Lada 8: Ошибка 404. Страница не найдена

Названы самые покупаемые автомобили в России этим летом

2021-09-04T07:16:49+03:00

2021-09-04T07:16:49+03:00

2021-09-04T07:16:49+03:00

2021

https://1prime.ru/business/20210904/834602686.html

Названы самые покупаемые автомобили в России этим летом

Бизнес

Новости

ru-RU

https://1prime.ru/docs/terms/terms_of_use.html

https://россиясегодня.рф

Самыми часто покупаемыми автомобилями лета 2021 года стали авто марки Lada, при этом чаще всего покупатели выбирали модели Granta и Vesta. Об этом сообщает RT со ссылкой на… ПРАЙМ, 04.09.2021

lada, авто, новости, бизнес, авто

https://1prime.ru/images/83236/02/832360251.jpg

1920

1440

true

https://1prime.ru/images/83236/02/832360251.jpg

https://1prime.ru/images/83236/02/832360248.jpg

1920

1080

true

https://1prime.ru/images/83236/02/832360248.jpg

https://1prime.ru/images/83236/02/832360244.jpg

1920

1920

true

https://1prime.ru/images/83236/02/832360244.jpg

https://1prime.ru/transport/20210903/834600937.html

Агентство экономической информации ПРАЙМ

7 495 645-37-00

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://россиясегодня.рф/awards/

Агентство экономической информации ПРАЙМ

7 495 645-37-00

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://россиясегодня.рф/awards/

Агентство экономической информации ПРАЙМ

7 495 645-37-00

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://россиясегодня.рф/awards/

Агентство экономической информации ПРАЙМ

7 495 645-37-00

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://россиясегодня.рф/awards/

Агентство экономической информации ПРАЙМ

7 495 645-37-00

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://россиясегодня.рф/awards/

Названы самые покупаемые автомобили в России этим летом

МОСКВА, 4 сен – ПРАЙМ. Самыми часто покупаемыми автомобилями лета 2021 года стали авто марки Lada, при этом чаще всего покупатели выбирали модели Granta и Vesta. Об этом сообщает RT со ссылкой на результаты исследования СберАвто, сервиса для покупки и продажи авто онлайн. 

Водителей предупредили о штрафах, которые могут ждать их в 2022 году

Через сервис было реализовано 16% новых автомобилей данной марки и 84% — подержанных. 

Второе место заняла марка KIA c 32% новых и 68% подержанных автомобилей, купленных за три летних месяца. Чаще всего покупатели обращали внимание на модели Rio и Sportage.

Замыкает тройку лидеров еще один южнокорейский бренд — Hyundai, 36% продаж которого составили новые автомобили, а 64% — с пробегом. Наиболее покупаемыми марками стали Solaris и Creta.

Чаще всего россияне покупали автомобили в кредит — 70% сделок в сервисе за лето было проведено с использованием заемных средств.

Читайте также:

Продажи «АвтоВАЗа» в России в августе упали на 32,6%

В России возник дефицит автомобилей Lada | | Infopro54

Алексей Подщеколдин, глава совета директоров «БН-Моторс», считает, что подобный дефицит автомобилей Lada отмечается по всему модельному ряду, передает ГЛАС.ru. Он уточнил, что недостаток данных автомобилей касается не только моделей, собранных в России, но и импортных.

Владистав Рыдаев, вице-президент ассоциации РОАД, говорит о сильном дефиците модели Granta. Особенно это заметно в Северо-Западном федеральном округе.

В начале августа текущего года изготовление Lada Granta было приостановлено на неделю в связи с дефицитом электронных комплектующих. 16 августа «АвтоВАЗ» восстановил работу после отпуска. Но эта модель не будет выпускаться в ближайшее время.

С учетом планового отпуска компании, производство модели приостановлено более чем на месяц. По этой же причине останавливается конвейер, на котором собираются LADA Largus, XRAY, а также Renault Logan и Sandero.

В целом за лето завод шесть раз приостанавливал выпуск ряда моделей из-за нехватки автоэлектроники.

Завод «LADA Ижевск», производящий Vesta и Vesta SW, в меньшей степени страдает от дефицита и планирует работать в соответствии с обычным графиком производства при существующей видимости поставок.

— «АвтоВАЗ» при поддержке российских федеральных и региональных властей, а также Группы Renault, прилагает все возможные усилия для решения проблемы поставок и скорейшего возвращения своих заводов к нормальному режиму работы, — заявили в пресс-службе «АвтоВАЗа».

Напомним, ранее «АвтоВАЗ» планировал ввести с 6 сентября по 31 ноября увеличенный на один час рабочий день в подразделениях, связанных с производством автомобилей. Дополнительное рабочее время смен связано с продолжающимся ростом российского автомобильного рынка и необходимостью более чем на 10% увеличить производственный план. Оплата дополнительного рабочего времени будет производиться в двойном размере. Вместе с тем до сентября текущего года «АвтоВАЗ» планирует нанять дополнительно более 1500 сотрудников на производственную площадку в Тольятти для удовлетворения растущего спроса.

Так, в июле «АвтоВАЗ» реализовал на российском рынке 32 013 автомобилей LADA – это на 3% больше, чем годом ранее. По итогам семи месяцев 2021 года российские дилеры LADA продали 232 232 машины, что на 42% выше показателя за аналогичный период прошлого года. В результате рыночная доля LADA составила 24,3% против 22,1% годом ранее, согласно данным АЕБ. Как говорил ранее президент «АвтоВАЗа» Николя Мор, в течение оставшейся части года объем продаж на российском авторынке будет во многом зависеть от возможностей поставок в связи с текущей мировой ситуацией с нехваткой электронных компонентов.

Набор для обнаружения IL-8 (человека) LANCE Ultra TR-FRET, 10000 точек анализа

Набор для обнаружения человеческого IL-8 LANCE Ultra разработан для обнаружения и количественного определения человеческого интерлейкина 8 в средах для культивирования клеток с использованием гомогенного анализа TR-FRET (этапы без промывки и разделения).

Набор на 500 точек содержит достаточно реагентов для работы с 500 лунками в 384-луночном формате с использованием реакционного объема 20 мкл (15 мкл образца). Набор на 10 000 точек содержит достаточно реагентов для обработки 10 000 лунок в 384-луночном формате с использованием реакционного объема 20 мкл (15 мкл образца).

• Этапы без промывки, без разделения
• Технология TR-FRET
• Чувствительное обнаружение
• Высокая воспроизводимость
• Более быстрое получение результатов
• Простая автоматизация
• 96-луночный, 384-луночный и 1536- форматы лунок

LANCE и LANCE (возбуждает хелат лантаноидов) Ultra — это наши TR-FRET (временнóй разрешенный резонансный перенос энергии флуоресценции), гомогенные (без промывки) технологии. Одно представляющее интерес антитело помечено донорным флуорофором (хелат LANCE Europium), а вторая молекула помечена акцепторным флуорофором (краситель U Light ^™ ).При возбуждении на длине волны 320 или 340 нм энергия может передаваться от донорного хелата европия к акцепторному флуорофору, если он достаточно близок для FRET (~ 10 нм). Это приводит к испусканию света с длиной волны 665 нм.

Интерлейкин 8 (IL8 или CXCL8), член семейства хемокинов ELR + CXC, представляет собой полипептид 8,4 кДа, который образует гомодимеры in vivo. IL8 секретируется несколькими типами клеток: фибробластами, моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками, среди многих других, в ответ на воспалительные стимулы.Это хемоаттрактант и активатор нейтрофилов, направляя их из периферической крови к месту воспаления. Это также мощный ангиогенный фактор, способствующий миграции и пролиферации эндотелия и эпителия при некоторых видах рака, и он связан с метастазированием. Он передает сигналы через два специфических рецептора, связанных с G-белком, CXCR1 и CXCR2, имеющих ~ 77% идентичности.

Подтверждение FRET в отдельных живых клетках отсутствия значительной амилоидной β-опосредованной активации каспазы 8

Реферат

Когда клетки подвергаются воздействию молекул, вызывающих гибель, таких как фактор некроза опухоли-α или Fas, каспаза 8 активируется и расщепляет посредник апоптоза, Bid, который является членом семейства Bcl-2.После дополнительной модификации C-концевой фрагмент Bid перемещается в митохондрии и индуцирует высвобождение цитохрома c в цитоплазму. В попытке непосредственно наблюдать расщепление Bid и следующие события в живых клетках мы сконструировали вектор, кодирующий Bid, слитый с желтым флуоресцентным белком (YFP) и голубым флуоресцентным белком (CFP) (YFP-Bid-CFP). При экспрессии YFP-Bid-CFP в клетках млекопитающих мы смогли наблюдать эффективную передачу энергии от возбужденного CFP к YFP в молекуле YFP-Bid-CFP и, что важно, гибридный белок YFP-Bid-CFP был полностью функциональным. в камерах.Когда YFP-Bid-CFP расщеплялся каспазой 8 при активации анти-Fas Abs, но не Aβ или туникамицином, такой передачи энергии не обнаруживалось. Насколько нам известно, это первый отчет (–) о визуализации активации Bid протеолитическим расщеплением с прямым наблюдением за расщеплением YFP-Bid-CFP в цитоплазме и последующей транслокацией расщепленного Bid в митохондрии и ( ii ) отсутствие значительной активации каспазы 8, опосредованной Aβ или туникамицином, в отдельных живых клетках.

Апоптоз играет важную роль в развитии и гомеостазе, и было показано, что каспазы играют важную роль в апоптозе. Сложные фенотипы мышей с «нокаутом каспаз» предполагают, что несколько механизмов активации каспаз действуют параллельно и что пути передачи сигнала к апоптозу специфичны для стимула и специфичны для отдельных типов клеток (1).

Повреждение митохондрий является основным этапом усиления сигнала на пути апоптоза, и митохондрии также являются основным местом действия белков семейства Bcl-2 (2).Многие члены этого семейства содержат четыре консервативных домена (2), обозначенных Bh2, Bh3, Bh4 и Bh5 (BH, B cl-2 h омологический домен), и хотя многие из этих белков являются проапоптотическими [Bax, Bak и др. (3, 4)], другие — антиапоптотические [Bcl-2, Bcl-x _L и др. (5, 6)]. Независимо от их про- или антиапоптотических эффекторов, многие из этих белков имеют склонность к образованию гомо- и гетеродимеров.

Bid — проапоптотический член семейства Bcl-2, который содержит только домен Bh4.Впервые он был отмечен за его способность связываться с Bcl-2 и Bax (3). Мутационный анализ показал, что интактный домен Bh4 необходим для связывания с Bcl-2 и Bax, и эта связывающая активность коррелирует со способностью Bid вызывать гибель клеток. Эти наблюдения предложили модель, в которой Bid служит лигандом, вызывающим смерть, который перемещается из цитозоля на митохондриальную мембрану, чтобы инактивировать Bcl-2 или активировать Bax (3, 7). В пролиферирующих клетках неактивный Bid (белок 22 кДа; p22) локализуется в цитоплазме.При воздействии на клетки фактора некроза опухоли-α или Fas, оба из которых индуцируют апоптоз, каспаза 8 активируется сигнальным комплексом, индуцирующим смерть. Расщепление Bid каспазой 8 дает два фрагмента (p15 и p7) (8). Открытый остаток глицина на С-конце Bid (p15) подвергается N- миристоилированию (9), и полученный C-концевой фрагмент Bid (p15) перемещается на внешнюю мембрану митохондрий, где он связывается с Bax или с Бак (4, 10). Эти взаимодействия вызывают высвобождение цитохрома c из митохондрий, а высвобождение цитохрома c приводит к образованию комплекса, который содержит цитохром c , Apaf1 и каспазу 9 в цитоплазме.Этот комплекс активирует каспазу 9, а активная каспаза 9 расщепляет нижестоящие эффекторы каспазу 3 и каспазу 7 (11).

В предыдущем исследовании (9) GFP был слит с C-концом Bid и выявил транслокацию Bid-GFP в митохондрии из цитозоля. Однако эта система не могла непосредственно наблюдать расщепление Bid и, таким образом, предоставляла ограниченную информацию для мониторинга активации каспазы 8 в дополнение к транслокации Bid в отдельных живых клетках.

Недавно было продемонстрировано, что можно объединить два белка, которые флуоресцируют на разных длинах волн, и контролировать резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) (12–14) и обнаруживать протеолитическую активность (15), точно так же, как обнаружение внутриклеточное расщепление нуклеиновых кислот с помощью FRET (16).Первым успешным примером этой стратегии было генетическое конструирование тандемных молекул синего флуоресцентного белка и GFP, связанных линкерной последовательностью, которая могла быть расщеплена определенной протеазой (17). FRET возник, когда два белка, которые флуоресцируют на разных длинах волн (донор и акцептор), были связаны вместе, и энергия могла передаваться напрямую от донора к акцептору. Когда акцептор и донор были разделены протеолитическим расщеплением линкера, FRET не регистрировался.Таким образом, FRET — мощный инструмент для исследования молекулярных событий в живых клетках (12–19).

В нашей недавней работе Bid был идентифицирован как один из проапоптотических генов с помощью нашей системы обнаружения функциональных генов, основанной на рандомизированных гибридно-рибозимных библиотеках (20–22). Чтобы непосредственно наблюдать активацию идентифицированного Bid различными индукторами апоптоза и обнаруживать активность каспазы 8 в апоптотических клетках, мы сконструировали гибридный белок, соединив желтый флуоресцентный белок (YFP) и голубой флуоресцентный белок (CFP) с N-концом и C конец торгов соответственно.Используя нашу систему, мы получили in vivo изображений активации каспазы 8 в отдельной клетке, что позволило нам продемонстрировать отсутствие значительной активации каспазы 8, опосредованной амилоидом-β (Aβ) или туникамицином (Tm), у индивидуума. живые клетки.

Материалы и методы

Клонирование кДНК для Bid и конструирование вектора экспрессии для YFP-Bid-CFP.

Ген усиленного YFP (CLONTECH) амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в сайты Bam HI и Hin dIII pcDNA 3 (Invitrogen) для генерации pYFP.Ген усиленного CFP (CLONTECH) также был амплифицирован с помощью ПЦР и вставлен в сайт Xho I pYFP для генерации pFRET. Вектор pFRET-линкер (кодирующий YFP-линкер-CFP) кодировал три дополнительных остатка глицина в сайте Bam HI / Eco RI pFRET.

Полноразмерный ген для Bid амплифицировали из библиотеки кДНК печени человека в плазмиде (Takara, Kyoto) с использованием cBid up (5′-CAGGCCATGGACTGTGAGGTCAACA-3 ‘) и cBid down (5′-TCAGTCCATCCCATTTCTGGCTAAG-3′) в качестве праймеров.Продукт ПЦР был клонирован в pGEM-T (Promega), и целостность клонированной кДНК была подтверждена секвенированием. Укороченную форму Bid амплифицировали с BidFRET-F (5’-CGGGATCCGAGTGCATCACAAA-3 ‘) и BidFRET-R (5′-GCGAATTCATTTCTGGCTAAGC-3’) в качестве праймеров из клонированного Bid в pGEM-T. Продукт ПЦР расщепляли Bam HI и Eco RI и субклонировали по сайту Bam HI / Eco RI pFRET для создания pFRET-Bid. Укороченную форму Bid вставляли в вектор pYFP с использованием тех же рестрикционных ферментов.Короткую форму Bid с добавлением метионина амплифицировали с помощью Hind-Met-fBid-5 ‘(5′-AAGCTTATGGAGTGCATCACAAACCTACT-3’), поскольку усеченная форма Bid не имела стартового кодона, а BidFRET-r в качестве праймеров из клонированного Сделайте ставку в pGEM-T. Продукт ПЦР Bid вставляли в сайт Hin dIII / Eco RI pFRET для генерации pBid-CFP.

Культура и трансфекция клеток.

COS7 и клетки NIH 3T3 выращивали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% FCS (GIBCO / BRL).Перед трансфекцией клетки делили на аликвоты по 1 × 10 ⁶ клеток на 10-сантиметровую чашку или 1 × 10 ⁵ клеток на 2-сантиметровую стеклянную чашку. Через 16–24 ч клетки трансфицировали pFRET-Bid с использованием реагента для трансфекции PolyFect (Qiagen, Chatsworth, CA) в соответствии с протоколом производителя. Клетки SK-N-SH выращивали в MEM-α (GIBCO / BRL) с добавлением 10% FCS (GIBCO / BRL). Клетки SK-N-SH стабильно трансфицировали плазмидами с использованием липофектамина 2000 (GIBCO / BRL) в соответствии с протоколом производителя.После трансфекций клетки отбирали воздействием Генетицина (Sigma) и клонировали стабильные клеточные линии.

Получение флуоресцентных изображений каждой клеточной линии.

Перед обработкой клеток лекарствами клетки, временно или стабильно экспрессирующие слитые белки, культивировали в чашке со стеклянным дном (IWAKI, Tokyo) в течение 40 или 24 часов соответственно. Клетки наблюдали с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии Olympus IX-50. Чтобы наблюдать эффект in vivo FRET, клетки возбуждали с помощью фильтра возбуждения (440 ± 10 нм) плюс дихроичное зеркало 455 нм.Эмиссионные изображения YFP (545 ± 17,5 нм) и CFP (480 ± 15 нм) регистрировали с помощью охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью с компьютерным управлением (ARGAS-20, Hamamatsu Photonics). Затем цифровые флуоресцентные изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения nih image. Контраст был изменен в изображении шкалы серого в том же диапазоне. Затем эти изображения были раскрашены с помощью программного обеспечения для фотошопа (Adobe Systems, Mountain View, CA). Изображения были вычтены из фона. Когда изображения сравнивались, растяжение контраста и цветовая шкала были идентичными, так что сопоставимая яркость в каждом изображении соответствовала сопоставимому сигналу над фоном.

Расщепление YFP-Bid-CFP рекомбинантной каспазой 8

клеток COS7, трансфицированных pFRET-Bid, собирали и ресуспендировали в буфере для обработки ультразвуком, который содержал 20 мМ Hepes (pH 7,5), 10 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA и 1 мМ DTT при 4. ° C. После обработки ультразвуком гомогенат центрифугировали при 10000 × g в течение 10 минут, и супернатант использовали для анализа расщепления рекомбинантной человеческой каспазой 8 (Oncogen Science) при 25 ° C.

Оптические измерения.

После инкубации с каспазой 8 реакционные смеси (общий объем 600 мкл) переносили в кювету спектрофлуориметра (FP-750, Jasco, Tokyo). Спектры испускания флуоресценции регистрировали после возбуждения при 433 нм. Экстракты родительских клеток использовали в качестве контроля.

Иммуноблоттинг.

Экстракты клеток, которые были инкубированы с каспазой 8, разделяли с помощью SDS / PAGE (10% полиакриламид), а затем белки переносили на Clear Blot Membrane-P (ATTO, Tokyo) с помощью электропереноса.Блоты зондировали поликлональными антителами против GFP, а затем вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (Amersham Pharmacia). Иммунореакции выявляли с помощью системы вестерн-блоттинга ECL Plus (Amersham Pharmacia).

Индукция апоптоза и визуализация живых клеток.

клеток NIH 3T3, трансфицированных pFRET-Bid, выращивали в чашках со стеклянным дном диаметром 35 мм в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали фактором некроза опухоли-α (0.5 нг / мл; Sigma) и циклогексимид (1 мкг / мл; Sigma) (23) и исследовали через 3 часа с помощью флуоресцентной микроскопии. Митохондрии идентифицировали с помощью 100 нМ MitoTracker (Molecular Probes).

линий клеток SK-N-SH, которые были стабильно трансфицированы pFRET-линкером или pFRET-Bid, обрабатывали антителами против Fas (1 мкг / мл; Medical and Biological Laboratories, Нагоя, Япония) и циклогексимидом (1 мкг / мл). мл; Sigma; ссылка 24), Tm (2 мкг / мл; Sigma; ссылки 25 и 26) или Aβ (25–35 аминокислот; 40 мкМ; Biochem; ссылки.27–29). Клетки, обработанные антителом против Fas, исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии через 6 часов, а другие обработанные клетки исследовали после 12-часовой инкубации.

Результаты и обсуждение

Разработка идентифицированной заявки с помощью системы обнаружения генов для обеспечения сенсорных функций.

Чтобы непосредственно наблюдать активацию Bid, который ранее был идентифицирован как один из проапоптотических генов, с помощью наших рандомизированных гибридно-рибозимных библиотек (20–22), мы соединили YFP и CFP с N- и C-концами Bid, соответственно, через спейсер, содержащий по три остатка глицина в каждом случае (рис.1). С YFP и CFP максимальное расстояние, на котором может происходить резонансная передача энергии, ограничено 100 Å, и, кроме того, эффективность передачи энергии чрезвычайно чувствительна к расстоянию между донором (CFP) и акцептором (YFP). Чтобы подвести донора на приемлемое расстояние от акцептора, мы удалили аминокислоты с обоих концов Bid (рис. 1 A ) в соответствии с информацией из кристаллической структуры Bid (30, 31), надеясь, что полученная химерная белок будет функциональным in vivo .Полученный в результате гибридный белок YFP-Bid-CFP обеспечивает прямую передачу резонансной энергии от CFP к YFP (фиг. 1 D ). Химерный белок сохранил последовательность, расщепляемую каспазой 8 и сайтом миристоилирования (9). Мы ожидали, что когда химерный Bid расщепляется каспазой 8, FRET больше не возникает.

( A ) Схематическое изображение доменной структуры CFP-Bid-YFP. YFP и CFP были связаны с Bid (остатки 16–194) гибкими спейсерами, которые состояли из трех остатков глицина каждый, для образования CFP-Bid-YFP.Стрелка между остатками 61 и 62 указывает сайт расщепления каспазой 8. ( B ) В нашей системе FRET возбуждение CFP на 433 нм должно приводить к эмиссии на 473 нм, если YFP не находится в непосредственной близости. В YFP-Bid-CFP энергия должна передаваться от возбужденного CFP к YFP с результирующим излучением на длине волны 525 нм. Когда слитый белок расщепляется каспазой 8, энергия больше не может передаваться от возбужденного CFP к YFP. ( C ) Флуоресцентные изображения клеток COS7, которые экспрессировали указанные слитые белки (ось и ).Изображения были получены с использованием фильтров FRET, CFP и YFP (ось x ). (Полоса = 20 мкм.) ( D ) Спектры флуоресценции экстрактов клеток, которые экспрессировали различные гибридные белки. Количество общего белка для каждого образца доводили до 1,4 мг / мл. Возбуждали экстракты клеток, экспрессирующих YFP-Bid (розовая линия), Bid-CFP (черная линия), YFP-Bid-CFP (зеленая линия), YFP-linker-CFP (желтая линия) и родительские клетки (красная линия). при 433 нм и спектры испускания записывали и нормализовали при 450 нм.

Мы попытались визуализировать изменения FRET непосредственно с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии. Когда клетки COS7, экспрессирующие YFP-Bid, возбуждались синим светом (460–490 нм) и эмиссия отслеживалась в зеленом диапазоне (510–550 нм), сигналы легко обнаруживались (рис. 1 C Top Center ). Эти клетки не испускали флуоресценции при возбуждении на длине волны 400–440 нм (Рис. 1 C Верхний левый и Правый ). Когда клетки COS7, экспрессирующие Bid-CFP, возбуждали на длине волны 400–440 нм, испускаемая флуоресценция наблюдалась в синем диапазоне (рис.1 C Слева посередине ). В этом случае не наблюдалось значительного FRET (рис. 1 C, средний центр справа ), и 460–490 нм синего света не могли возбудить белок Bid-CFP (рис. 1 C, средний центр ). Напротив, когда клетки, которые экспрессировали YFP-Bid-CFP, возбуждали при 460-490 нм или 400-440 нм, мы детектировали флуоресценцию из-за YFP, CFP и FRET (Рис. 1 C Bottom ). Следует отметить, что во всех экспериментах по визуализации, включая те, что показаны на рис. 4 и 5, как для реальных, так и для контрольных изображений FRET использовались одинаковые экспозиции.

Рис. 1 D показывает спектр флуоресценции экстрактов из каждой клеточной линии при возбуждении во флуорометре при 433 нм. Лизаты клеток, которые экспрессировали YFP-Bid-CFP и YFP-linker-CFP (описанные в Materials and Methods ), давали пик при 525 нм, который соответствовал FRET. Напротив, лизаты клеток, которые экспрессировали YFP-Bid, не давали подобного пика при 525 нм, а в спектрах испускания Bid-CFP наблюдали пик при 473 нм. Лизаты родительских клеток не показали пика при возбуждении на длине волны 433 нм.Эти наблюдения указывают на эффективную передачу энергии между донором (CFP) и акцептором (YFP) внутри слитого белка.

Подтверждение использования Engineered YFP-Bid-CFP в качестве субстрата для Caspase 8

Мы исследовали, может ли химерный белок YFP-Bid-CFP по-прежнему служить субстратом для каспазы 8 in vitro , а также быть полностью функциональным in vivo , потому что, чтобы разрешить FRET, мы усекли Bid на обоих концах.Мы записали спектры излучения экстракта клеток COS7, экспрессирующих YFP-Bid-CFP, до и после инкубации аликвот клеточного экстракта с возрастающими количествами каспазы 8 в течение 1–22 ч (рис. 2). Эффективность FRET явно зависела от количества каспазы 8 (фиг. 2 A ) и продолжительности инкубации (фиг. 2 C ). Флуоресценция из-за FRET (пик при 525 нм) неуклонно снижалась с увеличением концентрации каспазы 8 и достигла минимума на 1000 единиц (рис.2 A , голубая линия).

( A ) Результаты спектрофлуориметрического анализа расщепления YFP-Bid-CFP в клеточных экстрактах каспазой 8. Экстракты инкубировали с возрастающими количествами каспазы 8 (Cas-8) в течение 22 часов при 25 ° C, а затем Спектры регистрировали после возбуждения при 433 нм. ( B ) Отношение флуоресценции YFP (525 нм) к флуоресценции CFP (473 нм) рассчитывали для каждой концентрации каспазы 8 в реакционной смеси. Относительное соотношение FRET определяли как отношение значений флуоресценции YFP / флуоресценции CFP, измеренных до и после инкубации с каспазой 8.( C ) Зависимое от времени расщепление YFP-Bid-CFP, как продемонстрировано спектрофлуориметрическим анализом.

Чтобы определить чувствительность гибридного белка к каспазе 8, мы изменили график данных, показанных на рис. 2 A , как показано на рис. 2 B , в котором относительное отношение флуоресценции YFP к флуоресценции CFP ( измеренные при 525 и 473 нм соответственно) нанесены на график зависимости от концентрации каспазы 8 в логарифметической шкале. Отношение (YFP / CFP) нормализовали по отношению к соотношению нерасщепленного слитого белка.Мы также подтвердили, что слитый белок расщеплялся каспазой 8 вестерн-блоттингом (рис. 3). После 13-часовой инкубации уровень YFP-Bid-CFP в контрольной дорожке (загруженной клеточным лизатом без добавления каспазы 8; дорожка 1) не изменился. Напротив, когда клеточный лизат инкубировали с 1000 единицами каспазы 8 (дорожка 2), YFP-Bid-CFP расщеплялся на два фрагмента с ожидаемой подвижностью. Эти результаты показали, что слитый белок распознается как субстрат и расщепляется каспазой 8 in vitro и что FRET очень чувствителен к активности каспазы 8.Таким образом, YFP-Bid-CFP является хорошим индикатором расщепления Bid, предположительно из-за активации каспазы 8 in vivo . Поэтому в этом отчете мы утверждаем, что индикатор отображает активацию каспазы.

Вестерн-блоттинг, демонстрирующий расщепление YFP-Bid-CFP каспазой 8. Дорожка 1, контроль (без каспазы 8) и полоса 2, экстракт клеток COS 7, инкубированных с 1000 единиц каспазы 8 в течение 22 часов при 25 ° C. . Экстракты разделяли с помощью SDS / PAGE на 10% полиакриламидном геле и подвергали вестерн-блоттингу с Ab анти-GFP.Верхняя стрелка указывает YFP-Bid-CFP. Средняя стрелка указывает на C-концевой слитый с Bid-CFP белок, а нижняя стрелка указывает на YFP-N-концевой слитый с Bid белок.

Мониторинг активности каспазы 8 с помощью YFP-Bid-CFP в отдельной клетке.

Затем мы проверили, позволит ли слитый белок контролировать активность каспазы 8 в отдельных клетках. Мы трансфицировали клетки NIH 3T3 плазмидой, кодирующей YFP-Bid-CFP, и индуцировали апоптоз, подвергая клетки действию фактора некроза опухоли-α и циклогексимида.Эти агенты нарушают потенциал митохондриальной мембраны в клетках NIH 3T3 (23). Как показано на фиг. 4, YFP-Bid-CFP давал диффузные флуоресцентные изображения при возбуждении CFP и YFP (фиг. 4 B и C ) в необработанных клетках. Напротив, при индуцировании гибели клеток (фиг.4 D — G ) флуоресцирует только CFP (фиг.4 E и F ), и флуоресценция локализуется в митохондриях (фиг.4 G ). ). Эти результаты показали, что, несмотря на модификации на обоих концах, YFP-Bid-CFP был полностью функциональным in vivo и действовал как датчик активированной каспазы 8.

Субклеточная локализация YFP-Bid-CFP. Клетки NIH 3T3 трансфицировали pFRET-Bid и инкубировали в течение 52 часов. Клетки на D — G подвергали воздействию фактора некроза опухоли-α плюс циклогексимид в течение 3 часов. Контроли не подвергались воздействию этих агентов ( A — C ). После инкубации клетки наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Фазово-контрастные изображения ( A и D ), изображения флуоресценции CFP ( B и E ) и изображения флуоресценции YFP ( C и F ).(Полоса = 20 мкм в A — F ). Субклеточную локализацию усеченного Bid (голубая флуоресценция) и митохондрий (оранжевая флуоресценция) оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии ( G ). (Бар = 10 мкм.)

Роль Aβ в болезни Альцгеймера.

Используя слитый белок с донорной и акцепторной составляющими, мы исследовали другие системы гибели клеток, уделяя особое внимание этиологии болезни Альцгеймера, нейродегенеративного расстройства, характеризующегося невритными бляшками и нейрофибриллярными клубками в различных областях мозга (32).Aβ, пептид, состоящий из 39–43 аминокислотных остатков, является основным компонентом сенильных бляшек. Это широко изученный токсический фрагмент интегрального мембранного белка, известного как белок-предшественник амилоида (32). Aβ вызывает гибель первично культивируемых нейронов посредством активации c-Jun и секреции лиганда Fas, при этом апоптотический каскад протекает JNK-зависимым образом (27). В частности, считается, что секретируемый лиганд Fas активирует каспазу 8 и вызывает каскад событий, ведущих к гибели клеток.Кроме того, при болезни Альцгеймера, по-видимому, существует сильная взаимосвязь между стрессом на уровне эндоплазматического ретикулума (ER) и гибелью нейронов (25, 26, 33). Недавно сообщалось, что каспаза 12 локализована в ER и активируется стрессом ER, и что нейроны коры с дефицитом каспазы 12 дефектны в апоптозе, индуцированном Aβ (25). Следовательно, каспаза 12, по-видимому, опосредует ER-специфический путь апоптоза и может способствовать нейротоксичности Aβ.

Обнаружение в реальном времени активации ставки и ее последующей транслокации в митохондрии.

Чтобы изучить апоптотическую передачу сигналов в отдельных нервных клетках с помощью флуоресцентной микроскопии, мы исследовали эффекты трех индукторов апоптоза: Aβ, Tm, который индуцирует стресс ER (25, 26), и антитела против Fas, которое работает как лиганд Fas. на клетках нейробластомы человека SK-N-SH. Мы выделили стабильные клоны, которые экспрессировали белки YFP-linker-CFP или YFP-Bid-CFP (фиг. 5 A ). Затем клетки обрабатывали индукторами апоптоза, упомянутыми выше. Как показано на рис.5 B , мы наблюдали транслокацию Bid в митохондрии только в клетках, обработанных антителами против Fas (стрелки). Обработанные Aβ клетки проявляли стандартные признаки апоптоза, но локализация флуоресцентных белков в большинстве клеток (> 94%) воспроизводимо была такой же, как и в необработанных клетках (см. Таблицу 1 и аналогичные изображения на Рис. 5 C для большего количества клеток которые были взяты независимо от показанных на рис. 5 B ). В этих клетках редко обнаруживаются флуоресцентные белки, локализованные в митохондриях.Точно так же мы не смогли обнаружить локализацию каких-либо слитых белков в митохондриях в клетках, обработанных туникамицином (таблица 1, рис. 5 B и C Bottom ).

Флуоресцентные изображения YFP-Bid-CFP и YFP-linker-CFP в клетках, обработанных различными индукторами апоптоза. ( A ) Клетки SK-N-SH стабильно трансфицировали pFRET-Bid или pFRET-linker, и изображения записывали в условиях фазового контраста (фаза) и с фильтрами FRET, CFP и YFP.Линкер относится к YFP-linker-CFP, а Bid относится к YFP-Bid-CFP. YFP-линкер-CFP и YFP-Bid-CFP равномерно диффундируют по клеткам. (Полоса = 20 мкм.) ( B ) Клетки индуцировали к апоптозу с помощью антител против Fas (Fas), Tm или Aβ. После обработки изображения были записаны, как указано выше. Клетки, индуцированные апоптозом, также наблюдали при более высоком ( B ) и более низком ( C ) увеличении. (Бар = 10 мкм.)

Процент апоптотических клеток, представивших митохондриальную локализацию расщепленного Bid

Когда клетки SK-N-SH обрабатывали антителами против Fas, известным индуктором каспазо-8-зависимого апоптоза, слитый белок Bid расщеплялся, и флуоресценция испускалась в основном из CFP (показано стрелками на фиг.5 B и C Top и Таблица 1) с одновременным исчезновением FRET. Более того, C-концевой участок слитого белка был перемещен в митохондрии, как мы и ожидали. Наши результаты показывают, что клетки SK-N-SH чувствительны к антителам против Fas и что каспаза 8 может быть активирована в этих клетках через сигнальный комплекс, индуцирующий смерть. Отрицательные результаты, полученные с туникамицином, подтверждают более раннее сообщение о том, что активация каспазы 8 не является необходимой для индукции апоптоза этим препаратом (34).

Доказательства против значительного участия Aβ в активации каспазы 8: противоречие может возникнуть из-за измерений в режиме реального времени в отдельной клетке по сравнению с измерениями в больших клетках.

Существует сообщение о том, что Aβ является нейротоксическим агентом, который индуцирует секрецию лиганда Fas в первично культивируемых клетках (27). В нашей системе, хотя расщепление YFP-Bid-CFP каспазой 8 могло быть четко обнаружено при обработке клеток лигандами Fas, соответствующая активация Aβ была едва обнаружена в отдельных клетках при измерениях в реальном времени с помощью флуоресцентной микроскопии.Спорные данные относительно участия Aβ в активации каспазы 8 могут быть согласованы с помощью настоящего анализа, если мы предположим, что Aβ не играет значительной роли в расщеплении прокаспазы 8. Важно отметить, что мы наблюдали апоптоз. события в отдельных индивидуальных клетках, тогда как обнаружение активации каспазы 8 из небольшого числа апоптотических клеток через зависимый от комплекса сигнальный путь, индуцирующий гибель, могло быть усилено, если в прошлом использовались основные клетки.Следовательно, вероятно, что в клетках SK-N-SH какой-то другой основной путь (например, стресс ER) играет решающую роль в Aβ-зависимой гибели клеток.

Заключение

Таким образом, ( i ) мы разработали систему FRET, используя YFP-Bid-CFP, и ( ii ) результаты, полученные с этой системой in vitro и in vivo , согласуются с моделью, в которой активация митохондриального пути апоптоза приводит к апоптозу в клетках NIH 3T3.Наконец, ( iii ) мы продемонстрировали на отдельных клетках, что анти-Fas Ab может активировать каспазу 8, тогда как Tm и Aβ не смогли (в значительной степени) этого сделать. Текущие измерения в режиме реального времени в пределах одной клетки, в отличие от предыдущих анализов, основанных на массивных клетках, позволяют нам предположить, что Aβ не играет значительной роли в расщеплении прокаспазы 8. Следовательно, функционально активный YFP- Слитый белок Bid-CFP должен быть очень полезным инструментом для дальнейшего анализа различных путей апоптоза в различных линиях культивируемых клеток.

Благодарности

Мы благодарим профессора Юкико Гото из Токийского университета и доктора Лауру Нельсон из Национального института передовых промышленных наук и технологий за полезные комментарии к рукописи. Это исследование было поддержано грантами Министерства экономики, торговли и промышленности (METI) Японии, грантом Организации по развитию новой энергетики и промышленных технологий (NEDO) Японии, грантом Фонда содействия фундаментальным исследованиям для инновационных биологических наук. (PROBRAIN) Японии и грант на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта, науки и культуры (MEXT) Японии.

Сноски

• ↵ ‡ R.O. и А. внес равный вклад в эту работу.

• ↵¶ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: taira {at} chembio.t.u-tokyo.ac.jp.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

Сокращения

• Домен BH, домен гомологии Bcl-2

• YFP, желтый флуоресцентный белок

• CFP, голубой флуоресцентный белок

• Aβ, амилоид-β пептид

• Tm, туникамицин

• FRET, резонансный перенос энергии флуоресценции

• ER, эндоплазматический ретикулум

• Авторское право © 2002, Национальная академия наук

Выравниватели ладов / грифов — StewMac

Выравниватели ладов / накладки грифа

Прецизионная шлифовка для ровной поверхности.
Быстрые и точные инструменты для нивелирования для профессионального магазина.

Каждая тяжелая прямоугольная стальная труба размером 1 «x 2» прецизионно отшлифована для обеспечения ровности узких сторон. Прикрепите 3M Stikit Gold Abrasives, чтобы быстро выровнять лады или выровнять поверхность грифа без натяжения. Края инструмента гладкие, чтобы предотвратить образование зазубрин.

Доступны три длины для любой работы:

Устройство выравнивания ладов / накладки на 8 дюймов
Более короткая 8-дюймовая длина идеально подходит для выравнивания пятна и создания спада или сложных радиусов на гитарах, и этот размер как раз подходит для мандолин и укулеле.Если в магазине так много применений, достаточно только одного выравнивателя — вот и все!

Устройство выравнивания ладов / накладки на гриф, 16 дюймов
Длина 16 дюймов лучше всего подходит для работы с установленными гитарными и басовыми грифами. Вы выравниваете большинство ладов одновременно, что дает вам более быстрые и точные результаты. И вам не нужно беспокоиться о том, чтобы ударить по гайке, седлу. , или оборудование.

Регулятор лада / накладки грифа, 24 дюйма
24-дюймовая длина быстро выравнивает лады и накладки грифа на новых грифах и на грифах без установки.Благодаря сверхдлинному размеру вы выровняете все лады одновременно, что даст вам более быстрые и точные результаты.

Роджер Садовски , первоклассный строитель и мастер по ремонту, написал нам:
«Я занимался выравниванием грифов и ладов в течение 30 лет и думал, что у меня все в порядке. Тем не менее, я недавно попробовал 16-дюймовые стальные выравниватели (# 4578) и поговорим о том, чтобы научить старую собаку новым трюкам! Мои грифы никогда не были лучше, и они работают намного лучше, чем файлы для выравнивания ладов.Еще раз спасибо, StewMac !!! »

Сохранить с набором: Набор выравнивателей и Stikit
Абразивные материалы Stikit режутся как напильник, служат дольше, чем обычная наждачная бумага, и имеют размер, соответствующий ширине 1 дюйм наших выравнивателей. Это те же самые профессиональные наждачные бумаги, которые мы используем для быстро и чисто выровняйте накладки грифа и лады, а также удалите царапины перед повторной заливкой и полировкой.

Каждый набор включает один выравниватель и четыре 15-ярдовых рулона Stikit, по одному каждой зернистости: 320, 400, 600 и 800 зернистости.Больше крупки можно приобрести отдельно.

Каждый регулятор лада / грифа имеет ширину 1 дюйм (25 мм), высоту 2 дюйма (50 мм) и доступен в трех вариантах длины: 8 дюймов (203 мм), 16 дюймов (406 мм) и 24 дюйма (609 мм).

Генетически закодированный датчик лактата FRET и его использование для обнаружения эффекта Варбурга в единичных раковых клетках

Abstract

Лактат перемещается между клетками и внутри них, играя метаболические и сигнальные роли в здоровых тканях. Лактат также является предвестником измененного метаболизма и участвует в патогенезе воспаления, гипоксии / ишемии, нейродегенерации и рака.Многие опухолевые клетки демонстрируют высокую скорость производства лактата в присутствии кислорода, феномен, известный как эффект Варбурга, который имеет диагностическое и, возможно, терапевтическое значение. В этой статье мы представляем Laconic, генетически закодированный датчик лактата на основе Forster Resonance Energy Transfer (FRET), разработанный на основе бактериального фактора транскрипции LldR. Лаконичный количественный показатель лактата от 1 мкМ до 10 мМ, на него не влияли глюкоза, пируват, ацетат, бетагидроксибутират, глутамат, цитрат, α-кетоглутарат, сукцинат, малат или оксалацетат в концентрациях, обнаруженных в цитозоле млекопитающих.Экспрессируемый в астроцитах, клетках HEK и клетках глиомы T98G, датчик позволял динамически оценивать уровни лактата в отдельных клетках. Используемый в комбинации с блокатором транспортера монокарбоксилата MCT, датчик был способен различать, является ли клетка чистым продуцентом лактата или чистым потребителем лактата. Применение протокола MCT-block показало, что базальная скорость продукции лактата в клетках глиомы T98G в 3–5 раз выше, чем в нормальных астроцитах. Напротив, скорость накопления лактата в ответ на митохондриальное ингибирование азидом натрия в глиоме была в 10 раз ниже, чем в астроцитах, что согласуется с нарушенным метаболизмом опухоли.Отношение между скоростью продукции лактата и скоростью индуцированного азидом накопления лактата, которое можно оценить обратимо и в отдельных клетках, было идентифицировано как высокочувствительный параметр эффекта Варбурга со значениями 4,1 ± 0,5 для клеток глиомы T98G. и 0,07 ± 0,007 для астроцитов. Таким образом, в этой статье описывается генетически закодированный датчик лактата и его использование для измерения концентрации лактата, потока лактата и эффекта Варбурга в отдельных клетках млекопитающих.

Образец цитирования: San Martín A, Ceballo S, Ruminot I, Lerchundi R, Frommer WB, Barros LF (2013) Генетически закодированный датчик лактата FRET и его использование для обнаружения эффекта Варбурга в единичных раковых клетках.PLoS ONE 8 (2): e57712. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712

Редактор: Мика Екабсонс, Университет Миссисипи, США

Поступила: 24.09.2012; Одобрена: 24 января 2013 г .; Опубликовано: 26 февраля 2013 г.

Авторские права: © 2013 San Martín et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Частично поддерживается грантом Fondecyt 1100936. Centro de Estudios CientÍficos (CECs) финансируется правительством Чили через Программу базального финансирования центров передового опыта CONICYT и Gobierno Regional de Los Ros. WBF был поддержан грантом Национальных институтов здравоохранения (NIDDK; 1RO1DK079109). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Лактат — это органический анион, который участвует в промежуточном метаболизме эукариотических и прокариотических клеток. В клетках млекопитающих лактат продуцируется из пирувата цитозольным ферментом лактатдегидрогеназой (ЛДГ) и обменивается с интерстициальным пространством и между субклеточными компартментами посредством транспортеров монокарбоксилата (МСТ). Гипоксические ткани и опухоли выделяют большое количество лактата, и когда-то считалось, что высвобождение лактата всегда было патологическим, но теперь становится очевидным, что в дополнение к его роли в гипоксии, лактат выполняет важные функции в здоровых тканях, насыщенных кислородом.Межклеточный и субклеточный обмен лактата, называемый лактатным челноком, является неотъемлемой частью нормального энергетического метаболизма мышц и мозга [1], [2]. В ткани мозга, несмотря на нормальный или повышенный уровень кислорода в тканях, нервная активность сопровождается резким повышением уровня лактата в тканях. Производят ли нейроны или потребляют ли они лактат во время нейронной активности, и когда, остается спорным вопросом [3] — [7], который может значительно выиграть от измерения лактата в отдельных клетках. Кроме того, лактат поддерживает процесс миелинизации [8], может вести себя как межклеточный сигнал в сосудисто-нервном взаимодействии и ощущении натрия [9], [10], контролирует собственное производство [11] и необходим для формирования долговременной памяти [12]. ], [13].Патофизиологические роли лактата включают воспаление, заживление ран, микробную инфекцию, нейродегенерацию и рак [14] — [18].

Стандартные методы измерения лактата основаны на ферментативных реакциях, за которыми следуют фотометрические или амперометрические процедуры. Эти методы ограничены, поскольку они должны потреблять субстрат и / или требовать разрушения образца; ни один из них не способен обнаруживать внутриклеточный лактат неинвазивно в реальном времени или с разрешением отдельных клеток. В настоящей статье описывается генетически закодированный репортер лактата, использование этого репортера для определения транспорта лактата и метаболического потока с улучшенным пространственно-временным разрешением, а также разработка чувствительного параметра метаболизма рака.

Результаты

LldR в окружении пары FRET mTFP-Venus Сообщает [лактат]

Генетически закодированные наносенсоры Фёрстера с резонансной передачей энергии (FRET) были разработаны для измерения динамических изменений концентрации нескольких молекул, представляющих биологический интерес, с улучшенным пространственно-временным разрешением. Сенсоры FRET представляют собой слитые белки, состоящие из лиганд-связывающего фрагмента, элемента распознавания и флуоресцентной пары с перекрывающимися спектрами излучения и возбуждения, обычно CFP и YFP.Связывание тестовой молекулы вызывает конформационное изменение, которое влияет на относительное расстояние и / или ориентацию между флуоресцентными белками, вызывая увеличение или уменьшение эффективности FRET. Описанный здесь наносенсор основан на LldR, бактериальном регуляторе транскрипции, который состоит из двух модулей: лактат-связывающего / регуляторного домена и ДНК-связывающего домена [19], [20]. Для создания лактатного сенсора мы выбрали гены LldR из Corynebacterium glutamicum и из Escherichia coli в качестве потенциальных элементов распознавания.Трехмерная структура двух белков, связывающих лактат, практически совпадает (рис. 1A), но они идентичны только на 19,4%, различаются многочисленными заряженными остатками, которые могут влиять на сканирование поверхностного заряда и, возможно, на изменение эффективности FRET [21]. . В качестве пары FRET мы выбрали mTFP [22] и Venus [23], которые, по сравнению с CFP и YFP, ярче и менее чувствительны к pH. Общая архитектура датчиков изображена на рис. 1B, где mTFP расположен на N-конце, LldR фланкирован линкерами, а Венера расположена на C-конце.Для каждого из двух генов было сконструировано восемь вариантов с использованием сайт-специфической рекомбинации. Варианты различаются наличием ДНК-связывающего домена и длиной / составом линкера (последовательности доступны на фиг. S1). Сравнительный анализ показал, что в ответ на лактат E. coli и C. glutamicum chimeras изменили соотношение своей флуоресценции в противоположном направлении, и что конструкции из E. coli были более чувствительны к лактату. Удивительно, но ДНК-связывающий домен был важен для изменения FRET.Как было показано ранее для наносенсоров глюкозы [21], сенсоры лактата без искусственных линкеров работают лучше (рис. 1C). Для дальнейшей характеристики был выбран вариант с наибольшим абсолютным изменением отношения. Этот наносенсор, названный Laconic (LACtate Optical Nano Indicator от CECs), содержит полноразмерный LldR из E. coli без искусственных линкеров. Спектр излучения Laconic характеризовался ожидаемыми пиками флуоресценции mTFP и Венеры при 492 нм и 526 нм соответственно, а также снижением эффективности FRET при связывании лактата (рис.2А). Кинетика LldR для L-лактата неизвестна. На рисунке 2B показано, что Laconic обнаруживает лактат более чем на четыре порядка величины (от 1 мкМ до 10 мМ) вместо двух порядков, обеспечиваемых односайтовыми сенсорами, такими как наносенсоры глюкозы [24]. При анализе in vitro Laconic по крайней мере так же чувствителен, как лучший коммерчески доступный набор на основе ферментов. Кривые зависимости реакции от дозы лактата были определены при различных значениях pH (фиг. 2C), показав небольшой эффект при кислотных значениях и более выраженный эффект при щелочных значениях.Специфичность была исследована путем воздействия на датчик панели метаболитов, и были обнаружены некоторые помехи для пирувата и цитрата (рис. 2D-I). Пируват не изменял соотношение FRET (рис. 2D), но при высоких концентрациях пируват блокировал эффект низкого лактата (рис. 2G). Физиологическая концентрация пирувата в клетках млекопитающих ниже 100 мкМ и в 10–50 раз ниже, чем у лактата [1], поэтому эндогенный пируват не должен влиять на восприятие лактата в физиологических условиях.Цитрат в концентрации 1 мМ увеличивал соотношение FRET на 6% (фиг. 2D) и уменьшал реакцию сенсора на высокий уровень лактата (фиг. 2H). Никаких эффектов не наблюдалось при 10 мкМ или 100 мкМ цитрате (фиг. 2D и 2H). Цитрат в цитозоле ниже 100 мкМ [25] — [27], и поэтому не ожидается, что он будет мешать восприятию лактата в цитозоле. Однако это может повлиять на восприятие митохондрий, поскольку содержание цитрата митохондрий в 10 раз выше. Экстремальные окислительно-восстановительные отношения, достигнутые с помощью комбинаций НАДН и НАД ⁺ [28], не оказали заметного влияния на чувствительность к лактату (рис.2I).

Рис. 1. Лаконичный датчик лактата FRET на основе регулятора транскрипции LldR.

(A) Кристаллографическая структура LldR из Corynebacterium glutamicum [19] и 3D-структура LldR из Escherichia coli , предсказанная с использованием LldR из C. glutamicum и FadR из E. coli в качестве матриц. Сервер 3.0 из лаборатории Fiser (http://www.fiserlab.org/servers_table.htm). (B) Общая конструкция: регулятор транскрипции LldR расположен между флуоресцентными белками mTFP и Венерой, с искусственными пептидами, разделяющими белки (синие и оранжевые линкеры).(C) Влияние 10 мМ лактата на коэффициент флуоресценции 8 вариантов лактатного сенсора на основе LldR либо из E. coli , либо из C. glutamicum . Наиболее чувствительная из конструкций, указанная стрелкой, использовалась в остальной части исследования.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g001

Рис. 2. Характеристика Laconic in vitro .

(A) Спектры излучения в отсутствие и в присутствии 10 мМ лактата.(B) Соотношение между mTFP и флуоресценцией Венеры (при возбуждении 430 нм) измеряли при 0, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 и 10 мМ лактата. Непрерывная линия соответствует наилучшему соответствию двойной прямоугольной гиперболы данным со значениями кажущейся константы диссоциации (K _D ) 8 ± 2 мкМ и 830 ± 160 мкМ, и соответствующими максимальными значениями ΔR 8 ± 0,4% и 11 ± 0,4%. (C) Кривые зависимости реакции от дозы лактата измеряли при указанных значениях pH. Непрерывная линия соответствует наилучшему соответствию двойной прямоугольной гиперболы данным при pH.4. (D) Ответ сенсора на 5 мМ лактата, пирувата, ацетата, глутамата, β-гидроксибутирата и глюкозы, 1 мМ α-кетоглутарата, сукцината, малата или оксалацетата или возрастающие концентрации цитрата (0,01, 0,1 и 1 мМ). На панелях с E по I кривые зависимости реакции от дозы лактата измеряли в присутствии 1 мМ ацетата, глутамата, β-гидроксибутирата или глюкозы (E) в 1 мМ α-кетоглутарата, сукцината, малата или оксалацетата (F). , в 0,25, 1 мМ или 10 мМ пирувата (G), в 0,01, 0,1 или 1 мМ цитрате (H) и в 0.2 мкМ НАДН, 100 мкМ НАД + или 0,2 мкМ НАДН плюс 100 мкМ НАД + (I). Непрерывные линии соответствуют наилучшему соответствию двойной прямоугольной гиперболы для контрольных данных.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g002

Лаконичные отчеты о цитозольном лактате в клетках млекопитающих

Датчик показал ожидаемое цитозольное распределение с исключением ядра при экспрессии в клетках HEK293 (фиг. 3A). Хотя большая часть сенсора была обнаружена в цитозоле, нельзя исключить возможность локализации небольшой фракции в ядре.Однако маловероятно, что сенсор связывается с ДНК млекопитающих, поскольку этот тип регулятора транскрипции спираль-поворот-спираль не экспрессируется в клетках млекопитающих. Более конкретно, связывание LldR с прокариотической ДНК требует 17-нуклеотидной последовательности AATTGGCCCTACCAATT [20], которая, согласно бласт-анализу, отсутствует в геноме млекопитающих. Последовательность также отсутствует в эукариотических промоторах (EPD, Eukaryotic Promoters Database, ExPASy). Возможность сенсорного вмешательства в транскрипцию, которую мы не одобряем, может быть устранена путем замены Ile 23 на серин, что, как недавно сообщалось, устраняет ДНК-связывающую активность LldR [29].

Рисунок 3. Изображение цитозольного лактата.

(A) Клетки HEK293, экспрессирующие Laconic, изображение при 440 возбуждения / 535 испускании). Масштабная линейка составляет 20 мкм. (B) Коэффициент флуоресценции измеряли при 0,01, 0,1, 1 и 10 мМ внеклеточного лактата в клетках HEK293, обработанных метаболическими ингибиторами и проницаемых до H ⁺ , как описано в разделе «Материалы и методы». (C) Динамику флуоресценции mTFP и Венеры измеряли в присутствии 2 мМ глюкозы / 1 мМ лактата или 10 мМ пирувата, как указано.Клетка с низкой экспрессией сенсора, требующая сильного освещения, была выбрана для демонстрации нечувствительности отношения флуоресценции к фотообесцвечиванию. Коэффициент флуоресценции был преобразован в концентрацию лактата с использованием соотношения в пирувате (нулевой лактат), как описано в тексте.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g003

Для калибровки гликолиз блокировали йодуксусной кислотой, а метаболизм митохондрий блокировали ротеноном в отсутствие глюкозы, и клетку фиксировали протонный ионофор нигерицин в буфере, богатом калием.При остановке потока лактата и отсутствии градиента pH МСТ использовали для уравновешивания лактата через плазматическую мембрану. Полученная калибровочная кривая (фиг. 3B) была аналогична форме, наблюдаемой с очищенным белком, предполагая, что датчик in situ ведет себя так же, как in vitro . Однако изменение соотношения mTFP / Venus при всех концентрациях лактата примерно вдвое превышало наблюдаемое in vitro . Мы не знаем, почему динамический диапазон сенсора выше в клетках. Возможные объяснения включают негативное вмешательство гистидиновой метки, используемой для очистки in vitro , и / или лучшую стабилизацию белка во внутриклеточной среде.Датчик не может быть откалиброван в астроцитах, потому что в этих клетках депривация глюкозы не приводит к истощению лактата, о чем свидетельствует устойчивый ответ на пируват (см. Ниже) и отсутствие ответа на низкие концентрации лактата (данные не показаны), что, возможно, объясняется устойчивым уровнем лактата. продукция из гликогена и / или различного сродства MCT. Даже в клетках HEK проницаемость MCT не является линейной, и серьезное повреждение клеток, вызванное процедурой калибровки, могло привести к изменению сенсорного белка. По этой причине был разработан менее инвазивный протокол одноточечной калибровки, который можно применять в ходе экспериментов без повреждения клеток.Чтобы истощить клетки лактата, мы использовали свойство MCT и других способствующих транспортеров, называемое транс-ускорением или ускоренным обменом [30]. Термодинамическое равновесие MCT зависит от градиентов лактата и pH, но также зависит от градиента любого другого субстрата. Принудительный внутрь градиент пирувата применяли для увеличения количества обращенных внутрь пустых участков связывания и уменьшения числа обращенных наружу пустых участков связывания, увеличения оттока лактата и уменьшения притока лактата.Новое термодинамическое равновесие может быть достигнуто только тогда, когда соотношение внутриклеточного лактата к внеклеточному равно соотношению пирувата внутри клетки к внеклеточному. Поскольку внеклеточный лактат поддерживался близким к нулю за счет суперфузии раствора без лактата, внутриклеточный лактат, по прогнозам, будет падать, как показано на фиг. 3C. Монохлорацетат (MCA), субстрат MCT, снижает коэффициент флуоресценции в той же степени, что и пируват (рис. S2), указывая на то, что производство лактата из пирувата незначительно по сравнению с экструзией лактата через MCT.Это можно объяснить тем фактом, что сочетание высокого содержания пирувата и отсутствия глюкозы сильно истощает НАДН [28], [31], ограничивая реакцию ЛДГ. Измерения с помощью ферментативного набора подтвердили, что MCA снижает лактат астроцитов (рис. S2). При значении коэффициента флуоресценции при «нулевом» лактате кинетические константы определяли in vitro , и предполагая максимальное изменение коэффициента флуоресценции 38% (из кривой доза-ответ, подобранной для данных клеток HEK), данные флуоресценции были преобразованы в концентрации лактата, как показано на рис.3С. Дальнейшая проверка протокола нулевого лактата была обеспечена наблюдением, что после продолжительной депривации глюкозы / лактата в клетках HEK пируват не влиял на соотношение флуоресценции (данные не показаны), что соответствует полному истощению лактата и очень низкому уровню NADH: NAD ^{+ Соотношение} присутствует в клетках, лишенных глюкозы [28], [31]. Приведенное выше свидетельство плюс наблюдение in vitro о том, что сенсор не реагирует на низкий лактат в присутствии высокого содержания пирувата (рис. 2G), предполагает, что коэффициент флуоресценции в присутствии высокого содержания пирувата является хорошей оценкой нулевого лактата.Тем не менее, даже небольшой остаточный сигнал может привести к значительному смещению, поэтому рекомендуется соблюдать осторожность при использовании датчика для количественного определения лактата, особенно в астроцитах.

Контролируя обмен лактата между клетками и интерстициальным пространством, MCT являются узловыми точками тканевого метаболизма. Поглощение 5 мМ лактата астроцитами было ингибировано на 65 ± 3% и 62 ± 7% в присутствии блокаторов MCT флоретина и парахлормеркурибензоата (pCMBS; гистограмма на рис. S3). Превращение лактата в пируват с помощью ЛДГ снизит скорость накопления лактата, но поскольку концентрации пирувата на порядок ниже, чем концентрации лактата, этот эффект должен быть небольшим.Мы не ожидаем, что буферизация лактата с помощью ЛДГ или самого датчика будет основным фактором, потому что внутриклеточный лактат, обычно в диапазоне от сотен микромолярных до миллимолярных, более распространен, чем любой из них [32], [33].

Измерение производства и потребления лактата

Диаграмма потоков на фиг. 4A показывает, как на внутриклеточную концентрацию лактата влияет производство гликолита, потребление митохондрий и экспорт / импорт через MCT. Скорость гликолиза в точке его входа оценивалась с помощью датчика глюкозы FRET путем блокирования транспортера глюкозы GLUT при одновременном отслеживании скорости, с которой гексокиназа истощает внутриклеточный пул глюкозы [34], метод, который служил для обнаружения быстрых изменений в астроцитах. гликолиз в ответ на нейрональные сигналы [11], [35], [36].Следуя аналогичному принципу, обмен лактата был исследован в клетках HEK293 путем нарушения устойчивого состояния с помощью блокатора MCT при измерении цитозольного лактата с помощью Laconic. В присутствии глюкозы в качестве исключительного топлива флоретин вызывает накопление внутриклеточного лактата, что свидетельствует о чистом производстве лактата, но если глюкоза заменяется лактатом, результатом является истощение лактата (рис. 4B), что свидетельствует о чистом импорте лактата. В клетках НЕК флоретин подавлял только 57 ± 5% активности МСТ (рис.S3), и поэтому занижает фактические темпы производства или потребления примерно на 40%. pCMBS был более эффективным блокатором MCT, чем флоретин в клетках HEK, с ингибированием 96 ± 1% (фиг. S3), что дает более точную оценку продукции лактата (фиг. 4C). В астроцитах скорость продукции лактата, рассчитанная с помощью процедуры калибровки, описанной на рис. 3C, составила 2 ± 0,5 мкМ / с (n = 22 клетки в трех экспериментах), что соответствует правильному порядку величины, учитывая, что при идентичной культуре и экспериментальной В условиях, когда астроциты потребляли глюкозу со скоростью 2 мкМ / с [34], некоторая часть глюкозы окислялась до CO ₂ .Острое ингибирование окислительного фосфорилирования (OXPHOS) азидом стимулировало выработку лактата в несколько раз (рис. 4D), что соответствует наблюдаемой стимуляции потребления глюкозы [34]. Контрольные измерения pH с помощью BCECF показали, что азид вызывает небольшое закисление, которое в астроцитах достигает 0,1 единицы pH за период, в течение которого определялось накопление лактата (рис. S4). К 2 мин воздействия азида три типа клеток стабилизировались при pH примерно на 0,2 единицы pH ниже контрольных значений. Влияние флоретина и pCMBS на внутриклеточный pH было меньше.Принимая во внимание умеренную чувствительность лактатного сенсора к небольшому закислению (рис. 2C), pH, по-видимому, не является значимым фактором дифференциального воздействия ингибиторов на чувствительность к лактату в астроцитах, клетках HEK293 и T98G.

Рисунок 4. Определение метаболических потоков.

(A) Схема метаболизма лактата. Цитозольная концентрация лактата зависит от баланса между производством гликолита, потреблением митохондриями пирувата и лактата и обменом с внеклеточным пулом лактата через МСТ.(B) Внутриклеточный лактат контролировали в отдельных клетках HEK293 во время временного воздействия флоретина (50 мкМ) в присутствии 25 мМ глюкозы (верхняя панель) или 1 мМ лактата (нижняя панель). (C) Ответы внутриклеточного лактата на временное ингибирование МСТ флоретином (50 мкМ) или pCMBS (500 мкМ) последовательно измеряли в той же самой клетке HEK293 в присутствии 25 мМ глюкозы. Прямые линии представляют собой наклоны накопления лактата, рассчитанные по линейной регрессии в течение первой минуты воздействия.Гистограмма суммирует данные трех экспериментов. (D) Эффект 5 мМ азида натрия измеряли на астроците во время воздействия 50 мкМ флоретина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g004

Одноклеточное определение метаболизма рака в реальном времени

Раковые клетки имеют дефектные митохондрии и сильный гликолиз, явление, известное как эффект Варбурга, который также присутствует в клеточных линиях [15]. В соответствии с незначительной ролью митохондрий в производстве АТФ в раковых клетках, измерение глюкозы в реальном времени с помощью датчика глюкозы FRET [37] показало, что гликолиз в клетках глиомы T98G гораздо менее чувствителен к ингибированию OXPHOS, чем гликолиз в астроцитах (рис.S5). Таким образом, устойчивый гликолитический ответ на азид можно интерпретировать как признак того, что митохондрии играют важную роль в производстве клеточного АТФ. Обратимость эффектов азида и флоретина позволила последовательно наносить азид, флоретин и pCMBS на одну и ту же клетку. Результаты показывают, что астроциты и клетки глиомы имеют противоположные паттерны, причем астроциты сильно реагируют на азид, но слабо реагируют на флоретин / pCMBS, а клетки T98G слабо реагируют на азид и более сильно — на флоретин / pCMBS (рис.5A-D). Анализ частоты сбора данных, необходимой для точной оценки реакции на азид, описан на рисунке S6. Контрольные эксперименты показали, что, как наблюдали в клетках HEK, в клетках глиомы T98G pCMBS является лучшим ингибитором MCT, чем флоретин (95 ± 5% и 53 ± 3% ингибирования, соответственно; рис. S3). Соотношение между базальной продукцией лактата и реакцией на ингибирование OXPHOS, измеренное в одном и том же диапазоне соотношения флуоресценции и в одной и той же клетке, должно быть нечувствительным к концентрации лактата и, следовательно, меньше зависеть от возможных различий в концентрации лактата в покое или поведении сенсоров между типами клеток.Такое соотношение, которое мы назвали индексом Варбурга, было очень чувствительным к метаболическим различиям между астроцитами и клетками глиомы. Рассчитанный с флоретином, который в большей степени недооценивает продукцию лактата в клетках глиомы и клетках HEK, чем в астроцитах (рис. S3), индекс Варбурга составлял 0,07 ± 0,01 в астроцитах, 0,74 ± 0,15 в клетках HEK и 1,7 ± 0,2 в клетках глиомы. Рассчитанный с помощью pCMBS, индекс Варбурга составил 0,07 ± 0,01 для астроцитов, 0,94 ± 0,08 для клеток HEK и 4,1 ± 0,6 для клеток глиомы (рис.5E). В исследованиях и клинических испытаниях вводятся более специфические ингибиторы MCT, которые можно использовать при микромолярных концентрациях или ниже. Было обнаружено, что AR-C155858, специфический ингибитор MCT1 и MCT2 [38], ингибирует поглощение 5 мМ лактата астроцитами на 87% (рис. S7). При использовании AR-C155858 индекс Варбурга, рассчитанный в астроцитах, составил 0,07 ± 0,006 (рис. S7). Контрольные эксперименты показали, что флоретин, азид и AR-C155858 не влияли на восприятие лактата in vitro (рис.S8). Предполагается, что pCMBS не будет взаимодействовать с датчиком, поскольку он не проникает в клетки млекопитающих.

Рисунок 5. Метаболическая характеристика опухолевых клеток.

(A) Астроцит, экспрессирующий Laconic, последовательно подвергали воздействию 5 мМ азида, 50 мкМ флоретина и 500 мкМ pCMBS. Прямые линии представляют начальные наклоны накопления лактата, подогнанные линейной регрессией в том же диапазоне значений отношения. (B) Клетку глиомы T98G, экспрессирующую Laconic, последовательно подвергали воздействию 5 мМ азида, 50 мкМ флоретина и 500 мкМ pCMBS.Прямые линии представляют начальные наклоны накопления лактата, подогнанные линейной регрессией в том же диапазоне значений отношения. (C) Резюме начальных наклонов (отношение Δ / мин), полученных в трех экспериментах типа, показанного на A и B. (D) График корреляции между скоростями накопления лактата (отношение Δ / мин) в азиде и в pCMBS. Символы представляют отдельные астроциты (белые), клетки HEK293 (серые) или клетки T98G (черные). (E) Индекс Варбурга оценивался как соотношение между скоростью производства лактата с pCMBS и накоплением лактата с азидом и использовался для окрашивания силуэта каждой ячейки в соответствии с 16-цветной справочной таблицей.На вставке показана изолированная клетка, которая находилась примерно в 100 мкм от кластера. Гистограмма суммирует данные из 3 экспериментов в каждом типе ячеек. Шкала 20 мкм. *, p <0,05 между всеми типами клеток.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.g005

Обсуждение

Мы использовали бактериальный регулятор транскрипции LldR в качестве распознающего элемента для создания Laconic, генетически закодированного биосенсора, который определяет лактат в физиологическом диапазоне.Экспрессированный в клетках млекопитающих датчик был способен к чувствительной оценке активности переносчика лактата и продукции лактата и был использован для создания нового одноклеточного параметра эффекта Варбурга, метаболического товарного знака раковых клеток. Разработка сенсора на основе LldR обеспечивает основу для создания широкого спектра новых индикаторов, поскольку суперсемейство GntR, членом которого является LldR, включает по меньшей мере 270 других факторов транскрипции, которые связывают пируват, жирные кислоты, аминокислоты, цикл TCA. промежуточные продукты и др.[19], [39], которые являются возможными элементами распознавания для генетически закодированных наносенсоров.

Датчик был способен определять уровни лактата в диапазоне от 1 мкМ до 10 мМ. Расширенный диапазон обнаружения был неожиданным, поскольку ранее разработанные датчики метаболитов охватывают всего два порядка [40] — [43]. Сродство в основном определяется свойствами распознающего элемента, а не флуоресцентными партнерами, поэтому отличительное кинетическое поведение этого сенсора на основе LldR и его чувствительность к мМ уровням пирувата могут представлять интерес для исследователей, работающих над регуляцией транскрипции.Лаконичность дает преимущества перед альтернативными методами, в первую очередь разрешающей способностью. Для ферментативных анализов и ВЭЖХ требуется большое количество клеток, что дает достоверные данные только при наличии метаболической однородности. Настоящие ткани и даже первичные тканевые культуры представляют собой сложные смеси клеток, которые лучше всего растут и дифференцируются в присутствии друг друга, популярным примером является совместное культивирование нейронов и астроцитов. Как и другие генетически закодированные наносенсоры, Laconic может экспрессироваться in vivo в идентифицированных типах клеток с использованием трансгенеза или вирусной трансдукции и может быть нацелен на субклеточные органеллы.Еще одним плюсом оптических измерений является то, что они не требуют разрушения образца, что позволяет проводить статистически мощные эксперименты типа «до» и «после». В дополнение к переносу МСТ, активность которых можно оценить с помощью pH-чувствительного красителя, лактат также транспортируется независимо от протонов через щелевые соединения [44] и, возможно, через полуканалы коннексина и каналы паннексина, потоки, которые невидимы для измерений pH и которые теперь можно подойти.

Хотя подобная форма калибровочных кривых, полученных in vitro и в клетках HEK, обнадеживает, необходимая жесткость полного протокола калибровки вызывает беспокойство, и на данном этапе невозможно гарантировать, что кинетические параметры получены . in vitro представляют поведение сенсора в клетках.Таким образом, данные могут рассматриваться как полуколичественные и выражаться в терминах отношения Δ с использованием точки нулевого лактата в качестве эталона, в идеале в экспериментах до и после со скоростью, сравниваемой при аналогичных значениях отношения. Еще одним ограничением Laconic является его чувствительность к pH в щелочном диапазоне. В физиологических условиях цитозольный pH большинства клеток колеблется от 7,0 до 7,4, диапазон, в котором датчик показал незначительные изменения, но, учитывая широкий диапазон охваченных концентраций, даже относительно небольшое изменение pH может привести к ошибке в определении лактата.Если присутствует сильное изменение pH, коррекция может быть произведена с помощью красных чувствительных к pH белков или красителей, совместно загруженных в те же клетки или с помощью параллельных экспериментов BCECF. Постоянной проблемой клеточного метаболизма является степень, в которой митохондрии метаболизируют лактат вместо пирувата [45] — [47], феномен, с которым можно бороться с помощью лактатного сенсора, экспрессируемого в цитозоле. Измерение лактата в митохондриальном матриксе может оказаться более трудным из-за пониженной чувствительности Laconic к pH 7.8-8.0 среды этого отсека и возможное вмешательство цитратов. Эти ограничения, возможно, можно преодолеть с помощью мутагенеза, что продемонстрировано на чувствительности к pH сенсора NADH Peredox [28].

В протоколе оценки продукции / потребления лактата в идеале должен использоваться обратимый ингибитор, способный блокировать проницаемость лактата, не влияя на другие мембранные белки или внутриклеточные процессы. Ни pCMBS, ни флоретин такому описанию не соответствуют, но они дополняют друг друга.pCMBS не проникает в клетку, но воздействует на многочисленные поверхностные белки, и ее действие необратимо, что исключает возможность проведения экспериментов до и после. Мы не знаем, почему астроциты были более устойчивы к pCMBS. Возможна дифференциальная чувствительность изоформ МСТ, но мы не смогли найти доказательств этого в литературе. Ожидается, что частичное ингибирование с помощью pCMBS занижает продукцию лактата в астроцитах примерно на 35%, с аналогичным смещением, внесенным в индекс Варбурга. Действие флоретина обратимо, но менее эффективно и неспецифично.Помимо ингибирования МСТ, и флоретин, и pCMBS нацелены на переносчик глюкозы GLUT, но это не должно ставить под угрозу анализ астроцитов, нейронов, раковых клеток, фибробластов, клеточных линий в целом и других клеток, которые поддерживают внутриклеточную глюкозу в состоянии покоя на уровнях> 300 мкМ. [34], [37], [40]. В таких клетках уровень глюкозы значительно превышает K _m гексокиназы, и потребление глюкозы остается постоянным в течение нескольких минут в присутствии блокатора GLUT [34]. Фармацевтические компании недавно разработали высокоаффинные блокаторы MCT, которые могут быть использованы для данной цели, когда они станут коммерчески доступными.Для этой статьи мы протестировали AR-C155858, специфический ингибитор MCT 1 и MCT2 [38]. При использовании с культивированными астроцитами и клетками глиомы AR-C155858 вел себя аналогично флоретину и pCMBS (рис. S6). Однако AR-C155858 не ингибирует MCT4, изоформу, важную для зрелых астроцитов, мышечных клеток и некоторых линий раковых клеток [48], [49]. Перед измерением продукции лактата эффективность выбранного ингибитора необходимо проверить с помощью анализа поглощения. В сочетании с нокдаунами MCT с использованием siRNA или shRNA, датчик лактата также можно использовать для распознавания вклада конкретных изоформ в поток лактата.

Стимуляция гликолиза азидом объясняется прекращением выработки митохондриального АТФ, что, возможно, усугубляется дополнительным потреблением АТФ митохондриальной АТФ-синтазой, действующей в обратном направлении. Обращение АТФ-синтазы усугубит гликолитическую стимуляцию за счет дальнейшего снижения соотношения АТФ / АДФ. Добавление олигомицина, ингибитора АТФ-синтазы, к азиду может обеспечить более точную оценку стимуляции гликолиза, учитывая эндогенное потребление АТФ, происходящее в клетке до митохондриального ингибирования.Мы не думаем, что более медленное накопление лактата в ответ на азид в опухолевых клетках объясняется большей транспортной способностью лактата. В пределе начальная скорость отклонения лактата от равновесного состояния после гликолитической стимуляции зависит только от потока лактата в состоянии покоя и степени стимуляции. Поскольку раковые клетки имеют более высокие потоки покоя, чем нормальные клетки, ожидается, что начальная скорость увеличения лактата в ответ на данную гликолитическую стимуляцию будет выше. Если на практике истинная начальная скорость не может быть определена, отток лактата станет фактором, но, по прогнозам, большая способность раковых клеток к переносу лактата будет компенсироваться соизмеримым большим потоком лактата.Слабый гликолитический ответ на азид может быть связан со слабой функцией митохондрий, но также с регуляторными дефектами гликолиза. Если тип клеток не может увеличить свою скорость гликолиза в ответ на азид, это может быть ошибочно принято за фенотип опухолевого типа. Однако мы считаем, что это может быть не обычным явлением, поскольку эффект Пастера, по-видимому, является универсальной особенностью здоровых клеток млекопитающих. Это связано с тем, что у большинства клеток есть внутриклеточный пул глюкозы, который вместе с пулом гликолитических промежуточных продуктов будет поддерживать выработку лактата, по крайней мере, какое-то время.Мышечные клетки имеют заметно низкие стационарные уровни глюкозы, но, как известно, они реагируют на митохондриальные ингибиторы сильной стимуляцией гликолиза за счет отложений гликогена. Между прочим, мы наблюдали, что клетки НЕК увеличивают выработку лактата в ответ на азид, даже в отсутствие внеклеточной глюкозы (данные не показаны).

Раковые клетки более гликолитичны, чем нормальные клетки, даже в присутствии кислорода, явление, впервые отмеченное Отто Варбургом, которое привлекает повышенное внимание в связи с патогенезом, диагностикой и, возможно, лечением рака [14], [15], [50] .Молекулярные механизмы, ответственные за эффект Варбурга, являются плейотропными, включая дефекты и модуляции увеличения функции гликолитических и митохондриальных ферментов, которые различаются между типами рака и даже между клеточными линиями внутри опухоли. Существует положительная корреляция между агрессивностью опухоли / резистентностью к химиотерапии и интенсивностью эффекта Варбурга. Это явление в настоящее время обнаруживается путем сравнения уровней потребления глюкозы и кислорода или, альтернативно, уровней производства лактата и потребления кислорода, оцененных в популяциях клеток.Настоящий датчик и связанные с ним протоколы вносят свой вклад в эту область, позволяя оценить эффект Варбурга в отдельных клетках, что является полезной функцией для изучения гетерогенных популяций клеток.

Материалы и методы

Стандартные реагенты и ингибиторы были приобретены у Sigma. AR-C155858 был приобретен в Haoyuan Chemexpress (Шанхай)

Конструкция датчика лактата

Бактериальную геномную ДНК выделяли с использованием системы очистки Wizard® SV. Геномную ДНК (Promega) и гены LldR амплифицировали со специфическими праймерами.Чтобы упростить стратегию клонирования в C. glutamicum , сайт BamH I был удален путем введения молчащей однонуклеотидной мутации. Для облегчения субклонирования последовательностей LldR сайты рестрикции AflII и KpnI были соответственно введены на 3 ‘и 5’ конце ампликонов. Реакции ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы горячего старта KOD (Novagen), а их продукты проверяли секвенированием (Macrogen. Inc). Шестнадцать вариантов датчика лактата, восемь для E. coli и восемь для C.glutamicum , были созданы с использованием технологии рекомбинационного клонирования Gateway® (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, были сконструированы пять плазмидных векторов: целевой вектор и четыре входных вектора. Вектор-адресат (pDEST01) содержал основной вектор pRSET-B, в котором последовательности ДНК, кодирующие полигистидиновый хвост, mTFP и Венеру, были клонированы ниже бактериального промотора Т7. Кассета рекомбинации с введенными сайтами AflII и KpnI, амплифицированная из pDEST14 с помощью ПЦР, была вставлена ​​между последовательностями для mTFP и Венеры.Четыре вектора входа были сконструированы с использованием вектора pCR®8 / GW / TOPO TA путем клонирования последовательностей, соответствующих полному LldR из E. coli (pENTLldR01), полной длины LldR из C. glutamicum (pENTLldR02). , лиганд-связывающий домен LldR из E. coli (pENTLldR03) и лиганд-связывающий домен LldR из C. glutamicum (pENTLldR04). Наконец, шестнадцать экспрессионных векторов были созданы посредством LR-рекомбинации между вектором-адресатом pDEST01 и каждым из четырех входных векторов с последующим условным удалением линкера между mTFP и LldR или линкера между LldR и Венерой путем переваривания экспрессионных векторов с помощью рестрикционные ферменты Kpn I и AflII.

Очистка белка

Шестнадцать вариантов трансформировали в E. coli BL21 (DE3). Одиночную колонию засевали в 100 мл среды LB со 100 мг / мл ампициллина (без IPTG) и встряхивали в темноте в течение 2–3 дней. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об / мин (4 ° C) в течение 10 мин и разрушали ультразвуком (Hielscher Ultrasound Technology) в 5 мл трис-HCl буфера pH 8,0. Бесклеточный экстракт получали центрифугированием при 10000 об / мин (4 ° C) в течение 1 часа и фильтрованием супернатанта (0.45 мкм). Белки очищали с использованием никелевой смолы (His Bin® от Novagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Элюированные белки количественно определяли с использованием метода Biuret и хранили при -20 ° C в 20% глицерине. Вариант, который показал наибольшее изменение соотношения флуоресценции, названный Laconic (Lactate Optical Nanosensor from CECs), был клонирован в pcDNA3.1 (-) для экспрессии в эукариотических клетках с использованием сайтов рестрикции BamH I и Hind III.

Животные и клеточные культуры

Использованные животные представляли собой смешанных мышей-самцов F1 (C57BL / 6J × CBA / J), содержащихся в помещении для животных в условиях SPF при комнатной температуре 20 ± 2 ° C, в цикле свет / темнота 12/12 часов со свободным доступом. к пище и воде.Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Centro de Estudios Científicos. Смешанные корковые культуры нейрональных и глиальных клеток (новорожденные в возрасте 1-3 дней) готовили, как описано [51]. Для настоящего исследования измерялись только астроциты. Клетки глиомы HEK293 и T98G были получены из Американской коллекции типовых культур и культивированы при 37 ° C в 95% воздуха / 5% CO ₂ в DMEM / F12 10% фетальной бычьей сыворотке. Клетки HEK и клетки T98G трансфицировали при 60% слиянии с использованием Lipofectamine 2000 (Gibco) с эффективностью> 90% в клетках HEK и прибл.20% в клетках T98G. Астроциты трансфицировали при 60% слиянии, используя Lipofectamine 2000 (Gibco), с прим. 20% эффективности или, альтернативно, воздействие 5 × 10 ⁶ БОЕ Ad Laconic или Ad FLII ¹² Pglu600 µδ6 (серотип 5, изготовлено на заказ Vector Biolabs), которые трансдуцировали> 90% клеток. Не было очевидной разницы в поведении сенсора в астроцитах, трансфицированных плазмидой, и астроцитах, трансдуцированных аденовирусным вектором. Клетки исследовали через 24–72 ч.

Измерения флуоресценции

Очищенные никелем белки ресуспендировали при 100 нМ во внутриклеточном буфере, содержащем (мМ): 10 NaCl, 130 KCl, 1,25 MgSO ₄ и 10 HEPES, pH 7,0, и измеряли с помощью анализатора-ридера для микропланшетов (EnVision, PerkinElmer). Белки возбуждали при 430 нм, и интенсивность флуоресцентного излучения mTFP и Венеры регистрировали при 485 нм и 528 нм, соответственно. Отношение между выбросами использовалось для характеристики датчиков.Спектры излучения получали при возбуждении 430 нм с окнами 2 нм. Клетки получали изображение при комнатной температуре (22-25 ° C) в 95% -ном воздухе / 5% CO ₂ -газированном растворе следующего состава (в мМ): 112 NaCl, 1,25 CaCl ₂ , 1,25 MgSO ₄ , 1-2 глюкозы, 10 HEPES, 24 NaHCO ₃ , pH 7,4, с 3 мМ KCl (астроциты) или 5 мМ KCl (HEK293 и T98G) с использованием вертикального конфокального микроскопа Olympus FV1000, оснащенного 20-кратным погружением в воду. (NA 1.0) и твердотельный лазер с длиной волны 440 нм.В качестве альтернативы, клетки были визуализированы с помощью Olympus IX70 или микроскопа Olympus BX51, оборудованного иммерсионным объективом с 40-кратным увеличением (NA 1,3) или с 20-кратным иммерсионным объективом (NA 0,95). Микроскопы были оснащены монохроматорами CAIRN (Фавершам, Великобритания) и камерой Hamamatsu Orca, управляемой программным обеспечением Kinetics, или камерой Rollera, управляемой программным обеспечением Metafluor, соответственно. Для измерения соотношения наносенсоров клетки возбуждали на длине волны 430 нм в течение 0,2–0,8 с. Излучение было разделено с помощью CAIRN Optosplit, оснащенного полосовыми фильтрами на 480 ± 20 (mTFP) и 535 ± 15 нм (Venus).Соотношение между mTFP и Венерой использовалось для оценки лактата. После отдельных экспериментов определяли коэффициент флуоресценции при нулевом лактате в присутствии 10 мМ пирувата (см. Фиг. 3C). Большинство данных представлено как разница между коэффициентом флуоресценции и коэффициентом флуоресценции в присутствии пирувата, Δ (mTFP / Venus). Чтобы сгенерировать пропорциональное изображение из 8-битных изображений с вычитанием фона и избежать деления на ноль, к изображению Венеры (знаменатель) было добавлено произвольное смещение значения 5. В pH-чувствительный краситель BCECF загружали сложный эфир при 0.1 мкМ в течение 3–4 мин, и сигнал калибровали, подвергая культуры воздействию растворов с различным pH после пермеабилизации клеток 10 мкг / мл нигерицина и 20 мкг / мл грамицидина во внутриклеточном буфере. BCECF последовательно возбуждали при 440 и 490 нм (0,05 с) и отображали при 535 ± 15 нм. Для калибровки лактатного сенсора в клетках клетки HEK293 предварительно инкубировали в течение 1 часа с 500 мкМ йодуксусной кислоты для блокирования гликолиза в GAPDH [52]. Затем внеклеточный и внутриклеточный лактат уравновешивали с использованием эндогенного H ⁺ -связанного монокарбоксилатного переносчика МСТ в присутствии обменника нигерицина H ⁺ / K ⁺ (10 мкМ) и 2 мкМ ротенона во внутриклеточном буфере следующего состав (мМ): 10 NaCl, 130 KCl, 1.25 MgSO ₄ , 10 HEPES pH 7,2. Внутриклеточную глюкозу измеряли с помощью датчика FRET [37], как подробно описано в [34]. Для оценки внутриклеточного лактата с помощью другого метода,> 80% конфлюэнтных чистых культур астроцитов, выращенных на чашках Петри диаметром 35 мм, трижды промывали ледяным буфером для визуализации с добавлением 50 мкМ флоретина, а затем проницаемостью 500 мкл 10 мМ HEPES pH 7,4 и 0,1% тритона. Лактат в экстракте измеряли с помощью набора для анализа лактата Biovision в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ

Временные курсы без планок погрешностей соответствуют одиночным ячейкам. Эксперименты повторяли от трех до шести раз по 6–18 клеток в эксперименте, если не указано иное. Регрессионный и статистический анализ проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot (Jandel). Различия в средних значениях парных выборок оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между более чем двумя группами оценивались с помощью одностороннего дисперсионного анализа рангов Крускала-Уоллиса с последующим тестом Дуннса.Значения P <0,05 считались значимыми и отмечены звездочкой (*).

Дополнительная информация

Относится к Рис.1 . Выравнивание последовательностей датчиков лактата. Восемь вариантов лактатного сенсора были созданы либо с LldR из E. coli , либо с C. glutamicum , как описано в экспериментальных процедурах. Вариант 04 из E. Coli был назван Лаконичным.Идентичные аминокислотные остатки выделены желтым.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s001

(DOC)

Относится к Рис.3 . Истощение лактата, вызванное пируватом и монохлорацетатом. (A) Астроциты были последовательно подвергнуты воздействию 5 мМ лактата, 10 мМ пирувата и 50 мМ монохлорацетата (MCA). Промежуточные данные взяты из 5 ячеек в одном эксперименте.Гистограмма суммирует разницу между контрольными соотношениями и в присутствии пирувата или MCA для 3 отдельных экспериментов. (B) Цельноклеточный лактат оценивали с помощью ферментативного набора в астроцитарных культурах, подвергнутых воздействию 2 мМ глюкозы / 1 мМ лактата (контроль), после 5-минутного воздействия 50 мМ MCA или после 5-минутного воздействия 5 мМ лактата. Данные взяты из 3–4 отдельных определений. *, p <0,05 относительно контроля.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s002

(DOC)

Относится к Рис.4 . Ингибирование поглощения лактата флоретином и pCMBS. Клетки глиомы T98G подвергали воздействию 5 мМ лактата в отсутствие и в присутствии 50 мкМ флоретина или 500 мкМ pCMBS. Прямые линии представляют начальную кривую поглощения лактата. Гистограммы суммируют данные для 3 экспериментов в каждом типе ячеек. *, p <0,05 по флоретину.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s003

(DOC)

Относится к Рис.4 . Влияние азида, флоретина и pCMBS на pH. Внутриклеточный pH измеряли с помощью BCECF в астроцитах, подвергнутых воздействию 5 мМ азида, 50 мкМ флоретина или 500 мкМ pCMBS. Также показано контрольное подщелачивание 10 мМ хлоридом аммония. Данные взяты из 8 ячеек в одном эксперименте. Стрелки показывают время, выбранное для гистограмм ниже, которые суммируют падение внутриклеточного pH для 3 экспериментов в каждом типе клеток. Обратите внимание, что измерения накопления лактата на рис.5 были выполнены через 30 секунд для азида, через 2 минуты для флоретина и через 4 минуты для pCMBS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s004

(DOC)

Относится к Рис.5 . Истощение внутриклеточной глюкозы азидом. Эффект 5 мМ азида на внутриклеточную глюкозу измеряли с помощью датчика глюкозы FRET (Bitner et al., 2010). Гистограмма представляет степень истощения глюкозы после 2 мин воздействия азида (стрелка) в 3 экспериментах на каждом типе клеток.*, p <0,05 по отношению к астроцитам и клеткам HEK293.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s005

(DOC)

относится к Рис.5 . Влияние частоты сбора данных на оценку повышения лактата в ответ на азид. Астроциты, экспрессирующие лактатный сенсор в присутствии 2 мМ глюкозы, подвергались воздействию 5 мМ азида, в то время как коэффициент флуоресценции измерялся каждую секунду (1 Гц).Линейная функция была адаптирована к начальной фазе повышения лактата, давая расчетную скорость 0,23 мин ^–1 (левая панель). Когда данные были прорежены для имитации частоты сбора данных 0,1 Гц, расчетная скорость составила 0,26 мин ^-1 (правая панель). На нижнем графике показаны данные для 3 разных ячеек. Аналогичные результаты были получены в отдельном эксперименте.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s006

(DOC)

Относится к Рис.5 . Оценка индекса Варбурга с AR-C155858. ( A ) Поглощение 5 мМ лактата измеряли в астроцитах в отсутствие и в присутствии 1 мкМ AR-C155858. Данные взяты из 10 ячеек в двух экспериментах. ( B ) Астроцит, экспрессирующий Laconic, последовательно подвергали воздействию 5 мМ азида и 1 мкМ AR-C155858. Прямые линии представляют собой наклоны накопления лактата, рассчитанные с помощью линейной регрессии в том же диапазоне значений отношения.Гистограмма показывает сводку наклонов (отношение Δ / мин), полученных для 10 ячеек в двух экспериментах. Рассчитанный индекс Варбурга составил 0,07 ± 0,006.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s007

(DOC)

Относится к Рис. 4 — 5 . Влияние флоретина, AR-C155858 и азида на определение лактата in vitro. Отношение mTFP / Venus измеряли в указанных условиях и выражали относительно контрольного значения в отсутствие лактата.Данные взяты из 6 определений в двух разных сенсорных экстрактах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057712.s008

(DOC)

Благодарности

Мы благодарим Карин Алегрию и Джессику Молина за техническую помощь, а также Карен Эверетт и Карлоса Кармона за критическое прочтение рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: ASM LFB. Проведены эксперименты: ASM SC IR RL. Проанализированы данные: ASM SC IR RL WBF LFB.Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: WBF. Написал статью: LFB.

Ссылки

1. 1. Gladden LB (2004) Метаболизм лактата: новая парадигма для третьего тысячелетия. J Physiol 558: 5–30.
2. 2. Брукс Г.А. (2009) Клеточно-клеточные и внутриклеточные лактатные челноки. J Physiol 587: 5591–5600. jphysiol.2009.178350 [pii]; 10.1113 / jphysiol.2009.178350 [doi].
3. 3. Pellerin L, Bouzier-Sore AK, Aubert A, Serres S, Merle M и др.(2007) Активно-зависимая регуляция энергетического обмена астроцитами: обновленная информация. Glia 55: 1251–1262.
4. 4. Barros LF, Deitmer JW (2010) Обеспечение глюкозы и лактата синапсом. Brain Res Rev 63: 149–159.
5. 5. Belanger M, Allaman I, Magistretti PJ (2011) Энергетический метаболизм мозга: фокус на метаболическом сотрудничестве астроцитов и нейронов. Cell Metab 14: 724–738 S1550-4131 (11) 00420-7 [pii]; 10.1016 / j.cmet.2011.08.016
6. 6. Wyss MT, Jolivet R, Buck A, Magistretti PJ, Weber B (2011) Доказательства in vivo лактата как источника энергии нейронов.J Neurosci 31: 7477–7485 31/20/7477 [pii]; 10.1523 / JNEUROSCI.0415-11.2011 [doi].
7. 7. Jolivet R, Allaman I, Pellerin L, Magistretti PJ, Weber B (2010) Комментарии к недавним исследованиям моделирования метаболических взаимодействий астроцитов и нейронов. J Cereb Blood Flow Metab 30: 1982–1986 jcbfm2010132 [pii]; 10.1038 / jcbfm.2010.132 [doi].
8. 8. Ринхольм Дж. Э., Гамильтон Н. Б., Кессарис Н., Ричардсон В. Д., Бергерсен Л. Х. и др. (2011) Регулирование развития олигодендроцитов и миелинизации глюкозой и лактатом.J Neurosci 31: 538–548 31/2/538 [pii]; 10.1523 / JNEUROSCI.3516-10.2011 [doi].
9. 9. Attwell D, Buchan AM, Charpak S, Lauritzen M, MacVicar BA, et al. (2010) Глиальный и нейрональный контроль мозгового кровотока. Nature 468: 232–243 nature09613 [pii]; 10.1038 / nature09613 [doi].
10. 10. Симидзу Х., Ватанабэ Э., Хияма Т.Ю., Нагакура А., Фудзикава А. и др. (2007) Глиальные каналы Nax контролируют передачу сигналов лактата нейронам для восприятия [Na +] мозга. Нейрон 54: 59–72.
11. 11.Сотело-Хитшфельд Т., Фернандес-Монкада И., Баррос Л.Ф. (2012) Острый контроль с обратной связью астроцитарного гликолиза с помощью лактата. Glia 60: 674–680 10.1002 / glia.22304 [doi].
12. 12. Suzuki A, Stern SA, Bozdagi O, Huntley GW, Walker RH и др. (2011) Транспорт лактата между астроцитами и нейронами необходим для формирования долговременной памяти. Cell 144: 810–823 S0092-8674 (11) 00132-2 [pii]; 10.1016 / j.cell.2011.02.018 [doi].
13. 13. Newman LA, Korol DL, Gold PE (2011) Лактат, продуцируемый гликогенолизом в астроцитах, регулирует обработку памяти.PLoS One 6: e28427 10.1371 / journal.pone.0028427 [doi]; PONE-D-11-12947 [pii].
14. 14. Ganapathy V, Thangaraju M, Prasad PD (2009) Переносчики питательных веществ при раке: актуальность для гипотезы Варбурга и не только. Pharmacol Ther 121: 29-40.
15. 15. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB (2009) Понимание эффекта Варбурга: метаболические потребности пролиферации клеток. Наука 324: 1029–1033.
16. 16. Теннант Д.А., Дюран Р.В., Готтлиб Э. (2010) Ориентация на метаболическую трансформацию для лечения рака.Nat Rev Cancer 10: 267–277 nrc2817 [pii]; 10.1038 / nrc2817 [doi].
17. 17. Ли Ю., Моррисон Б.М., Ли Ю., Ленгахер С., Фарах М.Х. и др. (2012) Олигодендроглии метаболически поддерживают аксоны и способствуют нейродегенерации. Nature 487: 443–448 nature11314 [pii]; 10.1038 / nature11314 [doi].
18. 18. Funfschilling U, Supplie LM, Mahad D, Boretius S, Saab AS и др. (2012) Гликолитические олигодендроциты поддерживают миелин и долгосрочную целостность аксонов. Nature 485: 517–521 nature11007 [pii]; 10.1038 / nature11007 [doi].
19. 19. Гао Ю.Г., Сузуки Х., Итоу Х., Чжоу Й., Танака Й. и др. (2008) Структурная и функциональная характеристика LldR из Corynebacterium glutamicum: репрессора транскрипции, участвующего в утилизации L-лактата и сахара. Nucleic Acids Res 36: 7110-7123 gkn827 [pii]; 10.1093 / nar / gkn827 [doi].
20. 20. Агилера Л., Кампос Э., Хименес Р., Бадиа Дж., Агилар Дж. И др. (2008) Двойная роль LldR в регуляции оперона lldPRD, участвующего в метаболизме L-лактата в Escherichia coli.J Bacteriol 190: 2997–3005 JB.02013-07 [pii]; 10.1128 / JB.02013-07 [doi].
21. 21. Деушл К., Окумото С., Фер М., Лугер Л.Л., Кожух Л. и др. (2005) Создание и оптимизация семейства генетически кодируемых сенсоров метаболитов с помощью полурациональной белковой инженерии. Protein Sci 14: 2304–2314.
22. 22. Day RN, Booker CF, Periasamy A (2008) Характеристика улучшенного донорского флуоресцентного белка для микроскопии с резонансным переносом энергии Форстера. Дж. Биомед Опт 13: 031203 10.1117 / 1.2939094 [DOI].
23. 23. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Nat Biotechnol 20: 87–90 10.1038 / nbt0102-87 [doi]; nbt0102-87 [pii].
24. 24. Takanaga H, Frommer WB (2010) Облегчительные переносчики плазматической мембраны функционируют во время транзита ER. FASEB J 24: 2849–2858 fj.09-146472 [pii]; 10.1096 / fj.09-146472 [doi].
25. 25.Siess EA, Brocks DG, Wieland OH (1978) Распределение метаболитов между цитозольным и митохондриальным компартментами гепатоцитов, выделенных от накормленных крыс. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 359: 785–798.
26. 26. Кауппинен Р.А., Хилтунен Дж.К., Хассинен И.Е. (1982) Компартментация цитрата в связи с регуляцией гликолиза и митохондриального трансмембранного протонного электрохимического градиента потенциала в изолированном перфузируемом сердце крысы. Biochim Biophys Acta 681: 286–291 0005-2728 (82)
    -0 [pii].
27. 27. Саха А.К., Лейбутт Д.Р., Дин Д., Ваввас Д., Себокова Е. и др. (1999) Цитрат и регуляция малонил-КоА в мышцах крысы in vivo. Am J Physiol 276: E1030 – E1037.
28. 28. Hung YP, Albeck JG, Tantama M, Yellen G (2011) Визуализация цитозольного окислительно-восстановительного состояния NADH-NAD (+) с помощью генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора. Cell Metab 14: 545–554 S1550-4131 (11) 00342-1 [pii]; 10.1016 / j.cmet.2011.08.012 [doi].
29. 29. Гао Ц., Ху Ц., Чжэн З., Ма Ц., Цзян Т. и др.(2012) Использование лактата регулируется регулятором LldR типа FadR у Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 194: 2687–2692 JB.06579-11 [pii]; 10.1128 / JB.06579-11 [doi].
30. 30. Brown MA, Brooks GA (1994) Транстимуляция транспорта лактата из везикул сарколеммы крысы. Arch Biochem Biophys 313: 22–28 S0003-9861 (84) 71353-1 [pii]; 10.1006 / abbi.1994.1353 [doi].
31. 31. Чжао Ю., Цзинь Дж., Ху Кью, Чжоу Х.М., Йи Дж. И др. (2011) Генетически закодированные флуоресцентные сенсоры для определения внутриклеточного НАДН.Cell Metab 14: 555–566 S1550-4131 (11) 00350-0 [pii]; 10.1016 / j.cmet.2011.09.004 [doi].
32. 32. Maughan DW, Henkin JA, Vigoreaux JO (2005) Концентрации гликолитических ферментов и других цитозольных белков в диффундирующей фракции протеома мышц позвоночных. Mol Cell Proteomics 4: 1541-1549 M500053-MCP200 [pii]; 10.1074 / mcp.M500053-MCP200 [doi].
33. 33. Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (1999) Динамические и количественные измерения Ca2 + с использованием улучшенных камелеонов.Proc Natl Acad Sci U S A 96: 2135–2140.
34. 34. Bittner CX, Loaiza A, Ruminot I, Larenas V, Sotelo-Hitschfeld T. и др. (2010) Измерение скорости гликолиза с высоким разрешением. Фронт нейроэнергетики 2: 1–11.
35. 35. Биттнер С.Х., Вальдебенито Р., Руминот I, Лоайза А., Ларенас В. и др. (2011) Быстрая и обратимая стимуляция астроцитарного гликолиза с помощью K ⁺ и отсроченный и стойкий эффект глутамата. J Neurosci 31: 4709–4713.
36. 36.Ruminot I, Gutiérrez R, Peña-Munzenmeyer G, Añazco C, Sotelo-Hitschfeld T, et al. (2011) NBCe1 опосредует острую стимуляцию астроцитарного гликолиза внеклеточным K ⁺ . J Neurosci 31: 14264–14271.
37. 37. Takanaga H, Chaudhuri B, Frommer WB (2008) GLUT1 и GLUT9 как основные участники притока глюкозы в клетки HepG2, идентифицированные с помощью высокочувствительного внутримолекулярного датчика глюкозы FRET. Biochim Biophys Acta 1778: 1091–1099.
38. 38. Ovens MJ, Davies AJ, Wilson MC, Murray CM, Halestrap AP (2010) AR-C155858 — мощный ингибитор переносчиков монокарбоксилата MCT1 и MCT2, который связывается с внутриклеточным сайтом, включающим трансмембранные спирали 7-10.Biochem J 425: 523-530 BJ20091515 [pii]; 10.1042 / BJ20091515 [doi].
39. 39. Георги Т., Энгельс В., Вендиш В.Ф. (2008) Регулирование использования L-лактата регулятором LldR типа FadR из Corynebacterium glutamicum. J Bacteriol 190: 963–971 JB.01147-07 [pii]; 10.1128 / JB.01147-07 [doi].
40. 40. Фер М., Лалонд С., Лагер И., Вольф М. В., Фроммер В. Б. (2003) Визуализация in vivo динамики поглощения глюкозы в цитозоле клеток COS-7 с помощью флуоресцентных наносенсоров. J Biol Chem 278: 19127–19133.
41. 41. Фер М., Фроммер В. Б., Лалонд С. (2002) Визуализация поглощения мальтозы живыми клетками дрожжей с помощью флуоресцентных наносенсоров. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 9846–9851 10.1073 / pnas.142089199 [doi]; 142089199 [pii].
42. 42. Окумото С., Лугер Л.Л., Мичева К.Д., Реймер Р.Дж., Смит С.Дж. и др. (2005) Обнаружение высвобождения глутамата из нейронов с помощью генетически закодированных наносенсоров FRET, отображаемых на поверхности. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 8740–8745 0503274102 [pii]; 10.1073 / pnas.0503274102 [doi].
43. 43. Lager I, Looger LL, Hilpert M, Lalonde S, Frommer WB (2006) Конверсия предполагаемого сахаросвязывающего белка Agrobacterium в датчик FRET с высокой селективностью по сахарозе. J Biol Chem 281: 30875–30883 M605257200 [pii]; 10.1074 / jbc.M605257200 [doi].
44. 44. Rouach N, Koulakoff A, Abudara V, Willecke K, Giaume C (2008) Астроглиальные метаболические сети поддерживают синаптическую передачу в гиппокампе. Наука 322: 1551–1555.
45. 45.Hussien R, Brooks GA (2011) Переносчик лактата митохондрий и плазматической мембраны и экспрессия изоформы лактатдегидрогеназы в линиях клеток рака молочной железы. Physiol Genomics 43: 255–264 Physiolgenomics.00177.2010 [pii]; 10.1152 / Physiolgenomics.00177.2010 [doi].
46. 46. Hashimoto T, Hussien R, Cho HS, Kaufer D, Brooks GA (2008) Доказательства комплекса окисления лактата митохондрий в нейронах крыс: демонстрация важного компонента лактатных челноков мозга.PLoS One 3: e2915 10.1371 / journal.pone.0002915 [doi].
47. 47. Dubouchaud H, Butterfield GE, Wolfel EE, Bergman BC, Brooks GA (2000) Тренировка на выносливость, выражение и физиология LDH, MCT1 и MCT4 в скелетных мышцах человека. Am J Physiol Endocrinol Metab 278: E571 – E579.
48. 48. Marcillac F, Brix B, Repond C, Johren O, Pellerin L (2011) Оксид азота индуцирует экспрессию транспортера монокарбоксилата MCT4 в культивируемых астроцитах с помощью cGMP-независимой транскрипционной активации.Glia 59: 1987–1995 10.1002 / glia.21240 [doi].
49. 49. Dimmer KS, Friedrich B, Lang F, Deitmer JW, Broer S (2000) Низкоаффинный транспортер монокарбоксилата MCT4 адаптирован к экспорту лактата в высоко гликолитические клетки. Biochem J 350, ч. 1: 219–27: 219–227.
50. 50. Tennant DA, Duran RV, Boulahbel H, Gottlieb E (2009) Метаболическая трансформация при раке. Канцерогенез 30: 1269–1280 bgp070 [pii]; 10.1093 / carcin / bgp070 [doi].
51. 51. Loaiza A, Porras OH, Barros LF (2003). Глутамат вызывает быструю стимуляцию транспорта глюкозы в астроцитах, о чем свидетельствует конфокальная микроскопия в реальном времени.J Neurosci 23: 7337–7342.
52. 52. Schmidt MM, Dringen R (2009) Дифференциальные эффекты йодацетамида и йодацетата на гликолиз и метаболизм глутатиона культивируемых астроцитов. Фронт нейроэнергетики 1: 1 10.3389 / neuro.14.001.2009 [doi].

Рассмотрены 5 лучших многомасштабных гитар с веерными ладами: 6, 7 и 8-струнные

У многомасштабной гитары есть накладка на грифе, которая включает в себя шкалу разной длины.

Более толстые струны на гитаре длиннее, а короткие — короче.

Это достигается расположением бриджа и гайки под углом, чтобы он выглядел «веером».

Многоуровневые веерные ладовые гитары являются фаворитом многих гитаристов, поскольку они обеспечивают повышенный комфорт, лучший контроль и улучшенную интонацию.

Если вы чувствуете, что вам нужна веерная многомасштабная гитара в вашей коллекции, есть несколько моделей на выбор, но я считаю, что Schecter Reaper 7 — лучшая.У него привлекательный корпус, длина шкалы 25,5 дюймов, отличный бридж и звукосниматели, и мне просто нравится ощущение грифа.

Но если Schecter не для вас (дизайн его корпуса весьма необычен!), Существует множество других.

В этой статье я рассмотрю Schecter Reaper 7 и другие многомасштабные гитары с веерными ладами, чтобы вы могли выбрать ту, которая лучше всего подходит для вас.

В этом посте мы рассмотрим:

Зачем вам использовать многомасштабную гитару с веерным ладом?

Мультимедийная гитара известна своей улучшенной интонацией и натяжением струн.Более длинные струны наверху обеспечивают басовитый тон, а высокие струны — ровный и четкий верхний диапазон. Конечным результатом является инструмент, который сочетает в себе тугие нижние струны, сохраняя при этом легкость игры на высоких.

Кроме того, расположение и натяжение струн делают игру более комфортной. И соло, и ритм играть легче, и гитаристы в целом имеют больший контроль.

Однако у веерных ладов есть свои плюсы и минусы.Вот некоторые из них, которые следует учитывать:

Плюсы многомасштабной гитары

• Меньшее натяжение струн на более высоких струнах облегчает их сгибание, что упрощает соло
• Большее натяжение нижних струн позволяет использовать струны более низкого калибра для улучшить звучание
• Высокие струны создают более плавный звук
• Низкие струны делают звук более четким, плотным и обеспечивают лучшую интонацию
• Большее пространство между более высокими струнами облегчает воспроизведение ритмов
• Производит постепенное увеличение натяжения струн, чтобы они лучше работает с большинством толщин струн
• Меньше обрезки высоких и низких струн

Минусы гитары с разной шкалой

• Более длинная длина грифа требует некоторого привыкания и может не подходить для всех игроков
• Большой вентилятор может быть неудобным для некоторых игроков и затруднять формирование определенных форм аккорда
• Ограниченные возможности звукоснимателя, хотя рынок улучшается g
• Ограниченные производственные возможности, хотя рынок улучшается.
• Если вам нужен конкретный вентилятор, возможно, вам придется настроить его по индивидуальному заказу.

Гитары Multiscale чаще всего используются гитаристами, играющими прогрессивный и техничный металл.

Что искать в многомасштабной гитаре с веерным ладом?

• Звук : Как и при покупке любой гитары, вам понадобится превосходный звук.
• Долговечность : Вам нужно, чтобы ваша гитара имела прочную конструкцию, чтобы выдержать испытание временем.
• Комфорт : К гитаре с веером нужно привыкнуть, но в конечном итоге вам понадобится гитара, на которой играть максимально комфортно.
• Вентилятор : Выбранный вами вентилятор будет напрямую влиять на звук.Например, если вы приобретаете гитару размером 25,5–27 дюймов, у нее будет веер на 1,5 дюйма, причем каждая струна будет длиннее на 0,25 дюйма по мере подъема от высшей к низшей.
• Другие особенности : поскольку веерные ладовые гитары не так популярны, как другие гитары, вам может быть сложно найти гитары с особыми функциями и звукоснимателями. Однако каждый год производители обновляются, чтобы сделать доступными больше моделей.

Безопасно доставьте свою гитару из точки А в точку Б с лучшими гитарными футлярами и чехлами.

Обзор лучших веерных гитар

Теперь, когда мы узнали, что такое многомасштабная веерная гитара и на что обращать внимание при покупке гитар, давайте посмотрим, что там есть.

Лучшая ладовая гитара с веером: Schecter Reaper 7

(просмотреть больше изображений)

Schecter известен изготовлением металлических гитар, и с таким именем, как ‘Reaper’, эта модель, как вы знаете, идеально подойдет для гитаристов, играющих тяжелую музыку. .

Корпус имеет отделку из болотного ясеня, которая создает отличный альтернативный вид.

The Reaper — семиструнный инструмент с металлическим корпусом и накладкой из черного дерева. У него есть хардтейл Diamond Decimator, струна для хипшота через бридж корпуса и звукосниматели Diamond Decimator.

(просмотреть больше изображений)

Он имеет длину шкалы 25,5 дюйма. Он оснащен ручками регулировки громкости и тембра, а также 5-позиционным переключателем.

Лучшая бюджетная гитара с веером: Jackson DKAD7 MS X-Series Dinky GB

(просмотреть больше изображений)

Гитара с веером имеет особую конструкцию, которая делает ее более дорогой, чем другие модели, но Есть такие, которые доступны по цене, например, Jackson DKAD7.

Его разумная цена делает его отличным выбором для гитаристов, которые хотят узнать, каково играть на веерном ладу. Название Jackson означает, что у него отличный металлический край.

Гитара имеет арочный корпус из красного дерева и цельный гриф из красного дерева, скрепленный болтами, сделанный из прочного графитового армирования и шарнира.

Лавровый 7-струнный гриф имеет 24 больших лада. Шкала составляет от 648 до 686 мм, а ширина порожка — 47,6 мм.

Поставляется с двумя звукоснимателями-хамбакерами Jackson Blade, имеет регулятор громкости, регулятор тембра и трехпозиционный тумблер.Он доступен в черном глянцевом цвете.

Лучшая дешевая 8-струнная гитара с веерным ладом: Harley Benton R-458BK

(просмотреть больше изображений)

8-струнная гитара является фаворитом среди метал-гитаристов. Это помогает им лучше достичь выпадающих настроек и получить приятный басовый тон.

Harley Benton — отличный выбор для метал-гитаристов, которые предпочитают гитарные гитары с веерными ладами. Его низкая цена означает, что вы можете увидеть, насколько он вам нравится, прежде чем делать больше инвестиций.

Гитара имеет корпус из липы, кленовый гриф и насадки на гриф на болтах. Радиус накладки грифа составляет 350 мм с 24 выступающими средними гигантскими ладами.

Имеет шкалу 686/648 мм. Он включает в себя 2 звукоснимателя HI-Gain для хамбакеров, одну ручку тембра, одну ручку громкости и трехпозиционный переключатель.

Его глянцевое черное покрытие делает его привлекательным выбором.

Чтобы узнать больше о других гитарах в металле, загляните в Best Guitar for Metal: 11 обзоров с 6, 7 и даже 8 струнами.

Лучшая гитара с веером без головы: Strandberg Boden Original

(просмотреть больше изображений)

Гитара без головы является фаворитом многих гитаристов. Поскольку он имеет меньший вес, распределение массы приближает гитару к корпусу, и настройка более стабильна.

Strandberg Boden — прекрасный выбор для тех, кто предпочитает семиструнные струны с веерным ладом. У него выделяющийся корпус, а дополнительная струна позволяет металлическим гитаристам играть на более низких низких частотах.

У Boden корпус из болотного ясеня с топом из клена пламени 4A, гриф из клена и гриф из клена Birdseye.

Его акустика делает его идеальным для игры на соло и ритм. Он имеет пассивные звукосниматели Suhr и активные звукосниматели Fishman, которые обеспечивают естественный звук даже при усилении.

Его масштаб варьируется от 25,5 до 26,25 дюйма. На корпусе есть ручка тембра и громкости, а также трехпозиционный селектор звукоснимателей.

Он имеет конструкцию с болтовым креплением, радиус грифа 20 дюймов и 24 лада, а также доступен как 8-струнный.

Лучшая шестиструнная веерная гитара: ESP LTD M-1000MS FM

(просмотреть больше изображений)

Большинство гитар, перечисленных здесь, семиструнные, но если вам нравится веерный лад, стиль и предпочитаете упрощать, ESP LTD M-1000MS может быть больше вашей скоростью.

ESP быстро превратились из бутика в популярный фаворит, особенно среди измельчителей. Они известны тем, что производят красивые гитары с великолепным звучанием.

У этой гитары корпус из красного дерева, гриф из кленового пламени и накладка на гриф из 5 кленового дерева.

Тонкий гриф с 24 ладами-джамбо, обеспечивающий отличные игровые возможности и широкий диапазон тембров. Масштаб колеблется от 673 до 648 мм.

Он имеет один пикап Сеймура Дункана Назгула и один пикап Сеймура Дункана Разумного. Ручки включают регулятор громкости и двухтактный регулятор тембра.

Блокирующий тюнер будет держать вас в тонусе. Его привлекательная прозрачная черная атласная краска делает его эстетичным.

Часто задаваемые вопросы о многомасштабной гитаре с веером

Вот несколько часто задаваемых вопросов о многомасштабных гитаре с веерным ладом:

Трудно ли играть на многомасштабных гитарах?

Гитары Multiscale требуют некоторого привыкания, но большинство гитаристов говорят, что, как только вы их поймете, они сделают игру более комфортной.

Это связано с тем, что установка повторяет естественный расклад ваших пальцев на грифе.

В чем преимущество семиструнной гитары?

Многие многомасштабные веерные лад-гитары имеют семь или даже восемь струн.

Добавленные струны предоставляют вам более широкий диапазон нот для игры без изменения настройки шестой струны.

Это также упрощает формирование аккордов и делает более удобным размещение пальцев.

Обеспечивает низкие ноты, идеально подходящие для тяжелых музыкальных стилей.

Какая стандартная настройка у семиструнной гитары?

Семиструнные гитары имеют верхнюю струну, настроенную на B, а все остальные струны имеют стандартную настройку.

Итак, пока седьмая струна настроена на си, остальные струны настроены на E A D G B E, переходя от шестой струны к первой.

Тем не менее, многие метал-гитаристы настраивают верхнюю струну на А, чтобы добиться лучшей настройки с выпадающим списком, улучшенных басовых линий и более легкого формирования пауэр-аккорда.

У восьмиструнных гитар верхняя струна настроена на F #, которую многие гитаристы настраивают на E по тем же причинам, по которым они настраивают B на A на семиструнной.

Мультимасштабные гитары лучше?

Это предмет для обсуждения и действительно зависит от игрока.

Однако большинство гитаристов согласны с тем, что более длинная нижняя струна обеспечивает лучшее натяжение.

Также утверждают, что он выравнивает натяжение гитары, улучшая интонацию.

Что такое гитара с нулевым ладом?

Нулевые лады — это лады, расположенные на грифе гитар и подобных инструментов, таких как банджо, мандолины и бас-гитары.

Если вы посмотрите на эти гитары, вы заметите несколько сантиметров пространства между концом грифа и маркером первого лада.

Эта установка предназначена для правильного размещения строк. Некоторые также утверждают, что на гитарах с нулевым ладом легче играть.

Многоуровневая гитара с веерным ладом — отличный выбор для гитаристов, которым нужны такие преимущества, как улучшенный комфорт и интонация.

Когда дело доходит до вариантов с веером, я считаю, что Schechter Reaper 7 лучше всего благодаря своей прочной конструкции, великолепному внешнему виду, семи струнам и другим функциям, обеспечивающим потрясающий звук и универсальность.

Но с таким большим количеством этих гитар на рынке, у вас явно есть работа для вас.

Что вы выберете в качестве фаворита?

Только начинаете с гитарой? Прочтите Лучшие гитары для начинающих: откройте для себя 13 доступных по цене электрооборудования и акустики

Джуст Нуссельдер, основатель Neaera, занимается маркетингом контента, отец и любит пробовать новое оборудование с гитарой в основе его страсти, и вместе со своей командой он с 2020 года создает подробные статьи в блогах, чтобы помочь лояльным читателям советами по записи и игре на гитаре.

Зацените меня на Youtube , где я опробую все это оборудование:

Лобовая пила Eclipse Deep — глубина 11-3 / 8 дюйма

Восемь причин рассмотреть возможность использования TR-FRET

Резонансный перенос энергии флуоресценции с временным разрешением (TR-FRET) — это технология, которая генерирует измеримый флуоресцентный сигнал, когда две биомолекулы сближаются.Это делает его идеальным для изучения широкого спектра биологических событий, в том числе многих, которые характеризуют клеточные сигнальные пути. До недавнего времени TR-FRET считался исключительной областью специализированных скрининговых лабораторий с высокой пропускной способностью. Однако растущая коммерческая доступность готовых к использованию наборов для иммуноанализа TR-FRET открыла этот метод для гораздо более широкого массового использования. В этой статье объясняется, какую пользу могут принести исследователи, решившие интегрировать TR-FRET в рабочие процессы.

По-настоящему однородная технология

В отличие от обычного сэндвич-ELISA, который включает в себя несколько инкубаций, перемежаемых длительными этапами промывки, TR-FRET следует простому протоколу без промывки, добавления и считывания.Это не только обеспечивает более быстрое получение результатов, но также повышает надежность анализа за счет минимизации количества этапов, на которых может быть внесена изменчивость. По мнению экспертов, при использовании предварительно оптимизированного набора для иммуноанализа TR-FRET время практической работы может составлять всего 5 минут, а готовые наборы повышают воспроизводимость экспериментов, тем самым сокращая количество повторных тестов, которые необходимо проводить. выполненный.

Высокая специфичность

В типичном иммуноанализе TR-FRET используются два антитела для сэндвич-детекции.Каждый распознает отдельный эпитоп на антигене-мишени, но в то время как одно антитело (донор) конъюгировано с лантаноидом, другое (акцептор) конъюгировано с маломолекулярным флуоресцентным красителем. Когда оба антитела связываются с мишенью, возбуждение донора приводит к передаче энергии соседней молекуле акцептора, производя сигнал, который прямо пропорционален концентрации мишени. По сравнению с такими технологиями, как вестерн-блоттинг, в которых для получения качественного результата используется только одно антитело, TR-FRET обеспечивает высокоспецифичные и количественные измерения в результате конфигурации сэндвич-анализа.

Исключительная чувствительность

Используя лантаноиды, такие как хелат европия, в качестве доноров, TR-FRET имеет очень низкий фоновый сигнал. Это объясняется исключительно длительным временем жизни флуоресценции (до 1 мс) лантаноидов, что позволяет им обеспечивать как временную, так и спектральную дискриминацию по сравнению с фоновой флуоресценцией. Поскольку длительная флуоресценция приводит к высокому отношению сигнал / шум, TR-FRET часто более чувствителен, чем ELISA, что делает его идеальной технологией для обнаружения фосфобелков.

Низкая флуоресцентная интерференция

Еще одним преимуществом длительного флуоресцентного времени жизни лантаноидов является то, что она снижает интерференцию флуоресценции, проблема, которая может быть особенно проблематичной при работе с аутофлуоресцентными клетками или лизатами, или флуоресцентными химическими веществами, которые часто встречаются в библиотеках соединений. Поскольку задержка между возбуждением и испусканием лантаноидов может быть намного больше, чем у традиционных флуоресцентных красителей, замена традиционного иммуноанализа, основанного на флуоресценции, на TR-FRET является эффективным подходом для решения этой проблемы.

Совместимость с широкими фильтрами возбуждения / излучения

Помимо длительного времени жизни флуоресценции, лантаноиды также обладают большим стоксовым сдвигом. Преимущество этого состоит в том, что он позволяет использовать молекулы-акцепторы, которые производят видимые, ближние или инфракрасные спектры излучения. Хотя такие акцепторы демонстрируют превосходное перекрытие со спектрами излучения хелата европия или подобных молекул, они подвержены гораздо меньшему количеству помех, чем многие другие флуоресцентные красители, но все же могут быть считаны с использованием существующих инструментов / фильтров TR-FRET для легкой интеграции в существующие рабочие процессы.

Чрезвычайно устойчивый

В отличие от флуоресцентных красителей, используемых для детекции во многих ELISA, донорные и акцепторные молекулы, используемые для TR-FRET, не страдают от фотообесцвечивания. Таким образом, стабильный сигнал предоставляет исследователям гораздо большую гибкость, например, устраняя необходимость хранить реагенты и аналитические планшеты в темноте и устраняя необходимость считывать данные с планшетов сразу после завершения эксперимента. TR-FRET также дает возможность считывать каждую пластину несколько раз, например, во время кинетического исследования или разрешает повторное считывание в случае возникновения проблем со считывателем планшета.

Сохраните драгоценный материал образца

Хотя анализы, основанные на оптической плотности, трудно уменьшить, поскольку сигнал зависит от концентрации, уменьшение TR-FRET намного проще. Флуоресцентные индикаторы позволяют проводить анализы TR-FRET с использованием всего 15 мкл клеточного лизата на лунку без ущерба для точности — функция, которая позволяет проводить больше тестов на образец, чем может быть достигнуто с помощью многих ELISA.

Доступные, готовые к использованию наборы для оптимизации рабочих процессов

При использовании имеющихся в продаже наборов для иммуноанализа TR-FRET нет необходимости проводить разработку и оптимизацию анализов на месте.Вместо этого готовые наборы содержат тщательно отобранные, хорошо совместимые пары TR-FRET-антитело с высокой степенью совместимости и снабжены проверенным положительным контрольным материалом для обеспечения надежных результатов анализа.