Тех характеристики лада х рей: LADA XRAY в Воронеже, купить новую LADA XRAY 2020 в автосалоне Воронеж-Авто-Сити: цены и комплектации, обзор, фото

Содержание

Лада Икс Рэй: цена Лада Икс Рэй, технические характеристики Лада Икс Рэй, фото, отзывы, видео

Отзывы владельцев Лада Икс Рэй

Лада Икс Рэй, 2016 г

Первые впечатления. Двигатель тянет нормально, можно пренебречь лишним переключением. Приборы читаются, но не очень, оптитрон был бы очень кстати. Приятно удивил режим работы дворников при включении омывателя. После окончания работы через некоторое время дворники делают еще один взмах. В салоне Лада Икс Рэй тихо, ничего не шумит, не дребезжит, но пластик дубовый. Проезжаем первую половину пути по федералке и сворачиваем на дорогу районного значения, асфальт целый, но местами очень неровный. Отличный полигон для проверки ходовых качеств автомобиля. С наступлением темноты слегка расстроил головной свет: ближний вроде нормальный, а дальний совсем не очень. Единое мнение, что не Гранте фары светят намного лучше. Далее расстраивает задняя подвеска. Ход подвески видимо меньше, чем у Гранты (и всех предыдущих переднеприводных ВАЗов) и на неровностях зад очень сильно подбрасывает, т.к. ход подвески вниз заканчивается очень быстро. Там где Гранта свободно поливает 110 км/ч, на Лада Икс Рэй пришлось ехать 80. Перед идет нормально и неровности глотает без проблем. У брата Ниссан Санни с похожей проблемой в задней подвеске и пришли к единому мнению, что заднюю подвеску «заниссанизировали», т.е. очень похожа на ниссановскую. Сегодня по этой дороге ехали трое взрослых и один ребенок, ситуация улучшилась, но не на много. Как уже кем-то было сказано раньше, очень не хватает плафона посередине салона. Позже была обнаружена и приятно удивила система помощи трогания в гору. Мне не нравится, что на дисплее бортового компьютера показывает или температуру окружающего воздуха или часы. Хотелось бы видеть и то и другое. При кратковременной стоянке температуры окружающего воздуха начинает врать. При положении ключа зажигания «радио» работает вентилятор отопителя. Режим дворников имеет регулируемую паузу. В режиме включения заднего дворника не хватает отдельного положения омывателя. После омывателя надо выключать задний дворник, иначе останется включенным в режиме пауза (единственный). Клиренс радует. Ну, пока вроде все. Не был обнаружен обдув ног задних пассажиров (тоже расстроило).

   Достоинства: шумоизоляция. Удобный салон. Клиренс.

   Недостатки: «козлит» задняя подвеска. Дальний свет.

  Алексей, Сузун


Лада Икс Рэй, 2016 г

В Лада Икс Рэй есть все, что есть, к примеру, в Honda CR-V, машина мягкая, очень хорошо рулится, бодрая, симпатичная, места с моим ростом 1.9 м более чем достаточно, над головой очень много пространства, сзади за собой сел и также ничего не давит. Приятная в управлении. Багажник двухсекционный, есть полочка, по бокам ниши большие, еще и в запаску положить что-нибудь можно. Из минусов: нет подсветки кнопок мультируля. Ночью на ощупь. Нет кнопки на руле для переключения треков, папок, надо отвлекаться и лезть в мультимедиа. Нет подсветки приборов в режиме ходовых огней и режиме авто, если день и горят только ходовые огни. Шкалы приборов мелкие. Нет подлокотника (опция за деньги). Нет датчика температуры двигателя. Нет зеркальца в козырьке для водителя (женщинам). Нет режима авто на стеклоподъемниках (не знаю, есть ли у конкурента Сандеро). Нет регулировки руля по вылету. Надо привыкать к роботу. Но не критично, я после автомата «Тоетовского» не чувствовал особого дискомфорта. Нормально переключает, надо притереться, и все будет хорошо. Плюсов у Лада Икс Рэй много: мягкость подвески на кочках. Хорошее руление на дороге. Приемистый мотор. Большой для своего класса салон. Клиренс визуально большой, ничего не висит под брюхом. Багажник с подпольем. Удобно. Классная камера, приятная и понятная мультимедиа. Звук колонок не плохой, не меломан, но играет хорошо. Обзорность хорошая. Большущий с подсветкой бардачок. Розетка 12 в в багажнике. Интересная внешность.

   Достоинства: в отзыве.

   Недостатки: в отзыве.

  Александр, Краснодар


Лада Икс Рэй, 2016 г

Лично для меня, внешний вид Лада Икс Рэй это что-то новое и свежее, получился достаточно индивидуальным, вживую смотрится намного интереснее, чем на фото. Железо в отличие от «Джентры» толще, нажатием пальца не продавливается. Качество сборки не уступает Форду Фьюжину, в плане зазоров. По ЛКП время покажет, на «Джентре» краска начала слазить в первые полгода, перекрашивал пороги и арки крыльев заново. В общем, качество окраски и сборки оцениваю на 4+ из 5. Внешний вид 5 из 5 (конечно дело вкуса). Интерьер — дубовый пластик везде, но смотрится достаточно хорошо, проехал 350 км, пока ничего не скрипит, не гремит, чистится легко. Приятная подсветка панели приборов, ярко светит плафон освещения салона, стоят диодные лампы. Высокая посадка, сиденья поначалу показались жёсткими, но постепенно начали принимать форму моей 5 точки, специально проверял, садясь на пассажирское сиденье, оно кажется более жёстким. Кондиционер работает хорошо. Печка не шумная. В сильный дождь от запотевания без кондиционера не справиться.

Коробка передач на Лада Икс Рэй работает чётко, в отличие от «Джентры», не хрустит, не свистит. Заметил одну интересную вещь, при включении первой и задней передачи обороты поднимаются сами, можно не газовать машинка покатится сама. Классная штука, помощь при трогании в горку, девушкам очень понравится. Двигатель достаточно резвый, несмотря на обкатку, намного шустрее «Джентры» и тише «Фьюжина». По шуму в салоне — X-ray самый тихий из всех моих бывших авто. Очень нравится, что двигатель цепной. Под капотом всё аккуратно, уже поездил по лужам и по грязи, под капотом чистота. Обзору в машине ничего не мешает, в Форде были слишком толстые стойки, в «Джентре» низковато. Подвеска что-то между «Фьюжином» и «Джентрой», в меру упругая, но по ямам на приличной скорости звук не очень приятный. На «Джентре» работала тише, но слишком вялая плохо отражалась на управлении. Клиренс на Лада Икс Рэй — это вообще подарок, не хватает полного привода. На трассе ведёт себя предсказуемо, боковым ветром не сдувает, хотя думал, будет как на Фьюжене, ветер очень чувствовался.

   Достоинства: интерессная внешность. Крепкое железо. Коробка. Работа подвески. Управляемость.

   Недостатки: пластик.

  Владимир, Тюмень


Лада Икс Рэй, 2017 г

Решил поделиться своими первыми впечатлениями от Лада Икс Рэй. Была у нас и 10-ка, потом «Нексия». Родилась дочка и нам стало тесно. Хотелось что то побольше и повыше. Что мы только не рассматривали — новую Ниву, Логан, Дастер, японцев. Ещё и цены скакнули, тут уж особо и не размахнуться. У тестя Дастер и мы тоже поначалу присматривали, но цена в 850 тыс. деревянных нас отпугнула. Нива нам очень понравилась, особенно расцветка Тундра, но древний двигатель и постоянный полный привод тоже сыграли не в её пользу. Все же это машина больше для рыболововохотников. У нас же почти 100% городское использование автомобиля, полный привод нужен только зимой. В Рязани снег не чистят, ждут пока он сам растает. Под конец отчаялись уже и решили брать новый Логан, но друг отца посоветовал глянуть новую Ладу — Весту и Лада Икс Рэй. Взяли с женой тестя и поехали смотреть, что за очередное чудо наши придумали. Я так-то слышал про эти машины, да и обзоры смотрел на них в интернете. Но тут, как говорится — лучше один раз потрогать, чем сто раз услышать. В общем, вживую нам машины обе понравились. Действительно красивые, что уж тут юлить. Весту мы не стали рассматривать как вариант – надоели седаны, а вот Лада Икс Рэй зацепил. В прайсе была комплектация за 639, хотели её, но оказалось, что завод снял их с производства. Следующая комплектация была за 680 — там не было белого цвета и ПТС в наличии, но были люксовые на механике и с 110 л.с. движком как мы хотели. Таким образом, ценник возрос до 712. Собирали средства всем миром, чтобы не в кредит и все-равно не хватало. В итоге дилер пошел нам на встречу и подарил коврики, обработку и скинул 7 тыс.р. Вроде мелочь, если учитывать общую стоимость машины, да и продажи у них никакие, а с другой стороны рубль хрен кто даст бесплатно. Так что мы даже очень рады.

   Достоинства: мягкость хода. Шумоизоляция. Удобный салон. Внешний вид.

   Недостатки: мелкие.

  Павел, Рязань


Лада Икс Рэй, 2017 г

Здравствуйте, купили на днях Лада Икс Рэй. Хотели Форд Фокус, но увы и ах, меньше чем за миллион не нашли. Не потянули. И тоже берут сомнения, а не прогадали ли мы. Это же все-таки ВАЗ. Супругу вроде нравиться. Соглашусь с тем, что до кроссовера он не дотягивает, скорей хэтчбек с высоким клиренсом. Первый косяк, обнаружили, не работает микрофон. Очень смущает пол, хлипко как-то там всё. Педаль газа не очень понравилась и её расположение. Кнопка стеклоподъемника — неудобно, изгибать руку нужно. Салон даже приблизительно до иностранных не дотягивает. Огромный плюс — ямы совсем не чувствуешь, вроде по езде очень даже пойдёт, я думаю за такие деньги авто для тех кто берет, чтобы ездить на ней, пока дышит, потому что мало верится, что года через три можно будет выгодно продать. Извините за сумбур.

   Достоинства: внешний вид. Подвеска.

   Недостатки: просчеты в эргономике. Нет ощущения качества.

  Ольга, Каменск-Уральский


Лада Икс Рэй, 2018 г

Отличная машина. Красивая, комфортная. По пересечённым местностям Лада Икс Рэй хорошо проезжает, хорошая подвеска. Мне и моей семье очень нравится. Стиль — будто машина из будущего. Отличные сиденья, задние и передние. Очень удобный экран (GPS, USB, AUX, Bluetooth), возможность подключить телефон и разговаривать это нечто. Также машина уведомит вас, если на вашем телефоне мало заряда. Это космос. Я всем её рекомендую. Семейный кроссовер подходит для всего, поездки на море, на природу, на дачу (это важное, так как чаще всего это грязь на дороге, но для такой машины это не проблема). Больше всего нравится динамика и стиль автомобиля и его салона, всё очень красиво и очень удобно. Идеально работает климат-контроль, какую угодно температуру выставляешь. Водительское сиденье регулируется по высоте. Автоматическое включение заднего дворника в дождь. Автоматическое срабатывание курсовой устойчивости. По трассе Лада Икс Рэй идёт идеально.

   Достоинства: внешний вид. Динамика. Вместительность салона. Багажник. Комфорт. Дизайн салона. Мультимедиа. Шумоизоляция. Подвеска. Проходимость. Качество сборки. Управляемость. Расход топлива. Надежность. Стоимость обслуживания.

   Недостатки: 5 передач.

  Александр, Воронеж


Лада Икс Рэй, 2019 г

Расхваливать Лада Икс Рэй не буду, машина справляется со всем, что она должна делать. Немного дегтя вот добавлю. Зимой после снегопада через сугроб вперед не едет, зато задом как на танке (удобнее все-таки передом ездить). И еще один недостаток — все-таки салон маловат будет (не машина, а сам салон). В остальном хороший получился автомобиль. Я не постесняюсь Лада Икс Рэй поставить в один ряд с Солярисом и Логаном, а то и выше. Вот если бы на нем да в нулевые, а так немного запоздали лет так на 11. Все работает исправно и ровно, но все равно не покидает то чувство, что едешь на обычной Калине (у меня до этого была). Ларгус повальяжнее будет. Опять зимой после 90 км/ч появляется чувство, что она начинает плавать (резина «Виатти» шипованная), но начинаешь рулить перестраиваться, все «рулится» и едет без подвохов. С другой стороны сейчас везде камеры, так что погонять не получается.

   Достоинства: очень маленький радиус разворота. Богатое оснащение для Лады. Внешний вид. Будет пошустрее на разгон чем Ларгус. Оцинкованный кузов.

   Недостатки: завышенный расход. Салон тесноватый будет. Шумоизоляция.

  Артем, Москва

 

Технические характеристики Lada XRAY | официальный дилер Лада в Екатеринбурге.

Технические характеристики

Модификации 1.6 MT (106 л.с.) 1.8 AMT (122 л.с.)
Двигатель
Марка топлива АИ-95 АИ-95
Мощность двигателя (л.с.) 106 122
Объем двигателя 1.6 1.8
Привод Передний Передний
Тип двигателя АИ-95 АИ-95
Топливный бак (л) 50 50
Трансмиссия 5 5
Габаритные размеры
Высота (мм) 1570 1570
Длина (мм) 4165 4165
Колесная база (мм) 2592 2592
Количество дверей 5 5
Количество мест 5 5
Объем багажника 361 / 1207 361 / 1207
Полная масса 1650 1650
Снаряженная масса 1190 1190
Ширина (мм) 1764 1764
Динамические характеристики
Время разгона (0-100 км/ч, с) 11.4 10.9
Максимальная скорость (км/ч) 176 186
Подвеска
Дорожный просвет (мм) 195 195
Задняя подвеска полунезависимая, пружинная полунезависимая, пружинная
Передняя подвеска независимая, пружинная независимая, пружинная
Размер колес 195 / 65 / R15 205 / 55 / R16 195 / 65 / R15 205 / 55 / R16
Расход топлива
Городской (л/100 км) 9.3 8.6
Загородный (л/100 км) 5.9 5.8
Километров на баке 694 735
Смешанный (л/100 км) 7.2 6.8

Основные характеристики

Длина кузова автомобиля достигает 4165 мм, ширина – 1764 мм, высота – 1570 мм. При этом колесная база составляет 2592 мм, клиренс – 195 мм.

Он может оснащаться двигателем объемом 1,4; 1,6 л. Мощность силового агрегата достигает 100 л.с.; 123 л.с.

Машина может иметь механическую — МТ или автоматическую — АТ коробку переключения передач. МКПП понравится водителям, которые хотят полностью контролировать процесс езды. АКПП максимально удобна автолюбителям, которые не имеют большого стажа вождения.

До скорости 100 км/ч авто разгоняется за 11.4 с. Чтобы преодолеть расстояние 100 км при езде в смешанном режиме, понадобится от 7.2 л горючего.

Полные технические характеристики Лада Икс Рей 2021 года выпуска Вы найдете на нашем сайте. Чтобы получить ответы на интересующие Вас вопросы, свяжитесь с менеджерами автосалона Селект Авто.

Купите кроссовер Lada XRAY в Самаре

Описание модели

Кроссовер LADA XRAY создан для тех, кто не привык теряться в толпе.

Быть выше, быть ярче, быть заметней, быть свободным – это стиль тех, кто выбирает LADA XRAY.

Максимум впечатлений уже ждёт Вас за рулём LADA XRAY!

Компактный – но солидный, высокий – но динамичный. Это LADA XRAY

Рельефная поверхность крыльев и дверей подчеркивает динамичный стиль уверенного в себе кроссовера. Автомобиль с развитой «мускулатурой» преуспевает во всех дисциплинах: скоростная поездка по трассе, маневрирование в тесноте города, уверенное движение по грунту, снегу и неровностям урбанистического пейзажа.

LADA XRAY создан по принципу «Автомобиль – мой второй дом»: интерьер машины комфортен и рационален.

В салоне — набор ниш и подстаканников, карманы в обивках дверей, охлаждаемый перчаточный ящик. В багажнике – крепления для сетки, пластиковые ниши за арками задних колес. Заднее сиденье складывается в пропорции 60/40, что позволяет при необходимости перевозить габаритный груз. Отделение под полом багажника для вещей, которые необходимо хранить не на виду. Обеспечена новая вместительность салона: увеличена длина салона, что улучшило комфорт для пассажиров заднего сиденья. Благодаря широкому заднему проему пятой двери просто и легко разместить багаж для всей семьи.

Динамика и комфорт

LADA XRAY – это комфортная и высокая посадка, особенно удобная в городе и на легком бездорожье, динамичный мотор, острая управляемость, хорошая шумоизоляция. Подвеска автомобиля настроена на активное маневрирование: газонаполненные амортизаторы и передний подрамник обеспечивают отличный контроль над дорогой. Высокий внедорожный клиренс вместе с энергоемким, беспробойным шасси гарантируют отличную проходимость.

Активная безопасность

За активную безопасность автомобиля отвечает функция курсовой устойчивости ESC.

Интеллектуальная система предотвращает занос автомобиля и включает ряд необходимых опций безопасности:

антиблокировочная система тормозов (ABS): в случае экстренного торможения сохраняет управляемость автомобиля;

усилитель экстренного торможения (BAS): при резком нажатии на педаль тормоза система автоматически повышает давление в тормозной магистрали, максимально эффективно замедляя автомобиль;

противобуксовочная система (TCS): обеспечивает динамичный старт на скользком или неоднородном покрытии, а в случае пробуксовки одного из колес система выполняет функцию блокировки дифференциала;

система распределения тормозных усилий (EBD): оптимально делит усилия между осями, предотвращая занос.

Пассивная безопасность

В каждом LADA XRAY – подушка безопасности водителя и пассажира, передние ремни безопасности с механизмом предварительного натяжения и ограничителем нагрузки.

Для комфортной и безопасной перевозки юных пассажиров LADA XRAY оснащен системой крепления детских кресел ISOFIX и блокировкой задних дверей.

Безопасный автомобиль – тот, который заметен на дороге. LADA XRAY никогда не потеряется в потоке, благодаря ярким светодиодным дневным ходовым огням. Светодиодная полоска выполняет и стилевую функцию, подсвечивая хромированный «Икс» передка.

Двигатели

Два варианта мотора позволяет выбрать LADA XRAY в соответствии с собственными потребностями в динамике. Двигатель мощностью 106 л.с. оснащается механической трансмиссией, а для наиболее мощного, 122-сильного мотора предлагается также автоматизированная трансмиссия (АМТ).

Подготовлен к суровым условиям
— двусторонняя оцинковка наружных панелей кузова;
— антикор днища и скрытых полостей кузова;
— увеличенный до 195 мм дорожный просвет;
— энергоемкая подвеска;
— шины с высотой профиля, оптимальной как на асфальте, так и на грунте;
— эффективный воздушный фильтр салона;
— проверенная временем платформа B0 – это надежное шасси, отработанная электроника, тщательно просчитанные силовые элементы кузова;
— пластиковая облицовка и резиновые уплотнители порогов: надежная изоляция от загрязнений.

Трансмиссия

АМТ, сочетающая функционал «механики» и «автомата», создана для России, поэтому ее работоспособность не зависит от температуры на улице. АМТ обладает полным функционалом механической коробки передач, включая торможение двигателем и возможность выехать «враскачку» из сугроба. В отличие от всех других вариантов трансмиссии, АМТ экономит топливо, продлевает ресурс автомобиля, а кроме того, она значительно доступней других автоматических коробок передач.

Yahoo News Japan (Япония): российский «монстр» танк Т-90М «Прорыв» поступает в войска | Военное дело | ИноСМИ

Популярный японский информационно-новостной сайт Yahoo News Japan в публикации под заголовком «Российский Ростех поставил в войска очередную крупную партию новейших модернизированных танков Т-90М „Прорыв»» сообщает об успешной программе модернизации в России танков линии Т-90 и создании на их базе настоящего «русского монстра», вызывающего горячий интерес во всем мире.

Сайт рассказывает о том, что программа модернизации старых танков Т-70 началась в России еще в 90-е года. Но тогда ей помешали экономические трудности, переживавшиеся страной. Новое дыхание российская программа модернизации танкового парка получила только с началом 2000-х годов.

Нынешняя вершина этой модернизации — танк Т-90М «Прорыв» — является кардинально обновленной машиной, по авиационным стандартам могущей быть отнесенной к классу 4++. Кардинально изменился не только внешний облик танка — он стал более приземистым, компактным и малозаметным, но и основные его показатели и характеристики.

На Т-90М «Прорыв» установлена принципиально новая башня. Она легко узнаваема по внешнему виду из-за находящегося сзади короба для боеприпасов. Машина получила 125-мм пушку, обеспечивающую применение новых боеприпасов высокого могущества, а также управляемых ракет, позволяющих поражать бронированные цели и даже вертолеты на дальности до 5 км.

The National Interest
The National Interest
The National Interest

При этом конструкторам удалось существенно увеличить внутренний забронированный объем пространства башни, благодаря чему внутри разместили дополнительное электронное оборудование и улучшили условия работы экипажа.

Боезапас танка Т-90М размещается и внутри корпуса, и во внешнем коробе, что повышает безопасность экипажа.

На танке стоит модульный комплекс динамической защиты третьего поколения.

Существенно повышена энерговооруженность танка. Новый 12-цилиндровый дизельный многотопливный двигатель выдает мощность до 1130 лошадиных сил (прежние модификации Т-90 — только 840 л.с.). Т-90 развивает скорость до 70 км/час по шоссе и до 45-50 км/час по пересеченной местности. Танк получил и более совершенную индивидуально-торсионную подвеску, которая обеспечивает высокую устойчивость машины на ходу и во время стрельбы.

Командир танка Т-90М обладает панорамным прицелом и высокоавтоматизированной системой управления огнем. Это позволяет значительно повысить точность огня, сократить время подготовки первого выстрела, внедрить автомат сопровождения цели.

Кроме того, новая электроника сделала возможным реализацию режима ведения огня «охотник — стрелок». Это когда командир ведет разведку целей независимо от положения башни, передает соответствующие данные и ставит задачи на их поражение наводчику, а тот самостоятельно их уничтожает одним нажатием кнопки на своем планшете. Одновременно командир продолжает наблюдение и разведку других объектов. Функция двухканального автоматического сопровождения целей (одновременно и независимо с места наводчика и командира) позволяет сократить время на их поражение в разы.

Отличные фото танка Т-90М в действии можно посмотреть здесь.

Комментарии японских читателей с сайта Yahoo News Japan

iso

Т-90М можно сравнивать с западными танками MBT, однако он значительно легче них и гораздо более энерговооружен. Танк очень приземистый и малозаметный. К тому же легкий и проходимый. Вообще в нем очень многое учтено из недостатков более ранних модификаций Т-90, в том числе и по результатам войны в Сирии и Ираке. Поэтому это вполне эффективная и опасная машина. Она является итогом целой цепи модернизаций и вобрала многое новое из мировой танковой техники. Нам в Японии, являющейся морской островной державой, нечего и думать и таких танках. Наша бронетанковая техника по сравнению с ними слаба. С другой стороны, в случае войны, таким танкам, как Т-90, развернуться в маленькой Японии будет трудно.

mat

Так что, свою знаменитую Т-14 «Армату» русские больше не производят? В 2015 году этот танк разрекламировали как самый совершенный танк в мире, а вот прошло более 5 лет, и в серийное производство его, судя по всему, не запустили. Что-то российское министерство обороны ничего не сообщает о поставках Т-14 в войска. Так что, русские удовлетворились сильно модернизированным вариантом Т-90М?

Судя по всему, эти танки уже совсем другие, чем старые первые Т-90. Думаю, они теперь вполне сравнимы с американскими М-1, если не превосходят их. Наверное, русские посчитали нерациональным массово производить «через силу» страшно дорогие Т-14.

С этими Т-14 много носился прежний российский министр обороны Сердюков, который говорил, что сделает этот танк подходящим для любых условий во всем мире. В чем-то в военной реформе успехов он добился. Но теперь в России новое военное руководство и новый курс в танковой технике?

а48

Думаю, проводимая русскими глубокая модернизация своего танкового парка вполне оправдана. Сколько бы мы ни уповали на дроны, но для окончательного прорыва последних оборонительных рубежей противника и его уничтожения без ударной силы танков не обойтись.

Видимо, в своей стратегии русские исходят из этой концепции и в целом правильно делают с учетом европейских пространств.

hokkyokusei

Большое преимущество Т-90М — это наличие у него системы армейского интернета, который объединяет в единое информационное пространство все объекты, оснащенные подобными комплексами, на поле боя. Такая же система есть и у Т-14. Благодаря этому танк может получать целеуказания даже о тех целях, которые экипаж визуально не наблюдает: координаты поступят с командного пункта, беспилотника или другого средства разведки на поле боя. Насколько я знаю, у западных танков пока такой системы нет.

yor

А мне кажется, в последнее время боевая ценность танковых колонн снижается. Их главный противник — дроны. Они могут летать и атаковать танки повсюду.

В мире уже получил развитие т.н. «дроновый терроризм». Скоро он и Японию накроет!

ugo

А русские, оказывается, довольно рациональный народ!

Берут одну какую-то базовую хорошо зарекомендовавшую себя модель или образец вооружений и последовательно модернизируя его, доводят до совершенства! Неплохо!

mbp

По-моему, это все результаты перестройки!

sak

Да, Т-90М — это настоящий монстр. И пушка у него огромная!

Материалы ИноСМИ содержат оценки исключительно зарубежных СМИ и не отражают позицию редакции ИноСМИ.

LADA XRAY в кредит по программе LADA Finance

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Гидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7» цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости (только для 1.8)
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7» цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электрогидроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Камера заднего вида
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости (только для 1.8)
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система с навигацией (7» цветной дисплей с TouchScreen, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

Технические характеристики Renault Sandero 2020-2021 у официального дилера

Технические характеристики Рено Сандеро 2021 года


Маневренный и экономичный хэтчбек Renault Sandero по характеристикам, надежности, уровню комплектации – оптимален как семейный автомобиль для современного города. При габаритах 4080х1733х1523 мм пятиместной машине с 320-литровым багажником легко находится место парковки, а благодаря усиленной подвеске, клиренсу 172 мм, штатной защите картера автомобиль не страшится съехать на разбитый проселок. После рестайлинга авто получило обновленную головную оптику, улучшенную аэродинамику кузова со стремительными линиями, которые характерны для более дорогих моделей производителя.

Новый Рено Сандеро: технические характеристики и оснащение


Автомобиль доступен на российском рынке с тремя модификациями 1,6- литровых бензиновых двигателей, ориентированных на различные условия эксплуатации:

  • 82-сильным мотором с распределенным впрыском и пятиступенчатой МКПП для небольших городов;
  • 16-клапанным двигателем мощностью 113 л.с. с механической пятискоростной КПП для регулярных длительных поездок по трассе;
  • 102-сильным агрегатом с четырехступенчатой автоматической коробкой передач для эксплуатации в мегаполисе.

Базовая версия Renault Sandero Access оснащается исключительно двигателем мощностью 82 л.с. Для комплектаций Life и Drive актуальны все три агрегата, которые разгоняют хэтчбек до скорости 163–177 км/час, ускоряются до 100 км/час за 10,7–13,9 секунды, расходуют на 100 км комбинированного цикла 6,6–8,6 л бензина.

Безопасность и комфорт


Зона повышенного внимания – безопасность всех участников дорожного движения. На всех автомобилях независимо от комплектации установлены подушки безопасности для водителя, крепления Isofix для детских кресел, ремни безопасности, системы распределения усилия торможения, «Эра-Глонасс». Среди опционального оборудования присутствуют датчики парковки, система курсовой устойчивости, ассистент движения на подъем.

Упростить управление и создать комфортную атмосферу, начиная с версии Renault Sandero Life, призвано штатно устанавливаемое оборудование:

  • бортовой компьютер;
  • круиз-контроль;
  • кондиционер;
  • противотуманные фары;
  • открываемый из салона лючок топливного бака.

По желанию собственника устанавливаются пакеты аудио и мультимедиа.

Рено Сандеро 2020-2021 года у официального дилера


Приобретая авто в Татарстане клиент вправе знать, что новый хэтчбек полностью готов к суровым испытаниям после установки зимнего пакета, большая часть опций которого, а также дистанционный пуск двигателя входят в основную комплектацию Renault Sandero Drive.

При обращении в дилерский центр доступен обширный перечень дополнительных возможностей:

  • тест-драйв с началом и окончанием в указанных точках;
  • покупка по программам автокредитования, trade-in, господдержки;
  • лизинг для юридических лиц;
  • регистрация транспортного средства;
  • приобретение оригинальных аксессуаров;
  • авторизованное техобслуживание.

Чтобы уточнить наличие, комплектацию, технические характеристики Рено Сандеро и купить автомобиль в Казани по рекомендованной производителем цене, приезжайте в автосалон «КАН АВТО», звоните по указанным телефонам, оставляйте заявку на сайте.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

3.1.3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия

Общие принципы флуоресцентной спектроскопии здесь не объясняются. Его можно найти в специальных учебниках [48], и его краткое изложение представлено на рис. 3.17.

Рисунок 3.17. Общий принцип флуоресцентной спектроскопии. (A) Представление основных переходов между двумя синглетными состояниями молекулы. На остальной части этого рисунка синие и зеленые стрелки (темно-серая и серая стрелка в печатных версиях) представляют собой поглощение света и его излучение флуоресценцией, соответственно.Оранжевая стрелка (светло-серая стрелка в версиях для печати) представляет релаксацию энергии за счет безызлучательных процессов. Для простоты теоретически запрещенный переход в более низкоэнергетическое триплетное состояние «T» не был представлен, но он лежит в основе излучения фосфоресценции. (B) Схематическое изображение флуоресцентного спектрофотометра. (C) Химическая структура и абсорбция (синяя кривая (темно-серая в печатных версиях)) — эмиссионные (зеленая кривая (серая в печатных версиях)) спектры флуоресцеина.

Наиболее распространенными флуоресцентными фрагментами являются органические флуорофоры (кумарины, флуоресцеины, родамины, оксазины и цианины в порядке увеличения длины волны флуоресцентного излучения), хелаты лантаноидов или флуоресцентные наночастицы (см. Главу 6.9).

Двумя наиболее интересными аспектами для целей этой книги являются измерение динамической релаксации светового излучения, позволяющее определить характерные времена жизни флуоресценции, и определение расстояния между двумя флуорофорами (наложенными на одном или двух различных молекул), используя эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

FRET обычно предназначен для определения расстояния (а также ориентации) между флуоресцентным донором ( D ) и акцептором ( A ). Эффективность безызлучательной передачи энергии между D и A зависит от следующего:

1.

Относительная ориентация D и A , которые рассматриваются как диполи

2.

Степень перекрытия спектров между спектром излучения флуоресценции D и спектром поглощения A

3.

Расстояние r между D и A

Если спектральное перекрытие между флуоресценцией D и поглощением A равно нулю, передачи энергии не будет, даже если D и A очень близки. Если есть спектральное перекрытие, то передача энергии масштабируется как величина, обратная шестой степени r , что типично для диполь-дипольных взаимодействий между небольшими молекулами (см. Главу 2.1). Эффективность передачи энергии тогда определяется как

(3,34) E = R06R06 + r6

В этом уравнении R 0 является критическим расстоянием, на котором эффективность передачи энергии снижается до 50% от максимальное значение при r = 0.

В теории Ферстера R 0 пропорционально квантовому выходу донора ( ϕ ) и интегралу спектрального перекрытия Дж между излучением спектр D и спектр поглощения A :

(3.35) R0 = (8,8 × 10-25) · K2 · ϕ · Jn4

, где K учитывает взаимную ориентацию D и A . n — показатель преломления используемого растворителя.

Перед проведением экспериментов FRET с определенной молекулярной системой необходимы следующие предварительные эксперименты:

1.

Квантовый выход донора должен быть измерен в растворителе, используемом для экспериментов FRET.

2.

Спектры флуоресценции D и спектры поглощения A необходимо измерить при концентрациях, используемых в эксперименте FRET для вычисления интеграла перекрытия J .

Эффективность FRET показана на рис. 3.18 для различных значений R 0 .

Рисунок 3.18. Эффективность передачи энергии резонанса флуоресценции в зависимости от расстояния между D и A для R 0 = 1 (), 2 ((серый в печатных версиях)) и 5 ​​((темно-серый в версии для печати)) нм.

На схемах в верхней части представлены изменения расстояния между D (обозначено звездочкой) и A (обозначено кружком) по отношению к конформационному изменению.

Справедливость уравнения. (3.35) был критически протестирован для дансил- (Pro) n -нафтилпептидов, проявляющих конформацию спирали полипролина типа II. Вдоль этой спирали расстояние между донором нафтила и акцептором дансила можно точно регулировать числом пролинов в аминокислотной последовательности [49].

FRET использовался для исследования многих механизмов реакции. Типичным примером является выяснение индуцированного вирусами слияния липидов, межфазного явления, имеющего фундаментальное значение в медицинских науках [50].

Флуоресцентная спектроскопия особенно полезна для исследования взаимодействий между биомакромолекулами, такими как белки, и их партнерами по связыванию. Действительно, взаимодействие может изменить локальную полярность вокруг флуорофора и, следовательно, локальные дипольные моменты. Это вызывает изменение положения либо самого низкого энергетического уровня (самая высокая занятая молекулярная орбиталь), либо / или энергетического уровня молекулярной орбитали возбужденного состояния (например, самая низкая незанятая молекулярная орбиталь) и, следовательно, изменение поглощения спектр, но еще более заметное изменение в спектре излучения.

В качестве примера рассмотрим собственные флуоресцентные аминокислоты в белках. Соответствующие флуоресцентные группы представляют собой боковые цепи триптофана (Trp в трехбуквенном коде аминокислот), тирозина (Tyr) и фенилаланина (phe). Среди этих боковых цепей Trp имеет самый высокий квантовый выход эмиссии. Максимум спектра поглощения расположен при 280 нм, а максимум излучения — при 340 нм в воде. Но этот максимум излучения смещается в сторону более коротких длин волн (синее смещение), если Trp находится в гидрофобной внутренней части белка, и смещается в сторону более высоких длин волн, когда белок разворачивается (см. Главу 2.9).

Интенсивность флуоресценции также можно изменить с помощью процессов гашения. График отношения интенсивности флуоресценции в отсутствие гасителя, F 0 , к интенсивности флуоресценции F в присутствии концентрации гасителя [ Q ] обычно дает прямую линию:

(3,36 ) F0F = 1 + KS · [Q]

Наклон этого так называемого уравнения Штерна – Фольмера дает константу тушения K S , которая напрямую связана со временем жизни флуоресцентной группы в отсутствие тушителя, τ , и бимолекулярной константе скорости процесса тушения, k q , согласно

(3.37) Ks = kq · τ

Экспериментально полученное значение k q часто сравнивают с константой скорости диффузии для бимолекулярного процесса k d = 2,0 × 10 10 л моль −1 с −1 . Когда k q > k d , процесс закалки ограничен диффузией, и процесс закалки является «статическим». Это означает, что существует комплексное образование между флуоресцентной молекулой в основном состоянии и гасителем.Процесс гашения также может быть «динамическим», подразумевая образование комплекса между флуоресцентной молекулой в возбужденном состоянии и гасителем.

Наконец, еще одно интересное применение флуоресцентной спектроскопии состоит в проведении анализов конкурентного связывания. Флуоресцентной молекуле (теперь называемой «рецептором» R ) сначала разрешается взаимодействовать с известной молекулой C ( C для «конкурента»), которая действует как гаситель и, как известно, связывается с известным область рецептора.Затем интересующий лиганд, L , титруют в рецепторном растворе; если интенсивность флуоресценции изменяется, C замещается L , что означает, что L связывается с рецептором в месте, близком к C . Хорошо известными примерами конкурентов флуоресценции альбуминов являются варфарин и ибупрофен, которые действуют как маркеры сайтов для сайта I (расположенного в субдомене IIA альбуминов) и сайта II (расположенного в субдомене IIIA альбуминов) соответственно [51].

Теперь мы сосредоточимся на реализации флуоресцентной спектроскопии на поверхностях.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

5.2 Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс электронной передачи энергии между двумя флуорофорами (т. Е. Флуорофором-донором и флуорофором-акцептором), приводящий к изменение излучаемого света, которое часто используется в чувствительных флуоресцентных детекторах.Предпосылкой для выполнения FRET является то, что спектр излучения донора должен перекрываться со спектром поглощения акцептора. Таким образом, выбранный донорный флуорофор ограничивает выбор акцепторного флуорофора. Еще одним условием FRET является то, что расстояние между донором и акцептором должно быть меньше 10 нм [85]. Таким образом, реакция системы FRET очень чувствительна к образованию и дезорганизации сэндвич-структуры между донором и акцептором. Здесь мы классифицируем систему FRET на два подкласса по разным акцепторам.Первый подкласс — это система FRET с флуорофорами в качестве акцепторов, такими как органические красители, квантовые точки и т. Д., Которые отображают согласованный спектр поглощения с излучением донора и передают поглощенную энергию излучению с другой длиной волны. Во втором подклассе акцептором является гаситель флуоресценции, который может поглощать и передавать энергию, поглощенную донорами, в тепло или другую энергию, но без испускания фотонов. Такой акцептор снижает интенсивность излучения, даже приводя к полному тушению флуоресценции.В этих случаях золотые наноматериалы, углеродные нанотрубки и листы графена всегда играют роль тушителей.

Благодаря своим широким и настраиваемым спектрам поглощения и высоким квантовым выходам квантовые точки и органические красители часто используются в качестве акцепторов в системах обнаружения FRET первого подкласса. Например, для обнаружения мальтозы была разработана эффективная система FRET на основе КТ и меченного красителем аналога сахара [86]. В этом исследовании в качестве доноров использовались нанокристаллы CdSe – ZnS ядро-оболочка, конъюгированные с мальтозосвязывающим белком (MBP) через координацию сродства к металлу.Два типа акцепторов были использованы для образования двух различных сенсорных систем FRET, соответственно, обозначенных как β-циклодекстрин-QSY9 и β-циклодекстрин-Cy3.5. После связывания домена β-циклодекстрина с MBP хвостатый QSY9 способен подавлять эмиссию QD, рис. 11.12A. Добавление мальтозы высвободит β-циклодекстрин-QSY9 за счет конкурентного связывания, что приведет к восстановлению флуоресценции. Точно так же в случае β-циклодекстрина-Cy3.5 Cy3 служит мостиком для передачи энергии от QD к Cy3.5, что приводит к красному свечению, Рис. 11.12B. Эта изящная конструкция использует двухступенчатый механизм FRET для реализации FRET на большие расстояния. Кроме того, аналогичная система FRET применяется для обнаружения тринитротолуола с высокой специфичностью в водной среде [87].

Рисунок 11.12. Иммуноанализ первого подкласса флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).

(A) датчики 560QD-MBP и (B) 530QD-MBP-Cy3-β-CD-Cy3.5 FRET. (C) Доноры люминола и акцептор квантовых точек на основе резонансного переноса энергии хемилюминесценции [86,88].

FRET — мощный инструмент для определения крошечного изменения расстояния между донорными и акцепторными флуорофорами или сворачивания конформации белка в событиях связывания. Однако, как и другие флуоресцентные технологии, традиционный FRET также страдает от фотообесцвечивания и автофлуоресценции. Поэтому разработана новая стратегия резонансного переноса энергии между хемилюминесцентным флуорофором и квантовыми точками, называемая резонансным переносом энергии хемилюминесценции (CRET). По сравнению с FRET возникновение CRET легко запускается из-за окисления люминесцентной подложки, вместо того, чтобы использовать возбуждающий лазер.Например, реакция люминол / H 2 O 2 CL, катализируемая HRP, может быть выбрана для образования чувствительной системы CRET с квантовыми точками [88]. Как показано на рис. 11.12C, QD, модифицированные BSA, могут быстро взаимодействовать с HRP, связанной с антителом BSA (анти-BSA), где происходит CRET. В этой стратегии HRP в качестве катализатора напрямую комбинируется с QD, которые могут непрерывно катализировать выделение донора CL (то есть люминола), в конечном итоге достигая эффективного CRET. Однако CRET требует дополнительного количества H 2 O 2 , что усложняет реакционную систему, увеличивает рабочие процессы и чувствительно к условиям окружающей среды.Более того, эмиссия квантовых точек может быть подавлена ​​высокой концентрацией H 2 O 2 .

Во втором подклассе системы FRET чаще всего используются наноматериалы Au, такие как наночастицы Au и наностержни Au. Предполагается, что наноматериалы Au обладают высокой эффективностью тушения флуоресценции и относительно большим эффективным расстоянием [89]. Во-первых, разница в размерах между крупными донорами наноматериалов Au и молекулярными акцепторами повышает эффективность ЭТ от донорно-акцепторных пар с увеличением расстояния.Во-вторых, их сечения поглощения и рассеяния света удивительно велики, обычно на несколько порядков больше, чем у обычных красителей [90], что значительно усиливает их поглощение до передаваемой энергии. Кроме того, нет необходимости в ориентации донора для продолжения ET, когда сферические наночастицы Au используются в качестве акцепторов. Как следствие, на основе наноматериалов Au разработаны многие системы обнаружения FRET для проведения чувствительных и точных обнаружений [89,91].Например, чувствительный и совместимый флуоресцентно-активируемый зонд на основе AuNP был предложен для сверхчувствительного обнаружения PSA в сыворотке крови пациентов (рис. 11.13A). В этой конструкции AuNP обладают высокой эффективностью загрузки органических красителей, которые могут полностью высвобождаться тиолсодержащим цистеамином. Таким образом, система детектирования FRET реализовала сверхвысокую чувствительность 0,032 пг / мл для ПСА, что в 2 раза меньше, чем у традиционного детектирования флуоресценции [92].Однако анализ, проводимый в микротитровальных планшетах, требует разделения сыворотки / плазмы при обнаружении цельной крови и повторных процессов промывки, чтобы избежать флуоресцентного фона и неспецифической абсорбции, которые являются трудозатратными и требуют много времени.

Рисунок 11.13. Иммуноанализы с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) с использованием наночастиц золота в качестве гасителя.

(A) Представление активируемых наночастиц красителя и золота (AuNP) FRET иммуноанализа на простатоспецифический антиген.(B) Одностадийный иммуноферментный анализ UCNPs-AuNPs FRET на IgG козы [92,93].

Затем была разработана одностадийная система FRET на основе твердой подложки in situ с повышающим преобразованием и AuNP для прямого обнаружения цельной крови [93]. Как показано на рис. 11.13B, UCNP предварительно внедряют на предметное стекло, а AuNP, модифицированные с помощью IgG, конъюгированы с UCNP перед обнаружением. При смешивании с образцом аналита козий IgG, присутствующий в образцах, будет конкурентно связываться с UCNP и вынудить AuNP отключиться, что приведет к восстановлению флуоресценции UCNP по мере увеличения концентрации анализируемого вещества.Аналогичная система UCNPs-AuNPs FRET также применяется для обнаружения сверхчувствительных бактерий с использованием аптамеров вместо антител в качестве лигандов распознавания на поверхности наночастиц [91].

В отличие от нульмерных AuNP, графеноподобные наноразмерные двумерные наноматериалы (например, графен, оксид графена [GO], MoS 2 , SnS 2 , WS 2 ) обладают большим поперечным сечением, два -размерное распределение нарушений и случайная ориентация активных центров, которые использовались в системах FRET с невероятно увеличивающейся скоростью, рис.11.14. В предыдущем отчете был разработан иммуноферментный анализ FRET на основе наноразмерного графена и КТ CdTe для точного обнаружения гликопротеина AFP для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы [94]. В этой системе присутствие целевого AFP может вызвать создание конъюгатов QD / AFP / нанографен и снизить интенсивность флуоресценции QD, в результате чего достигается эффективность тушения 66% ± 4% и предел обнаружения 0,15 нг / мл. Что еще более важно, авторы обнаружили, что система на основе нанографена и квантовых точек превысила предел расстояний традиционных систем FRET.Они получили эффективное расстояние FRET приблизительно 22,3 нм по сравнению с максимумом 10 нм в традиционных системах FRET; высокая гибкость и случайное расположение двумерного графенового нанолиста способствует их перекрытию с квантовыми точками с образованием различных эффективных конфигураций квантовых точек-графен. Нанолист GO был использован вместе с пептидом SNAP-25, модифицированным зеленым флуоресцентным белком, для создания сверхчувствительного биосенсора FRET [95]. В этом биосенсоре восстановление интенсивности флуоресценции показало линейную зависимость с логарифмической концентрацией целевых нейротоксинов ботулина (BoNT) в широком диапазоне обнаружения от 1 фг / мл до 1 пг / мл.Более того, новый биосенсор FRET не только может определять концентрацию целевого аналита, но также может оценивать протеазную активность BoNT-LcA. Примечательно, что именно протеазная активность целевого BoNT-LcA привносит в детекцию эффект амплификации и способствует сверхвысокой чувствительности. Впоследствии графеновые квантовые точки (GQD) с функционализацией амином были использованы в качестве доноров в датчике FRET с графеновым нанолистом в качестве акцепторов для обнаружения сердечного приступа [96]. Сердечный тропонин I (cTnI) является золотым стандартом для диагностики инфаркта миокарда (ИМ), что обуславливает его высокую специфичность для определения ИМ.Однако референсный предел концентрации cTnI в клиниках довольно низок и составляет 0,04 нг / мл, что создает проблемы для традиционных методов обнаружения. Здесь система FRET GQDs-графен преодолела эту проблему, реализовав очень низкий предел обнаружения 0,192 пг / мл и сверхширокий диапазон обнаружения, шесть порядков величины для целевой концентрации аналита от 1 до 10 6 пг / мл.

Рисунок 11.14. Иммуноанализы с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) с использованием 2D-графена в качестве гасителя.

(A) Иммуносенсор FRET на основе оксида графена для обнаружения патогенов и белков. Безызлучательный перенос энергии (NRET) от полупроводниковых квантовых точек к соседним двумерным листам (B) MoS 2 или (C) SnS 2 однослойной и малослойной толщины [98–100].

Праймер для молекулярных выражений для микроскопии: специализированные методы микроскопии — FRET


Микроскопия с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET)
Вводные понятия

Точное местоположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением.Метод резонансного переноса энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости.Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному хромофору без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью событий, зависящих от растворителя, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансной передаче энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем эффекты растворителя на коротких расстояниях, а диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая в первую очередь зависит от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано излучением фотонов и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора. Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофора разделены расстоянием примерно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами. Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET.На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка. Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофоры. Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках.Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET. Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков.Если два белка, один из которых мечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса на длине волны максимальной абсорбции будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках.В дополнение к изучению взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору, акцептору.В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь. Теория, предложенная Теодором Ферстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Ферстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновений и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается усиленное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3). Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора.Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора в резонансной передаче энергии флуоресценции. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками.Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3). Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев.В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Ферстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их. Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров.На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий. В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти.Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора. Согласно теории Ферстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

K T = (1 / т D ) [R 0 / r] 6

, где R (0) — критическое расстояние по Ферстеру, , t (D), — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры.Критическое расстояние Ферстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость переноса равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора. Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Ферстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии. Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц.Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R 0 = 2,11 x 10 -2 [k 2 J (l) h -4 Q D ] 1/6

, в котором k-квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (l) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и поглощения акцептора (с длина волны, выраженная в нанометрах), h представляет собой показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , посредством уравнение:

r = R 0 [(1 / E T ) — 1] 1/6

и E (T) оценивается как:

E T = 1 — (t DA / t D )

, где t (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов переходов донора и акцептора и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве энергии резонанса флуоресценции. передаточная пара. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии непосредственно применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в поворот зависит от k -квадрат, J (l) , h и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Ферстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от изменений в J (l) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Frster для обычных пар донор-акцептор RET
Донор Приемник Frster Distance
(нанометры)
Триптофан Дансил 2.1
IAEDANS (1) ДДПМ (2) 2,5 — 2,9
BFP DSRFP 3,1 — 3,3
Дансил FITC 3,3 — 4,1
Дансил Октадецилродамин 4.3
CFP GFP 4,7 — 4,9
CF (3) Красный Техас 5,1
Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 — 5,5
Cy3 Cy5 > 5.0
GFP YFP 5,5 — 5,7
КУЗОВ FL (4) КУЗОВ FL (4) 5,7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6,1
FITC Тиосемикарбазид эозина 6.1 — 6,4
B-фикоэритрин Cy5 7,2
Cy5 Cy5,5 > 8,0
(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина 4)
(4 , 4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен
Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( k -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Ферстера верна и применима к измерению расстояний, эта переменная по-прежнему вызывает споры.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения к в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимается значение 0,67. применены. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате k становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате k . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений k -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния, возможно, до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если не невозможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые данные указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит.С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для k -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, условия, которое вряд ли будет достигнуто. Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( k -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

k 2 = (cos q T — 3cos q D cos q A ) 2 = (sin q D sin q A cos f — 2cos q D cos q A ) 2

, где q (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, q (D) и q (A) — углы между этими диполями и вектором соединяющий донор и акцептор, а f — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше R (0) .Из-за сильной (в шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены с помощью FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но просто и надежно по его результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекул донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей дипольный перенос, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии донорных и акцепторных молекул.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований к флуорофорам, образцу и режиму (режимам) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для микроскопии FRET (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способного наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на Рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе, чтобы исследовать и регистрировать ячеек с использованием стандартного светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ) освещения.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией для выявления пространственного расположения флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье для получения широкоугольной флуоресценции и получения изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рисунке 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, следует учитывать ряд важных практических моментов, когда измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии проводятся с помощью оптического микроскопа:

  • Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.

  • Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.

  • Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.

  • Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным.Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.

  • Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.

  • Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.

  • Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.

  • Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации ( k -квадрат). Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.

  • При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.

  • Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.

  • Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации.Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов. Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Обнаружение FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам.Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансной передачи энергии, обычно используется отношение двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET.Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора. Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии.Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения. Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора.На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям. Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров.Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансной передачи энергии между двумя белками

.

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений флуоресцентного резонансного переноса энергии в целом, некоторые очень специфичны для оптического микроскопа.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии.Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектрального просвечивания) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая испускания донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рис. 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( t ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (т) = I 0 эксп (-т / т)

, где I (0) — это начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — это интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( t ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощить возбужденное состояние. резонансной передачей энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (а)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (b) )) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( f ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( t (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( t ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии посредством измерений в установившемся режиме, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Мэрилендский университет и Институт биотехнологии Мэрилендского университета (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Томас Дж. Феллерс и Майкл У.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 г. Ист. Поль Дирак, доктор философии, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.


НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.
© 1998-2021, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения правообладателей.Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми юридическими положениями и условиями, изложенными владельцами.
Этот веб-сайт поддерживается нашей командой

по графике и веб-программированию
в сотрудничестве с оптической микроскопией в Национальной лаборатории сильного магнитного поля
.
Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 14:19
Счетчик доступа с 26 ноября 2004 г .: 83039
Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов,

используйте кнопки ниже для перехода на их веб-сайты:

Роль диффузии ориентации и разделения флуорофоров в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это широко используемый метод одиночных молекул для измерения наноразмерных расстояний от изменений безызлучательной передачи энергии между донорными и акцепторными флуорофорами.Для макромолекул и комплексов эта наблюдаемая эффективность переноса используется для вывода изменений в молекулярной конформации в различных экспериментальных условиях. Однако иногда наблюдаются сдвиги в эффективности FRET даже при наличии убедительных экспериментальных доказательств того, что конформационное состояние молекулы не изменилось. Мы исследуем способы, которыми такие расхождения могут возникнуть из-за кинетических эффектов. Мы показываем, что значительные сдвиги могут возникнуть из-за взаимодействия между кинетикой возбуждения, ориентационной диффузией флуорофоров, разделительной диффузией флуорофоров и неизлучающим тушением.

Образец цитирования: Wallace B, Atzberger PJ (2017) Фёрстеровский резонансный перенос энергии: роль диффузии ориентации и разделения флуорофора в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET. PLoS ONE 12 (5): e0177122. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122

Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

Поступила: 15.11.2016; Принят к печати: 21 апреля 2017 г .; Опубликовано: 19 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Wallace, Atzberger.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные, использованные в исследовании, представлены непосредственно в документе.

Финансирование: Эта работа была поддержана карьерным грантом Национального научного фонда 0956210, Национальным научным фондом: Отделение математических наук 1616353 (www.nsf.gov) и CM4 DESC0009254 Министерства энергетики США (http://science.energy.gov/ascr/).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

1 Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — широко используемый метод измерения одиночных молекул для измерения расстояний внутри и между молекулами [1, 2]. FRET основан на безызлучательной передаче энергии между возбужденной молекулой донора и молекулой акцептора.Ферстер разработал теорию безызлучательного переноса, основанную на диполь-дипольных взаимодействиях [1, 3]. Для расстояния R теория Ферстера предсказывает масштабирование эффективности передачи энергии как ∼ ( R / R 0 ) −6 . На практике обычно R 0 ∼ 1 нм [1–3]. Экспериментальная реализация с использованием FRET в качестве «спектроскопической линейки» для измерения расстояний внутри отдельных молекул была введена в экспериментах Страйера и Хогланда в 1960-х годах [2, 4, 5].С этого времени FRET продолжала развиваться и стала универсальным инструментом, широко используемым в биологических науках и биотехнологиях [6–10].

В биологических науках FRET используется для сообщения о межбелковых взаимодействиях [11, 12]. На уровне одной молекулы FRET использовался для измерения расстояний между метками при характеристике структур и динамики макромолекул, включая РНК, ДНК, белки и их молекулярные комплексы [6, 13-15]. Измерения FRET, зависящие от времени, были разработаны для характеристики кинетики реакции ферментов [6, 16–18], взаимодействий лиганд-рецептор [7, 19–21], конформационной динамики белков [13, 22, 23] и движения молекул моторные белки [24, 25].

Многие типы молекул могут быть использованы для образования пары акцептор-донор в FRET. Некоторые молекулы обладают фотофизикой, которая приводит к тушению без излучения при взаимодействии с окружающими химическими частицами или внутримолекулярными химическими группами [26–30]. Это дает возможность использовать зонды FRET для сообщения о локальной концентрации химических веществ, таких как ионы металлов [26, 31] в воде или ионы Ca + , высвобождаемые во время нейрональной активности [15]. В развивающейся биотехнологии FRET также используется для разработки новых типов высокоточных сенсоров для обнаружения одиночных молекул и высокопроизводительных анализов для скрининга [7, 8, 20].

В однопарном FRET (spFRET) одна пара акцепторных и донорных молекул используется для измерения внутримолекулярных расстояний [4]. Чтобы охарактеризовать различные молекулярные конформационные состояния или гетерогенные состояния субпопуляций, ратиометрический анализ используется для оценки эффективности переноса E [18, 32]. При повторных измерениях это обычно отображается в виде гистограммы значений эффективности E . В различных экспериментальных условиях, таких как введение денатуранта, сдвиги в наблюдаемой гистограмме эффективности интерпретируются как изменения в конформационном состоянии молекулы [6, 14, 23, 33].В недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было замечено, что в некоторых ситуациях такие сдвиги FRET могут происходить даже тогда, когда нет явных изменений в конформационном состоянии. Это открытие подтверждается экспериментами, в которых рентгеновское рассеяние молекул указывает на отсутствие конформационных изменений или вовлеченная молекулярная структура по своей природе жесткая, такая как полипролиновая цепь [34, 35]. Прецедент такого изменения эффективности обусловлен свойствами среды. Эксперименты, подобные тем, что были выполнены Жангом, Фу, Лаковичем и другими [36, 37], демонстрируют, что присутствие посторонних частиц (в частности, серебра в их исследованиях) может влиять на донорно-акцепторное взаимодействие.Более того, результаты Макарова и Плакско [38] предполагают, что для гибкого полимера не только конформационное состояние, но и сквозная кинетика могут влиять на наблюдаемую эффективность FRET.

Это представляет собой важный вопрос характеристики того, как могут происходить сдвиги в эффективности FRET при очевидном отсутствии каких-либо изменений в конформационном состоянии. Мы исследуем с помощью теории и стохастического моделирования роль, которую играет кинетика возбуждения, ориентационная диффузия флуорофоров, разделительная диффузия флуорофоров и неизлучающее тушение.Наши результаты нацелены на количественную оценку величины этих эффектов и помочь определить режимы, в которых эти факторы могут повлиять на экспериментальные измерения.

2 Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

2.1 Эффективность передачи

Эффективность FRET — это доля энергии, которая без излучения передается от донора к молекуле акцептора. Первоначально предполагается, что энергия может быть испущена только как донорный фотон или без излучения передана акцептору, чтобы в конечном итоге испускаться как акцепторный фотон.В этом случае эффективность переноса связана со скоростями испускания фотонов донора и акцептора κ A и κ D как (1) Мы проиллюстрируем процесс донорно-акцепторного переноса на рис. 1.

Рис. 1. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET).

Молекула-донор возбуждается до более высокого энергетического состояния адсорбированным фотоном. Донор возвращается в свое основное состояние, испуская фотон или передавая энергию молекуле акцептора.Возбужденное состояние акцепторной молекулы релаксирует за счет испускания фотонов. Показаны два широко используемых донорно-акцепторных красителя Cy 3 и Cy 5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g001

Для некоторых систем может быть важно учитывать также дополнительные фотохимические состояния, как в [39, 40], или передачу энергии от столкновений с другими молекулами. в растворе, что приводит к безизлучающему тушению [28–30]. Мы рассмотрим некоторые из этих эффектов в следующих разделах.

Теория Ферстера предсказывает, что скорость безызлучательного переноса κ T зависит от расстояния разделения донор-акцептор R как (2) Это основано на диполь-дипольных взаимодействиях и разделительных расстояниях, меньших длины волны излучающего фотона [1–3]. τ D = 1/ κ D обозначает среднее время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.Характерное расстояние Ферстера R 0 зависит от фотофизики молекул донора и акцептора через (3) N A — это число Авогодроса, κ 2 фактор, связанный с относительной ориентацией диполь-диполей донор-акцептор [5, 41], Φ D — квантовый выход флуоресценция донора при отсутствии акцептора, Дж, — интеграл перекрытия, связанный со спектром адсорбции донора и акцептора, n — показатель преломления.Более подробно см. [1–3, 5, 10, 42].

Когда вся переданная энергия немедленно испускается как акцепторный фотон, мы имеем κ A = κ T . Тогда зависимость эффективности FRET от расстояния может быть выражена как (4) Теория Ферстера имеет важную полезность, заключающуюся в том, что расстояние разделения донора и акцептора R может быть определено из наблюдений E . Для получения R 0 требуется только принципиальное знание некоторых свойств фотофизики донорных и акцепторных молекул.Это позволяет использовать FRET в качестве эффективной линейки наноразмеров для молекулярных систем [4, 23, 24, 27, 43].

2.2 Однопарный FRET для молекул, диффундирующих в свободном растворе

Чтобы получить измерения отдельных молекул для свободно диффундирующих молекул, донор обычно возбуждается, ожидая, пока отдельная молекула диффундирует в фокус лазерного луча [6, 18, 23, 24]. Когда молекула находится в области, достаточно близкой к фокальной точке лазера (в пределах фокального объема), донор возбуждается с высокой вероятностью, и происходит последовательность эмиссии донорных и акцепторных фотонов, см. Рис. 2.За время нахождения молекулы в фокальном объеме можно подсчитать количество обнаруженных донорных и акцепторных фотонов n D , n A . Это позволяет сделать пропорционально-метрическую оценку эффективности переноса как [18, 32] (5) Эти экспериментальные данные об эффективности FRET затем обычно объединяются для формирования гистограммы наблюдаемой эффективности передачи энергии E . Мы отмечаем, что на практике существует ряд важных соображений для таких экспериментов, таких как разработка критериев того, когда такая последовательность излучений должна считаться значительным событием FRET или когда есть короткие длительности в фокусном объеме или дробовой шум. .

Рис. 2. Одномолекулярное событие FRET.

Событие FRET начинается, когда молекула, помеченная парой донора и акцептора, диффундирует в объем достаточно большой лазерной интенсивности вблизи фокальной точки (слева). Подсчет зарегистрированного излучения фотонов для акцептора n A и донора n D регистрируется до тех пор, пока молекула не диффундирует за пределы фокального объема (вверху справа). Во время возбуждения донора либо излучается фотон, либо энергия безызлучательно передается акцептору и испускается со скоростью, зависящей от конформации молекулы (внизу справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g002

Гистограмма эффективности дает характеристику относительных пропорций различных конформационных состояний или субпопуляций молекул, встречающихся во время измерения. Для случая гомогенных молекул в одном и том же конформационном состоянии ожидается, что гистограмма эффективности покажет узкий пик вокруг характеристической эффективности FRET, соответствующей донарно-акцепторному разделению конформации.Тогда естественно рассматривать изменения в конформационном состоянии молекулы, ища сдвиги в местоположении пика на гистограмме FRET. Это широко используется в экспериментальной практике для характеристики биомолекулярных систем [6, 13, 14, 22].

Однако в недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было обнаружено, что при некоторых обстоятельствах может происходить значительный сдвиг в гистограмме эффективности FRET, в то время как нет явного изменения в конформационном состоянии. Мы используем теорию и стохастическое моделирование, чтобы исследовать роль кинетики.Сначала мы исследуем роль вращательной и поступательной диффузии флуорофоров на шкале времени кинетики возбуждения донорных и акцепторных молекул. Затем мы рассмотрим роль дополнительных эффектов, таких как тушение без излучения.

3 Важность донорно-акцепторной кинетики

3.1 Донорно-акцепторное возбуждение и релаксация

Мы рассматриваем роль кинетики донорного и акцепторного возбуждения, переноса энергии и релаксации. Мы моделируем событие возбуждения донора как происходящее со скоростью κ D = 1/ τ D . τ D — среднее время жизни возбуждения донора в отсутствие акцептора. Молекула донора в возбужденном состоянии либо релаксирует, испуская фотон со скоростью κ D , либо передавая энергию молекуле акцептора со скоростью κ T в соответствии с уравнением (2) . Подчеркнем, что на практике коэффициент κ T зависит от ряда факторов.Это включает расстояние R между донором и акцептором. Это также зависит от относительной ориентации донора и акцептора, которая захватывается членом κ 2 в уравнении (3).

Мы исследуем, как такая зависимость передачи энергии от конфигурации донора и акцептора конкурирует с другими кинетиками возбуждения и релаксации. С этой целью мы разрабатываем стохастическую модель кинетики возбуждения-релаксации и выполняем моделирование вращательной и поступательной диффузии акцепторных и донорных молекул.Мы исследуем влияние этих эффектов на эффективную κ T и наблюдали эффективность передачи FRET E .

3.2 Донорно-акцепторная ориентационная диффузия

Взаимная ориентация дипольных моментов молекул донора и акцептора может существенно влиять на эффективность передачи энергии [5, 41, 42, 44, 45]. Это видно из фактора κ 2 , который вносит вклад в уравнение (3). Фактор κ определяется формулой [5, 41, 42] (6) Символы и обозначают единичные векторы, представляющие ориентацию дипольных моментов акцепторных и донорных молекул.Указывает единичный вектор разделения, указывающий от донора к акцептору.

Вклады от эффектов ориентации часто аппроксимируются усреднением, предполагая, что ориентация быстро распространяется изотропно в масштабе времени, намного превышающем время возбуждения донора. Часто используется усредненный фактор ориентации 〈 κ 2 〉 = 2/3, [41, 42]. Однако во многих ситуациях ориентационная диффузия может быть сопоставима с временной шкалой возбуждений или, исходя из стерики молекулярного уровня, она может не быть изотропной выборкой всех ориентаций [12, 41, 44, 46].Кроме того, даже для быстрой диффузии экспериментальные измерения часто включают небольшую выборку значений κ 2 , которые могут находиться в диапазоне от 0 до 4. Это выборка из распределения с нерегулярными и асимметричными характеристиками, см. Рис. 3.

Рис. 3. Распределение фактора ориентации κ 2 .

Показаны случайные акцепторно-донорные ориентации для κ 2 , которые распределены между 0 и 4. Распределение демонстрирует хорошо известный куспид при κ 2 = 1 (см. Вставку).Большая часть распределения находится между κ 2 = 0 и κ 2 = 1 со значительным смещением в сторону κ 2 = 0. Гистограмма была построена из 10 7 случайных ориентаций красителя. пары.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g003

Мы исследуем роль диффузии ориентации и ее роль в наблюдаемой эффективности FRET, приводящей к возможным сдвигам. Поскольку важен только относительный угол между донором и акцептором, мы можем моделировать вращательную диффузию броуновским движением по поверхности сферы [47].Это может быть выражено в сферических координатах случайным процессом (7) D R обозначает коэффициент диффузии на поверхности, а ρ радиус сферы. Уравнения следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48, 49]. Символы и обозначают независимые броуновские движения. Для сферы радиусом ρ конфигурация, связанная со сферическими координатами (Θ t , Φ t ), должна интерпретироваться в картосовых координатах как X t = ρ sin (Θ т ) cos (Φ т ), Y т = ρ sin (Θ т ) sin (Φ т ) , и Z t = ρ cos (Θ t ).

Мы выполняем моделирование путем численного вычисления временных шагов, приближающих стохастический процесс в уравнении (7). Это достигается путем проецирования броуновского движения на поверхность сферы. В частности, мы используем пошаговую процедуру по времени (8) (9) Генерируется на каждом шаге как трехмерная гауссова случайная величина с независимыми компонентами, имеющими нулевое среднее значение и единицу дисперсии. Мы отмечаем, что этот подход позволяет избежать осложнений, связанных со сферическими координатами, за счет исключения необходимости переключать карты координат, когда конфигурации приближаются к вырождениям около полюсов сферы [50].

Мы характеризуем временной масштаб вращательной диффузии как τ R = 4 π 2 ρ 2 / D R . Мы используем для красителя длину ρ = 1 нм и окружность сферы 2 πρ . Окружность сферы служит опорной шкалой длины для шкалы времени диффузии τ R . Мы проводим стохастическое моделирование с использованием этих параметров с шагом по времени не более Δ t = τ R /500.

Мы рассматриваем случай, когда акцептор и донор могут свободно вращаться, но удерживаются на фиксированном расстоянии R . Возьмем R = R 0 , так что для идеального усреднения по всем конфигурациям ориентации эффективность передачи составляет E = 0,5. Рассмотрим динамику вращения относительно времени жизни возбуждения донора, характеризующуюся τ D / τ R .

Мы рассматриваем как быструю вращательную диффузию, где большинство конфигураций хорошо отбираются за время жизни донора τ D / τ R ≫ 1, так и медленную вращательную диффузию, где только очень ограниченное подмножество конфигураций отбираются за время жизни донора τ D / τ R ≪ 1. Для медленной вращательной диффузии мы обнаружили, что ограниченная выборка за время жизни донора может привести к значительным сдвигам наблюдаемого FRET перенести E в сторону более низкой эффективности, см. рис. 4.

Рис. 4. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

Сверху вниз красители с уменьшающейся вращательной диффузией, имеющие характерные времена диффузии τ R / τ D = 19,5, 97,5, 195,0, 975. Средние значения эффективности в каждом случае соответственно равны E = 0,486, E = 0,456, E = 0,438 и E = 0,403. Сдвиг средней эффективности от самой медленной к самой быстрой рассмотренной диффузии составляет около 20%.Примечательной особенностью уменьшения коэффициента диффузии является расширение распределения наблюдаемых значений эффективности. Эталонная эффективность E 0 = 0,5 обозначена красной линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g004

Все конфигурации ориентации одинаково вероятны, и коэффициент κ 2 линейно влияет на эффективность переноса в уравнении (3). Как следствие, проявленный сдвиг является результатом чисто кинетических эффектов.В частности, для наиболее быстрой вращательной диффузии донор и акцептор имеют больше возможностей занять ориентацию, благоприятную для передачи энергии. Другими словами, когда диффузия велика, донор и акцептор успевают диффундировать, чтобы встретить конфигурации, которые находятся в «зоне наилучшего восприятия», имеющей наибольшие шансы на запуск передачи энергии. Когда вращательная диффузия намного медленнее, чем время жизни донора, ориентация донора и акцептора остается близкой к начальной начальной конфигурации, которая в первую очередь определяет скорость передачи энергии.Это проявляется как сдвиг значений κ 2 в сторону меньших значений, соответствующих менее эффективному переносу, когда вращательная диффузия медленная относительно срока службы донора, см. Рис. 5.

Рис. 5. Фактор ориентации во время переноса.

Показаны факторы κ 2 , которые возникли при моделировании во время передачи энергии от донора к акцептору. Сравним случай медленной вращательной диффузии τ D / τ R = 0.001 и быстрая вращательная диффузия τ D / τ R = 0,05. Для медленной вращательной диффузии κ 2 коэффициенты демонстрируют значительный сдвиг в сторону меньших значений. Это следствие того, что быстрая вращательная диффузия дает больше возможностей быть в благоприятных ориентациях для передачи энергии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g005

Изменение эффективности переноса в результате кинетики вращения может быть значительным.Для относительно быстрой вращательной диффузии в масштабе времени τ R / τ D = 19,5, мы находим, что передача энергии составляет E = 0,486. Это близко к тому моменту, когда ориентация полностью усредняется, чтобы получить передачу энергии E = 0,5. Для шкалы времени медленной вращательной диффузии τ R / τ D = 975 мы имеем эффективность переноса E = 0.403. В этом случае кинетика вращения привела к сдвигу в средней эффективности переноса на 17%.

Наши результаты указывают на то, что эффективность передачи FRET E может демонстрировать значительный сдвиг без какого-либо изменения конформационного состояния измеряемой молекулы. Эти изменения возникают исключительно из-за разной скорости вращательной диффузии. На практике это может происходить из-за изменений вязкости окружающего растворителя или из-за переходных событий связывания с молекулами, присутствующими в растворителе, которые временно ограничивают вращение донора и акцептора.Мы показываем сдвиги, которые могут происходить из-за этих эффектов в широком диапазоне коэффициентов диффузии на рис. 6.

Рис. 6. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

По мере того, как вращательная диффузия уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется. На вставке показан сдвиг в процентах, измеренный как % сдвиг = | E obs E 0 | / E 0 где мы берем эталонный КПД E 0 = 0.5. Первые несколько точек данных имеют τ D / τ R = 0,001, 0,003 и 0,005.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g006

3.3 Донорно-акцепторная диффузия на расстоянии

Мы рассматриваем роль относительной поступательной диффузии донорных и акцепторных молекул. Нас особенно интересует случай, когда измеряемое конформационное состояние молекулы включает выборку по ансамблю различных конфигураций.В этом случае донор и акцептор могут претерпевать значительную трансляционную диффузию за время жизни донора [51, 52]. Например, для неупорядоченного белка или полимера, подвергнутого различным условиям сольватации, FRET может использоваться для определения радиуса инерции [35, 53–55]. Когда ансамбль конфигураций остается неизменным, мы исследуем роль кинетики, связанной с диффузией расстояния разделения.

Мы моделируем диффузию разделительного расстояния R с помощью случайного процесса. (10) γ обозначает эффективное сопротивление, Φ потенциал свободной энергии для расстояния R , D S эффективный коэффициент диффузии при разделении и W t броуновское движение.Уравнение следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48]. Мы моделируем разделение донорной и акцепторной меток, прикрепленных к полимеру, с помощью потенциала свободной энергии. (11) Мы параметризуем модель, используя коэффициент диффузии D S и принимаем сопротивление γ = k B T / D S , где k B — коэффициент Больцмана. постоянная и T — температура.Чтобы смоделировать, что происходит, когда расстояние разделения приближается к нулю, мы избегаем отрицательных длин с помощью отражающего граничного условия в нуле [49]. Мы характеризуем эту диффузную динамику шкалой времени τ S = 2 / D S где — это та же длина, что и в уравнении (11). Параметры, используемые по умолчанию в нашем моделировании, приведены в Таблице 1.

В состоянии равновесия этот процесс диффузии имеет разделительное распределение (12) где — статистическая сумма [56].Для моделирования этого процесса мы генерируем временные шаги, используя метод Эйлера-Мараюмы [57]. (13) η n генерируется на каждом временном шаге как независимая стандартная гауссова случайная величина с нулевым средним и единичной дисперсией. Длительность временного шага обозначается как Δ t . На практике мы используем временной шаг с Δ t = τ S /10 4 . Чтобы дать некоторое представление о флуктуациях разделения и в качестве подтверждения наших методов моделирования, мы показываем численные результаты для равновесного распределения на рис.7.

Рис. 7. Равновесное распределение расстояний между донорами и акцепторами.

Результаты моделирования шагов акцепторно-донорных меток диффузии полимера (гистограмма) сравниваются с предсказанным распределением расстояний разделения из уравнения (12) (красная кривая). Результаты получены из 1,8 × 10 6 выборочных шагов моделирования, соответствующих среднему значению μ = R 0 и дисперсии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g007

Мы рассматриваем роль кинетики разделения донора и акцептора в течение времени жизни возбуждения донора. Мы рассматриваем эффективность переноса для различных скоростей разделения диффузии D S относительно времени жизни донора τ D . Это может быть охарактеризовано как τ D / τ S где τ S = 2 / D S .

Мы обнаружили, что уменьшение коэффициента диффузии разделения приводит к значительному сдвигу в эффективности переноса FRET, см. Рис. 8. Мы также обнаружили, что по мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение наблюдаемых эффективностей значительно расширяется. Для самого быстрого трансляционного коэффициента диффузии у нас есть средняя эффективность переноса E = 0,723, для самого медленного рассматриваемого поступательного коэффициента диффузии E = 0,508. Это дает относительный сдвиг в эффективности передачи FRET на 30%.

Рис. 8. Коэффициент диффузии разделения и эффективность переноса FRET.

Коэффициент диффузии отрыва соответствует τ D / τ S = 0,69, 0,07 и 0,007. У них средняя эффективность передачи соответственно E = 0,723, E = 0,553 и E = 0,508. Это соответствует относительному сдвигу на 30% в эффективности переноса. По мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение эффективностей переноса значительно расширяется.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g008

Набор конфигураций одинаков как для самой быстрой, так и для самой медленной диффузии, поэтому изменение эффективности переноса происходит исключительно из-за кинетических эффектов. В течение времени жизни донора диффузия влияет на то, насколько вероятно, что донор и акцептор встретят конфигурации, благоприятные для передачи энергии. В случае медленной диффузии скорость передачи энергии в первую очередь определяется исходной конфигурацией донора и акцептора.

В случае быстрой диффузии относительно времени жизни донора, донор и акцептор имеют больше возможностей встретить благоприятные конфигурации для передачи энергии. Эта разница в том, как часто встречаются такие «зоны наилучшего восприятия» для передачи энергии в течение срока службы донора, подтверждается наблюдаемыми разделительными расстояниями, которые возникают во время передачи энергии, см. Рис. 9.

Рис. 9. Расстояние разделения во время передачи энергии.

Показаны расстояния разделения, которые имели место при моделировании во время передачи энергии.Сравним случай медленной диффузии на расстояние τ D / τ S = 0,007 и быстрой диффузии на расстояние τ D / τ S = 0,69 . В случае быстрой диффузии мы видим, что передача энергии происходит гораздо чаще при меньших разделительных расстояниях.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g009

Мы видим, что для самого быстрого коэффициента диффузии во время передачи энергии возникают значительно меньшие разделительные расстояния и, следовательно, в среднем большая эффективность FRET.В случае самого медленного коэффициента диффузии мы видим, что распределение разделительных расстояний шире и более точно соответствует равновесному распределению разделительных расстояний, поскольку скорость передачи энергии в значительной степени определяется исходной конфигурацией донора и акцептора. Мы показываем сдвиги в передаче энергии для широкого диапазона коэффициентов диффузии разделения на рис. 10.

Рис. 10. Распространение расстояний и сдвиги в эффективности передачи FRET.

По мере того, как расстояние диффузии уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется.На вставке мы показываем сдвиг как относительный процент, равный % shift = | E obs E 0 | / E 0 с эталонной эффективностью E 0 = 0,5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g010

3.4 Роль тушения без выбросов

Мы также рассматриваем случай, когда донор может снять возбуждение через неизлучающий путь [29]. Одним из возможных механизмов является динамическое тушение, когда донор высвобождается, вступая в контакт с химическими частицами, диффундирующими в окружающем растворе [26–28].У некоторых доноров есть фотофизика, на которую существенно влияет присутствие ионов. Это используется в некоторых экспериментах в качестве репортера концентрации ионов [15, 26, 31].

Мы принимаем эти эффекты во внимание, развивая некоторую теорию того, как дополнительный неизлучающий путь может изменить наблюдаемую эффективность FRET. Неизлучающий путь гашения можно смоделировать в нашей кинетике, убивая некоторую часть событий девозбуждения донора, которые привели бы к передаче энергии акцептору и, в конечном итоге, испусканию акцепторных фотонов.Для эффективности передачи FRET это соответствует увеличению уравнения (5) до (14) Величина 1 — α дает долю девозбуждений доноров, которые приводят к тому или иному типу тушителя без излучения. Дает соответствующую смещенную эффективность FRET при включении пути тушения.

Случай α = 1 соответствует ситуации, когда не излучающих тушащих событий не происходит. В этом случае у нас есть. В случае α = 0 все наблюдаемые девозбуждения приводят к не излучающим тушащим событиям вместо девозбуждения донора посредством событий передачи FRET и испускания акцепторных фотонов.В этом случае мы имеем, см. Рис. 11.

Рис. 11. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Наблюдаемая эффективность переноса FRET показана при включении дополнительного неизлучающего пути в донорно-акцепторную кинетику. Для различных скоростей α неизлучающих событий гашения результаты показывают, как повышается эталонная эффективность переноса E в случае отсутствия гашения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g011

Эффективность FRET удобно выразить как (15) куда . Это обеспечивает эталонный показатель f , соответствующий отношению эмиссии донора к эмиссии акцептора, когда нет неизлучающего тушения. Эталонная доля f связана с эталонной эффективностью передачи FRET E как f = E −1 -1. Сдвиг в процентах наблюдаемой эффективности FRET, возникающий в результате гашения, определяется выражением (16) Мы видим, что процентный сдвиг FRET, который происходит из-за гашения, зависит от эталонной эффективности передачи FRET E .Фактически, возникающий сдвиг становится все более чувствительным по мере уменьшения E , см. Рис. 12.

Рис. 12. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Относительное процентное изменение эффективности переноса показано, когда тушение без излучения происходит как часть донорно-акцепторной кинетики.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g012

4 Обсуждение

Мы показали несколько различных способов, с помощью которых эффективность FRET может быть изменена как следствие кинетических эффектов, в то время как лежащее в основе молекулярное конформационное состояние фактически осталось прежним.Мы рассматриваем, как такие кинетические механизмы связаны с некоторыми недавними экспериментами, изучающими причины сдвигов в эффективности FRET [19, 34, 35, 58].

FRET часто используется для измерения конформационных изменений или фолдинга белков, поскольку денатурирующие условия меняются [22, 35, 53]. В недавней работе Липмана, Плакско и др. [35] радиус вращения полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ) рассматривается в условиях сольватации, которые дают случайные спирали. В отличие от белков, не ожидается, что ансамбль конфигураций полимера PEG существенно изменится при изменении денатуранта.Это подтверждается экспериментами по измерениям рассеяния рентгеновских лучей, которые действительно показывают, что радиус вращения ПЭГ остается неизменным при изменении денатуранта [35, 58]. Это обеспечивает полезный контроль для исследования FRET, поскольку условия денатуранта меняются.

Интересным открытием является то, что измерения FRET в одних и тех же условиях показывают значительный сдвиг в измеренной эффективности передачи. Для полимера PEG 3 кДа в денатуранте GuHcl в диапазоне концентраций от 0 до 6 М молярный сдвиг наблюдался в эффективности переноса примерно на 20% по сравнению с E 0 = 0.5. Для того же полимера в денатуранте , мочевина в диапазоне концентраций от 0 до 8M наблюдается сдвиг в эффективности на ~ 24% по сравнению с E 0 = 0,5. Аналогичные сдвиги были обнаружены для экспериментов, проведенных с использованием ПЭГ 5 кДа [35].

Наши результаты показывают, что значительные сдвиги могут происходить в наблюдаемой эффективности FRET, даже когда нет никаких основных изменений в конформационном ансамбле. Мы показали, как эффективность переноса может изменяться исключительно из-за кинетических эффектов, возникающих из-за изменения скорости диффузии ориентации акцептор-донор, диффузии расстояния между донором и акцептором, а также из-за неизлучающего тушения.Для диффузии расстояния разделения донор-акцептор мы обнаружили, что такие кинетические эффекты могут вызывать сдвиги в эффективности до 48%. Это произошло, когда шкала времени диффузии на расстоянии приблизилась к шкале времени жизни донора, см. Рис. 10.

Один из способов объяснить экспериментально наблюдаемые сдвиги — рассмотреть, как денатурирующий агент увеличивает вязкость растворителя [35, 59]. Ожидается, что изменения вязкости растворителя будут тесно связаны с изменениями скорости диффузии, как предполагает соотношение Стокса-Эйнштейна [49].Такой механизм теоретически исследован в работах [58, 60]. Мы обсуждаем здесь, как результаты нашего моделирования связаны с изменениями вязкости растворителя.

Предполагаемое изменение объемной вязкости растворителя при изменении концентрации денатуранта мочевины при 8M составляет 1,66, а для GuHcl 6M — 1,61, согласно экспериментам [59]. Чтобы связать вязкость с коэффициентом диффузии, можно использовать соотношение Стокса-Эйнштейна D = k B T / γ .Сопротивление определяется как γ = 6 πμa , где μ — вязкость растворителя, а a — эталонная шкала длины, характеризующая размер диффундирующей молекулы. Это говорит о том, что увеличение вязкости растворителя в 1,61 раза снижает коэффициент диффузии в 0,6 раза.

В наших расчетах, взяв за основу τ D / τ S = 0,1, такое изменение вязкости приводит к сдвигу эффективности переноса на ∼12%.Этот вклад, обусловленный исключительно диффузионной кинетикой разделения донора и акцептора, составляет примерно половину сдвига ∼24%, наблюдаемого для 8M мочевины , и ∼20%, наблюдаемого для 6M GuHcl в [35]. Это согласуется с выводами [58], предполагающими, что другие механизмы также могут играть роль в наблюдаемом изменении эффективности переноса.

При интерпретации этих эффектов существует ряд потенциальных тонкостей. Во-первых, донорные и акцепторные молекулы сравнимы по размеру с молекулами, денатурирующими вязкость, и изменения коэффициента диффузии, возможно, могут быть более значительными из-за более сложных взаимодействий, чем предполагалось при использовании простой объемной теории вязкости и диффузии [61–63].Еще одним соображением является роль неизлучающего тушения, вызванного столкновительным контактом молекул денатуранта с донором [29]. В сочетании с кинетическими изменениями диффузии даже небольшое количество возбуждений, приводящее к тушению <5%, привело бы к общему комбинированному сдвигу на ~ 20% в наблюдаемой эффективности переноса, см. Рис. 12.

5 Заключение

Мы показали, что кинетика может играть значительную роль в изменении наблюдаемой эффективности переноса FRET, даже если нет основного изменения в конформационном состоянии измеряемой молекулы.Мы обнаружили, что изменение ориентации диффузии может в самых крайних случаях изменить эффективность переноса до 20%. Для рассматриваемой диффузии расстояние разделения донор-акцептор мы обнаружили в самых крайних случаях сдвиги до 48%. Наши данные о расстоянии донор-акцептор согласуются с исследованиями Макарова и Плакско [38]. Отметим, что наши результаты, касающиеся ориентационной диффузии, учитывают дополнительные эффекты, которых нет в [38], и могут предложить некоторое объяснение сдвигов FRET, которые наблюдаются в жестких полипролиновых цепях [34, 35].Мы обнаружили, что диффузионная кинетика как ориентации, так и разделения демонстрирует отчетливую подпись на гистограмме наблюдаемой эффективности переноса в виде уширения пиков. Мы также обнаружили, что неизлучающие тушения, которые происходят даже на умеренном уровне, могут привести к значительным сдвигам в наблюдаемой эффективности переноса. Обсуждаемые нами механизмы имеют потенциально важные последствия при интерпретации измерений FRET, особенно в отношении выводов из изменений расстояния FRET и того, как это связано с изменениями конформационного состояния молекул.При анализе измерений FRET мы надеемся, что наши результаты предоставят несколько полезных ориентиров, которые помогут определить значимость наблюдаемых сдвигов и роль кинетических эффектов.

Благодарности

Авторы P.J.A и B.W благодарят за поддержку исследовательского гранта NSF CAREER — 0956210, NSF DMS — 1616353 и DOE ASCR CM4 DESC0009254. Авторы также хотели бы поблагодарить А. Саймона, Э. Липмана и К. Плакско за полезные обсуждения и предложения. Признавая вышеперечисленное, авторы берут на себя полную ответственность за содержание и комментарии в рукописи.

Вклад авторов

  1. Концептуализация: PJA BW.
  2. Расследование: PJA BW.
  3. Методология: PJA BW.
  4. Написание — черновик: PJA BW.
  5. Написание — просмотр и редактирование: PJA BW.

Ссылки

  1. 1. Forster TH. Механизмы передачи энергии электронного возбуждения. Дополнение к радиационным исследованиям. 1960; 2: 326–339.
  2. 2. Clegg RM. История FRET: от зачатия до родов. В: CD G, JR L, редакторы. Обзоры в Флуоресценции. т. 3. Springer; 2006. с. 1–45.
  3. 3. Форстер Т. 10-я лекция в память о Спайерсе. Механизмы передачи электронного возбуждения. Обсудите Faraday Soc. 1959; 27 (0): 7–17.
  4. 4. Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1967. 58 (2): 719–726. pmid: 5233469
  5. 5. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. FRET — резонансный перенос энергии Форстера: от теории к приложениям. 1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 23–62.
  6. 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул. Наука. 1999. 283 (5408): 1676–1683. pmid: 10073925
  7. 7. Сонг Й., Мадахар В., Ляо Дж. Развитие FRET-анализа в платформы для количественного и высокопроизводительного скрининга белок-белковых взаимодействий.Анналы биомедицинской инженерии. 2011. 39 (4): 1224–1234. pmid: 21174150
  8. 8. Plaxco KW, Soh HT. Биосенсоры на основе переключателей: новый подход к молекулярному обнаружению in vivo в реальном времени. Тенденции в биотехнологии. 2011; 29 (1): 1–5. pmid: 21106266
  9. 9. Хаас Э., Качальски-Кацир Э., Стейнберг И.З. Броуновское движение концов олигопептидных цепей в растворе, оцениваемое по передаче энергии между концами цепи. Биополимеры. 1978. 17 (1): 11–31.
  10. 10.Рахман ММ. Введение в перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET). Научный журнал физики. 2012 ;.
  11. 11. Назаров П.В., Кохорст РБМ, Вос В.Л., Апанасович В.В., Хемминга М.А. Исследование FRET мембранных белков: подгонка на основе моделирования для анализа внедрения и ассоциации мембранных белков. Биофизический журнал. 2006. 91 (2): 454–466. pmid: 16632512
  12. 12. Поршень DW, Kremers GJ. Флуоресцентный белок FRET: хорошее, плохое и уродливое.Направления биохимических наук. 2007. 32 (9): 407–414. pmid: 17764955
  13. 13. Агафонов Р.В., Неграшов И.В., Ткачев Ю.В., Блейкли С.Е., Титус М.А., Томас Д.Д. и др. Структурная динамика спирали реле миозина по данным EPR и FRET с временным разрешением. Труды Национальной академии наук. 2009. 106 (51): 21625–21630.
  14. 14. Эдидин М. Флуоресцентный резонансный перенос энергии: методы измерения молекулярной конформации и молекулярной близости. В: Текущие протоколы в иммунологии.John Wiley & Sons, Inc.; 2001. с. -. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.im1810s52.
  15. 15. Ueda Y, Kwok S, Hayashi Y. Применение зондов FRET в анализе нейрональной пластичности. Границы в нейронных цепях. 2013; 7: 163–. pmid: 24133415
  16. 16. Ха Т, Тинг А.Ю., Лян Дж., Колдуэлл В.Б., Дениз А.А., Chemla DS и др. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1998. 96 (3): 893–898.
  17. 17. Шреста Д., Дженей А., Надь П., Вереб Г., Сёллёси Дж. Понимание FRET как исследовательского инструмента для исследований сотовой связи. Международный журнал молекулярных наук. 2015. 16 (4): 6718–6756. pmid: 25815593
  18. 18. Дениз А.А., Дахан М., Грюнвелл Дж.Р., Ха Т, Фаулхабер А.Е., Chemla DS и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Фёрстера от расстояния и субпопуляций. Труды Национальной академии наук.1999. 96 (7): 3670–3675.
  19. 19. Вайс С. Измерение конформационной динамики биомолекул с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Nat Struct Mol Biol. 2000. 7 (9): 724–729.
  20. 20. Вентилятор C, Plaxco KW, Heeger AJ. Биосенсоры на основе донорно-акцепторных расстояний, модулируемых связыванием. Тенденции в биотехнологии. 2005. 23 (4): 186–192. pmid: 15780710
  21. 21. Ни Q, Чжан Дж. Динамическая визуализация сотовой сигнализации. В: Эндо И., Нагамуне Т., редакторы.Нано / микробиотехнология. Берлин, Гейдельберг: Springer Berlin Heidelberg; 2010. с. 79–97. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1007/10_2008_48.
  22. 22. Шулер Б., Липман Э.А., Итон Вашингтон. Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белков с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Природа. 2002; 419 (6908): 743–747. pmid: 12384704
  23. 23. Hofmann H, Hillger F, Pfeil SH, Hoffmann A, Streich D, Haenni D и др. Одномолекулярная спектроскопия сворачивания белка в шаперониновой клетке.Труды Национальной академии наук. 2010. 107 (26): 11793–11798.
  24. 24. Wickersham CE, Cash KJ, Pfeil SH, Bruck I, Kaplan DL, Plaxco KW и др. Отслеживание молекулярного двигателя с помощью оптического кодировщика в наномасштабе. Nano Lett. 2010. 10 (3): 1022–1027. pmid: 20121107
  25. 25. Мори Т., Вале Р.Д., Томишиге М. Как кинезин ждет между шагами. Природа. 2007. 450 (7170): 750–754. pmid: 18004302
  26. 26. Лю Б., Цзэн Ф., Ву Г., Ву С. Наночастицы как каркас для основанного на FRET ратиометрического обнаружения ионов ртути в воде с квантовыми точками в качестве доноров.Аналитик. 2012. 137 (16): 3717–3724. pmid: 22737682
  27. 27. Li H, Ren X, Ying L, Balasubramanian S, Klenerman D. Измерение динамики одиночных молекул нуклеиновых кислот в растворе с помощью двухцветной фильтрованной ратиометрической флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2004. 101 (40): 14425–14430. pmid: 15452356
  28. 28. Marras SAE, Kramer FR, Tyagi S. Эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции и контактно-опосредованного тушения в олигонуклеотидных зондах.Исследования нуклеиновых кислот. 2002; 30 (21): e122 – e122. pmid: 12409481
  29. 29. Чанг Х.С., Луи Дж. М., Итон, Вашингтон. Различие между динамикой белка и фотофизикой красителя в экспериментах с одномолекулярным FRET. Биофизический журнал. 2009. 98 (4): 696–706.
  30. 30. Стейнберг И.З., Качальски Э. Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательной передаче энергии. Журнал химической физики. 1968. 48 (6): 2404–2410.
  31. 31. Дин KM, Qin Y, Palmer AE. Визуализация ионов металлов в клетках: обзор аналитических методов, подходов и зондов. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Исследование молекулярных клеток. 2012; 1823 (9): 1406–1415.
  32. 32. Ha T, Enderle T, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Weiss S. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1996. 93 (13): 6264–6268. pmid: 86
  33. 33. Нат А., Саммалкорпи М., ДеВитт Д., Трекслер А., Эльбаум-Гарфинкль С., О’Херн С. и др. Конформационные ансамбли альфа-синуклеина и тау-белка: сочетание одномолекулярного FRET и моделирования. Биофизический журнал. 2012; 103 (9): 1940–1949. pmid: 23199922
  34. 34. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.2005. 102 (8): 2754–2759. pmid: 15699337
  35. 35. Уоткинс Х.М., Саймон А.Дж., Сосник Т.Р., Липман Э.А., Хьелм Р.П., Плакско К.В. Отрицательный контроль с произвольной катушкой воспроизводит несоответствие между измерениями рассеяния и FRET размеров денатурированного белка. Труды Национальной академии наук. 2015; 112 (21): 6631–6636.
  36. 36. Лакович JR, Kuśba J, Shen Y, Malicka J, D’Auria S, Gryczynski Z, et al. Влияние металлических частиц серебра на резонансную передачу энергии между флуорофорами, связанными с ДНК.Журнал флуоресценции. 2003. 13 (1): 69–77.
  37. 37. Чжан Дж., Фу Й., Лакович-младший. Улучшенная передача энергии резонанса Фёрстера (FRET) на отдельной металлической частице. Журнал физической химии C. 2007; 111 (1): 50–56.
  38. 38. Макаров Д.Е., Plaxco KW. Измерение расстояний в развернутых биополимерах с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции: влияние динамики полимерных цепей на наблюдаемую эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции. Журнал химической физики.2009; 131 (8).
  39. 39. Камли Б.А., Браун FLH, Липман Е.А. Перенос Фёрстера за предел слабого возбуждения. Журнал химической физики. 2009; 131 (10).
  40. 40. Муньос-Лоса А., Крутчет С., Крюгер Б. П., Харцелл Л. Р., Меннуччи Б. Беспокойство по поводу FRET: отказ идеального дипольного приближения. Биофизический журнал. 2009. 96 (12): 4779–4788.
  41. 41. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. Оптимизация коэффициента ориентации по каппа-квадрату для более точных измерений FRET в FRET — резонансная передача энергии Форстера: от теории к приложениям.1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 63–104.
  42. 42. Эндрюс Д.Л., Демидов А.А. Глава 14: Теоретические основы и разработка приложений. В кн .: Передача энергии резонанса. В то время как 2009. с. 461–499.
  43. 43. Саху Х. Ферстер резонансный перенос энергии — Спектроскопический нанополимер: принцип и приложения. Журнал фотохимии и фотобиологии C: обзоры фотохимии. 2011; 12 (1): 20–30.
  44. 44. Валчевска-Шевц К., Корри Б.Учет диффузии и ориентации красителя при связывании измерений FRET с расстояниями: три простых вычислительных метода. Phys Chem Chem Phys. 2014. 16 (24): 12317–12326. pmid: 24824374
  45. 45. Икбал А., Арслан С., Окумус Б., Уилсон Т.Дж., Жиро Г., Норман Д.Г. и др. Зависимость от ориентации в переносе флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, концевыми присоединенными к двухцепочечным нуклеиновым кислотам. Труды Национальной академии наук. 2008. 105 (32): 11176–11181.
  46. 46.Клозе Д., Клар Дж. П., Громанн Д., Кей К.В.М, Вернер Ф., Штайнхофф Х.Дж. Моделирование против реальности: сравнение прогнозов расстояния In Silico с измерениями DEER и FRET. PLoS ONE. 2012; 7 (6): e39492–. pmid: 22761805
  47. 47. Brillinger DR. Частица, случайно перемещающаяся по сфере. Журнал теоретической вероятности. 1997. 10 (2): 429–443.
  48. 48. Оксендал Б. Стохастические дифференциальные уравнения: Введение. Springer; 2000.
  49. 49. Гардинер CW.Справочник по стохастическим методам. Серия по синергетике. Springer; 1985.
  50. 50. Сигурдссон Дж. К., Атцбергер П. Дж. Гидродинамическое связывание включений частиц, встроенных в изогнутые двухслойные липидные мембраны. Мягкая материя. 2016; 12 (32): 6685–6707. pmid: 27373277
  51. 51. Гурунатан К., Левитус М. Флуктуационная спектроскопия FRET диффундирующих биополимеров: вклад конформационной динамики и поступательной диффузии. J. Phys Chem B. 2010; 114 (2): 980–986. pmid: 20030305
  52. 52.Бадали Д., Градинару СС. Влияние броуновского движения флуоресцентных зондов на измерение наноразмерных расстояний с помощью резонансной передачи энергии Фёрстера. Журнал химической физики. 2011; 134 (22): 225102. pmid: 21682537
  53. 53. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Труды Национальной академии наук. 2007. 104 (5): 1528–1533.
  54. 54.Хаас Э. Ансамблевые методы FRET в исследованиях белков с внутренними нарушениями. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред. Анализ внутренне нарушенных белков: том 1, методы и экспериментальные инструменты. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 2012. с. 467–498. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-61779-927-3_28.
  55. 55. Шулер Б., Мюллер-Шпет С., Соранно А., Неттелс Д. Применение конфокального одномолекулярного FRET к внутренне неупорядоченным белкам. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред.Анализ внутренне нарушенных белков: том 2, методы и экспериментальные инструменты. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer Нью-Йорк; 2012. с. 21–45. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_2.
  56. 56. Reichl LE. Современный курс статистической физики. Jon Wiley and Sons Inc .; 1997.
  57. 57. Э. КП, Платен Э. Численное решение стохастических дифференциальных уравнений. Springer-Verlag; 1992.
  58. 58. Ю Т.Ю., Мейсбергер С., Хиншоу Дж., Поллак Л., Харан Дж., Сосник Т.Р. и др.Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и FRET-спектроскопия одиночных молекул дают сильно различающиеся представления о низкоденатурантном развернутом состоянии. Журнал молекулярной биологии. 2012. 418 (3-4): 226–236. pmid: 22306460
  59. 59. Кавахара К., Танфорд С. Вязкость и плотность водных растворов мочевины и гидрохлорида гуанидина. Журнал биологической химии. 1966. 241 (13): 3228–3232. pmid: 56
  60. 60. Мурацугу А., Ватанабе Дж., Киношита С. Влияние диффузии на резонансный перенос энергии Фёрстера в маловязком растворе.Журнал химической физики. 2014; 140 (21): 214508. pmid: 247
  61. 61. Ли З. Критический размер частиц, при котором соотношение Стокса-Эйнштейна нарушается. Phys Rev E. 2009; 80 (6): 061204–.
  62. 62. Шарма М., Яшонат С. Нарушение связи Стокса – Эйнштейна: роль взаимодействий в размерной зависимости самодиффузии. J. Phys Chem B. 2006; 110 (34): 17207–17211. pmid: 169
  63. 63. Бернштейн Дж., Фрикс Дж. Анализ диффузии отдельных частиц с временным связыванием с использованием фильтрации частиц.Журнал теоретической биологии. 2016; 401: 109–121. pmid: 27107737

Механика магнитотактического остова in vivo, выявленная с помощью корреляционной микроскопии FLIM-FRET и STED.

  • 1.

    Ngounou Wetie, A.G. et al. . Исследование стабильных и временных белок-белковых взаимодействий: прошлое, настоящее и будущее. Proteomics 13 , 538–57 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 2.

    Глотцер М. и Хайман А. А. Полярность клеток: важность полярности. Curr. Биол. 5 , 1102–1105 (1995).

    CAS Статья Google Scholar

  • 3.

    Купер Г. М. In Клетка: молекулярный подход 253–255 (Sinauer Associates, 2000).

  • 4.

    Грауман П. Л. Динамика бактериальных цитоскелетных элементов. В клеточная подвижность и цитоскелет 909–914 (Wiley-Blackwell, 2009).

  • 5.

    Lichtman, J. W. & Conchello, J.-A. Флуоресцентная микроскопия. Нат. Методы 2 , 910–919 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 6.

    Турковид Б., Вирант Д. и Эндесфельдер У. От одиночных молекул к жизни: микроскопия на наноуровне. Анал. Биоанал. Chem. 408 , 6885–6911 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 7.

    Сал, С. Дж., Хелл, С. В. и Якобс, С. Флуоресцентная наноскопия в клеточной биологии. Нат. Rev. Mol. Cell Biol. 18 , 685–701 (2017).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8.

    Тортароло, Г., Кастелло, М., Диаспро, А., Кохо, С. и Вичидомини, Г. Оценка разрешения изображения в микроскопии истощения с использованием стимулированного излучения. Оптика 5 , 32 (2018).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 9.

    Vicidomini, G., Bianchini, P. & Diaspro, A. Микроскопия сверхвысокого разрешения STED. Нат. Методы 15 , 173–182 (2018).

    CAS Статья Google Scholar

  • 10.

    Годин А.Г., Лунис Б. и Когнет Л. Подходы микроскопии сверхвысокого разрешения для визуализации живых клеток. Biophys. J. 107 , 1777–1784 (2014).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 11.

    Хуанг, Б., Бэбкок, Х. и Чжуан, X. Нарушение дифракционного барьера: получение изображений клеток со сверхвысоким разрешением. Cell 143 , 1047–1058 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 12.

    Селвин П. Р. Возрождение резонансного переноса энергии флуоресценции. Нат. Struct. Биол. 7 , 730–734 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13.

    Sun, Y., Day, R. & Periasamy, A. Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции. Нат. Protoc. 6 , 1324–1340 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 14.

    Тардиф, К. и др. . Наноскопия с визуализацией времени жизни флуоресценции для измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в клеточных нанодоменах. Нейрофотоника 6 , 1 (2019).

    Артикул Google Scholar

  • 15.

    Deng, S. и др. . Влияние времени жизни флуоресценции донора и акцептора на метод применения резонансного переноса энергии Фёрстера в STED-микроскопии. J. Microsc. 269 , 59–65 (2018).

    CAS Статья Google Scholar

  • 16.

    Лойдольт-Крюгер, М. и Мария STED-микроскопия пар FRET (2018).

  • 17.

    Дженнингс, П. К., Кокс, Г. С., Монахан, Л. Г. и Гарри, Э. Дж. Визуализация бактериального цитокинетического белка FtsZ со сверхвысоким разрешением. Микрон 42 , 336–341 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18.

    Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T. & van Wezel, G.P. Положительный контроль деления клеток: FtsZ рекрутируется SsgB во время споруляции Streptomyces. Genes Dev. 25 , 89–99 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 19.

    Ван, Н., Батлер, Дж. И Ингбер, Д. Механотрансдукция через поверхность клетки и через цитоскелет. Наука 260 (1993).

  • 20.

    Кёрниг, А. и др. . Исследование механических свойств цепочек магнитосом у живых магнитотактических бактерий. Nano Lett. 14 , 4653–4659 (2014).

    ADS Статья Google Scholar

  • 21.

    Уэбе Р. и Шулер Д. Биогенез магнитосом у магнитотактических бактерий. Нат. Rev. Microbiol. 14 , 621–637 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 22.

    Фейвр, Д. и Годек, Т. У. От бактерий до моллюсков: принципы, лежащие в основе биоминерализации материалов из оксида железа. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 54 , 4728–4747 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 23.

    Файвр, Д. Формирование цепочек магнитных наночастиц в бактериальных системах. MRS Bull. 40 , 509–515 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 24.

    Комейли, А., Ли, З., Ньюман, Д. К., Дженсен, Г. Дж.Магнитосомы — это воображаемые клеточные мембраны, организованные актин-подобным белком MamK. Наука 311 , 242–245 (2006).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 25.

    Scheffel, A. et al. . Кислый белок выравнивает магнитосомы вдоль нитчатой ​​структуры магнитотактических бактерий. Nature 440 , 110–114 (2006).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 26.

    Феррер, Дж. М. и др. . Измерение силы молекулярного разрыва между отдельными актиновыми филаментами и актин-связывающими белками. Proc. Natl. Акад. Sci. 105 , 9221–9226 (2008).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 27.

    Scheffel, A. & Schüler, D. Кислый повторяющийся домен белка MamJ магнитоспирилл gryphiswaldense демонстрирует гипервариабельность, но не требуется для сборки цепей магнитосом. J. Bacteriol. 189 , 6437–6446 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 28.

    Карилло, М. А., Беннет, М. и Фейвр, Д. Взаимодействие белков, связанных с магнитосомной сборкой, в магнитотактических бактериях, как было выявлено с помощью двухгибридной двухфотонной флуоресцентной микроскопии для визуализации прижизненной флуоресценции с двухфотонным возбуждением для резонансного переноса энергии. J. Phys. Chem. B 117 , 14642–14648 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 29.

    Bennet, M. et al. . Биологически контролируемый синтез и сборка наночастиц магнетита. Фарадей Обсудить. 181 , 71–83 (2015).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 30.

    Katzmann, E., Scheffel, A., Gruska, M., Plitzko, J. M. & Schüler, D. Потеря актин-подобного белка MamK оказывает плейотропное действие на формирование магнитосом и сборку цепей в Magnetospirillum gryphiswaldense. Мол. Microbiol. 77 , 208–224 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 31.

    Торо-Науэльпан, М. и др. . Сегрегация органелл прокариотических магнитосом обусловлена ​​движением динамической актин-подобной нити MamK. BMC Biol. 14 , 88 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 32.

    Морозова К.С. и др. . Флуоресцентный белок дальнего красного цвета, возбуждаемый красными лазерами для проточной цитометрии и STED-наноскопии со сверхвысоким разрешением. Biophys. J. 99 , L13–5 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 33.

    Ан, С. Дж. И Алмерс, В. Отслеживание образования комплекса SNARE в живых эндокринных клетках. Наука 306 , 1042–1046 (2004).

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 34.

    Блом, Х. и Виденгрен, Дж. Микроскопия истощения с использованием стимулированной эмиссии. Chemical Reviews 117 , 7377–7427 (2017).

    CAS Статья Google Scholar

  • 35.

    Фогт, Н. Биофизика: разгадывая магнитогенетику. Нат. Методы 13 , 900–901 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 36.

    Мейстер, М.Физические пределы магнитогенетики. Elife 5 , e17210 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 37.

    Nägerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W. и Bonhoeffer, T. Визуализация дендритных шипов на живых клетках с помощью микроскопии STED. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 , 18982–7 (2008 г.).

    ADS Статья Google Scholar

  • 38.

    Heyen, U. & Schüler, D. Рост и формирование магнитосом микроаэрофильными штаммами Magnetospirillum в ферментере с контролируемым кислородом. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 61 , 536–44 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 39.

    Schüler, D., Uhl, R. & Bäuerlein, E. Простой метод светорассеяния для определения магнетизма в Magnetospirillum gryphiswaldense. FEMS Microbiol. Lett. 132 , 139–145 (1995).

    Артикул Google Scholar

  • 40.

    Хильдебрандт, Н. In FRET — Фёрстеровский резонансный перенос энергии 105–163 (Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2013).

  • 41.

    Беннет, М., Гур, Д., Юн, Дж., Парк, Ю. и Фейвр, Д. Дистанционно настраиваемое фотонное устройство на основе бактерий. Adv. Опт. Матер. 5 , 1600617 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 42.

    Шагин Д.А. и др. . GFP-подобные белки как повсеместное суперсемейство многоклеточных животных: эволюция функциональных особенностей и структурной сложности. Мол. Биол. Evol. 21 , 841–850 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 43.

    Клаусс, А., Конрад, Ф. и Хилле, С. Бинарные фазовые маски для упрощения юстировки системы и определения основных аберраций с помощью пространственных модуляторов света в STED-микроскопии. Sci. Отчет 7 , 15699 (2017).

    ADS Статья Google Scholar

  • 44.

    Vicidomini, G. et al . Более четкая маломощная наноскопия STED за счет временного стробирования. Нат. Методы 8 , 571–575 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 45.

    Сейдж, Д. и др. . DeconvolutionLab2: программное обеспечение с открытым исходным кодом для микроскопии деконволюции. Методы 115 , 28–41 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • Приложения для передовой микроскопии — обзор FRET- Oxford Instruments

    Обзор решений Andor для FRET

    FRET (иногда называемый Förster Resonance Energy Transfer ) позволяет определить близость двух флуорофоров.FRET — это один из ряда методов одиночных молекул, таких как TIRF, SIM и локализация сверхвысокого разрешения, которые приобрели популярность в последние годы. Резонансная передача энергии происходит только на очень короткие расстояния, обычно в пределах 10 нм, и включает прямую передачу энергии возбужденного состояния от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору в качестве альтернативы затуханию флуоресценции от донора. При передаче энергии молекула акцептора переходит в возбужденное состояние, из которого она распадается эмиссионно (всегда с большей длиной волны, чем у акцепторного излучения).Возбуждая донора, а затем отслеживая относительные выбросы донора и акцептора, последовательно или одновременно, можно определить, когда произошел FRET и с какой эффективностью.

    Флуорофоры могут использоваться для специфической маркировки представляющих интерес биомолекул, а условие расстояния для FRET составляет порядка диаметра большинства биомолекул (1-10 нм). Это означает, что FRET можно использовать для определения того, когда и где две или более из этих меченых биомолекул (обычно белки) взаимодействуют в своем физиологическом окружении.Сигнал FRET, соответствующий определенному месту на изображении микроскопа, обеспечивает дополнительную точность определения расстояния, превышающую оптическое разрешение (~ 0,25 мм) светового микроскопа. Помимо пространственной близости, для эффективного FRET, пара красителей должна также демонстрировать значительное перекрытие спектра возбуждения донора со спектром поглощения акцептора. Именно эта характеристика составляет один из экспериментальных парадоксов FRET:

    .
    • Спектральные профили пары FRET не могут быть разделены настолько, чтобы у нас было плохое перекрытие,
    • , тем не менее, кто-то хочет избежать «перекрестных помех» между двумя каналами формирования изображения, т.е.е. В идеале комплект эмиссионных фильтров донора должен собирать только свет от донора, а не от акцептора, и наоборот.

    На практике это может быть достигнуто с помощью коротких полосовых фильтров, которые собирают свет только с более коротковолновой стороны донорного излучения и более длинноволновой стороны акцепторного излучения. Это может несколько ограничить поток фотонов как от донора, так и от акцептора во время типичного экспонирования, особенно если учесть, что эти измерения лучше всего проводить в условиях пониженной мощности возбуждения, так что мы не увеличиваем скорость обесцвечивания.Это означает, что для экспериментов FRET требуются сверхчувствительные детекторы.
    Примеры пар красителей FRET включают:

    • BFP-GFP
    • CFP-DSRED
    • BFP-GFP
    • Cy3-Cy5
    • CFP-YFP
    • Алекса488-Алекса555
    • Алекса488-Cy3
    • Алекса594-Алекса647
    • FITC-TRITC
    • Тербий (III) -Флуоресцеин
    • DiSBAC4 (3) -CC2-DMPE (пара FRET, чувствительная к напряжению)

    Профиль пары красителей CFP-YFP FRET показан ниже:

    Спектральные профили поглощения и излучения пары CFP-YFP FRET.

    Камеры

    Andor iXon EMCCD, будь то в качестве ключевого компонента платформы конфокальной визуализации живых клеток Dragonfly или в составе другой конфокальной системы, представляют собой хорошо зарекомендовавшие себя детекторные решения для получения изображений FRET. EMCCD позволяет с высоким разрешением и высоким отношением сигнал-шум (S / N) определять взаимодействий FRET по всей отображаемой области или объему клетки и помогает устранить низкие уровни фотонов, присутствующие при использовании узкополосных фильтров. В сочетании с тщательным выбором наборов фильтров это обеспечивает высокую целостность данных FRET.Поскольку EMCCD преодолевают предел обнаружения минимального уровня шума при любой скорости считывания, молекулярные взаимодействия можно отслеживать динамически с высокой точностью. Кроме того, мощность возбуждения часто может быть уменьшена, а это означает, что фототоксические эффекты и эффекты фотообесцвечивания сведены к минимуму, так что молекулярные взаимодействия могут отслеживаться в течение гораздо более длительных периодов. Для получения дополнительной информации о выборе детектора для исследования одиночных молекул, пожалуйста, просмотрите статью Какой детектор является лучшим для исследований одиночных молекул?

    1.О, H-K et al. (2019) Быстрое и простое обнаружение охратоксина A с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии в иммуноанализе бокового потока (FRET-LFI) Toxins 11 (5), 292; https://doi.org/10.3390/toxins11050292
    2. Ху Дж. и др. (2018) Объединение антенн из наночастиц золота с резонансным переносом энергии флуоресценции одиночных молекул (smFRET) для изучения динамики шпильки ДНК Nanoscale, 10, 6611-6619 10.1039 / C7NR08397A
    3. Чаурасия К.Р., Дама Р.Т. (2018) Одномолекулярный FRET-анализ ДНК-связывающих белков.В: Peterman E. (eds) Single Molecule Analysis. Методы молекулярной биологии, том 1665. Humana Press, New York, NY
    4. Юнг С. и др. (2018), Мониторинг в реальном времени состояния связывания / диссоциации и окислительно-восстановительного состояния ионов одного переходного металла. Бык. Korean Chem. Soc., 39: 638-642. DOI: 10.1002 / bkcs.11443

    Гибкий подход к оценке функций затухания флуоресценции в сложных системах передачи энергии | BMC Biophysics

    Выбор красителей

    Сначала мы выбрали набор красителей для оптимальной согласованности смоделированных и экспериментальных гистограмм донорского TCSPC и для отражения ожидаемого поведения при моделировании.Обратите внимание, что этот подход позволяет также рассчитывать гистограммы акцепторного TCSPC; здесь, если не указано иное, мы ориентируемся в первую очередь на гистограммы донорского TCSPC. Обычно радиус Ферстера пары FRET следует выбирать в пределах диапазона расстояний, которые ожидаются между донором и его ближайшим соседним акцептором, по следующим причинам. Во-первых, эффективность FRET и измеренные гистограммы донорского TCSPC чувствительно реагируют на расстояния в диапазоне от половины до двух радиусов Ферстера, тем самым увеличивая влияние небольших отклонений между расстояниями.Для расстояний, превышающих удвоенный радиус Ферстера, скорости FRET чрезвычайно низкие и очень мало влияют на зависящую от времени вероятность испускания фотонов. Передача энергии на расстояния, близкие к половине радиуса Ферстера, чрезвычайно эффективна, но вряд ли какие-либо донорные фотоны будут собраны. Обычно эти расстояния не влияют на распределение донорных фотонов, поскольку доноры с очень высокими скоростями тушения имеют пренебрежимо малую яркость по сравнению с донорами без акцепторов на расстояниях, близких к половине радиуса Ферстера.Кроме того, поскольку в пределах половины радиуса Ферстера перенос донора к акцептору происходит почти мгновенно, не ожидается значительных изменений в донорном TCSPC (или даже в акцепторном TCSPC). Во-вторых, фактор, описывающий взаимную ориентацию диполей перехода донорного излучения и поглощения акцептора ( κ 2 ) обычно принимается равным 2/3, что основано на предположении, что красители имеют достаточно времени, чтобы рандомизировать свою ориентацию в течение времени, пока донор остается возбужденным [1].Укорочение времени затухания флуоресценции за счет введения акцепторов на гораздо более близком расстоянии, чем половина радиуса Ферстера, дает это предположение примерно κ 2 неточно. В-третьих, слишком большое количество коротких расстояний резко увеличивает время моделирования за счет уменьшения количества собранных фотонов из-за большой конкуренции за дезактивацию переноса доноров. Кроме того, время затухания флуоресценции донора должно быть достаточно большим во время измерений, чтобы предоставить донорам достаточно времени для рандомизации своей ориентации после возбуждения и ограничения доли фотонов, обнаруживаемых неслучайным распределением углов испускания фотонов в начале обнаружение сигнала.

    Возможность гомо-FRET добавляет еще один аспект, который следует учитывать при выборе красителей. Обычно гомо-FRET уменьшает время, необходимое для рандомизации ориентации возбужденных красителей, и вносит случайность в направление излучения дипольного момента перехода донора. Кроме того, гомо-FRET изменяет положение возбужденного донора, которое обычно фиксируется при моделировании. Правильный выбор красителя сделает этот эффект незначительным. Стоксов сдвиг должен быть достаточно большим, чтобы минимизировать количество гомо-FRET при измерении времени затухания флуоресценции.Эффекты передачи возбужденных состояний между двумя соседними донорами в любом направлении не обязательно компенсируют друг друга. Следовательно, перекрытие спектров поглощения и излучения донора должно быть минимальным, чтобы ограничить передачи донор-донор расстояниями, близкими к нулю, на которых оба донора будут иметь почти одинаковое окружение.

    Здесь мы использовали Alexa 488 и Alexa 594 (технологии Life). Красители были выбраны потому, что они соответствуют описанным требованиям и критериям для подходящих экспериментальных установок, например.г. высокая фотостабильность, коэффициент экстинкции и квантовый выход [21,22].

    Генерация входных файлов

    Для считывания информации о позициях, служащих точкой привязки в код, входные файлы создаются по следующей схеме. Файлы содержат три декартовых координаты, которые определяют размеры моделируемого объема, три двоичных значения, определяющих периодичность системы в каждом направлении, а также количество и декартовы координаты доноров и акцепторов в системе.Все координаты даны в нанометрах.

    Мы случайным образом расположили наши красители в соответствии с вероятностями, полученными из (i) конкретных концентраций красителя со случайным распределением красителей в трехмерном пространстве, или (ii) фиксированных меченых структур с известными сайтами мечения в соответствии с вероятностями мечения донорами или акцепторами. . Кроме того, были созданы файлы с определенными расстояниями донор-акцептор в определенных соотношениях для сравнения моделирования с теоретически рассчитанным поведением времени затухания флуоресценции.

    Расчет скоростей FRET

    При моделировании возможных процессов дезактивации для каждого донора учитываются все акцепторы, которые могут оказаться ближе, чем в два раза радиуса Ферстера, учитывая также длину линкеров красителя. Расстояния х , скорость FRET х т и вероятности деактивации P Дезактивация затем рассчитываются для каждого донора (рис. 1, этап 1).6 $$

    (1)

    где τ D, 0 — время жизни донора в отсутствие акцептора и R 0 — характерный радиус Ферстера, при котором половина дезактивации электронно-возбужденных донорных состояний происходит за счет передачи энергии акцептору.

    $$ {P} _ {деактивация} = 1- \ exp \ left (- {\ displaystyle {\ sum} _i {k} _i} \ times \ varDelta t \ right) $$

    (2)

    где k и обозначает индивидуальные скорости дезактивации для этого конкретного донора посредством излучения фотонов, FRET или других процессов дезактивации, а Δ t — длина временного интервала.Периодичность объема учитывается для правильного определения среды каждого донора. [Дополнительную информацию см. В дополнительном файле 1.]

    Расстояния линкера могут быть выбраны индивидуально для донора и акцептора. При моделировании положение красителей изменяется от координат места маркировки, указанных во входном файле, на это расстояние в случайном направлении (рис. 1, шаг 4). Предполагается, что в течение одного цикла возбуждения положения красителя постоянны.Однако между двумя событиями возбуждения все красители перемещаются в объеме, который ограничен линкером, независимо от их последнего назначенного положения. Обратите внимание, что это приводит к довольно сложному распределению расстояний между красителями, что приводит к неэкономичному времени вычислений для аналитических решений. Короткое расстояние линкера минимизирует ошибки из-за неслучайной ориентации линкера и упрощения распределения расстояния красителя до его исходных координат. Напротив, более крупные линкерные последовательности допускают большие неточности в предсказанном распределении положений красителя.Однако серьезным нарушением предполагаемых условий было бы ограничение случайности ориентации красителя или его поворотной гибкости. Это могло быть связано с очень короткой или очень жесткой линкерной последовательностью. Ограниченная гибкость вращения красителя приведет к ложным предсказаниям κ 2 значений и, по крайней мере, на ранних временных шагах, зависящую от времени вероятность обнаружения излучаемых фотонов при выбранном угле обнаружения. Мы рекомендуем обеспечить разумную гибкость красителя, подтвердив рандомизацию красителя измерениями анизотропии [20].В качестве альтернативы, с помощью ограниченной подвижности краситель-диполь следует проводить точное моделирование молекулярной динамики (МД) для получения точного распределения относительных углов в каждой системе индивидуально [16]. Обратите внимание, что моделирование MD может потребовать исключительной вычислительной мощности и, следовательно, может быть неприменимо в сложных системах.

    Процедура моделирования

    После того, как каждый необходимый параметр считан или рассчитан, экспериментальная процедура моделируется (Рисунок 1, Шаг 2-11). Случайное подмножество доноров выбирается путем присвоения случайных чисел каждому донору и возбуждается в фиксированный нулевой момент времени, предполагая бесконечно короткий световой импульс для возбуждения (рисунок 1, шаг 3).Чтобы принять во внимание хронологию событий, каждый временной шаг, наблюдаемый в эксперименте, моделируется для всех красителей (рис. 1, этап 6-11). После моделирования в течение времени, равного всему экспериментально контролируемому времени, или когда в цикле возбуждения не осталось возбужденного донора, схема замыкается. Необязательно, временная зависимость дезактивации акцептора также моделируется на всем временном интервале. Циклы возбуждения повторяются до тех пор, пока за один временной интервал не будет достигнут порог фотонов, который устанавливается пользователем и необходим для сбора надлежащей статистики (Рисунок 1, Шаг 2).В течение каждого временного шага заданного цикла возбуждения доноры и акцепторы контролируются в заданном порядке (рисунок 1).

    Деактивация акцептора

    Чтобы акцепторы, которые уже получили квант энергии, стали доступными для новых событий FRET, мы назначаем случайную вероятность каждому электронно возбужденному акцептору с помощью генератора случайных чисел (рисунок 1, шаг 6). Если она ниже, чем вероятность дезактивации в течение временного шага моделирования, акцептор снова доступен для передачи энергии по аналогии с формулой.2, где время жизни акцептора является обратной суммой процессов дезактивации. Количество событий деактивации акцепторов суммируется для каждого временного интервала.

    Циклы возбуждения донора

    Каждому донору в системе присваивается случайное значение с помощью генератора случайных чисел. Доноры со случайными значениями ниже вероятности возбуждения возбуждаются. Мы ускорили моделирование, убедившись, что в каждом цикле возбуждения возбужден хотя бы один донор. Возбужденные доноры впоследствии упорядочиваются по их случайно назначенному значению, от наименьшего к наибольшему, и в данном цикле возбуждения моделируются в таком порядке, чтобы избежать возможного смещения из-за фиксированного порядка в смоделированных донорах (рис. 1, шаг 7).Все акцепторы на расстоянии, вдвое превышающем радиус Ферстера от донора, с учетом длины линкера как донора, так и акцептора, проверяются на их доступность для FRET в течение этого временного интервала. Вероятность оставаться возбужденным затем рассчитывается для каждого донора на основе его текущего окружения (уравнение 2) и сравнивается со случайной вероятностью оставаться возбужденным или нет (рисунок 1, шаг 8). В случае деактивации тип деактивации определяется путем определения интервалов вероятности из отношения скоростей деактивации различных процессов и сравнения с другой случайной вероятностью.Процесс деактивации, представляющий этот интервал, выбирается для деактивации (рисунок 1, шаг 9). Индивидуальные процессы деактивации суммируются для каждого смоделированного временного интервала. Следует отметить, что все фотоны, испускаемые в течение одного цикла возбуждения, считаются за заданный интервал времени. Это сделано потому, что предполагается, что зависящие от времени вариации вероятности обнаружения фотонов (под углом обнаружения) имеют второстепенное значение для моделируемых систем; также в действительности частота счета фотонов должна быть достаточно низкой, чтобы не вносить значительного вклада и не обнаруживать более одного фотона в цикле возбуждения.Если донор деактивируется посредством события FRET, соответствующий акцептор возбуждается и, следовательно, временно блокируется для другой передачи энергии (рис. 1, этап 11).

    Вывод моделирования

    Вывод состоит из всех идентификаторов доноров, у которых нет акцепторов на соответствующем расстоянии, а также включает таблицу, содержащую частоты всех процессов дезактивации доноров, наблюдаемых в каждом временном интервале. Общее количество деактиваций акцептора включается в вывод.Соотношение скоростей дезактивации для каждого акцептора обычно остается постоянным с течением времени. Следовательно, дезактивация акцептора представляет собой качественную гистограмму TCSPC, учитывая зависящую от времени картину возбуждения этой системы FRET. Обратите внимание, что распады акцептора полностью моделируются только в том случае, если циклы возбуждения не прекращаются после дезактивации всех доноров. Чтобы сравнить сигнал акцептора с экспериментально зарегистрированной статистикой акцепторных фотонов и установить их по отношению к наблюдаемому сигналу донора, предполагая известное соотношение вероятности обнаружения двумя системами обнаружения, нужно использовать только квантовый выход акцептора Φ Необходимо определить .

    $$ {\ varPhi} _A = \ frac {k_ {Флуоресценция}} {{\ displaystyle \ sum_i {k} _i}} $$

    (3)

    где k Флуоресценция отображает скорость дезактивации излучением фотонов. Для сравнения с экспериментальными данными смоделированный распад фотона должен быть свернут с функциями отклика прибора в день измерения для данного канала красителя, чтобы реализовать временную зависимость плотности вероятности обнаружения приборной установки.

    Измерения времени затухания флуоресценции

    Время затухания флуоресценции регистрировали на спектрометре FL920 (Edinburgh Instruments), работающем в режиме TCSPC. При измерениях использовалось временное окно 50 нс и 1024 канала. Образцы возбуждали при λ ex = 450 нм с использованием источника суперконтинуума SC-400-PP (Fianum), и эмиссия была собрана на λ em = 525 нм с использованием поляризатора, установленного под магическим углом, и многоканальной пластинки (европотон) в качестве детектора.Частота следования источника возбуждающего света была установлена ​​на 10 МГц.

    Определение квантового выхода и радиуса Ферстера

    Используя систему измерения квантового выхода фотолюминесценции (PL) (C9920, Hamamatu Photonics), квантовый выход Φ D для донора определено равным 0,6. На основании этого был определен радиус Ферстера, равный 5,4 нм (уравнение 4), если предположить, что рандомизация ориентации красителя происходит намного быстрее, чем время затухания флуоресценции. 4}} $$

    (4)

    где N A — это число Авогадро.

    Теоретические вычисления

    Для проверки согласованности нашего кода с теорией резонансного переноса энергии Фёрстера мы вычислили вероятность излучения фотона. Для нескольких расстояний результирующие распределения были установлены в зависимости от их веса в соответствии с ожидаемыми фотонами в течение первого временного интервала на основе вероятности испускания фотонов и доли возбужденных доноров в конкретном окружении.

    $$ {N} _P (t) = {\ displaystyle {\ sum} _i {f} _ {D, i}} \ times \ frac {d {D} _ {я, выбросы}} {dt} = {\ displaystyle {\ sum} _i {f} _ {D, i}} \ times {k} _ {выделение} \ times \ exp \ left (- {\ displaystyle {\ sum} _j {k} _j} \ times \ varDelta t \ right) $$

    (5)

    где N P ( t ) — количество фотонов в зависимости от времени, f D, i — доля доноров с окружением i , k эмиссия — скорость эмиссии донора, а сумма k j представляет собой комбинированную константу скорости деактивации для всех процессов деактивации.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *