Равон р3 или р4: Ravon R4 или Ravon Nexia R3 2017: Какую Выбрать?

Обзор недостатков Ravon Nexia R3

На нашем рынке бюджетный автомобиль Ravon сменил популярный Daewoo. А на замену Шевролет Авео Т250 пришла новая модель Равон Нексия RЗ. Автомобильный завод на протяжении многих лет создавал надежные и недорогие автомобили. Доступная стоимость в комплексе с хорошим оснащением, как для заявленной цены, вызвали немалый интерес у потенциальных потребителей. За кроткое время авто получил высокую популярность.

Преимущества машины очевидны. О них нам подробно рассказали во время презентации. А какие недостатки Равон Нексия отмечают владельцы с учетом опыта эксплуатации.

Про автомобиль Равон Нексия Р3

Свежеиспеченный автомобиль был представлен широкой публике в Москве в 2015 году. Узбекские представители отметили, что основные приоритеты, которые ставит перед собой компания, вовсе не рискованные эксперименты.

На первое место ставится надежность, качество, проверенное временем. При этом производители делают ставку на инновационные технологии и высокий уровень комфорта. В качестве подтверждения своим словам производитель представил модель по бюджетной стоимости. И к тому же она оказалась с хорошим уровнем оснащения, для данного класса авто, что, конечно, не могло не привлечь потребителей.

Отматывая время назад, стоит отметить, что большой неожиданностью было то, что Равон Нексия Р3 вовсе не похож на традиционную Нексию. Очередной дебютант – это измененный вариант Авео Т250. Во внешности машины прослеживаются черты хетчбека и седана Авео. Результат привлек к себе внимание и вызвал интерес. Новая модель получила оригинальный и симпатичный облик.

Слово «равон» означает плавный, ровный путь. Производители отметили, что новая модель имеет все шансы, чтобы оправдать свое название. В ней удачным образом соединились многие достоинства, среди которых – высокая безопасность, отличная техническая оснащенность, ездовые качества, стильные внешние данные и комфорт. Авто позиционируется изготовителем как выбор современных, рациональных и прагматичных людей.

Производитель предлагает машину в нескольких вариациях:

• Комфорт;
• Оптимум;
• Элегант.

Также покупатель может выбрать автоматическую либо механическую трансмиссию. Безопасность, как для авто такого класса – отличная. В зависимости от комплектации количество опций может изменяться.

Производитель предлагает широкую палитру цветов и несколько вариантов оснащения для салона. Все представлено просто шикарно. Бюджетный автомобиль имеет хорошее оснащение и, кажется, полностью оправдывает свою стоимость. Однако, как и любая продукция, он должен иметь не только сильные, но также слабые стороны.
Рассмотрим недостатки Равон Нексия Р3 на основе отзывов реальных собственников по прошествии некоторого времени эксплуатации.

Недостатки Равон Нексия Р3

Какие недостатки отмечают пользователи на основе своего опыта эксплуатации?

Салон

Салон машины предлагается в нескольких вариациях. Он может быть однотонным или выполнен в сочетании нескольких цветов. Так как данная марка относится к моделям бюджетных авто, не предусмотрена возможность отделки настоящей кожей, а также дорогим деревом.

Для одних пользователей это неважно, другие это отмечают как недостаток.
Стоит отметить, что пластик в салоне, ткань для чехлов как для бюджетного автомобиля выглядит вполне прилично. В максимальной версии двери отделаны тканевой обшивкой. Пластик имеет неплохое качество, приятный на ощупь и молчаливый. В салоне стоят вполне приличные кресла с регулировкой по высоте.

К недостаткам пользователи относят отсутствие подогрева передних сидений. Для комфортного размещения места хватит четырем упитанным взрослым или пяти студентам.

Качество сборки

Качество сборки нельзя назвать плохим, но многие пользователи все же отмечают некоторые недостатки. Стоит отметить, что в салоне, как и раньше, сильно разит феном.
Даже не сильно придирчивый потребитель заметит неравномерные пустоты между глянцевой черной площадкой и хромированным ободком в основании селектора АКП. Некоторые пользователи указывают на перекошенную пластиковую панель под лобовым стеклом.

Пластиковая облицовка порога водителя также установлена криво и ходит ходуном.

Стоит отметить, что подобные минусы встречаются не на каждой модели. На основе вышеописанных фактов можно сделать вывод о нестабильном качестве сборки. Во всем остальном интерьер выполнен неплохо как для бюджетной машины – черкая геометрия, отличная посадки, удобные кресла.

Внутри машина выглядит современно. Единственное, что выдает ее возраст – небольшие карманы в передних дверях, куда даже не поставишь даже пластиковую бутылку.

Внутреннее оснащение, мультимедиа, звук, динамики

Радио очень простое, чего и стоило ожидать от авто данного класса. Магнитола неплохая. Динамики слабые, но звук не раздражает. Мультируль многим не нравится. Причина – неудобные многофункциональные клавиши.

Печка греет, кондиционер охлаждает, вертушка для распределения воздушных потоков работает хорошо. Все продумано, просто и благородно.

Ездовые характеристики

Едет авто хорошо. Мотор достаточно резвый, надежность бюджетной машины отличная. Пользователи отмечают высокую сообразительность автомата. Ездовые характеристики, для авто такого класса – хорошие.

Они намного лучше, чем у остальных конкурентов. В автомобиле установлен неплохой двигатель и современная коробка передач. Хорошая связка мотора и коробки придает транспорту адекватную разгонную динамику и удерживает топливный аппетит в разумных пределах. Подвеска – плотная, выносливая. Клиренс отлично подходит под наши дороги.

Недостатки, которые отметили пользователи:

• Серьезный недостаток – отсутствие антигравийной пленки, которая уберегает от камней, песка задние колесные арки.
• Пользователи отмечают плохое качество шумоизоляции. Она намного хуже, чем у Логана и Гранты.
• Некоторые пользователи сочли серьезным недостатком отсутствие боковых подушек даже в топовой версии.
• На ровном асфальте авто чувствует себя превосходно. Но на стыках, ямах и выбоинах находится внутри не очень комфортно. Подвеска жесткая.

Существенный минус – отсутствие дистанционного управления центрального замка, а также подогрева передних сидений. Это может сильно отпугнуть потенциальных потребителей.

Что расстраивает во время движения?

Слишком жесткая подвеска, слабая шумка. Стоит отметить, что шумка вынуждает поднять вопрос качества. Кроме плохой защиты колесных арок, подкапотного пространства пользователи отмечают, что на высокой скорости через уплотнитель водительской двери пробивается ветер.

В общем, автомобиль, скорее всего, на любителя. И хорошая иномарка по стоимости Гранты – это всего лишь иллюзия благополучия, не более. Машина стоит дешево, с виду выполнена аккуратно, едет неплохо, внутри находиться достаточно комфортно. Тем не менее, даже после подорожания в своем классе авто остается одним из самых привлекательных вариантов.

Читайте также

обслуживание, эксплуатация, поломки и ремонт, выбор и покупка

Какие размеры дисков и шин на Равон Р4?

Ответить 1Ответов

Здравствуйте у меня одна причина, дёргается переключения передач на низком обороте ,кто знает может сталкивалось с таким проблемами.

Ответить 1Ответов

Выдавило масло с коленвала сальника р3 равон

Ответить 1Ответов

Здравствуйте, появились рывки на равон р3 при переключении передач. Возможно ли что вышел из строя датчик положения педали сцепления?

Ответить 2Ответов

На каком заводе собирается Равон Джентра?

Ответить 1Ответов

Здравствуйте, подскажите, какие параметры дисков и шин на Равон Джентра?

Ответить 1Ответов

Здравствуйте! У меня Равон нексия р3, время от времени иногда магнитофон не видит флешку. Когда включается, загораются какие-то кнопки RPT, RDM, INT. Возможно причина в этих кнопках? И какая функция в этих кнопках? Флешка совершенно новая.

Ответить 1Ответов

Регулируются ли клапана ГРМ на двигателе Ravon Nexia R3

Ответить 1Ответов

Горят,но не моргают указатели поворота и аварийная сигнализация,что это такое?

Ответить 1Ответов

Здравствуйте ,почему дёргается при отпускание педали газа Равон r4.

Ответить 1Ответов

Ravon R3. Здравствуйте.появился шум в двигателе из под клапанной крышки.может быть что Цепь ослабла?

Ответить 3Ответов

загорелась лампочка подушки безопасности, начала мигать лампочка ЕСП ,не горит лампочка и нет звукового сигнала ремня безопасности водителя,повысился расход бензина, переключение передач на акпп стала резким и дергает . ПОМОГИТЕ СОВЕТОМ , что делать и какому специалисту обратится? машина равон р3

Ответить 3Ответов

Ravon — Автозапчасти и аксессуары

Туркестан Сегодня 13:10

Ravon r3 r4 чихол Автозапчасти и аксессуары » Аксессуары для авто Караганда, Казыбекбийский район Сегодня 10:55

3 000 тг. Договорная Алматы, Жетысуский район Вчера 23:37

13 200 тг. Договорная Атырау, Привокзальный Вчера 17:59

55 000 тг. Договорная Нур-Султан (Астана), Есильский район Вчера 15:51

Чистка дроссельной заслонки Равон Джентра, Р2 Спарк, Р3 Нексия, Р4

Все мы хорошо знаем, что основным процессом, позволяющим полноценно функционировать двигателю внутреннего сгорания является сжигание в камерах его сгорания воздушно-топливной смеси.

Силовые агрегаты современных моделей авто, в числе которых и Дэу Нексия, а также его практическая копия Равон Джентра, оборудованы автоматической системой впрыска топлива.

А вот за такую же дозированную подачу в камеры сгорания воздуха, с целью образования соответствующей рабочей смеси отвечает дроссельный узел.

Основным устройством этого узла является дроссельная заслонка

В связи с особенностью предназначения дроссельная заслонка в двигателях указанных автомобилей, а также и Шевроле Спарк, устанавливается на патрубке воздушного фильтра перед впускным коллектором мотора.

Функционально дроссель является своеобразным клапаном в системе впуска воздуха в коллектор.

Он открывает в определённые моменты доступ воздушных масс в коллектор и перекрывает его поступление.

Кроме воздушных масс через отверстие дроссельной заслонки проходят и пары бензина с примесями отработавших газов, а также остатков сгоревшего масла.

Не удивительно, что с течением времени на внутренней поверхности дросселя и его деталей образовывается налёт.

А это уже утрудняет проход воздуха через это устройство.

Поэтому требуется проведение соответствующей чистки и промывки дроссельной заслонки в таких случаях.

Демонтаж дроссельного узла, а также чистка самой дроссельной заслонки не требует особых знаний, навыков и приспособлений.

А поэтому снять и почистить дроссельную заслонку в необходимых случаях может практически любой владелец авто.

Это в свою очередь позволит сэкономить немало средств и времени.

Выполняем самостоятельно чистку дроссельной заслонки Ravon Gentra

В представляемой очередной статье мы хотим рассказать о том, каким образом можно самому снять и провести чистку дроссельной заслонки Равон Джентра, а также Равон Р2, Р3, Р4 Шевроле Кобальт или Дэу Нексия.

• Связано это с тем, что устройство двигателей и дроссельных узлов на них ничем не отличаются во всех этих моделях.
• Единственным отличием может быть только объём самого мотора.
• Прежде всего хочется акцентировать внимание на том, что без особой надобности разбирать и чистить дроссельную заслонку не стоит.
• Если у вас всё функционирует нормально и двигатель работает ровно, то и лазить туда нет никакого смысла.
• Ну, а если в силовом агрегате уже начали плавать обороты или появились другие проблемы, такие как дёргание во время работы, например, свидетельствующие о том, что виновником всего может быть дроссельный узел или его заслонка, тогда уже другое дело.
• Просто мы после пробега автомобиля в 20 тыс. километров уже намеревались выполнить такую процедуру, для чего отсоединили все шланги и сняли гофрированный патрубок воздушного фильтра.

• Но, после этого, когда добрались до самой дроссельной заслонки, увидели, что зеркало её абсолютно чистое.
• Поэтому и отказались от этой затеи и не стали дальше разбирать.
• На сегодняшний день пробег нашего автомобиля составляет 35 тыс. километров и поэтому мы решили всё же снять полностью дроссельную заслонку и при необходимости почистить её.
• Но, прежде чем начинать разборку, необходимо в обязательном порядке отсоединить минусовую клемму аккумуляторной батареи.
• Этим вы убережёте себя от возникновения всяческих неприятностей.
• Затем, так, как у нас есть возможность, мы с помощью пневматического пистолета продуваем все узлы и детали, с которыми нам предстоит сейчас работать.

• Этим мы удалим всю грязь и пыль, которая могла собраться на патрубках и на самом дроссельном узле.
• К тому же это, как говорится, культура производства, да и самому будет приятнее работать.
• После этого начинаем непосредственно сам процесс разборки.
• Первым отстёгиваем от гофрированного патрубка датчик температуры поступаемого воздуха.

• Здесь просто необходимо нажать защёлку, которая держится на пружинке и датчик снимется.
• Дальше отсоединяем трубочку вентиляции картера, для чего необходимо нажать защёлку на его корпусе.

• Чтобы эта трубка не мешала, можно отсоединить её второй конец на крышке клапанов.

• Теперь нам нужно отсоединить фишку питания на дроссельном узле Равон Джентра.
• Для этого поднимаем отвёрткой или любым острым предметом красный флажок на самой фишке.

• Дальше вдавливаем чёрный язычок, расположенный внизу флажка.

• И в таком положении, придерживая язычок, снимаем фишку.

• После этого нам потребуется отсоединить гофрированный патрубок.
• Для этого ослабляем верхний хомут на гофре у корпуса фильтра.

• А также ослабляем нижний хомут на этом же гофрированном патрубке.

• Затем снимаем патрубок вверху с корпуса фильтра.

• И проверяем сразу состояние этого патрубка внутри.

• Чтобы не было внутри грязи и налёта масла.
• Ну и затем снимаем этот патрубок и внизу с дроссельного узла.
• После этого мы можем видеть дроссельную заслонку и оценить её состояние внутри.

• В нашем случае она оказалась практически чистой с этой стороны.
• Гофра внутри с этого конца также чистая.

• Дальше ключом на 10 откручиваем четыре болта, с помощью которых удерживается дроссельная заслонка.

• При этом стоит уточнить, что все четыре болта крепления дросселя здесь абсолютно одинаковые, поэтому вы их не перепутаете при сборке.
• После этого снимаем дроссельную заслонку.

• И когда мы переворачиваем эту заслонку, то с обратной стороны наш дроссель оказывается полностью чёрным.

• Вот вам и результат. А сразу, после снятия гофры заслонка была практически чистая.
• Это говорит о том, что всегда нужно проверять эту деталь не только с одной стороны, но и снимать полностью, чтобы проверить и с обратной стороны.
• Здесь также нужно иметь в виду, что если вы после чистки и установки обратно дросселя не хотите проводить адаптацию его к ЭБУ, то лучше руками внутри его не трогать.
• Поскольку контролёр её запомнил в таком положении и в этом же положении вы её обратно и установите на место.
• Тогда ничего больше делать не придётся. Просто нанесите чистящее средство из баллончика сверху и всё.
• Здесь же одновременно проверяем состояние и положение прокладки дросселя Равон Джентра.
• В нашем случае эта прокладка оказалась немного заломлена в одном месте.

• И это так устанавливали на заводе.
• Поэтому всегда при проведении чистки заслонки необходимо иметь запасную прокладку, чтобы всегда можно было заменить.
• В трубопроводе ближе к коллектору также имеется довольно сильная грязь.

• Почему с этой стороны много грязи и сама заслонка грязная, а с другой стороны этого совсем нет, объясняется очень просто.
• Дело в том, что на впускном коллекторе имеется трубка вентиляции картера.

• Так вот, в момент, когда дроссельная заслонка бывает полностью закрытой, во впускном коллекторе образуется разрежение или практически вакуум.
• В связи с этим картерные газы в этот момент вырываются наружу и попадают снова во впускной коллектор.
• А вместе с ними сюда поднимаются также примеси масла и грязи.
• Поэтому и внутри патрубка, а также заслонки со стороны коллектора, образуется грязный масляный налёт.
• Мало того, внутри патрубка за дроссельной заслонкой выходит ещё одна трубочка.

• Это сюда подсоединён клапан ЕГР.
• А поэтому по этой трубке сюда поступают и отработавшие газы, которые возвращаются во впускной коллектор на повторное сжигание.
• По этой причине также может, как в патрубке, так и на дросселе образовываться налёт.
• И это даже более вероятно, чем из-за трубки вентиляции картера. Не зря многие владельцы стремятся заглушить этот клапан.
• Что касается прокладки дросселя, то мы её решили не менять, поскольку повреждения, которые она имеет, несущественные.
• Эта прокладка не просто круглая, а она имеет ещё язычок, для которого на корпусе коллектора имеется специальная прорезь.

• Именно поэтому проблем с правильностью установки такой прокладки у вас возникнуть не должно.
• Итак, обрабатываем специальным чистящим средством нашу дроссельную заслонку, не касаясь при этом внутри её частей.

• И сразу же видим, какая грязь стекает с неё в подставленную для этого посудину. Используем мы средство для чистки карбюраторов.
• Струя из баллончика достаёт везде, поэтому и нет необходимости что-то поправлять руками.

• Преимущество этого средства в том, что оно практически сразу после обработки поверхности высыхает.
• Поэтому ничего протирать в последствии не нужно.
• Можно минуты две-три подождать после обработки, пока вся грязь откиснет. И затем снова всё смыть повторной обработкой.
• В крайнем случае, если есть острая необходимость можно ватными палочками протереть отдельные места внутри дросселя.

• При этом нужно соблюдать осторожность, чтобы не нарушить во время чистки положение самой заслонки дросселя Равон Джентра.
• По завершению чистки дросселя можно ветошью протереть его посадочное место перед установкой на место.

• Затем эту же поверхность прилегания слегка смазываем машинным маслом.

• Дело в том, что прокладка дросселя немного и загнулась из-за того, что при установке посадочная поверхность дросселя не была обработана маслом.
• Это очевидно.
• И после этого устанавливаем дроссельную заслонку обратно на своё место.

• При этом заводим её немного слева на правую сторону и совмещаем отверстия.
• Дальше вставляем и наживляем болты крепления дросселя по диагонали.

• После этого притягиваем немного эти болты и вставляем два других по диагонали.
• И теперь затягиваем до упора все четыре болта, но при этом закручиваем чувствительно, чтобы не переусердствовать.

• Затем ставим на место гофру воздушного фильтра.

• Сначала одеваем нижний конец, затем совмещаем верхний и после этого затягиваем хомуты.

• Дальше устанавливаем фишку питания дроссельного узла.

• Просто одеваем его до щелчка и затем задвигаем на место красный флажок.
• После этого одеваем в обратном порядке трубочки, которые мы снимали в начале и подсоединяем трубку вентиляции картера ещё и на крышке клапанов.
• Дальше одеваем клемму на аккумуляторе и пробуем запускать двигатель.
• Как и ожидалось, силовой агрегат запустился сходу и работает нормально.

• А это значит, что свою работу мы выполнили качественно и собрали всё правильно.
• Вот собственно и вся процедура.
• Поэтому наш рассказ о самостоятельной чистке дроссельной заслонки Равон Джентра и ряда похожих автомобилей на этом окончен.

Target Node — обзор

4.3 Условные случайные поля

Традиционные BN и MN являются генеративными моделями. Они фиксируют совместную раздачу. Также возможно построить MN для кодирования условного совместного распределения. Модель, отражающая условное совместное распределение, на самом деле более полезна для многих задач классификации и регрессии. Кроме того, традиционные модели MRF с наблюдением за меткой предполагают локальную гладкость метки независимо от наблюдаемых значений.Кроме того, они предполагают, что каждый узел метки связывает только свое собственное наблюдение, и, следовательно, наблюдения для разных узлов метки не зависят друг от друга с учетом их меток. Эти предположения нереалистичны для многих реальных проблем. Чтобы преодолеть ограничения, связанные с MRF, была введена модель условного случайного поля (CRF) [27]. В качестве дискриминативной модели CRF непосредственно моделирует апостериорное распределение вероятностей целевых переменных X с учетом их наблюдений Y .CRF, следовательно, кодирует p (X | Y) вместо их совместной вероятности, как в MRF. На рис. 4.7A приведен пример модели CRF.

Рисунок 4.7. (A) Пример модели CRF и (B) аналогичная метка-наблюдение MN.

По сравнению с меткой-наблюдением MN на рис. 4.7B, целевые узлы X CRF обусловлены всеми наблюдениями Y ¹ вместо индивидуального локального наблюдения Yi. В результате CRF следует локальному условному марковскому свойству. Пусть Xi и Xj — два узла в X , такие что

Xi⊥Xj | NXi, Y∀Xj∈X ∖ NXi ∖ Xi.

В нем указано, что с учетом своих соседей Xi не зависит от Xj только с учетом Y . Например, на рис. 4.7A, согласно CRF, X1 и X3 условно независимы друг от друга, только если X2 и Y . С другой стороны, для MN на рис. 4.7B, X1 и X3 условно независимы друг от друга, только при условии X2. По сравнению с марковским свойством MN, локальная условная независимость CRF более ограничена и, следовательно, слабее. Следовательно, он может фиксировать зависимости между локальными наблюдениями вместо того, чтобы предполагать их независимость, как по MRF.

Модель CRF над случайными величинами X = {X1,… XN}, обусловленная их наблюдениями Y , может быть определена следующим образом:

(4.24) p (x1, x2,…, xn | y) = 1Z (y ) ∏ (xi, xj) ∈Eψij (xi, xj | y) ∏xi∈Vϕi (xi | y),

, где Z ( y ) — статистическая сумма. Как унарная потенциальная функция ϕi (xi | y), так и попарная потенциальная функция ψij (xi, xj | y) обусловлены Y . С лог-линейной потенциальной функцией совместная вероятность может быть записана как

(4.25) p (x1, x2,…, xn | y) = 1Z (y) exp⁡ (−E (x | y)).

Для попарной модели CRF апостериорная функция энергии E (x | y) может быть определена как

E (x | y) = ∑xi∈V − αiEi (xi | y) −∑xi, xj∈EwijEij ( xi, xj | y),

где Ei (xi | y) и Eij (xi, xj | y) соответственно представляют собой условные унарную и попарную функции энергии, обе из которых обусловлены наблюдениями y .

Унарная потенциальная функция CRF представляет целевую апостериорную функцию и, следовательно, пропорциональна p (xi | y). Следовательно, унарная функция энергии пропорциональна −log⁡p (xi | y).В CV конструкция унарной потенциальной функции может быть гибкой в ​​зависимости от конкретной задачи. Он часто строится на основе выходных данных дискриминантного классификатора или регрессора. Попарная потенциальная функция представляет условную цель до p (xi, xj | y), а попарная функция энергии пропорциональна −log⁡p (xi, xj | y). В CV вместо того, чтобы обусловливать все наблюдения Y , для простоты вычислений функция попарной энергии обычно обусловлена ​​Yi и Yj, наблюдениями Xi и Xj.Более того, функция попарной энергии Eij (xi, xj | yi, yj) часто формулируется как произведение функции совместимости меток и штрафного члена. Функция совместимости меток измеряет согласованность между Xi и Xj, например, модель Поттса для дискретных узлов, тогда как штрафной член обычно является функцией ядра от различий между Yi и Yj. Такая парная функция энергии побуждает близлежащие узлы иметь одинаковые метки, обусловленные их аналогичными наблюдениями. Однако, как и функция совместимости MN, функция совместимости CRF не ограничивается локальной гладкостью.Он фиксирует предыдущие отношения по умолчанию между соседними метками, и его точное определение варьируется от задачи к задаче. В разделе 5.2.4 обсуждаются конкретные унарные и попарные энергетические функции CRF для сегментации изображения. Модели CRF часто применяются для маркировки изображений, где целевые переменные X соответствуют меткам. Маркировка изображений выполняется посредством вывода MAP, то есть

x⁎ = arg maxxp (x | y).

Хотя и CRF, и MRF с наблюдением за меткой захватывают условные распределения меток, они различаются в определении как унарных, так и попарных потенциальных функций.Для CRF унарная потенциальная функция захватывает апостериорную метку, тогда как унарная потенциальная функция для MRF наблюдения метки фиксирует вероятность метки. Более того, парная потенциальная функция для модели CRF обусловлена ​​наблюдениями метки, тогда как парная потенциальная функция для MRF наблюдений метки не зависит от наблюдений метки. Помимо преимуществ, упомянутых ранее, модели CRF требуют меньше обучающих данных, поскольку они моделируют только условное распределение X .Более того, по сравнению с моделями MN с меткой и наблюдением, они не предполагают, что Y является независимым при X , и допускают произвольные отношения между наблюдениями, что, очевидно, более естественно в действительности. С другой стороны, поскольку CRF моделирует p (X | Y), он не может получить совместное распределение вероятностей p (X, Y) или маргинальное распределение вероятностей p (X). Более того, модель CRF не может обрабатывать случаи, когда Y является неполным во время вывода. Генеративные модели не имеют этих ограничений.В таблице 4.1 приведены сходства и различия между CRF и MRF.

Таблица 4.1. Сходства и различия между CRF и MRF.

Позиции	MRF	CRF
Модели	1) модель p ( X , Y )	1) модель p ( X | Y )
	2) генеративная модель	2) дискриминационная модель
Допущения	1) X и Y следуют условию Маркова	X следует условию Маркова, учитывая Y
	2) Y независимы при данном X	2) Y зависимы
Параметризация	1) Унарный потенциал зависит только от локального наблюдения	И унарный, и парный потенциалы зависят от все (или рядом) наблюдения
	2) попарный потенциал НЕ зависит от наблюдений

(PDF) Мол. Кулярная, физико-химическая и сенсорная характеристика традиционного испанского сорта яблок «Pero de Cehegín»

Agronomy2020, 10, xFORPEERREVIEW18of20

Список литературы

1.Strasburger, E .; Noll, F.; Schenk, H.TratadodeBotánica, 7aediciónespañola; Omega, AFWSchinder‐

Ediciones: Barcelona, Испания, 1990; ISBN978‐8‐4282‐0873‐4.

2. Шевалье, ACL’originedesPoiriersetPommierssauvagesdenosforêtset lapartqu’ilsontprisedansla

формацияdesvariétéscultivées.Rev.Int.Bot.Appl.d’Agric.Trop.1953,  33, 583–585.

3. Cornille, A.; Gladieux, P.; Smulders, MJM; Roldán-Ruiz, I.; Laurens, F.; Le. Cam, B.; Нерсесян, A.; Clavel, 

J.; Olonova, M.; Feugey, L.; Etal. Apple: Secondary

ВкладEuropeanWildApple вGenomeCulctivities.PLoSGenet.2012, 8, 

e1002703, doi : 10.1371 / journal.pgen.1002703.

4. Harrison, N.; Harrison, RJ Об эволюционной истории отечественного яблока. Nat.Genet.2011 , 43, 

1043–1044, doi: 10.1038 / ng.935.

5. Reim, S.; Proft, A.; Heinz, S.; Höfer, M.Diversity oftheEuropeanindustrywildappleMalussylvestris

(L.) Mill. в «Восток» Руда «Горы» (Osterzgebirge), «Германия:« I. »Морфологическая» характеристика. «Генет»

Ресурс. doi: 10.1007 / s10722‐011‐9746 ‐ x.

6. FAOSTAT.Availableonline: http: //www.fao.org/faostat/es/#data/QC (доступ на 7July2020) .

7. MAPA.Availableonline: https: //www.mapa.gob.es/es/estadistica/temas/publicaciones/anuario‐de‐

estadistica /  ( по состоянию на 7 июля 2020 г.).

8. MAPA.Availableonline: https: //www.mapa.gob.es/es/agricultura/temas/producciones‐agricolas/frutas‐y‐

hortalizas / informacion_general.aspx (доступ on7July2020) .

9. Rivera, N.; Obón, C.; Ríos, S.; Selma, C.; Méndez, F.; Verde , A.; Cano, F.FrutosSecos, Oleaginosos, Frutales

deHueso, AlmendrosyFrutalesdePepita: LasVariedadesTradicionalesdela CuencadelríoSegura, Catálogo

EtnobotánicoI; UniversityofMurcia: Murcia, Spain, 1997; ISBN978-8‐4768‐4744-2.

10. Martínez, R.; Melgarejo, P.El «Perodecehegín»  (MalusdomesticaBorckh.). Agríc.Vergel2008, 320, 373 –377.

11. Harlan, JRGeographicPatterns ofVariation in SomeCultivationPlants.J.Hered.1975, 66, 182–191, 

doi : 10.1093 / oxfordjournals.jhered.a108610.

12. Harlan, JROurVanishingGeneticResources.Science1975, 188, 617–621, doi: 10.1126 / science.188.4188.617 .

13. Stanivuković, S.; Ujić, M.; Abić, M.; Mićić, N.; Bosancic, B.; Urić, G. Характеристика старогоApple

Сорта изBosniaand HerzegovinabyMeansPomologicalandBiochemicalAnalysis.Not.Bot.Horti 

Agrobot.Cluj ‐ Napoca2017, 45, 97–104, doi: 10.15835 / nbha45110537.

14. Mitre, I.; Mitre, V.; Ardelean, M .; Сестрас, Р .; Сестрас, А.Оценкастарыхкультур яблок, выращенных вЦентральном

Трансильвания, Румыния. Cluj ‐ Napoca2009, 37, 235–237, doi: 10.15835 / nbha3713127.

15.Dan, C.; Erban, C.; Sestraş, AF; Militaru, M.; Morariu, P.; Sestraş, REConsumerPerceptionConcerning

AppleFruit Качество, В зависимости от сортовиГедоническиймасштабоценки — ACaseStudy.Not.Sci.

Boil.2015, 7, 140–149, doi : 10.15835 / nsb719553.

16. Мартинес, R.Caracterizaciónvarietaldel «PerodeCehegín»  (MalusdomesticaBorkh) .InTrabajoFinalde 9000ra

Car ; EPSO ‐ MiguelHernandezUniversity: Orihuela, Spain, 2000.

17.Goulão, L.; Oliveira, CMМолекулярная характеристика культурных сортов яблок (Malus × domesticaBorkh.) С использованием

микросателлитов

(SSRиISSR) маркеров .Euphytica2001, 122, 81–89, doi: 10.1023 / a: 10126643.

18. Patzak, J.; Paprštein, F.; Henychová, A.; Sedlák , J.Сравнениеанализов генетического разнообразия структуры молекулярныхмаркерных данных

SSR внутри яблока (Malus × domestica) geneticresources.Genome2012, 55, 647–665, 

doi: 10.1139 / g2012-054.

19.Pérez-Romero, L.; Suárez, M.; Dapena, E.; Spain.Genet.Mol.Res.2015, 14, 1487–1501, doi: 10.4238 / 2015.feb.20.4.

20. Mažeikienė, I.; Šikšnianienė, JB ; Baniulis, D.; Gelvonauskienė, D.; Frercks, B.; Starkus, A.; Ebrauskienė, 

A.; Stanys, V.SSRanalysisbased «Немолекулярная» характеристика »зародышевой плазмы яблок в Литве.« Zemdirb.-

Agric.2019 », №106, №159–166, doi: 10.13080 / z ‐ a.2019.106.021.

21. Юн, W .; Ban, S.; Kim, G.; Kim, J.-H.; Kwon, S. .; Choi, C.Assessmentofapplecorecollectionsconstructed

usingphenotypicandgenotypicdata.Genet.Mol.Res.2015, 14, 6453 –6464, doi: 10.4238 / 2015.june.11.21.

22. Lassois, L.; Denancé, C.; Ravon, E.; Guyader, A.; Guisnel,. R.; Hibrand-Saint-Oyant, L.; Poncet, C.; Lasserre-

Zuber, P.; Feugey, L.; Durel, C.-E. Генетический «Разнообразие», «Структура» населения, «Родство», «Анализ» иPlantMol.Boil.

Rep.2016, 34, 827–844, doi: 10.1007 / s11105‐015‐0966‐7.

23. Pereira ‐ Lorenzo, S .; Urrestarazu, J.; Ramos-Cabrer, A.; Miranda, C.; Pina, A.; Dapena, E.; Moreno, M.Á.;

Errea , P.; Llamero, N.; Hernández, MBD; etal.Analysis ofgeneticdiversityand ofthe

NORTHWOODS LEAGUE 2016 GAME ОТЧЕТ АВТОРСКИЕ ПРАВА КОМПАНИИ POINTSTREAK SPORTS TECHNOLOGIES INC.ОТЧЕТ ПРЕДСТАВЛЕН 19.07.2016 01:07:49 КОРОБКА ОЦЕНКИ Дата игры: 16.07.2016 Уиллмар Стингерс 8 АТ Ватерлоо Бакс 6 С начала года с начала года Willmar AB R H BI AVG Waterloo AB R H BI AVG Вудс, Д СС 3 2 1 0.310 Миллиган, L C 5 0 1 2. 278 McAfee, Q PH, SS 2 0 0 0 .273 Weatherford, Z LF 5 0 0 0 .325 Пардо, округ Колумбия 4 0 1 3 .341 Нейстром, РФ 5 2 1 0 .311 Lambert, G 1B 5 1 2 2 .307 McGinnis, A DH 4 0 0 0 .284 Майер, Д. DH 5 0 1 1.333 Кертис, Т. 3В 4 0 0 0. 299 Toerner, J RF 3 1 0 0 .290 Benton, T 1B 1 1 0 0 .000 Эстрада, E LF 5 0 1 0 .288 Perry, D 1B, PH 1 0 0 0 .204 Беккер, L 2B 4 1 2 1 .315 Boxwell, A CF 3 1 1 1 .262 Коттам, К С 4 1 1 0.265 Рука, Дж PH 1 0 0 0. 272 Смит, Т. 3B 2 2 1 0 .423 Weiss, B SS 4 1 4 2 .250 Морроу, М 2B 2 0 1 0 .194 Сандерс, Z PH 0 1 0 0 .145 37 8 10 7 35 6 8 5 Виллмар 1 3 1 0 1 0 2 0 0 — 8 10 2 Ватерлоо 0 0 0 3 1 0 0 0 2-6 8 3 2B — Эстрада, Э. Л. Ф. (8), Смит, Т. 3В (3), Боксвелл, А. Ф. (7).3Б — Миллиган, L С (1). RBI — Пардо, D CF 3 (31), Ламберт, G 1B 2 (42), Mayer, D DH (24), Беккер, L 2B (18), ИТОГО 7 (0), Миллиган, L C 2 (15), Boxwell, A CF (12), Weiss, B SS 2 (13), ИТОГО 5 (0). HP — Toerner, J RF (11), Cottam, K С (6), Сандерс, З. PH (1).SF — Пардо, D CF (3). SH — Смит, Т 3В (0). SB — Вудс, D SS (7), Pardo, D CF 2 (16), Toerner, J RF (4). CS — Вайс, B SS 2 (3). E — Вудс, Д. СС (5), Смит, Т. 3В (5), Кертис, Т. 3Б (12), Бентон, Т. 1B (1), Морроу, M 2B (4). LOB — Willmar 12, Waterloo 6.ДП — М. Морроу (2Б) — Б. Вайс (СС) — Т. Бентон (1Б), Дж. Ламберт (1Б) — Д. Вудс (СС). C начала года на сегодняшний день IP H R ER BB SO HR ERA Willmar Гарсия, К (Ж, 3-1) 6.0 6 4 0 3 8 0 3,24 Зеленый, M (S, 3) 3,0 2 2 2 0 6 0 5,18 9 8 6 2 3 14 0 Ватерлоо Бейкер, S (L, 1-3) 1.2 4 4 3 2 2 0 2,78 Аграмонт, Д 2.2 2 2 2 3 1 0 4.58 Бойл, П 0,1 0 0 0 0 0 0 4,46 Мюльбергер, А 1,1 1 0 0 1 0 0 4,67 Спенсер, Н 1.0 3 2 2 0 0 0 4,03 Фостер, Дж 2,0 0 0 0 0 0 0 2,57 9 10 8 7 6 3 0 WP — Гарсия, К 2 (4), Бейкер, S 2 (5), Аграмонт, D 3 (4). ПБ — Миллиган, Л. НВ — Зеленая, М (3), Аграмонт, Д 2 (6).SO — Ламберт, Дж., Майер, Д., Беккер, Л., Миллиган, L 2, Weatherford, Z 5, Neustrom, R, Curtis, T 2, Benton, T, Перри, Д., Боксвелл, А., Хэнд, Дж. ББ — Макафи, К., Пардо, Д., Тёрнер, Дж., Беккер, Л., Смит, Т 2, Бентон, Т 2, Морроу, М. Б. Ф. — Гарсия, К 27 (143), Грин, М 12 (106), Бейкер, С 12 (155), Аграмонт, Д 16 (93), Бойл, П (176), Мюльбергер, A 6 (79), Спенсер, H 6 (100), Фостер, J 6 (30).P-S — Гарсия, K 99-65, Грин, М 47-35, Бейкер, С 53-34, Аграмонт, Д 60-32, Бойл, П 5-2, Muehlberger, A 21-10, Spencer, H 16-14, Foster, J 24-19. Т — 3:25. А — 2381 Вероятно, завтра: WLoo — # 29 Reichmann…. Вильмар — # 15 Хэнсон Погода: 78 градусов, ветер юго-восточный, 13 миль в час Пластинчатый судья — Джефф Хаманн, полевой судья №1 — Коул Локхарт, полевой судья №2 — Курт Аркенберг ИГРАТЬ ИГРОЙ ТОП 1-го УИЛЛМАРА СТИНГЕРС # 2 Дилан Вудс Swinging Strike, Swinging Strike, Фол, Мяч, 2 Dy Лан Вудс переходит на 1-е место (ошибка второго бас эман) # 9 Дэнни Пардо Болл, Болл, Болл, 9 Дэнни Пардо переходит на 1-е место (w alk), 2 Дилан Вудс продвигается на 2-е место (9) # 21 Грег Ламберт, Swinging Strike, Swinging Strike, 9, реклама Дэнни Пардо. прыгает на 2-ю (украденную базу), 2 наступает Дилан Вудс с на 3-е (украденная база), 21 выход Грега Ламберта (ул. вытащить качающийся) для выхода номер 1 # 44 Дэнни Майер Swinging Strike, 44 Дэнни Майер аут (5-3) за o ут номер 2 # 3 Джастин Тернер Болл, Swinging Strike, Ball, 9 Дэнни Пардо продвижение с до 3-го (дикая подача), 2 недостающих результата Дилана Вудса ed (дикий шаг), Swinging Strike, 3 Джастин Тёрнер выход (P5) для выхода № 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 1, Хитов: 0, Ошибок: 1, LOB: 1 НИЖНЯЯ ЧАСТЬ 1-Й ВАТЕРЛООБАКИ # 33 Lane Milligan Ball, Swinging Strike, Ball, Swinging Strike, 33 л Энн Миллиган вылетает из-за удара номер 1 # 28 Зак Уэзерфорд Swinging Strike, Ball, Swinging Strike, 28 Zach We Атерфордский удар бер 2 # 7 Роберт Нейстрем Болл, Размахивающий удар, Мяч, Размахивающий удар, Фол , 7 Роберт Нойстрем (вылет на левое поле) за номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 0, LOB: 0 ТОП 2-ГО СТИНГЕРОВ УИЛЛМАРА # 17 Эдди Эстрада Качающийся удар, Мяч, Мяч, Качающийся Удар, Мяч , Фол, 17 Аут Эдди Эстрады (вылет влево f ield) за номер 1 # 8 Люк Беккер Swinging Strike, Swinging Strike, Ball, 8 Люк Бек ker putout (вычеркнуть) за номер 2 # 42 Kole Cottam Swinging Strike, Качающийся удар, мяч, 42 Kole Co ттам переходит на 1-е место (сингл) # 1 Тайлер Смит Качающийся удар, Качающийся удар, Мяч, Мяч, Мяч , Фол, 1 Тайлер Смит переходит на 1-е место (ходьба), 42 км. оле Коттам переходит на 2-е место (1) # 2 Дилан Вудс Swinging Strike, 2 Дилан Вудс продвигается на 1-е место (si ngle), 1 Тайлер Смит переходит на 2-е место (2), 42 Коле Коттам переходит на 3-е место (2) # 9 Дэнни Пардо: мяч, мяч, размахивающий удар, размахивающий удар, фол , Фол, 9 Дэнни Пардо переходит на 1-е место (одиночный), 2 Дилан Вудс переходит на 2-е место (9), 1-е место — Тайлер Смит. выигравшие до 3-го места (9), заработано 42 балла по Kole Cottam (9) # 21 Грег Ламберт Swinging Strike, Ball, 21 Грег Ламберт продвигается к 1-й (сингл), 9 Дэнни Пардо переходит на 2-й (21), Заработано 2 очка Дилана Вудса (21), 1 Тайлер Смит S Заработано ядер (21) Подача Замена 31 Даниэль Аграмонт заменил Стивена Бейкера Питчера.# 44 Дэнни Майер 44 Дэнни Майер продвигается на 1-е место (по выбору полевого игрока), 21 Грег Ламберт выбыл (6-4) за третий номер РЕЗЮМЕ Выполнений: 3, Хитов: 4, Ошибок: 0, LOB: 2 НИЖНЯЯ ЧАСТЬ 2-Й ВАТЕРЛООБАКИ # 5 Adam McGinnis Ball, Ball, Swinging Strike, Ball, 5 Адам МакГиннис вывод (вылет в центр поля) для выхода номер 1 # 1 Тайлер Кертис Swinging Strike, Swinging Strike, Фол, Мяч, 1 Тай ler Curtis putout (L9) для выхода номер 2 # 32 Travon Benton Качающийся удар, мяч, мяч, размахивающий удар, мяч , Фол, 32 Травон Бентон переходит на 1-е место (ходьба) # 18 Алекс Боксвелл 18 Алекс Боксвелл (вылетает на правое поле) для номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 0, LOB: 1 ТОП ИЗ 3 СТИНГЕРОВ УИЛЛМАРА # 3 Джастин Тернер Болл, Ball, Ball, Swinging Strike, 3 Justin Toerne r переходит на 1-е место (ходьба) # 17 Эдди Эстрада Размахивая ударом, мячом, 3 продвижение Джастина Тёрнера o 2-й (дикая подача), Ball, Swinging Strike, 17 Eddi e Эстрада переходит на 1-е место (ошибка третьей базы мужчина), 3 Джастин Тёрнер продвигается на 3-е место (17) # 8 Люк Беккер Размахивая ударом, мячом, мячом, 8 заранее Люк Беккер с до 1-го (сингл), 17 Эдди Эстрада переходит на 2n d (8), Заработано 3 очка Джастина Тёрнера (8) # 42 Kole Cottam Swinging Strike, 42 Kole Cottam putout (вылет в правое поле) для выхода номер 1 # 1 Тайлер Смит Болл, Болл, 8 Люк Беккер переходит на 2-е место (дикий пи tch), 17 Эдди Эстрада переходит на 3-е место (дикая подача ), Мяч, Размахивающий удар, Размахивающий удар, Фол, 1 Тайлер Смит переходит на 1-е место (ходьба) # 2 Болл Дилана Вудса, Качающийся удар, Размахивающий удар, Мяч, 2 Dy Лан Вудс переходит на 1-е место (по выбору полевого игрока), 1 Тай Лер Смит переходит на 2-е место, 8-е место. Люк Беккер. ces до 3-го (2), 17 вынос Эдди Эстрады (1-2) для номер 2 # 9 Дэнни Пардо Swinging Strike, 9 Дэнни Пардо продвигается на 1-е место (fi выбор старшего), 2 раздачи Дилана Вудса (4-6) для нас т номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 1, Хитов: 1, Ошибок: 1, LOB: 3 НИЖНЯЯ ЧАСТЬ ТРЕТЬИХ ВАТЕРЛИНГОВ # 23 Brody Weiss 23 Brody Weiss продвигается на 1-е место (сингл) # 21 Мэтт Морроу Болл, 21 Мэтт Морроу переходит на 1-е место (сингл), 23 Броуди Вайс переходит на 2-е место (21) # 33 Lane Milligan Ball, Ball, Swinging Strike, 23 Brody Weiss ADVANC. es на 3-е место (33), поражение на 33 Lane Milligan (3 Dp) за номер 1, 21 выход Мэтта Морроу (3-6 DP) за номер 2 # 28 Зак Уэтерфорд Болл, Swinging Strike, Swinging Strike, 28 Zach We Атерфордский удар бер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, Хитов: 2, Ошибок: 0, LOB: 1 ТОП 4-ГО УИЛЛМАРА СТИНГЕРС # 21 Грег Ламберт Болл, 21 результат Грега Ламберта (5-3) за наш номер 1 # 44 Дэнни Майер Swinging Strike, Swinging Strike, Фол, Фол, 44 D Энни Майер выходит из-под контроля мбер 2 # 3 Джастин Тёрнер Болл, Болл, 3 Джастин Тёрнер продвигается на 1-е место (удар по высоте) # 17 Эдди Эстрада Размахивая ударом, мячом, 3 продвижение Джастина Тёрнера o 2-е место (украденная база), 17 выпусков Эдди Эстрады (3U) за номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 0, LOB: 1 НИЖНЯЯ ЧАСТЬ 4-Й ВАТЕРЛООБАКИ # 7 Роберт Нейстрем Swinging Strike, Ball, Swinging Strike, 7 Роберт Н. Евстром переходит на 1-е место (ошибка шорт-стопа) # 5 Адам МакГиннис Swinging Strike, 5 Адам МакГиннис выводит o правое поле) для номера выхода 1 # 1 Тайлер Кертис Swinging Strike, Swinging Strike, 1 Тайлер Кертис стр. utout (размахивая ударами) для выхода номер 2 # 32 Travon Benton Ball, размахивающий удар, мяч, мяч, 32 Travon Bento n продвигается к 1-му шагу, 7 Роберт Нойстром продвигается вперед. es на 2-й (32) # 18 Алекс Боксвелл 18 Алекс Боксвелл продвигается на 2-е место (дабл), 32 Траво n Бентон продвигается на 3-е место (18), 7-е место Роберт Нейстром (S) ядра Незаработанные (18) # 23 Броуди Вайс Swinging Strike, Swinging Strike, 23 Brody Weiss a dvances to 1st (single), 23 авансы Brody Weiss t o 2-е место (ОТ), 32 Незаслуженные очки Травона Бентона (23), 18 незаслуженных очков Алекса Боксвелла (23) # 21 Мэтт Морроу Ball, Ball, Swinging Strike, Ball, 21 Мэтт Морроу переходит к 1-му (прогулка), 23 Броуди Вайс переходит к 3-й (дикая подача) # 33 Лейн Миллиган Swinging Strike, Swinging Strike, 33 Lane Milligan аут №3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 3, Хитов: 2, Ошибок: 1, LOB: 2 ТОП 5-ГО УИЛЛМАРА СТИНГЕРС # 8 Люк Беккер Болл, Swinging Strike, Swinging Strike, Ball, 8 Lu Ке Беккер продвигается на 1-е место (сингл) # 42 Kole Cottam Swinging Strike, Ball, Ball, 42 Kole Cottam advanc es на 1-й (удар по высоте), 8 Люк Беккер продвигается вперед t o 2-й (42) # 1 Тайлер Смит, 42 Коле Коттам переходит на 2 (1), 8 место Люк Беккер продвигается на 3-е место (1), 1 поражение Тайлера Смита (1-4 SH) за номер 1 Нападение Замена 13 Куинси Макафи заменяет Дилана Вудса.# 13 Куинси Макафи: мяч, мяч, мяч, размахивающий удар, размахивающий удар , 13 Куинси Макафи переходит на 1-е место (ходьба) Питчинг Замена 17 Патрик Бойл заменяет Даниэля Аграмона Питчера. # 9 Дэнни Пардо Swinging Strike, Ball, Ball, Ball, 9 Дэнни Пардо a переходы на 1-е место (выбор полевого игрока), 42 Kole Cottam переходит на 3-е место (9), заработано 8 очков Люка Беккера ( 9), 13 аутов Куинси Макафи (4-6) за номер 2 Подача Замена 39 Эндрю Мюльбергер заменяет Патрика Бойла Питча э.# 21 Грег Ламберт Болл, 9 Дэнни Пардо переходит на 2-е место (украденная база), Swinging Strike, 21 аут Грега Ламберта (5-3) за из числа 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 1, Хитов: 1, Ошибок: 0, LOB: 2 ДНО 5-ГО ЯЧЕЙКА В защите Замена 13 Куинси Макафи переходит на Шортстоп.# 28 Зак Уэзерфорд Swinging Strike, Swinging Strike, 28 Зак Уэтерф ord putout (вычеркнуть, раскачиваясь) для аута номер 1 # 7 Роберт Нейстрем Болл, Swinging Strike, 7 Роберт Нейстрем продвигается до 1-го (одиночный) # 5 Адам МакГиннис 5 Адам МакГиннис оглушает (вылет в центр поля) f или из числа 2 # 1 Тайлер Кертис Swinging Strike, Ball, 7 продвижений Роберта Нейстрома до 2-го (дикая подача), Swing Strike, Ball, Ball, Фол, 1. Тайлер Кертис переходит на 1-е место (ошибка команды третий человек с низов), 7 незаработанных очков Роберта Нейстрома (1) # 32 Travon Benton Swinging Strike, Качающийся удар, Мяч, Мяч, 32 T Равон Бентон, вычеркнув, размахиваясь за аут номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 1, Хитов: 1, Ошибок: 1, LOB: 1 ТОП-6 УИЛЛМАР СТИНГЕРС # 44 Дэнни Майер Болл, Болл, 44 Дэнни Майер забил (P3) за их количество бер 1 # 3 Джастин Тёрнер Болл, Swinging Strike, 3 Джастин Тёрнер выводит из игры (4- 3) для выхода номер 2 # 17 Эдди Эстрада Swinging Strike, Swinging Strike, Ball, Ball, 17 E дди Эстрада переходит на 2-е место (дубль) # 8 Люк Беккер Болл, Болл, Болл, 8 Люк Беккер продвигается на 1-е место (i намеренная прогулка) # 42 Kole Cottam Swinging Strike, Ball, 42 Kole Cottam putout (летать в центр поля) для выхода номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 1, ошибок: 0, LOB: 2 ДНО 6-Й ВАТЕРЛООБАКИ # 18 Алекс Боксвелл, Swinging Strike, Swinging Strike, 18 Alex Boxwell аут №1 # 23 Броуди Вайс Swinging Strike, Swinging Strike, 23 Brody Weiss a танцы до 1-го (одиночный) # 21 Мэтт Морроу Болл, Swinging Strike, Болл, 23 Броуди Вайс на поражение (поймали на краже: CS 2-6) за номер 2, 21 Ma tt Morrow outout (P4) для выхода номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 1, ошибок: 0, LOB: 0 ТОП 7-ГО УИЛМАР СТИНГЕРС Питчинг Замена 10 запасных частей Хантера Спенсера на Эндрю Мюлбергер Питк ее.# 1 Тайлер Смит Swinging Strike, 1 Тайлер Смит переходит на 2-е место (делать убле) # 13 Куинси Макафи Болл, Качающийся удар, Размахивающий удар, Фол, 1 Тай Лер Смит переходит на 3-е место (13), 13-е место Куинси Макафи п. utout (4-3) для выхода номер 1 # 9 Дэнни Пардо Swinging Strike, заработано 1 очков Тайлера Смита (9), 9.Дэнни Пардо переигрывает (жертвуйте полетом в центр поля) der) за номер 2 # 21 Грег Ламберт 21 Грег Ламберт продвигается на 1-е место (сингл) # 44 Дэнни Майер Болл, 21 Грег Ламберт переходит на 2-е место (пас), Swinging Strike, Swinging Strike, Фол, 44 Дэнни Майер переходит на 1-е место (сингл), 44 Дэнни Майер аванс до 2-го места (ОТ), заработано 21 очко Грега Ламберта ( 44) # 3 Джастин Тёрнер 3 Джастин Тёрнер выдаёт (4-3) за номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 2, Хитов: 3, Ошибок: 0, LOB: 1 ДНО 7-Й ВАТЕРЛООБАКИ Подача Замена 11 замен Макс Грин на Кико Гарсиа Питчер.# 33 Лейн Миллиган 33 Лейн Миллиган поражение (1-3) для аута №1 # 28 Зак Уэтерфорд Болл, Размахивающий удар, Размахивающий удар, Фол, 28 Z ач Уэтерфорд оглушительный удар (размахивая ударом) на о ут номер 2 # 7 Роберт Нейстрем Размахивающий удар, Мяч, Размахивающий удар, Фол, Фол , 7 Роберт Нойстрем оглушает (вычеркивает, размахивая) f или из числа 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 0, LOB: 0 ТОП 8-ГО УИЛМАР СТИНГЕРС Подача Замена 16 замен Джейсона Фостера на Хантера Спенсера Питчера.# 17 Эдди Эстрада Swinging Strike, Ball, 17 Эдди Эстрада вывод (3- 1) для выхода номер 1 # 8 Люк Беккер Swinging Strike, 8 Люк Беккер переходит на 1-е место (э. рор первой базы) # 42 Kole Cottam Swinging Strike, Ball, 8 выход Люка Беккера (6-4) за аут № 2, 42 аута Kole Cottam (6-4-3 DP) за номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 1, LOB: 0 НИЖНЯЯ ЧАСТЬ ВАТЕРЛООБАКИ # 5 Адам МакГиннис Swinging Strike, 5 аутов Адама МакГинниса (5-3) за номер 1 # 1 Тайлер Кертис Болл, Мяч, Размахивающий удар, Размахивающий удар, Фол , Фол, 1 поражение Тайлера Кертиса (удар замахивается ) для выхода номер 2 Нападение Замена 6 Дэниел Перри заменил Травона Бентона.# 6 Дэниэл Перри Болл, Swinging Strike, Swinging Strike, 6 Daniel P erry putout (размахивая ударами) для выхода номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 0, LOB: 0 ТОП 9-ГО УИЛЛМАРА СТИНГЕРС # 1 Тайлер Смит Размахивающий удар, Размахивающий удар, Фол, Мяч, Мяч , 1 выход Тайлера Смита (вылет влево) за номер 1 # 13 Куинси Макафи, Swinging Strike, Swinging Strike, Ball, 13 Quincy Положительный результат McAfee (4-3) за номер 2 # 9 Дэнни Пардо Размахивающий удар, Размахивающий удар, Фол, Фол, Фол В защите Замена 6 Дэниэл Перри переходит на первую базу.# 9 Дэнни Пардо 9 поражение Дэнни Пардо (6-3) за выход номер 3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 0, совпадений: 0, ошибок: 0, LOB: 0 ДНО 9-ОЙ ВАТЕРЛООБАКИ Нападение Замена 12 замен на Джейка Хэнда на Алекса Боксвелла.# 12 Jake Hand Swinging Strike, Swinging Strike, 12 Jake Hand put аут (выпал 3-й страйк: KS 2) для аута номер 1 # 23 Броуди Вайс Болл, Swinging Strike, 23 Броди Вайс продвигается к 1-й (одиночный) Нападение Замена 8 Зак Сандерс заменил Мэтта Морроу.# 8 Зак Сандерс Swinging Strike, Качающийся удар, Ball, Ball, 8 Za c Сандерс продвигается на 1-е место (поражено подачей), 23 Броуди Вайс переходит на 2-е место (8) # 33 Лейн Миллиган Swinging Strike, Ball, 33 Лейн Миллиган продвигается вперед o 3-е место (тройное), заработано 23 очка Броуди Вайса (33), Заработано 8 очков Зака ​​Сандерса (33) # 28 Зак Уэзерфорд Болл, Swinging Strike, Swinging Strike, Ball, 28 Z ач Уэтерфорд оглушительный удар (размахивая ударом) на о ут номер 2 # 7 Роберт Нейстрем Swinging Strike, Swinging Strike, 7 Роберт Нейстро м выкладки (P1) для выхода №3 РЕЗЮМЕ Выполнений: 2, Хитов: 2, Ошибок: 0, LOB: 1

Эффективное генерирование двуаллельного нокаута P53 миниатюрных свиней Diannan с помощью TALEN и переноса ядра соматических клеток

J Transl Med.2017; 15: 224.

, ^{# 1, 2} , ^{# 1} , ^{1, 2} , ¹ , ^{1, 2} , ^{1, 3} , ^{1, 3} , ^{1, 2} , ^{1, 2} , ² , ^{1, 2} , ¹ и ^{1, 2, 3}

Youfeng Shen

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнань Сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

Kaixiang Xu

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

Zaimei Yuan

¹ State K Лаборатория сохранения и использования биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

Цзяньсюн Гуо

¹ Государство Ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

Хэн Чжао

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

Сюэцзэн Чжан

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

³ Кормление ключевых лабораторных животных и d Корм ​​провинции Юньнань, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

Лу Чжао

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

³ Ключевые лаборатории по питанию и кормлению животных провинции Юньнань, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

Юбо Цин

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

Honghui Li

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет Versity, Куньмин, Китай

Weirong Pan

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

Baoyu Jia

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани , Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

Хун-Е Чжао

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

Hong-Jiang Wei

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² College зоотехники и технологии, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

^{3 90 018 Основная лаборатория по питанию и кормлению животных провинции Юньнань, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай}

¹ Государственная ключевая лаборатория по сохранению и использованию биоресурсов в Юньнани, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

² Колледж зоотехники и технологий, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай

³ Ключевые лаборатории по питанию и кормлению животных провинции Юньнань, Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, 650201 Китай

Автор, отвечающий за переписку.

^№ Внесено поровну.

Поступило 28.04.2017 г .; Принято 27 октября 2017 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии вы должным образом указываете первоначального автора (авторов) и источник, предоставляете ссылку на лицензию Creative Commons и указываете, были ли внесены изменения.Отказ Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) распространяется на данные, представленные в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

Предпосылки

Свиньи обладают многими особенностями, которые делают их привлекательными в качестве биомедицинских моделей для различных заболеваний, включая рак. Р53 является важным геном-супрессором опухолей, который играет центральную роль в защите клеток от онкогенной трансформации и мутирует при большом количестве раковых заболеваний человека.Мутации P53 встречаются почти во всех типах опухолей и более чем в 50% всех опухолей. В недавней публикации были получены свиньи с мутированным геном P53, что привело к лимфоме, почечным и остеогенным опухолям. Однако примерно 80% опухолей человека имеют дисфункциональный P53. Модель свиньи с дефицитом P53 все еще требуется для выяснения.

Методы

Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), были сконструированы для нацеливания на экзон 4 свиного P53. Нацеленную активность оценивали с использованием анализа рекомбинации люциферазы SSA.Линии клеток с двуаллельным нокаутом (КО) P53 были созданы из одноклеточных колоний фетальных фибробластов, полученных от миниатюрных свиней Diannan , с последующей электропорацией с плазмидами TALENs. Одна клеточная линия была выбрана в качестве линии донорских клеток для переноса ядра соматических клеток (SCNT) для получения свиней P53 KO. Были получены мертворожденные плоды P53 KO и живые поросята. Генное типирование собранных клонированных особей было выполнено с помощью анализа T7EI и секвенирования. Клетки фибробластов Diannan миниатюрных поросят с двуаллельным нокаутом Р53 или дикого типа анализировали на реакцию Р53 на обработку доксорубицином с помощью конфокальной микроскопии и вестерн-блоттинга.

Результаты

Анализ рекомбинации люциферазы SSA показал, что целевые активности сконструированных TALEN были в 55,35 раза выше, чем у контроля. Восемь клеточных линий (8/19) были мутированы по Р53, и пять из них были двуаллельными нокаутами. Одна из линий двуаллельных клеток с нокаутом была выбрана в качестве ядерных донорных клеток для SCNT. Клонированные эмбрионы были перенесены в пять свинок-реципиентов, три из которых забеременели. Пять живых плодов были получены от одной суррогатной матери путем кесарева сечения через 38 дней беременности для генотипирования.Наконец, шесть живых поросят и один мертворожденный поросенок были взяты у двух реципиентов путем кесарева сечения. Анализ секвенирования целевого сайта подтвердил двуаллельный нокаут Р53 у всех плодов и поросят в соответствии с генотипом донорских клеток. Анализ кПЦР показал, что экспрессия мРНК Р53 значительно снизилась в различных тканях поросят с нокаутом. Кроме того, конфокальная микроскопия и вестерн-блоттинг показали, что клетки фибробластов миниатюрных поросят Diannan с двуаллельным нокаутом P53 были дефектными в опосредовании повреждения ДНК при инкубации с доксорубицином.

Заключение

TALEN в сочетании с SCNT были успешно использованы для получения миниатюрных свиней P53 KO Diannan . Хотя эти генно-инженерные миниатюрные свиньи Diannan не имели онкогенных признаков, ген P53 был дисфункциональным. Мы уверены, что эти свиньи предоставят новые мощные ресурсы для доклинической онкологии и фундаментальных исследований рака.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (10.1186 / s12967-017-1327-0) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: P53, TALEN, SCNT, Diannan миниатюрная свинья

Предпосылки

Ключевой ген супрессора опухоли P53 играет важную роль в широком спектре клеточных процессов, включая апоптоз, остановку клеточного цикла, старение, энергию метаболизм и антиоксидантная защита [1]. Эти стрессовые сигналы стимулируют активацию белка P53, которая в значительной степени опосредуется активностью P53 в регуляции транскрипции его генов-мишеней [2–4]. Также описаны не зависящие от трансактивации активности P53, от репрессии транскрипции до цитоплазматических и митохондриальных функций [5, 6].Р53 — наиболее часто инактивированный ген при спорадических раковых заболеваниях человека [7]. Было подсчитано, что примерно 80% опухолей человека имеют дисфункциональный P53. Мутации Р53 встречаются почти в каждом типе опухолей и более чем в 50% всех опухолей [8]. Мутации Р53 зародышевой линии у человека вызывают синдром Ли-Фраумени — семейное заболевание, характеризующееся ранним началом различных опухолей [9, 10]. Более того, ген Р53 соматически мутирован или удален в большом количестве раковых опухолей человека, что указывает на то, что этот опухолевый супрессор играет защитную роль против онкогенной трансформации во многих тканях [11].

Многие модификации P53 были созданы у мышей, включая нокаутные и индуцибельные мутации онкогенной активации [12]. Хотя генно-инженерные мышиные модели внесли значительный вклад в биологию рака [13], они по-прежнему имеют значительные ограничения в их полезности для моделирования рака человека из-за различий в биологии человека и мыши [14, 15]. Поскольку физиология, анатомия, патология, организация генома, масса тела и продолжительность жизни свиней и миниатюрных свиней больше похожи на таковые у людей, свинья представляет собой отличную биомедицинскую модель по сравнению с грызунами для конкретных заболеваний человека, включая рак [16, 17].Недавно ген P53 свиньи был мутирован путем введения миссенс-мутаций через rAAV, и были получены свиньи с лимфомой, почечными и остеогенными опухолями [18, 19]. Тем не менее, модель свиней с дефицитом P53 все еще требуется для выяснения.

Эффективность нацеливания на гены традиционной технологии гомологичной рекомбинации ДНК (HR) чрезвычайно низка [20]. Во многих случаях необходимы дополнительные этапы клонирования или разведения для получения двуаллельных мутантных животных из-за Cre или связанных с вирусом векторов, обычно индуцирующих однонитевые мутации ДНК [19, 21].Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), обеспечивают высокоэффективные и точные средства для нацеливания на гены путем введения двухцепочечных разрывов (DSB) в заранее выбранные сайты [22-24]. TALENs имеет большие перспективы для создания генно-инженерных свиней [22, 25, 26]. Недавно мы создали миниатюрных свиней с нокаутом GGTA1 Diannan и маленьких хвостов ханьских овец с нокаутом MSTN путем комбинирования TALEN с SCNT [27, 28].

В этом исследовании мы создали генетически модифицированных миниатюрных свиней Diannan путем редактирования генов в соматических клетках миниатюрных свиней Diannan с использованием технологии TALEN с последующей SCNT для получения миниатюрных свиней P53 KO Diannan .Также была проведена фенотипическая характеристика мутировавших свиней. Эти генно-инженерные миниатюрные свиньи Diannan станут мощным новым ресурсом для доклинической онкологии и фундаментальных исследований рака.

Методы

Химические вещества

Если не указано иное, все химические вещества были приобретены у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США).

Разработка и создание TALEN

TALEN, нацеленные на экзон 4 гена P53 свиньи (ID ансамбля: ENSSSCG00000017950), были разработаны и собраны компанией ViewSolid Biotech (Пекин, Китай).Последовательности распознавания TALENs P53 были следующими: левый TALEN 5′-TCTGGAACAGCCAAGT-3 ‘и правый TALEN 5′-CCCTCAAGGCCACTGAC-3’. Кодирующую область TALEN с ForkI клонировали в векторы pCAG. Эффективность нацеливания векторов TALEN in vitro оценивалась с помощью анализа рекомбинации люциферазным однонитевым отжигом (SSA), как описано ранее [28].

Культура клеток, трансфекция и отбор

Фетальные фибробласты свиньи (PFF) получали, как описано ранее [29]. Перед трансфекцией PFF размораживали и культивировали в среде (10% FBS и 1% PS) до достижения субконфлюэнтности.Приблизительно 7 × 10 ⁵ PFF в 700 мкл PBS, смешанных с 10,5 мкг пар плазмид TALEN, трансфицировали электропорацией при 250 В в течение одного 20-миллисекундного импульса (Gene Pulser Xcell Microbial System, Bio-Rad, США) в Кювета с зазором 4 мм. Затем клетки засевали в 5 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% FBS, в культуральную колбу T25 после 48-часовой инкубации при 37 ° C. Затем клетки обрабатывали трипсином и использовали метод чрезвычайно разбавленного культивирования для культивирования клеток и получения колоний единичных клеток.Через 12–14 дней колонии оценивали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (верхний праймер, 5′-ACTGCTCTCTGCCCTTGTCTT-3 ‘; нижний праймер, 5′-AGAGTGTGATGGGAAGGATGAG-3’), и амплифицированные фрагменты использовали для генотипирования, включая анализ эндонуклеаз рестрикции и секвенирование. Наконец, мы выбрали положительные клеточные линии фибробластов с двуаллельным KO в качестве ядерных доноров для SCNT.

Созревание ооцитов in vitro

Сбор и культивирование ооцитов выполняли, как описано ранее [29].

SCNT и генерация P53 KO плодов и поросят

Перенос ядра соматических клеток (SCNT) выполняли, как описано ранее [29]. Фибробласты с двуаллельным нокаутом Р53 (донорские клетки) культивировали до субконфлюэнтности перед переносом ядра и затем вводили в перивителлиновое пространство энуклеированного ооцита. Мембрана донорской клетки должна контактировать с цитоплазматической мембраной ооцита. Затем комплексы цитоплазма ооцита-клетка были слиты и активированы электрическими импульсами. Нормальные стадии дробления и бластоцисты ооцитов регистрировали через 2 и 7 дней культивирования соответственно.Количество клеток бластоцисты подсчитывали под микроскопом в ультрафиолетовом свете после фиксации и окрашивания Hoechst 33342. Реконструированные эмбрионы, культивированные в течение 14 или 16 часов, хирургическим путем переносили в пять помесных свинок-реципиентов (большие белые / ландрас дюрок) на следующий день после наблюдаемой течки. Одна беременность была доставлена ​​путем кесарева сечения на 38-й день беременности для определения клеточных линий фибробластов плода и генотипирования. Беременность была подтверждена примерно через 23 дня после хирургического переноса с помощью ультразвукового сканера (HS-101V, Honda Electronics Co., Ltd., Ямадзука, Япония). Плоды и поросята были восстановлены с помощью кесарева сечения на разных стадиях развития. Роды были выполнены путем кесарева сечения на 111 или 112 день беременности. Diannan миниатюрных свиней того же возраста, произведенных путем нормального полового размножения, использовали в качестве контроля.

Обнаружение генных мутаций

Геномную ДНК каждой клеточной колонии, тканей плода и уха каждого новорожденного клонированного поросенка экстрагировали с помощью набора геномной ДНК TIANamp (Tiangen, Пекин, Китай).Мутации в P53 оценивали с помощью ПЦР с последующим расщеплением эндонуклеазой I Т7 (T7EI). Праймеры для генотипирования для P53 были следующими: восходящий праймер 5′-ACTGCTCTCTGCCCTTGTCTT-3 ‘и нижестоящий праймер 5′-AGAGTGTGATGGGAAGGATGAG-3’. Вкратце, чтобы идентифицировать нокаут последовательности TALEN, продукты ПЦР 19 клеточных колоний были расщеплены T7EI. Положительная последовательность, которая не была расщеплена, была очищена с использованием набора для экстракции геля для подготовки к клонированию с использованием рекомбинированной плазмиды с плазмидным вектором PMD18-T (Takara), который был секвенирован для определения точных мутантных последовательностей (Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай). Мутации ДНК идентифицировали путем выравнивания последовательности между секвенированным аллелем и аллелем дикого типа (WT). Частоты мутаций рассчитывали, как описано ранее [23]. Колонии клеток, несущие мутации, криоконсервировали для SCNT.

Выделение РНК и КПЦР

Различные ткани, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки, мышцы и мозг, были получены от поросят P53 KO и WT, немедленно заморожены в жидком азоте и хранились при -80 ° C до использования.Общую РНК тканей и культивированных клеток, обработанных 100 мкМ DOX и без него в течение 24 часов, выделяли с использованием TRIzol (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК синтезировали из тотальной РНК с использованием набора Super RT Kit (TakaRa, Далянь, Китай). Полученную кДНК использовали в качестве матрицы в q-PCR на основе SYRB green (CFX-96, Bio-Rad, США). Последовательности праймеров можно найти в Дополнительном файле 1: Таблица S1. Уровни экспрессии мРНК P53 оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции (q-PCR).GAPDH использовался для нормализации.

Экстракция белка и иммуноблоттинг

FFC культивировали при плотности 1 × 10 ⁶ / лунку в 10-сантиметровом планшете и обрабатывали DOX (100 мкмоль / л) или без него в течение 24 часов. Клетки собирали и лизировали в буфере для лизиса RIPA (Beyotime, Китай) с ингибиторами протеаз при 4 ° C. После лизиса супернатанты получали центрифугированием при 14000 × g в течение 15 мин при 4 ° C. Белки (50 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE. После электрофореза белки переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) и реагировали с первичными антителами против P53 (Imaxgen), P21 (Eptomics) и GAPDH (Sigma).После инкубации мембраны промывали и инкубировали с антикроличьими вторичными антителами (R&D, США). Мембраны были разработаны с использованием системы обнаружения ECL (Easysee Western Blot Kit, Китай) и визуализированы с помощью системы визуализации (Bio-Rad, Universal Hood II, США).

Конфокальная флуоресцентная микроскопия

Клетки фибробластов поросят P53 KO и WT (7,5 × 10 ⁴ ), культивированные в среде со 100 мкМ DOX или без него в течение 24 ч, фиксировали в 4% (мас. / Об.) Параформальдегиде в течение ночи при 4 ° C и проницаемость 0.05% Triton X-100 в течение 30 мин. Затем клетки инкубировали с антителом против P53 при 4 ° C в течение ночи. После трехкратной промывки PBS клетки инкубировали с 400-кратно разведенными Alexa Fluor 488 антимышиными IgG (Thermo Fisher). Ядра инкубированных клеток окрашивали 5 мкг / мл Hoechst 33342, и клетки наблюдали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии (FV1000, Olympus Corporation).

Статистический анализ

Все значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение, и они были статистически проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA).* p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с контролем считались статистически значимыми.

Результаты

Конструирование TALEN, нацеленных на ген P53, и подтверждение активности

Пар TALEN, нацеленных на экзон 4 свиного P53, были синтезированы коммерчески; конструкции представлены на рис. а, б. Активность подтверждена с помощью анализа рекомбинации люциферазы SSA. Люциферазная активность пары TALEN target-P53 увеличивалась 55.В 35 раз по сравнению с активностью контроля (рис. C), что указывает на то, что пары TALEN были способны распознавать свои последовательности ДНК-мишени. Таким образом, пара плазмид TALEN, которая распознала экзон 4 P53, была использована для создания нацеленных на ген Diannan миниатюрных фибробластных клеток плода свиньи.

ТАЛЕН дизайн и деятельность. a Схематическая диаграмма нацеливания TALEN на экзон 4 гена P53 свиньи. b Схематическая диаграмма плазмид TALEN, специфичных для гена P53. c Определение активности TALEN с помощью анализа рекомбинации люциферазы SSA. Активность люциферазы была увеличена в 55,35 раза по сравнению с контрольной активностью.

Генерация мутанта P53

Diannan клетки фибробластов миниатюрной свиньи

Плазмиды TALEN трансфицировали в клетки фибробластов миниатюрных свиней Diannan посредством электропорации. Через 2 недели культивирования с помощью анализа T7EI было получено восемь положительных колоний из 19 клеточных колоний (рис.а). Затем положительные колонии были генотипированы секвенированием, которое показало, что три были моноаллельными КО, а пять — двуаллельными КО (рис. B). Результаты показали, что эффективность нацеливания, опосредованная TALEN, составляла до 42%, а пять мутантных колоний были двуаллельными KO.

TALEN-опосредованные мутации P53 в PFF. a Идентификация линий мутантных клеток по Р53. Клеточные линии, показывающие одну полосу, указывают на аллель WT, в то время как мутировавшие аллели давали три полосы в анализе T7EI. b Последовательности линий мутантных клеток по Р53.Последовательность WT показана выше. Идентифицированы делеционные и точечные мутации (обозначаемые «Δ» и «p» с количеством пар оснований)

Генерация плодов и поросят с нокаутом P53

Одна гомозиготная колония мутантных клеток (C12 #) была использована в качестве донорских клеток для SCNT . Мы произвели 2068 реконструированных эмбрионов с помощью SCNT. Частота дробления и образования бластоцист у эмбрионов составила 76,3% и 26,7% соответственно (таблица). Всего 1705 клонированных эмбрионов были перенесены пяти суррогатным матерям (таблица), и трое из них забеременели.Пять морфологически нормальных плодов (рис. А и таблица) были получены от одного реципиента через 38 дней, и их первичные фибробласты были изолированы и культивированы. Анализ секвенирования подтвердил, что пять плодов являются плодами с нокаутом Р53 в соответствии с колонией C12 # (рис. B). Шесть живых поросят и один мертвый поросенок (рис. А и таблица) были получены от двух реципиентов через 111 или 112 дней. Секвенирование ДНК показало, что все шесть живых поросят несли двуаллельные мутации в P53, а генотип соответствовал донорским клеткам, полученным из колонии C12 # (рис.б). Четыре поросенка умерли сразу после рождения, а оставшиеся два умерли примерно через 2 и 5 месяцев (таблица). Уровень экспрессии мРНК в различных тканях двуаллельного нокаута P53 и поросят WT был обнаружен, и результаты показали, что экспрессия мРНК P53 была значительно снижена по сравнению с WT, что подтвердило нарушение экспрессии P53 (рис. C).

Таблица 1

Компетенция развития реконструированных эмбрионов после слияния и электрической активации

No.эмбрионов (повтор)	Расщепление (%)	Бластоциста (%)	Число клеток в бластоцистах
1356 (6)	846 (76,3 ± 4,0)	367 (26,7 ± 3,9 )	54,6 ± 13,6

Таблица 2

Эффективность ядерного переноса SCNT

Донорские клетки	Реципиенты	перенесенные эмбрионы	Дни беременности (d)	Частота наступления беременности (мертворожденный / абортированный)	Поросята-мутанты или плод
	1	449	—	60%	—	—
	2	277	—		—
C12 #	3	312	38 (кесарево)		5 (плод)	5
	4 9008 6	348	112 (кесарево)		2	2
	5	319	111 (кесарево)		5 (1 мертвый)	5

TALEN-опосредованные мутации P53 клонированные плоды. a Пять живых плодов P53 KO были получены через 38 дней беременности. b Последовательности мутации P53 у плода. Последовательность WT показана выше. Идентифицированы делеции (обозначены буквой «Δ» и количеством пар оснований)

Идентификация трансгенных поросят. a Получены частично поросята P53 KO. b Последовательности мутации Р53 у клонированных поросят. Последовательность WT показана выше. Идентифицируются делеции (обозначенные буквой «Δ» и количеством пар оснований). c Относительные уровни экспрессии мРНК P53 в различных тканях поросят P53 KO и WT. Относительные уровни экспрессии мРНК P53 в тканях мозга, мышц, почек, сердца, печени и почек поросят P53 KO и WT измеряли с помощью q-PCR. Экспрессию гена GAPDH использовали для нормализации значений P53 . * p <0,05 и ** p <0,01 обозначают значительные различия у поросят P53 KO по сравнению с поросятами WT

Таблица 3

Время выживания поросят P53 KO

No.поросят P53 KO	Время выживания поросят P53 KO
P1 #	154 дня
P2 #	89 мин
P3 #	71 день
P4 #	85 мин
P5 #	144 мин
P6 #	202 мин

Функциональная инактивация нокаута свиного белка P53

Ожидалось, что белок P53 не будет произведен на свиньях с нокаутом Р53.Таким образом, мы проверили, ведет ли нокаут свиного P53 как его человеческие и мышиные ортологи, анализируя его экспрессию и активность в первичных фибробластах свиньи в отсутствие или в присутствии повреждений ДНК, индуцированных DOX (доксорубицин). Как показано на фиг. A, сравнимые уровни белка P53 индуцировались доксорубицином в фибробластах WT, но не в фибробластах KO P53. Соответственно, вестерн-блоттинг-анализ показал, что повреждение ДНК, вызванное обработкой доксорубицином, индуцировало устойчивую экспрессию белков P53 и P21 в фибробластах WT, но не в фибробластах P53 KO (рис.б). В совокупности эти результаты подтвердили, что белок P53 свиньи был функционально дефектным у миниатюрных свиней P53 KO Diannan , как и его аналоги человека и мыши.

Обнаружение фенотипов. a Внутриклеточную локализацию P53 анализировали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Клетки фибробластов поросят P53 KO и поросят WT обрабатывали DOX при 100 мкМ в течение 24 часов и окрашивали Hoechst 33342 (синий) и антителом против P53 (зеленый). b Клетки фибробластов обрабатывали, как описано выше, и уровни экспрессии белка проверяли с помощью вестерн-блоттинга.Экспрессия белков Р53 и Р21 в обработанных фибробластах показана в виде обрезанных блотов с использованием моноклональных антител против Р53 и Р21. Анти-GAPDH служил в качестве контроля загрузки

Обсуждение

Мышей или свиней с мутациями Р53 обычно генерирует система Cre / loxP и рекомбинантный аденоассоциированный вирус [18, 19, 30]. Однако эти методы имеют крайне низкую эффективность из-за их зависимости от гомологичной рекомбинации [20, 31]. Недавно сообщалось, что система TALEN демонстрирует высокую эффективность и специфичность нацеливания [32–34].На сегодняшний день TALEN успешно применяются для эффективного нацеливания на гены, а также для создания нескольких моделей на животных [35–38]. Кроме того, наше предыдущее исследование показало, что при редактировании плазмидной ДНК TALEN у овец не наблюдались заметные эффекты вне мишени с использованием полногеномного секвенирования [28]. Этот результат предполагает, что редактирование плазмидной ДНК TALEN у миниатюрных свиней Diannan также не будет иметь побочных эффектов. Поэтому в этом исследовании мы использовали технологию TALEN для нацеливания на гены в соматических клетках свиней, а затем SCNT для получения свиней P53 KO.Как и ожидалось, эффективность таргетирования TALEN в PFF составила до 42%. Пять были двуаллельными нокаутами, что указывало на то, что TALEN были более эффективным методом разрушения аллеля P53 в клетках фибробластов свиней. Мы выполнили в общей сложности пять переносов эмбрионов, в результате чего было получено семь двуаллельных KO поросят P53 от двух доношенных беременностей (таблица). Кроме того, мы собрали пять двуаллельных КО-плодов Р53 от одной беременной свиноматки, чтобы создать первичные клеточные линии для будущего использования. Частота наступления беременности составила 60%, что аналогично результатам Sieren et al.[19]. Более того, свиные фибробласты с двуаллельным нокаутом P53 не реагировали на Dox, что свидетельствует о дисфункциональности гена P53 у этих свиней. Недавно улучшенная система CRISPR / Cas9 сделала возможным более эффективное и более точное редактирование генов, включая точечную мутацию [39–42], что многообещающе для имитации различных нарушений P53 человека. Может ли он создавать модели, имитирующие различные нарушения P53 человека с помощью системы CRISPR / Cas9, требует дальнейшего изучения.

В предыдущих исследованиях была разработана модель мышей с мутацией или дефицитом P53 для изучения опухолей человека [12, 43, 44].Р53-мутантные мыши обычно используются для исследования синдрома Ли-Фраумени, который может вызывать различные опухоли, включая саркомы, рак груди, опухоли головного мозга и карциномы коры надпочечников [45]. Однако различные типы мутации P53 могут оказывать различное воздействие на животных, включая онкогенез и противоопухолевый генез [44]. У гомозиготных мышей с дефицитом Р53 наиболее часто наблюдаемыми опухолями являются злокачественные лимфомы [30, 43, 46, 47]. Хотя мышиные модели опухолей широко используются, их небольшой размер и короткая продолжительность жизни исключают возможность их применения в доклинических исследованиях.Свиньи приобретают все большее значение в биомедицине и предлагают ценные дополнительные ресурсы для исследований рака [48–51]. Недавно были созданы свиньи с мутантами P53, которые в основном имитируют мутацию локуса R175H в гене P53 человека, и на этих моделях свиней наблюдались лимфомы и остеосаркомы [18, 19]. Однако до настоящего времени о типах туморогенеза у свиней с дефицитом Р53 не сообщалось.

В этом исследовании из шести живых миниатюрных свиней с двуаллельным нокаутом P53 Diannan четыре умерли сразу после рождения, а остальные двое умерли примерно через 2 и 5 месяцев.Эти свиньи P53 KO были исследованы с помощью аутопсии и окрашивания гематоксилин-эозином (HE) и не имели признаков опухолей (данные не показаны). Недавнее исследование показало, что, хотя инактивации P53 у свиней было достаточно для спонтанного туморогенеза, не было также свидетельств опухолей или других аномалий у животных моложе 16 месяцев [18]. Sieren et al. [19] также сообщили, что вскрытие не выявило каких-либо скрытых опухолей у новорожденных поросят с мутацией P53, хотя у свиней, достигших половой зрелости, развились лимфомы, остеогенные и почечные опухоли.Таким образом, мы делаем вывод, что наши свиньи, возможно, не достигли возраста туморогенеза до своей смерти. Отсутствие образцов также могло привести к невозможности обнаружения опухолей у миниатюрных свиней с двуаллельным геном P53 KO Diannan . Должно быть получено больше двуаллельных KO свиней P53, и типы туморогенеза свиней P53 KO требуют дальнейшего изучения.

Выводы

Комбинация технологии редактирования генов TALEN и SCNT эффективно используется для создания двуаллельных свиней P53 KO Diannan .Хотя эти генно-инженерные миниатюрные свиньи Diannan не имели онкогенных признаков, ген Р53 у этих свиней был дисфункциональным. Мы уверены, что эти свиньи предоставят новые мощные ресурсы для доклинической онкологии и фундаментальных исследований рака.

Вклад авторов

HJW и HYZ разработали и разработали эксперименты. YS, KX, ZY, JG, HZ, CL, LZ, YQ, HL, WP, BJ и HJW проводили эксперименты. HJW и HYZ проанализировали данные. HYZ и KX написали статью. Все авторы рецензировали рукопись.Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Благодарности

Мы благодарим «Национальный фонд естественных наук Китая» и «Департамент науки и технологий провинции Юньнань» за поддержку, оказанную в этом исследовании.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Доступность данных и материалов

Все наборы данных, на которых основаны выводы статьи, доступны читателям.

Согласие на публикацию

Не применимо.

Одобрение этики

Использование и уход за животными соответствовали руководящим принципам ухода за животными, которые соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH № 85-23). Животные, использованные в этом исследовании, регулярно содержались в Центре лабораторных животных Юньнаньского сельскохозяйственного университета. Все эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Юньнаньского сельскохозяйственного университета.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (гранты № 31360549 и 31360549), Крупной программы фундаментальных исследовательских проектов провинции Юньнань (грант № 2014FC006) и Талантливого проекта молодых и молодых людей. Руководство академическими технологиями среднего возраста в провинции Юньнань (грант № 2013HB073).

Примечание издателя

Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​принадлежностей организаций.

Сокращения

rAAV	рекомбинантный аденоассоциированный вирус
TALENs	эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции
DSB	двухцепочечный разрыв ядер
SCNT соматическая клетка
SCNT перенос
SSA	однонитевой отжиг
PFFs	фибробласты плода свиньи
T7EI	T7 эндонуклеаза I
q-PCR	количественно-полимеразная цепная реакция
поливинилидендифторид
ECL	хемилюминесценция
DOX	доксорубицин

Сноски

Дополнительные электронные материалы

(онлайн-версия этой статьи 10.1186 / s12967-017-1327-0) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Youfeng Shen и Kaixiang Xu в равной степени внесли свой вклад в эту работу

Информация для авторов

Youfeng Shen, электронная почта: [email protected].

Кайсян Сюй, электронная почта: [email protected].

Дзаймэй Юань, электронная почта: [email protected]_mzy.

Jianxiong Guo, электронная почта: [email protected].

Хэн Чжао, электронная почта: [email protected].

Xuezeng Zhang, электронная почта: moc.621 @ gnezeuxgnahz.

Лу Чжао, электронная почта: [email protected].

Юбо Цин, электронная почта: [email protected].

Хунхуэй Ли, электронная почта: [email protected].

Вейронг Пан, электронная почта: [email protected].

Баою Цзя, электронная почта: [email protected].

Хун-Е Чжао, электронная почта: [email protected].

Хун-Цзян Вэй, электронная почта: [email protected].

Ссылки

1. Белый В.А., Ак П., Маркерт Э., Ван Х., Ху В., Пузио-Кутер А., Левин А.Дж. Происхождение и эволюция семейства генов p53.Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010; 2: а001198. DOI: 10.1101 / cshperspect.a001198. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Feng Z, Levine AJ. Регулирование энергетического метаболизма и путей IGF-1 / mTOR с помощью белка p53. Trends Cell Biol. 2010. 20: 427–434. DOI: 10.1016 / j.tcb.2010.03.004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Sengupta S, Harris CC. p53: гаишник на перекрестке репарации и рекомбинации ДНК. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 44–55. DOI: 10.1038 / nrm1546. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Vousden KH, Prives C. Ослепленные светом: растущая сложность p53. Клетка. 2009. 137: 413–431. DOI: 10.1016 / j.cell.2009.04.037. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Болиг Л., Ротер К. Одна функция — несколько механизмов: многообразная активность p53 как репрессора транскрипции. J Biomed Biotechnol. 2011; 2011: 464916. DOI: 10.1155 / 2011/464916. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Лю Дж, Чжан Ц., Фэн З. Супрессор опухоли p53 и его мутанты с усилением функции при раке.Acta Biochim Biophys Sin (Шанхай) 2014; 46: 170–179. DOI: 10,1093 / аббс / gmt144. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Palmero EI, Achatz MI, Ashton-Prolla P, Olivier M, Hainaut P. Мутации 53 опухолевого белка и унаследованный рак: за пределами синдрома Ли-Фраумени. Curr Opin Oncol. 2010. 22: 64–69. DOI: 10.1097 / CCO.0b013e328333bf00. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Сильный LC. Общий доклад: наследственный рак: уроки синдрома Ли-Фраумени. Gynecol Oncol. 2003; 88: 4–7. DOI: 10.1006 / gyno.2002.6673. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Оливье М., Холлштейн М., Эно П. Мутации TP53 при раке человека: происхождение, последствия и клиническое использование. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010; 2: а001008. DOI: 10.1101 / cshperspect.a001008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Донехауэр Л.А., Лозано Г. 20 лет изучают функции p53 у мышей, созданных с помощью генной инженерии. Нат Рев Рак. 2009; 9: 831–841. DOI: 10,1038 / nrc2731. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Cheon DJ, Орсулич С.Мышиные модели рака. Анну Рев Патол. 2011; 6: 95–119. DOI: 10.1146 / annurev.pathol.3.121806.154244. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Flisikowska T, Kind A, Schnieke A. Новая свинья на блоке: моделирование рака у свиней. Transgenic Res. 2013; 22: 673–680. DOI: 10.1007 / s11248-013-9720-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Gun G, Kues WA. Текущий прогресс генно-инженерных моделей свиней для биомедицинских исследований. Биоресурсы в открытом доступе. 2014; 3: 255–264. DOI: 10.1089 / biores.2014.0039. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16.Новак-Ималек М., Ниманн Х. Плюрипотентные клетки сельскохозяйственных животных: современное состояние и перспективы на будущее. Reprod Fertil Dev. 2012; 25: 103–128. DOI: 10.1071 / RD12265. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Заальфранк А., Янссен К.П., Равон М., Флисиковски К., Эзер С., Штайгер К., Флисиковска Т., Мюллер-Флиднер П., Шульце Е., Броннер С. и др. Модель остеосаркомы на свинье. Онкогенез. 2016; 5: e210. DOI: 10.1038 / oncsis.2016.19. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Sieren JC, Meyerholz DK, Wang XJ, Davis BT, Newell JD, Jr, Hammond E, Rohret JA, Rohret FA, Struzynski JT, Goeken JA, et al.Разработка и трансляционная визуализация модели онкогенеза свиней TP53. J Clin Invest. 2014; 124: 4052–4066. DOI: 10.1172 / JCI75447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Leuchs S, Saalfrank A, Merkl C, Flisikowska T., Edlinger M, Durkovic M, Rezaei N, Kurome M, Zakhartchenko V, Kessler B, et al. Инактивация и индуцируемая онкогенная мутация p53 у свиней, нацеленных на ген. PLoS ONE. 2012; 7: e43323. DOI: 10.1371 / journal.pone.0043323. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22.Хаушильд Дж., Петерсен Б., Сантьяго И., Кайссер А. Л., Карнват Дж. В., Лукас-Хан А., Чжан Л., Мэн Х, Грегори П. Д., Швинцер Р. и др. Эффективное создание двуаллельного нокаута у свиней с помощью нуклеаз цинкового пальца. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108: 12013–12017. DOI: 10.1073 / pnas.1106422108. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Миллер Дж.С., Тан С., Цяо Дж., Барлоу К.А., Ван Дж., Ся Д.Ф., Мэн Х, Пашон Д.Э., Люн Э., Хинкли С.Дж. и др. Архитектура нуклеазы TALE для эффективного редактирования генома.Nat Biotechnol. 2011; 29: 143–148. DOI: 10,1038 / НБТ.1755. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Урнов Ф.Д., Миллер Дж. К., Ли Ю. Л., Боседжур К. М., Рок Дж. М., Август С., Джеймисон А. С., Портеус М. Х., Грегори П. Д., Холмс М.С. Высокоэффективная коррекция эндогенных генов человека с использованием разработанных нуклеаз типа «цинковые пальцы». Природа. 2005; 435: 646–651. DOI: 10,1038 / природа03556. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Карлсон Д.Ф., Тан В., Лиллико С.Г., Стверакова Д., Праудфут С., Кристиан М., Войтас Д.Ф., Лонг К.Р., Уайтлоу С.Б., Фаренкруг СК.Эффективный нокаут гена, опосредованный TALEN, у домашнего скота. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 17382–17387. DOI: 10.1073 / pnas.1211446109. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Ли К., Квон Д. Н., Эзаши Т., Чой Ю. Дж., Парк С., Эрикссон А. С., Браун А. Н., Сэмюэл М. С., Парк К. В., Уолтерс Е. М. и др. Приживление iPS-клеток человека и аллогенных клеток свиней свиньям с инактивированным RAG2 и сопутствующим тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 7260–7265. DOI: 10.1073 / pnas.1406376111.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Cheng W, Zhao H, Yu H, Xin J, Wang J, Zeng L, Yuan Z, Qing Y, Li H, Jia B и др. Эффективное получение GGTA1-нулевых миниатюрных свиней Diannan с использованием TALEN в сочетании с переносом ядра соматических клеток. Репрод Биол Эндокринол. 2016; 14 (1): 77. DOI: 10.1186 / s12958-016-0212-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Ли Х, Ван Г, Хао З., Чжан Г, Цин И, Лю С., Цин Л, Пан В, Чен Л, Лю Г и др. Создание двуаллельных овец с нокаутом посредством редактирования генов и переноса ядра соматической клетки.Научный доклад 2016; 6: 33675. DOI: 10,1038 / srep33675. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Wei H, Qing Y, Pan W, Zhao H, Li H, Cheng W., Zhao L, Xu C, Li H, Li S и др. Сравнение эффективности переноса ядер соматических клеток Banna miniature инбредных свиней между различными донорскими клетками. PLoS ONE. 2013; 8: e57728. DOI: 10.1371 / journal.pone.0057728. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Чанг Й.Дж., Дифилиппантонио М.Дж., Тессаролло Л., Морс ХК, Ходес Р.Дж. Нарушение экзона 1 изменяет тканеспецифическую экспрессию мышиного p53 и приводит к селективному развитию В-клеточных лимфом.PLoS ONE. 2012; 7: e49305. DOI: 10.1371 / journal.pone.0049305. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Левандоски М. Условный контроль экспрессии генов у мышей. Nat Rev Genet. 2001; 2: 743–755. DOI: 10,1038 / 35093537. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Чен Л., Тан Л., Сян Х, Цзинь Л., Ли Кью, Донг И, Ван В., Чжан Г. Достижения в технологии редактирования генома и ее многообещающее применение в эволюционных и экологических исследованиях. Gigascience. 2014; 3: 24. DOI: 10.1186 / 2047-217X-3-24.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, Cunniff MM, Feng G, Zhang F. Набор эффекторных инструментов, подобных активатору транскрипции, для геномной инженерии. Nat Protoc. 2012; 7: 171–192. DOI: 10.1038 / nprot.2011.431. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Верес А., Гозис Б.С., Динг К., Коллинз Р., Рагавендран А., Брэнд Х, Эрдин С., Коуэн К.А., Тальковски М.Э., Мусунуру К. Обнаружена низкая частота нецелевых мутаций в отдельных клонах стволовых клеток человека, нацеленных на CRISPR-Cas9 и TALEN. путем секвенирования всего генома.Стволовая клетка клетки. 2014; 15: 27–30. DOI: 10.1016 / j.stem.2014.04.020. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Lei Y, Guo X, Liu Y, Cao Y, Deng Y, Chen X, Cheng CH, Dawid IB, Chen Y, Zhao H. Эффективное целевое разрушение генов в эмбрионах Xenopus с использованием сконструированных эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN) Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 17484–17489. DOI: 10.1073 / pnas.1215421109. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Сонг Дж., Чжун Дж., Го Икс, Чен И, Цзоу Кью, Хуанг Дж., Ли Х, Чжан Кью, Цзян З, Тан Ц и др.Получение кроликов с дефицитом RAG 1 и 2 с помощью микроинъекций TALEN в эмбрионы. Cell Res. 2013; 23: 1059–1062. DOI: 10.1038 / cr.2013.85. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Тессон Л., Усал С., Менорет С., Люнг Е., Найлс Б.Дж., Реми С., Сантьяго И., Винсент А.И., Мэн Х, Чжан Л. и др. Нокаутные крысы, полученные в результате микроинъекции эмбрионов TALEN. Nat Biotechnol. 2011; 29: 695–696. DOI: 10,1038 / NBT.1940. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Маруяма Т., Дуган С.К., Труттманн М.С., Билате А.М., Инграм-младший, Плоег Х.Л.Повышение эффективности точного редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9 за счет ингибирования негомологичного соединения концов. Nat Biotechnol. 2015; 33: 538–542. DOI: 10,1038 / НБТ.3190. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Zhao P, Zhang Z, Lv X, Zhao X, Suehiro Y, Jiang Y, Wang X, Mitani S, Gong H, Xue D. Одношаговая гомозиготность при точном редактировании генов с помощью улучшенной системы CRISPR / Cas9. Cell Res. 2016; 26: 633–636. DOI: 10.1038 / cr.2016.46. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 41.Mou H, Kennedy Z, Anderson DG, Yin H, Xue W. Прецизионные мышиные модели рака посредством редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9. Genome Med. 2015; 7: 53. DOI: 10.1186 / s13073-015-0178-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Программируемое редактирование основания-мишени в геномной ДНК без расщепления двухцепочечной ДНК. Природа. 2016; 533: 420–424. DOI: 10,1038 / природа17946. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43. Донехауэр, Л.А., Харви М., Слэгл Б.Л., Макартур М.Дж., Монтгомери, Калифорния, мл., Бутель Д.С., Брэдли А.Мыши, дефицитные по р53, имеют нормальное развитие, но подвержены спонтанным опухолям. Природа. 1992; 356: 215–221. DOI: 10.1038 / 356215a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44. Тайнер С.Д., Венкатачалам С., Чой Дж., Джонс С., Гебраниус Н., Игельманн Х., Лу Х, Сорон Дж., Купер Б., Брайтон С. и др. Мыши с мутантом р53, проявляющие фенотипы, связанные с ранним старением. Природа. 2002; 415: 45–53. DOI: 10.1038 / 415045a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45. Малкин Д., Ли Ф. П., Стронг LC, Фраумени Дж. Ф., мл., Нельсон К. Э., Ким Д. Х., Кассель Дж., Грыка М. А., Бишофф Ф. З., Тайский М. А. и др.Мутации р53 в зародышевой линии при семейном синдроме рака груди, сарком и других новообразований. Наука. 1990; 250: 1233–1238. DOI: 10.1126 / science.1978757. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Харви М., МакАртур М.Дж., Монтгомери, Калифорния, младший, Бутел Дж. С., Брэдли А., Донхауэр, Лос-Анджелес. Спонтанный и канцероген-индуцированный туморогенез у мышей с дефицитом р53. Нат Жене. 1993. 5: 225–229. DOI: 10,1038 / NG1193-225. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 47. Джекс Т., Ремингтон Л., Уильямс Б.О., Шмитт Е.М., Халахми С., Бронсон Р.Т., Вайнберг Р.А.Анализ спектра опухолей у мышей с мутантом р53. Curr Biol. 1994; 4: 1–7. DOI: 10.1016 / S0960-9822 (00) 00002-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 48. Айгнер Б., Реннер С., Кесслер Б., Климиук Н., Куроме М., Вунш А., Вольф Э. Трансгенные свиньи как модели для трансляционных биомедицинских исследований. Дж. Мол Мед (Берл) 2010; 88: 653–664. DOI: 10.1007 / s00109-010-0610-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 49. Flisikowska T, Kind A, Schnieke A. Генетически модифицированные свиньи для моделирования болезней человека. J Appl Genet. 2014; 55: 53–64. DOI: 10.1007 / s13353-013-0182-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Луо Й, Линь Л., Болунд Л., Дженсен Т.Г., Соренсен CB. Генетически модифицированные свиньи для биомедицинских исследований. J Inherit Metab Dis. 2012; 35: 695–713. DOI: 10.1007 / s10545-012-9475-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 51. Роджерс CS. Генетически модифицированный скот для биомедицинских моделей. Transgenic Res. 2016; 25: 345–359. DOI: 10.1007 / s11248-016-9928-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Полезно

Подключение сканера к компьютеру и создание офисной сети Как установить сканер с диска

Белый.Их размеры зависят от модели и марки производителя. Сегодня сканеры производят сотни компаний, в основном из США, Японии и некоторых стран …

Серверные каналы Discord и Server Discord — определение и цель

Discord — это мессенджер, позволяющий пользователям общаться друг с другом в голосовых и текстовых чатах. Разработчики Discord реализовали целую …

EaseUS Partition Master — программа для разметки жесткого диска Как работать с EaseUS Partition Master

Время чтения: 36 минут Для оптимизации хранения данных в системе мы используем разные логические разделы.Таким образом, большинство выделяют 1 диск, обычно C, под …

Как закрыть полный доступ на яндекс диске

Доброго времени суток всем! Сегодня мы говорим об очень удобном сервисе, который я давно использую в своей работе — Яндекс Диск. Что это за «зверь»? -…

Как перенести установленные программы на другой диск

Начну издалека.Оптимальный вариант установки Windows — изначально разделить на несколько логических дисков (чаще всего их 2). В одном из …

Как записать mp3-диск в машину

Введение Запись компакт-диска или DVD с mp3-треками, которые могут быть прочитаны в бытовых mp3-плеерах, означает запись лазерного диска в формате CD-ROM …

Шины и диски на Форд Эксплорер, размер колес на Форд Эксплорер Форд Эксплорер размер дисков

Использование шин, рекомендованных производителем автомобилей, позволяет избежать поломок и быстрого износа протектора.Ford Explorer 5 поставляется с …

Шины и диски на Nissan X-Trail, размер колес на Nissan X-Trail.

Рано или поздно: каждый автомобилист «убивает», «топчет», «подкатывает» резину и сталкивается с необходимостью ее замены. К сожалению, нет …

Зимняя резина для ravon r3

Колеса и шины на Ravon P4 (габариты и др. Параметры).Зимняя резина на равон р3 Алтайский край Амурская область Архангельская область Астрахань …

Сравнение тарифов на мобильный интернет у velcom Velcom безлимитный интернет 3g

Пакеты предоставляют неограниченный объем интернет-трафика. Безлимитный пакет обмена сообщениями включен в абонентскую плату Comfort S, Comfort …

Восстановить все игры, удаленные с вашего компьютера Как восстановить игру до того же уровня

В 2015 году.в Google Play можно было загрузить более 1,5 миллиона приложений и игр. Пользователи Android часто устанавливают приложения без разбора, а позже …

Индекс / images

	Имя	Последнее изменение	Размер	Описание
	Родительский каталог		—
900Є87 Ирбис-авто.gif	2013-03-02 11:52	14K
	╨г╨а╨Р╨Ы╨б╨Ш╨С╨С╨Р╨Э╨Ъ.jpg	2017- 09-25 14:27	24K
	1/	2020-04-30 20:21	—
	8.jpg	2013-03-07 11:56	136K
	11/	2020-04-10 15:18	—
	12/	2020-04-10 15:18	—
	13/	2020-04-10 15:18	—
	14/	2020-04-14 10:28	—
	15/	2020-04-15 11:34	—
	16/	2020-04-15 12:53	—
	17/	2020-04-16 15:47	—
	18- 07-03сервис.jpg	2018-07-06 10:09	267K
	18citroen.jpg	2013-06-21 19:32	97K
	20/	2020-04-20 10:11	—
	21/	2020-04-21 09:49	—
	22/	2020-04- 21 09:53	—
	23/	2020-04-23 09:40	—
	24/	2020-04-23 09:54	—
	25/	2020-04-24 16:05	—
	26/	2020-04-24 16:08	—
	27/	2020-04-27 09:54	—
	28/	2020-04-27 16:11	—
	29/	2020-04-29 09:41	—
	Ирбис-авто-15-08-17.jpg	2017-08-16 09:56	745K
	KIA-09-08-17.jpg	2017-08-16 09:50	745K
	Logo-Slogan.jpg	20.09.2017 17:54	103K
	RosbankL-RU102.jpg	2018-03-19 08:59	75K
	VSK_logo.jpg	20.09.2017 17:54	561K
	ajax-loader.gif	2013-03-02 11:52	4.1K
	b1-8.jpg	2013-06-07 19:46	164K
	b1 .jpg	2013-05-08 16:07	235K
	b2.jpg	2013-04-23 19:50	137K
	b3.jpg	2013-05-06 17:17	185K
	b3.png	2013-03-02 11:52	1.0M
	b4.png	2013-03-02 11:52	962K
	b4ss.png	2013-03-02 11:52	730K
	b4ssy.jpg	2013-03-29 20:12	124K
	b5.png	2013-03-02 11:52	550K
	b6.jpg	2013-06-27 18:25	84K
	b6.png	2013-03-02 11:52	816K
	b23f.jpg	2013-03-02 11:52	95K
	баннер /	2021-05-04 11:27	—
	bg.gif	2013- 03-02 11:52	138K
	bg.jpg	2013-03-02 11:52	54K
	bg1.gif	2013-03-02 11:52	141K
	bullets.png	2013-04-03 11:52	3.5K
	button.png	2013-03-02 11:52	1.4K
	button2.png	02-03-2013, 11:52	1.5K
	button_active.png	2014-09-10 23:21	21K
	c4_zimniy_paket.jpg	2013-10-07 17:39	124K
	citroen.jpg	2013-10-15 14:20	70K
	citroen.png	2013-03-02 11:52	1.6K
	crysler.png	2013-03-02 11:52	1.6K
	dom01.jpg	2020-04-07 11:54	143K
	dom02.jpg	2020-04-07 11:54	178K
	dom03.jpg	2020-04-07 11:54	177K
	dom04.jpg	2020-04-07 11:54	194K
	dom05.jpg	2020-04-07 11:54	143K
	dom06.jpg	2020-04-07 11:54	320K
	dom07.jpg	2020-04-07 11:54	200K
	dom08.jpg	2020-04-07 11:54	163K
	dom09.jpg	2020 -04-07 11:54	233K
	электронная почта /	2018-11-13 17:40	—
	facebook.png	2016-02-26 11:23	41K
	form /	2018-07-05 13:53	—
	friend_bg.png	2018-11-14 14:13	197K
	friend_logo.png	2018-12-17 17:56	3.0K
	grand_cherokee__2014.jpg	2013 -09-05 16:24	127K
	grandcherokee4.jpg	2013-06-18 18:15	165K
	graybg.png	2013-03-02 11:52	7.0K
	hyundai.png	2013-03-02 11:52	1.6K
	изображений /	2017-11-09 14:02	—
	irbisbonus.png	2018-11-12 16:20	2.3K
	irbisbonus_line.png	2018-11-12 16:27	1.8K
	ix35_hynday.jpg	2013-08-06 19:57	257K
	ix35_hynday_del.jpg	2013-07-10 17:28	167K
	ix35_irbis.jpg	2013-06-11 20:29	211K
	джип.jpg	2013-10-15 14:22	82K
	jeep.png	2013-03-02 11:52	1.5K
	jeep2014_2.jpg	2014-03-11 14:24	589K
	kia-trade-in.jpg	2016-09-12 10:05	26K
	kia .png	02.03.2013 11:52	1.6K
	kod.gif	2013-03-02 11:52	12K
	l1.png	2013-03-02 11:52	3.4K
	l2.png	2013-03-02 11:52	3.2K
	l3.png	2013-03-02 11:52	3.5K
	л4.png	2013-03-02 11:52	2.9K
	l5.png	2013-03-02 11:52	2.3K
	l6. png	2013-03-02 11:52	2.5K
	l7.png	2013-03-02 11:52	2.9K
	l11. png	02.03.2013 11:52	3.8K
	l22.png	2013-03-02 11:52	3.6K
	l33.png	2013-03-02 11:52	4.0 K
	l44.png	2013-03-02 11:52	3,7K
	l55.png	2013-03-02 11:52	2,9 К
	l66.png	2013-03-02 11:52	2.8K
	l77.png	2013-03-02 11:52	3.4K
	лготный- kredit-kia.jpg	2013-06-28 18:05	74K
	lifan-1.jpg	2016-09-05 10:17	21K
	lifan-1.png	21.03.2016 14:12	20K
	lifan-2.jpg	2016-09-05 10:17	15K
	lifan-2.png	2016-03-21 14:12	20K
	логотип- energo-garant.png	2017-09-20 17:54	8.1K
	logo-evro.jpg	2017-09-20 17:54	28K
	logo-life.png	25.08.2017 15:53 ​​	17K
	логотип-макс.jpg	2017-09-20 17:54	3.4K
	logo-rat.jpg	2017-09-25 14:30	419K
	логотип -ravon-1.gif	2016-08-09 11:20	3.1K
	logo-ravon-1.jpg	2016-09-05 10:17	17K
	logo-ravon-1.png	09.08.2016 11:24	7.0K
	logo-ravon-2.gif	2016-08-09 11:20	3.1K
	logo-ravon-2.jpg	2016-09 -05 10:17	15K
	logo-ravon-2.png	2016-08-09 11:24	6.0K
	logo-sk.png	20.09.2017 17:54	84K
	логотип-уралсиб.jpg	2017-09-25 14:29	24K
	logo-zenit.jpg	2017-09-25 14:30	84K
	логотип- zetta.png	2017-09-20 17:54	8.0K
	logo.gif	2013-03-02 11:52	2.4K
	mail /	2021-05-19 11:38	—
	map-ci-big.jpg	2015-12-08 11:16	168K
	map-ci-big.jpg.jpg	2013-03-02 11:52	109K
	map-ci-small.jpg	2015-11-17 17:48	24K
	map-hyundai-big.jpg	2013-03-02 11:52	90K
	карта-hyundai-small.jpg	2013-03-02 11:52	17K
	map-kia1-big.jpg	2015-01-28 15:39	156K
	map-kia1-small.jpg	2013-03-02 11:52	18K
	map-kia2-big.jpg	2018-09-10 15:12	39K
	map-kia2-big.jpg.jpg	2013-03-02 11:52	102K
	map-kia2-small.jpg	2018-09-10 15:12	82K
	mark.png	2013-03-02 11:52	747
	modal_img.png	2018-11-19 14:45	11K
	nav.png	2013-03-02 11:52	4.5K
	newcerato.jpg	2013-04-04 16:02	112K
	p1.gif	2013-03-02 11:52	1.7K
	p1.png	2013-03-02 11:52	1.5K
	p2. gif	2013-03-02 11:52	2.4K
	p2.png	2013-03-02 11:52	2.0K
	p3. gif	02.03.2013 11:52	2.4K
	p3.png	2013-03-02 11:52	2.0K
	p4.gif	2013-03-02 11:52	2.5 K
	p4.png	2013-03-02 11:52	2.3K
	p5.gif	2013-03-02 11:52	1,3 К
	п5.png	2013-03-02 11:52	1.3K
	p6.gif	2013-03-02 11:52	2.1K
	p6. png	2013-03-02 11:52	2.1K
	p7.gif	2013-03-02 11:52	2.5K
	p7. png	02.03.2013 11:52	2.4K
	p8.gif	2013-03-02 11:52	2.7K
	p8.png	2013-03-02 11:52	2,4 K
	photo-ci-big.jpg	2013-03-02 11:52	155K
	photo-ci-big.jpg.jpg	2013- 03-02 11:52	155K
	фото-ci-small.jpg	2013-03-02 11:52	32K
	photo-hyundai-big.jpg	2013-03-02 11:52	84K
	photo-hyundai-small.jpg	2013-03-02 11:52	36K
	photo-kia1-big.jpg	2013-03-02 11:52	182K
	фото-kia1-big.jpg.jpg	2013-03-02 11:52	182K
	photo-kia1-small.jpg	2013-03-02 11:52	34K
	photo-kia2-big.jpg	2018-09-10 12:40	287K
	photo-kia2-big.jpg.jpg	2013-03-02 11:52	163K
	фото-kia2-small.jpg	2018-09-10 12:40	101K
	probeg-1.jpg	2016-09-05 10:17	18K
	probeg- 2.jpg	2016-09-05 10:17	17K
	Проверено.jpg	2018-07-05 12:58	331K
	quoris. jpg	2013-03-29 20:04	142K
	распродажа.xlsx	2015-01-20 16:11	169K
	rubl.png	2018-11-13 14:40	18K
	s-citroen. jpg	2013-07-09 23:15	190K
	santaFe_i30_i40.jpg	2013-04-30 12:49	241K
	setelem.jpg	25.09.2017 14:34	14K
	sever.swf	2015-01-28 17:06	366K
	sever2.swf	2015-01-28 17:07	366K
	sezon_ohoti.jpg	2013-10-15 12:43	155K
	solaris.jpg	2013-10-15 12:42	153K
	sovkom.png	2017 -09-25 14:50	72K
	sportage.jpg	2013-08-06 19:54	210K
	ssangyng.jpg	2013-10-15 14:24	224K
	ssangyong-v- moskve.jpg	2013-09-12 19:19	217K
	ssangyong_rasprodaja.jpg	2013-11-09 17:39	174K
	ssy- leto.jpg	2013-07-02 20:27	183K
	ссы-распродажа.jpg	2013-09-20 21:02	180K
	ssyong.png	2013-03-02 11:52	1.6K
	ssyp.jpg	2013-09-02 18:57	82K
	strelka1.png	2013-03-02 11:52	295
	strelka2.png	2013-03-02 11:52	319
	Связь-Банк.JPG	2017-09-25 14:31	15K
	темп /	2020-04-10 10:34	—
	tinkoff.png	2017-09-25 15:04	88K
	tools_1.png	2018-11-13 11:58	4.5K
	tools_2.png	2018 -11-13 12:01	5.5K
	tools_3.png	2018-11-13 12:01	4.7K
	tools_4.png	2018-11-13 12:01	6.5 K
	tools_5.png	2018-11-13 12:01	4.0K
	unik_150000.jpg	2013-08-15 13:40	100K
	unikalnie_uslovia_citroen.jpg	2013-07-25 19:18	183K
	vaz.png	2015-03-23 ​​11:01	3.1K
	vaz_a.png	2015-03-23 ​​10:59	2.3K
	vazl.png	2015-03-23 ​​11:06	3.5K
	vkontakte.png	26.02.2016 11:23	41K
	vtb24_logo.png	2017-09-20 18:20	4.5K
	works_1.png	2018-11-13 16:32	1.5K
	works_2. png	2018-11-13 16:32	1.6K
	works_3.png	2018-11-13 16:32	2.1K
	works_4. png	13.11.2018 16:32	1.8K
	works_5.png	2018-11-13 16:32	1.4K
	юг.swf	27.02.2014 18:40	397K
	yug2.swf	2015-08-18 15:36	356K

% PDF-1.3 % 1 0 объект > поток конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 11 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text] / Font >>> эндобдж 7 0 объект > поток D ( ! 9Ng9Pp B @ 5 # а

.