERE (рис. 4D).

Обсуждение

В нескольких отчетах указано, что даже внутри вида ни один ген не может рассматриваться как идеальный эталонный ген для нормализации данных КПЦР для различных типов образцов и экспериментальных ситуаций [8], [10], [32]. Это связано с вариациями уровней экспрессии этих генов в разных экспериментальных условиях, на стадиях развития или в разных тканях или клетках.В этом исследовании мы специально стремились идентифицировать набор эталонных целей, которые стабильно выражаются в разнообразном наборе образцов, полученных от рыбок данио, модельного организма, который становится все более популярным в моделировании заболеваний, исследованиях развития и токсикологии. Наша стратегия была основана на идентификации определенных типов повторяющихся элементов, которые распространились по геному рыбок данио во время эволюции и которые также присутствуют в геномных последовательностях, которые транскрибируются в РНК.С помощью одной пары праймеров RT-qPCR можно амплифицировать один специфически экспрессируемый повторяющийся элемент (ERE), тем самым одновременно обнаруживая множество различных транскриптов, в которых присутствует специфический ERE. Основное предположение состоит в том, что при одновременном измерении многих транскриптов дифференциальная экспрессия некоторых из них не приведет к радикальному изменению общего уровня экспрессии ERE. Следовательно, ожидается, что экспрессия этого набора повторов будет очень стабильной в различных экспериментальных ситуациях, поскольку она служит для оценки общей численности фракции мРНК.Использование экспрессируемых повторяющихся элементов было впервые представлено Vandesompele et al. (2-й Международный симпозиум кПЦР, Фрайзинг-Вайенштефан, Германия, 6 сентября 2005 г.) и впоследствии подтвержденный Marullo et al. (2010) [13], где Alu-повторы, специфичные для приматов, использовали для нормализации биомаркеров в крови человека. Недавно появилось сообщение о том, что экспрессированные Alu-повторы могут успешно использоваться в качестве фактора нормализации в экспериментах RT-qPCR, в которых раковые клетки человека подвергались различным воздействиям [14], или в экспериментах по дифференцировке человеческих эмбриональных стволовых клеток [15].

В этом исследовании 10 различных ERE рыбок данио были выбраны в качестве кандидатов на цели нормализации на основе минимального количества выраженных копий и оценки сохранения. Затем сравнивали стабильность экспрессии этих ERE и 10 обычно используемых эталонных мРНК для исследований на рыбках данио. Стандартные эталонные гены участвуют в различных клеточных процессах и структурах, таких как метаболизм ( hprt1, gapdh ), транскрипция ( tbp, ), трансляция ( elfa ), структура цитоскелета ( bactin2, tuba1 ), главный комплекс гистосовместимости. ( b2m ) и биосинтез стероидов ( cyp19a1b ), таким образом избегая совместной регуляции при различных обработках [11], [32], [33].Мы не включали в это исследование часто используемые транскрипты рРНК (например, 18S и 28S рРНК). Действительно, хотя рРНК составляет более 90% всей РНК, было показано, что соотношение рРНК к мРНК может варьироваться в зависимости от условий эксперимента [34] — [36]. Более того, высокое содержание рРНК по сравнению с мРНК может препятствовать коррекции базовой флуоресценции при анализе данных кПЦР [7], [37]. Наконец, рРНК транскрибируется другой эндогенной РНК-полимеразой, не полиаденилируется и выполняет другую функцию по сравнению с мРНК, что делает рибосомную РНК нерепрезентативной формой РНК для нормализации мРНК.Поэтому использование рРНК в качестве фактора нормализации в экспериментах кПЦР не рекомендуется и может привести к неверной интерпретации данных.

Стабильность экспрессии

была протестирована на разнообразном наборе образцов, охватывающем различные экспериментальные установки в исследованиях рыбок данио, включая образцы, обработанные морфолино и соединениями, и образцы с разных стадий развития и из разных тканей взрослого человека. Особенно для последних двух типов образцов трудно найти факторы нормализации хорошего качества [11], скорее всего из-за драматических изменений в профилях экспрессии во время развития рыбок данио и значительных различий в экспрессии между разными созревшими органами [30], [38].Действительно, анализ экспрессии на разных стадиях развития и в тканях рыбок данио выявил низкую стабильность экспрессии всех обычно используемых эталонных мРНК с M-значениями выше 0,5, подразумевая, что эти гены не подходят для надежной нормализации данных экспрессии в этих экспериментальных условиях. Поразительно, но экспрессия одного из наиболее часто используемых эталонных генов, gapdh , является наименее стабильной из всех эталонных мишеней, протестированных в этом исследовании. В соответствии с этим наблюдением, предыдущие исследования тканей и клеточных линий позвоночных уже сообщили о плохой работе gapdh в качестве внутреннего эталонного гена и о вариабельности его экспрессии [39] — [43].Следовательно, мы настоятельно не рекомендуем дальнейшее использование gapdh в качестве эталонного гена для нормализации в экспериментах с рыбками данио. Примечательно, что большинство ERE рыбок данио проявили себя очень хорошо, причем во многих случаях M-значения были ниже 0,5, что свидетельствует о высокой стабильности экспрессии, таким образом четко обозначая ERE в качестве эталонной мишени выбора в этих экспериментальных условиях. Устойчивость нормализации ERE для анализа экспрессии на разных стадиях развития и в тканях рыбок данио была дополнительно подтверждена валидацией известных уровней дифференциальной экспрессии соответственно для генов zorba и pax6a .Нормализация с использованием общих референсных генов привела к совершенно разным паттернам экспрессии, что привело к ложной интерпретации данных. Эффективность ERE с точки зрения стабильности менее выражена в экспериментах с возмущениями, таких как лечение соединениями или инъекции морфолино. Хотя почти все эталонные мишени показали относительно хорошие результаты, опять же, стабильность экспрессии ERE в целом была лучше, чем у обычных эталонных генов. Относительно хорошая эффективность всех референсных мишеней, независимо от их природы, в экспериментах с соединениями и морфолино отражает более тонкое влияние этих обработок на общий профиль экспрессии у эмбрионов рыбок данио.Действительно, проверка известных уровней дифференциальной экспрессии гена acta2 в этих условиях не выявила серьезных различий между обеими стратегиями нормализации.

Чтобы определить наиболее стабильно выраженные эталонные цели во всех проведенных экспериментах, мы провели анализ агрегирования рангов. Этот анализ показывает, что стабильность экспрессии ERE была лучше, чем для обычных эталонных генов. ERE hatn10 , dna15ta1 и loopern4 представляют собой наиболее стабильные контрольные цели с M-значениями ≤0.5 во всех 6 опытах. Мы рекомендуем включить по крайней мере эти 3 гена в исследования экспрессии генов у рыбок данио для оценки их пригодности в качестве целей нормализации.

В рекомендациях MIQE от 2009 года подчеркивается необходимость точной нормализации данных RT-qPCR для получения надежных данных экспрессии. Однако в недавней статье в Nature Methods, в которой был проведен обзор 1700 публикаций с данными на основе qPCR с 2009 по 2013 год, сообщалось о плохом применении этих рекомендаций, включая неадекватные процедуры нормализации с широким использованием единичных непроверенных эталонных генов [44].Давно признано, что это может привести к ненадежным результатам, в частности, для измерения незначительных различий в уровнях экспрессии. Наше исследование полностью соответствует рекомендациям MIQE и решает проблему надлежащей нормализации в исследованиях экспрессии рыбок данио, впервые предоставляя набор надежных кандидатов референс-мишеней для нормализации данных RT-qPCR в широком диапазоне экспериментов с рыбками данио. ERE могут значительно облегчить и улучшить исследования экспрессии генов у рыбок данио.Кроме того, стратегия биоинформатики, изложенная для идентификации и проверки таких ERE в этом исследовании, может быть применена к другим организмам. Таким образом, мы ожидаем, что аналогичные тесты ERE qPCR будут разработаны и использованы в других модельных организмах для целей нормализации.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Типичный пример стандартной кривой разбавления и плавления ERE. A: Стандартная кривая разведения, используемая для определения эффективности амплификации праймеров набора праймеров dna15ta1 .В этом примере значения Cq, полученные для набора праймеров dna15ta1 , нанесены на график в зависимости от количества кДНК (нг) (экспортировано из программного обеспечения qbase +). Для каждого количества прилагаются две технические копии. B: Анализ кривой плавления для набора праймеров dna15ta1 (экспортированный из программного обеспечения LightCycler 480). Сверху график зависимости флуоресценции образца от температуры. Ниже первая отрицательная производная флуоресценции образца нанесена на график в зависимости от температуры, отображая температуру плавления в виде пика.В этом примере есть один острый пик от ампликона, имеющего Tm 76 ° C, что указывает на специфичность набора праймеров dna15ta1 .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091.s001

(DOCX)

Рисунок S2.

Схематическое изображение дизайна праймера ERE (гипотетический пример). Изображены полноразмерный повторяющийся элемент (темно-серая линия, вверху) и ряд выровненных повторяющихся элементов, содержащих фрагменты, полученные в результате комбинированного поискового запроса RefSeq / не-RefSeq.На первом этапе мы определяем наиболее часто выраженную часть последовательности ERE. Чтобы очертить эту область, все результаты бластов RefSeq и non-RefSeq выравниваются с согласованной последовательностью повторов, а последовательности, которые обычно присутствуют в большинстве фрагментов, используются в качестве шаблона для конструирования праймера с использованием праймера 3 с настройками по умолчанию.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091.s002

(TIF)

Рисунок S4.

GeNorm рассчитала значения парной вариации Vn / n + 1 для различных экспериментальных условий. Оптимальное количество контрольных целей (n) достигается, когда включение следующей контрольной цели (n + 1) снижает значение Vn / n + 1 ниже 0,15. Для каждого эксперимента значение V2 / 3 ниже 0,15, что указывает на то, что включение только двух эталонных целей, с наименьшим значением M, достаточно для адекватной нормализации.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109091.s004

(TIF)

Благодарности

Мы признательны Петре Вермассен за квалифицированную техническую помощь.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SVH JVS AWL. Проведены эксперименты: SVH GVP EJN AWL. Проанализированы данные: SVH JVS AWL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SVH GVP ARH SLF PRN ADP FSP PCK AWL. Участвовал в написании рукописи: SVH AWL JVS GVP.

Ссылки

  1. 1. Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж. А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж. И др. (2009) Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени.Clin Chem 55: 611–622.
  2. 2. Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J (2010) Как провести успешный анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени. Методы 50: 227–230.
  3. 3. Дхеда К., Хаггетт Дж. Ф., Чанг Дж. С., Ким Л. Ю., Бастин С. А. и др. (2005) Последствия использования неподходящего референсного гена для нормализации данных ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Анальная биохимия 344: 141–143.
  4. 4. Goossens K, Van Poucke M, Van Soom A, Vandesompele J, Van Zeveren A, et al.(2005) Выбор эталонных генов для количественной ПЦР в реальном времени на доимплантационных эмбрионах крупного рогатого скота. BMC Dev Biol 5: 27.
  5. 5. Kim BS, Rha SY, Cho GB, Chung HC (2004) Правило Спирмена как мера воспроизводимости микроматрицы кДНК. Геномика 84: 441–448.
  6. 6. Трикарико С., Пинзани П., Бьянки С., Паглирани М., Дистанте В. и др. (2002) Количественная полимеразная цепная реакция обратной транскрипции в реальном времени: нормализация к рРНК или отдельным генам домашнего хозяйства не подходит для биопсии тканей человека.Анальная биохимия 309: 293–300.
  7. 7. Вандесомпеле Дж., Де Претер К., Паттин Ф., Поппе Б., Ван Рой Н. и др. (2002) Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля. Genome Biol. 3: ИССЛЕДОВАНИЕ0034.
  8. 8. Dhorne-Pollet S, Thelie A, Pollet N (2013) Валидация новых эталонных генов для исследований экспрессии генов у Xenopus tropicalis во время эмбрионального и постэмбрионального развития с помощью RT-qPCR. Дев Дин 242: 709–717.
  9. 9. Якоб Ф., Гертлер Р., Наим С., Никсдорф С., Федье А. и др. (2013) Тщательный отбор референсных генов необходим для надежного проведения RT-qPCR в линиях нормальных и раковых клеток человека. PLoS One 8: e59180.
  10. 10. Ledderose C, Heyn J, Limbeck E, Kreth S (2011) Выбор надежных эталонных генов для количественной ПЦР в реальном времени в человеческих Т-клетках и нейтрофилах. BMC Res Notes 4: 427.
  11. 11. McCurley AT, Callard GV (2008) Характеристика генов домашнего хозяйства у рыбок данио: различия самцов и самок и влияние типа ткани, стадии развития и химической обработки.BMC Mol Biol 9: 102.
  12. 12. Hellemans J, Mortier G, De Paepe A, Speleman F, Vandesompele J (2007) Система относительной количественной оценки qBase и программное обеспечение для управления и автоматического анализа количественных данных ПЦР в реальном времени. Геном Биол 8: R19.
  13. 13. Марулло М., Зуккато С., Мариотти С., Лахири Н., Тебризи С.Дж. и др. (2010) Expressed Alu Repeats как новый надежный инструмент для нормализации количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени. Genome Biol. 11: R9.
  14. 14.Рихани А., Ван Маеркен Т., Паттин Ф., Ван Пер Дж., Бекерс А. и др. (2013) Эффективная нормализация RT-Qpcr на основе Alu-повторов в экспериментах по возмущению раковых клеток. PLoS One 8: e71776.
  15. 15. Vossaert L, O’Leary T., Van Neste C, Heindryckx B, Vandesompele J, et al. (2013) Референсные локусы для анализа дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток человека с помощью ОТ-КПЦР. BMC Мол Биол 14: 21.
  16. 16. Nasevicius A, Ekker SC (2000) Эффективный целевой нокдаун гена у рыбок данио.Нат Генет 26: 216–220.
  17. 17. Coucke PJ, Willaert A, Wessels MW, Callewaert B, Zoppi N, et al. (2006) Мутации в способствующем переносчике глюкозы GLUT10 изменяют ангиогенез и вызывают синдром извитости артерий. Нат Генет 38: 452–457.
  18. 18. Willaert A, Khatri S, Callewaert BL, Coucke PJ, Crosby SD, et al. (2012) GLUT10 необходим для развития сердечно-сосудистой системы и хорды и связывает функцию митохондрий с передачей сигналов TGFbeta.Hum Mol Genet 21: 1248–1259.
  19. 19. Rojas JC, Aguilar B, Rodriguez-Maldonado E, Collados MT (2005) Фармакогенетика пероральных антикоагулянтов. Фибринолиз свертывания крови 16: 389–398.
  20. 20. Weigt S, Huebler N, Strecker R, Braunbeck T, Broschard TH (2012) Эффекты развития кумарина и антикоагулянта, производного кумарина, варфарина на эмбрионах рыбок данио (Danio rerio). Reprod Toxicol 33: 133–141.
  21. 21. Мерфи Р.Д., Зон Л.И. (2006) Скрининг малых молекул у рыбок данио.Методы 39: 255–261.
  22. 22. Гупта Т., Маллинс М.К. (2010) Отсечение органов у взрослых рыбок данио. J Vis Exp.
  23. 23. Vermeulen J, Derveaux S, Lefever S, De Smet E, De Preter K и др. (2009). Предварительная амплификация РНК позволяет проводить крупномасштабные исследования экспрессии генов RT-qPCR на ограниченных количествах образцов. BMC Res Notes 2: 235.
  24. 24. Унтергассер А., Каткутаке И., Корессар Т., Йе Дж., Фэйрклот BC и др. (2012) Primer3 – новые возможности и интерфейсы.Nucleic Acids Res 40: e115.
  25. 25. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, Karlen Y, Bakker O и др. (2009) Эффективность амплификации: связь исходного уровня и систематической ошибки при анализе количественных данных ПЦР. Нуклеиновые кислоты Res 37: e45.
  26. 26. Pihur V, Datta S, Datta S (2009) RankAggreg, пакет R для взвешенного агрегирования рангов. BMC Bioinformatics 10: 62.
  27. 27. Юрка Дж., Капитонов В.В., Павличек А., Клоновски П., Кохани О. и др. (2005) Repbase Update, база данных повторяющихся эукариотических элементов.Cytogenet Genome Res 110: 462–467.
  28. 28. Bally-Cuif L, Schatz WJ, Ho RK (1998) Характеристика связывающего РНК белка, связанного с Orb / CPEB рыбок данио, и локализация материнских компонентов в ооцитах рыбок данио. Mech Dev 77: 31–47.
  29. 29. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF (1995) Этапы эмбрионального развития рыбок данио. Дев Дин 203: 253–310.
  30. 30. Ян Х, Чжоу Й, Гу Дж, Се С, Сюй И и др. (2013) Глубокий анализ секвенирования мРНК для выявления транскриптомного ландшафта эмбрионов и личинок рыбок данио.PLoS One 8: e64058.
  31. 31. Lakowski J, Majumder A, Lauderdale JD (2007) Механизмы, контролирующие экспрессию изоформы Pax6 в сетчатке, были сохранены между костистыми костями и млекопитающими. Дев Биол 307: 498–520.
  32. 32. Casadei R, Pelleri MC, Vitale L, Facchin F, Lenzi L и др. (2011) Идентификация генов домашнего хозяйства, подходящих для анализа экспрессии генов у рыбок данио. Паттерны экспрессии генов 11: 271–276.
  33. 33. Tang R, Dodd A, Lai D, McNabb WC, Love DR (2007) Проверка эталонных генов рыбок данио (Danio rerio) для количественной нормализации RT-PCR в реальном времени.Acta Biochim Biophys Sin (Шанхай). 39: 384–390.
  34. 34. Hansen MC, Nielsen AK, Molin S, Hammer K, Kilstrup M (2001) Изменения уровней рРНК во время стресса делают недействительными результаты блоттинга мРНК: флуоресцентная гибридизация рРНК in situ позволяет перенормировать для оценки клеточных уровней мРНК. J Bacteriol 183: 4747–4751.
  35. 35. Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A (2005) Нормализация ОТ-ПЦР в реальном времени; стратегии и соображения. Genes Immun. 6: 279–284.
  36. 36. Solanas M, Moral R, Escrich E (2001) Непригодность использования рибосомальной РНК в качестве контроля нагрузки для Нозерн-блот-анализов, связанная с дисбалансом между содержанием матричной и рибосомальной РНК в опухолях молочной железы крыс. Анальная биохимия 288: 99–102.
  37. 37. Hendriks-Balk MC, Michel MC, Alewijnse AE (2007) Ловушки при нормализации данных полимеразной цепной реакции в реальном времени. Basic Res Cardiol 102: 195–197.
  38. 38. Абрамссон А., Вестман-Бринкмальм А., Панни Дж., Густавссон М., фон Оттер М. и др.(2010) Протеомическое профилирование отдельных органов отдельных взрослых рыбок данио. Данио 7: 161–168.
  39. 39. Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, Clark BJ (2005) GAPDH как ген домашнего хозяйства: анализ экспрессии мРНК GAPDH в панели из 72 тканей человека. Physiol Genomics 21: 389–395.
  40. 40. Bustin SA (2000) Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. J Mol Endocrinol 25: 169–193.
  41. 41.Бустин С.А. (2002) Количественная оценка мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР): тенденции и проблемы. J Mol Endocrinol. 29: 23–39.
  42. 42. Дхеда К., Хаггетт Дж. Ф., Бастин С. А., Джонсон М. А., Рук Дж. И др. (2004) Валидация генов домашнего хозяйства для нормализации экспрессии РНК в ПЦР в реальном времени. Биотехники 37: 112–114, 116, 118–119.
  43. 43. Lin J, Redies C (2012) Гистологические доказательства: гены домашнего хозяйства бета-актина и GAPDH имеют ограниченное значение для нормализации экспрессии генов.Dev Genes Evol 222: 369–376.
  44. 44. Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж. И др. (2013) Необходимость прозрачности и передовой практики в литературе по qPCR. Nat Methods 10: 1063–1067.

HTML-тег

Тег HTML отмечает рубиновый текстовый компонент рубиновой аннотации.

Рубиновые аннотации часто используются в восточноазиатской типографике.

Символы Ruby (также пишутся rubi ) — это небольшие аннотативные глоссы, которые можно размещать над или справа от китайского символа при написании логографических языков, таких как китайский или японский, для демонстрации произношения.Аннотации Ruby обычно используются в качестве руководства по произношению относительно малоизвестных символов.

Синтаксис

Тег записывается как с текстом рубина, вставленным между начальным и конечным тегами.

Как это:

<рубин> база рубиновый текст

Примеры

Базовая аннотация Ruby

Вот пример использования тега для представления рубинового текста в рубиновой аннотации.

… <рубин> & # 27721; h & agrave; n & # 23383; z & igrave; & nbsp;

Без конечного тега

Конечный тег элемента может быть опущен, если за элементом сразу же следует элемент , , или . , или если в родительском элементе больше нет содержимого.

Конечный тег элемента может быть опущен, если за элементом сразу же следует элемент , , или . , или если в родительском элементе больше нет содержимого.

Следовательно, следующий пример соответствует HTML5.

<рубиновый> & # 26481; & # 20140; & # 12392; & # 12358; & # 12365; & # 12423; & # 12358;

Резервное содержимое

Вы можете использовать элемент , чтобы предоставить резервный контент для тех браузеров / пользовательских агентов, которые не поддерживают рубиновые аннотации.

Как это:

… <рубин> & # 28450; ( & # 12363; & # 12435; ) & # 23383; ( & # 12376; )

Атрибуты

Атрибуты могут быть добавлены к элементу HTML, чтобы предоставить дополнительную информацию о том, как этот элемент должен выглядеть или вести себя.

Элемент принимает следующие атрибуты.

Атрибут Описание
нет

Глобальные атрибуты

Следующие атрибуты являются стандартными для всех элементов HTML. Следовательно, вы можете использовать эти атрибуты с тегом , а также со всеми другими тегами HTML.

  • ключ доступа
  • автокапитализировать
  • класс
  • контентный
  • данные- *
  • директор
  • перетаскиваемый
  • скрыто
  • id
  • режим ввода
  • это
  • идентификатор товара
  • itemprop
  • itemref
  • товар объем
  • тип позиции
  • язык
  • часть
  • слот
  • проверка орфографии
  • стиль
  • tabindex
  • название
  • перевести

Полное описание этих атрибутов см. В разделе Глобальные атрибуты HTML 5.

Обработчики событий

Атрибуты содержимого обработчика событий позволяют вызывать сценарий из HTML-кода. Сценарий вызывается при наступлении определенного «события». Каждый атрибут содержимого обработчика событий имеет дело с отдельным событием.

  • onabort
  • onauxclick
  • размытие
  • отмена
  • oncanplay
  • можно пройти через
  • на замену
  • onclick
  • вкл.
  • контекстное меню
  • коп.
  • на смену
  • нарезка
  • ondblclick
  • ондраг
  • ондрагенд
  • ондрагентер
  • ондрагэксит
  • ondragleave
  • ондраговер
  • ондрагстарт
  • капля
  • на срок замены
  • пусто
  • завершено
  • ошибка
  • onfocus
  • onformdata
  • на входе
  • недействительно
  • нажатие клавиши
  • нажмите клавишу
  • onkeyup
  • onlanguagechange
  • загрузка
  • загруженные данные
  • загруженные метаданные
  • onloadstart
  • onmousedown
  • onmouseenter
  • onmouseleave
  • onmousemove
  • onmouseout
  • над мышью
  • onmouseup
  • паста
  • на паузу
  • в игре
  • в действии
  • в процессе
  • скорость изменения
  • сбросить
  • по размеру
  • в прокрутке
  • нарушение политики безопасности
  • востребовано
  • в поиске
  • при выборе
  • onslotchange
  • установлен
  • onsubmit
  • приостановлено
  • ontimeupdate
  • рычаг
  • по объему изменить
  • ожидает
  • на колесе

Большинство атрибутов содержимого обработчиков событий можно использовать для всех элементов HTML, но некоторые обработчики событий имеют определенные правила, касающиеся того, когда их можно использовать и к каким элементам они применимы.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *