Ширина лада гранта: АвтоВАЗ рассекретил новую Lada Granta — Российская газета

Содержание

АвтоВАЗ рассекретил новую Lada Granta — Российская газета

Новый седан Lada Granta официально рассекречен в пресс-релизе, распространенном АвтоВАЗом и поступившем в «РГ».

На снимках хорошо видны изменения, которые произойдут в дизайне одного из самых успешных автомобилей в истории тольяттинского автогиганта. В передней части машина получила узнаваемый X-дизайн в стиле Lada Vesta и Xray, хромированные «бумеранги», большую решетку радиатора с увеличенным «шильдиком» и новую головную оптику.

Перемены произошли и на корме. Табличка с номерным знаком теперь будет располагаться на крышке багажника, там же появятся четыре хромированные буквы LADA. Дизайнеры слегка изменили бампер и фонари и укоротили «усы» — пожалуй, самый спорный элемент в актуальном облике Granta. Теперь выштамповки на крышке больше соответствуют общей линии в дизайне.

Сбоку же машина останется прежней. Изменятся разве что полоски молдинга на дверях и рисунок колесных дисков. Но Х-образных выштамповок, как и ожидалось, АвтоВАЗ на боковинах не сделал — иначе седан, наверное, можно было путать с Vesta.

Обновленная Lada Granta. Фото: Пресс-служба АвтоВАЗа.

«Зарекомендовавшая себя надежность в совокупности с уверенным и современным внешним видом, интерпретированным через генетический код «ИКС-образного» дизайна, создают достойное обновление семейства Lada Granta и закладывают базу для его дальнейшего развития», — прокомментировали изменения в пресс-релизе. И сослались на мнение вице-президента по продажам и маркетингу Яна Птачека, предположившего, что Granta, которая и без того пользуется стабильно высоким спросом, сможет привлечь новых покупателей.

Об изменениях по технической части АвтоВАЗ не сообщил — и, по всей видимости, их не будет. При этом поклонники марки вправе надеяться, что перемены произойдут в салоне — вероятно, информация об этом появится позже. Ранее предполагалось, что Granta FL (так обозначается обновленная модель в документации) получит как минимум новую панель приборов и систему дистанционного управления и мониторинга Lada Connect.

Премьера автомобиля состоится в конце августа 2018 года на Московском международном автосалоне, напомнили в компании. При этом обновленным седаном на ММАС дело не обойдется. АвтоВАЗ вовсю тестирует еще и лифтбек с универсалом. Последний создан на базе Lada Kalina и пополнит семейство Granta, тогда как с моделью Kalina, насколько известно, производитель распрощается.

Обновленная Lada Granta. Фото: Пресс-служба АвтоВАЗа.

Интересно, как обновление отразится на цене Lada Granta — пока это самый доступный автомобиль в России и один из самых популярных. За полгода в России было распродано 45 672 таких автомобиля — на 9% больше, чем в 2017-м. Лучше разбирают только Kia Rio и Lada Vesta.

LADA Vesta Sport – Технические характеристики – Первый Лада Центр, Краснодар.

  • Кузов
  • Колесная формула / ведущие…

  • Расположение двигателя

  • Количество мест

  • Длина / ширина (по зеркалам) / высота,…

  • База, мм

  • Колея передних / задних колес,…

  • Дорожный просвет, мм

  • Объем багажного отделения, л

  • Двигатель
  • Код двигателя

  • Тип двигателя

  • Система питания

  • Рабочий объем, куб. см

  • Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об….

  • Максимальный крутящий момент, Нм / об….

  • Рекомендуемое топливо

  • Динамические характеристики
  • Максимальная скорость, км/ч

  • Время разгона 0-100 км/ч, с

  • Расход топлива
  • Городской цикл, л/100 км

  • Загородный цикл, л/100 км

  • Смешанный цикл, л/100 км

  • Масса
  • Снаряженная масса, кг

  • Технически допустимая максимальная масса,…

  • Максимальная масса прицепа без тормозной системы /…

  • Объем топливного бака, л

  • Трансмиссия
  • Тип трансмиссии

  • Передаточное число главной…

  • Подвеска
  • Передняя

  • Задняя

  • Рулевое управление
  • Рулевой механизм

  • Шины
  • Размерность

  • Размеры кузова Lada Granta — Таблицы размеров

    1.6 AT (2015 — н.в.)
    Тип кузовалифтбек
    Количество дверей5
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4247 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 AT (2014 — н.в.)
    Тип кузовалифтбек
    Количество дверей5
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4247 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 MT (2014 — н.в.)
    Тип кузовалифтбек
    Количество дверей5
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4247 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 MT (2014 — н.в.)
    Тип кузовалифтбек
    Количество дверей5
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4247 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 AT (2015 — н.в.)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 AT (2012 — 2015)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 AT (2014 — 2015)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 MT (2013 — н.в.)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 MT (2011 — н.в.)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 MT (2011 — н.в.)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    1.6 MT (2011 — н.в.)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2476 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1426 (мм)
    Дорожный просвет160 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)
    Sport 1.6 MT (2012 — н.в.)
    Тип кузоваседан
    Количество дверей4
    Количество мест5
    Колесная база2490 (мм)
    Колея передняя1430 (мм)
    Колея задняя1420 (мм)
    Дорожный просвет140 (мм)
    Ширина1700 (мм)
    Длина4260 (мм)
    Высота1500 (мм)

    Багажник Лада Гранта все размеры и фото – Просто автомобильный сайт

    Багажник Лада Гранта

    пожалуй является самым большим достоинством бюджетного седана, главная задача которого быть максимально практичным автомобилем. Собственно Lada Granta седан по сути является Лада Калина седан первого поколения. Правда у новой модели выросла длина более чем на 20 сантиметров и как раз за счет увеличения багажного отсека, а вот ширина, высота и колесная база остались неизменными.

    Сегодня производитель указывает, что объем багажного отделения Лада Гранта составляет 520 литров. Хотя в некоторых источниках встречается цифра 480 литров. Тут возникает вопрос как считать? Если считать по стандарту VDA, то получается 480 литров, а если считать в геометрических литрах тогда 520 литров. Какую методику подсчета использовал производитель, нам понятно. Но в любом случае первое впечатление любого человека при открытии багажника Lada Granta – он очень большой для такого класса авто!

    Не будем забывать, что задняя спинка сидения складывается частично, что существенно увеличивает ваши возможности для перевозки различных вещей. В таком положении в салон легко вмещаются вещи длиной более 1.5 метров. Фотография прилагается.

    Довольно широкий проём позволяет без труда загружать даже объемные вещи, сама крышка багажника этому практически не мешает. А ведь такая проблема есть у многих машин, у которых объем большой, но погрузить туда что объемное не получается.

    Линейные размеры багажника Лада Гранта

    • Погрузочная высота от земли – 660 мм
    • Ширина багажного проема сверху – 950 мм
    • Ширина багажного проема снизу – 850 мм
    • Ширина багажного проема по диагонали – 1100 мм
    • Ширина багажника между арок – 940 мм
    • Ширина багажника в самом широком месте – 1320 мм
    • Высота багажника внутри – 570 мм
    • Длина багажника до спинки заднего сидения – 1025 мм
    • Длина багажника при сложенном заднем сидении – 1650 мм
    • Высота проема между багажником и салоном – 480 мм

    Стоит заметить, что под полом багажника Lada Granta находится довольно большая ниша, где находится полноразмерное запасное колесо.

    Ширина гранты с зеркалами — Автомобильный портал AutoMotoGid

    Размеры кузова автомобилей Ваз, данные по геометрии и контрольным точкам Lada 2190 из заводской документации.

    Справочные линейные размеры проемов дверей Lada Granta

    Справочные линейные размеры проемов ветрового и заднего окна Ваз 2190

    Контрольные размеры кузова в моторном отсеке (подкапотное пространство Лада Гранта)

    Контрольные размеры кришки багажника Ваз 2190

    Основные размеры кузова ВАЗ 2190 (Лада Гранта) днище

    Заводские схемы показывают габаритные размеры кузова Лада Гранта, расстояние между колесами, углы переднего и заднего свеса, ширину колеи, вместительность салона и некоторые другие размеры.

    Ширина, высота кузова осталась аналогичной Лада Гранта седан, отличается только длина кузова, у лифтбека он короче на 14 мм. Размеры салона Лада Гранта лифтбек тоже практически такие же, как и у седана. Исключение составляет только пространство над головой задних пассажиров, которое уменьшилось на 8 мм.

    Объем багажника составляет 440 литров, но может быть увеличен до 760 литров, если сложить спинки задних сидений.

    Также, стоит отметить и отличие размеров багажного отделения. В кузове седан и спорт, багажник имеет одинаковый объем – 520 литров, а вот у лифтбек, багажник увеличен до 760 литров, благодаря измененному кузову.

    Ширина всех троих видов: седан, лифтбек и спорт – абсолютно одинаковая. Размеры машины, от края левого зеркала, до края правого – 1,7 метра. Такие габариты, не сильно отличаются от остальных моделей Лада (по ширине). При этом, вместительность и комфорт, в каждой модели абсолютно разный. Например, в Гранте салон довольно просторный, чего не скажешь про Калину.

    Высота, у кузова седан и лифтбек – одинаковая, и равняется 1,5 метра. А вот, что касается Лады спорт, то его высота немного меньше – 1470 мм. Разница в 30 мм, достигается за счет более низкой подвески. Размеры, обозначающие высоту, считаются от дорожного покрытия, с которым соприкасается колесо, до верхней точки крыши автомобиля.

    Также, у Гранты спорт, более широкая колесная база. То есть, не смотря на одинаковую ширину всех кузовов, у данного образца, колесные оси удлинены на 15 мм. Конечно, такая разница не значительна, и при таких размерах, колесо не будет выпирать из арок, увеличивая габариты автомобиля.

    Двери довольно широкие, что обеспечивает удобную посадку и высадку пассажиров. Высота задней двери – 97,2 см, а ширина – внизу 61 см, а вверху 83,3. Переднее двери, имеют немного большие габариты: высота – 1 метр, а ширина – 1 метр 72 миллиметра. При полном открытии дверей, доступ в салон, не будет иметь проблем.

    (речь буду вести не о визуальной узости, а об ощущениях водителя!)

    Последнее время частенько ловил себя на мысли, что возникает ощущение как-будто машина узкая и пролезает в те щели, где на прошлых авто не рискнул бы сунуться. То в пробках, то во дворах разъезжаюсь в очень узких местах, паркуюсь в узких местах. Хорошее чувство габаритов.

    Решил проверить характеристики, хотя я и так помнил что гранта примерно 1.7 м в ширину, и примерно такой же ширины был прошлый фокус (по характеристикам), но по ощущениям: фокус казался шире и по пространству в салоне, и по месту занимаемому на дороге!

    Итак приведу данные с каталога авто.ру, тех машин, на которых ездил немало, УЖЕ которых кажется гранта:

    Ширина 1700 мм (гранта)
    Колея передняя 1430 мм

    Ширина 1698 мм (фокус1)
    Колея передняя 1484 мм

    Ширина 1695 мм (Тойота корона премио )
    Колея передняя 1465 мм

    Ширина 1804 мм (Опель астра Н — тут все понятно! Широкая и по цифрам.)
    Колея передняя 1488 мм

    Ну и для сравнения, ширина Дэу Матиза 1495 мм. т.е. примерно на 20 см уже — это действительно узкая машина!

    Как видим, большинство из приведенных здесь авто имеют ширину около 1.7 м. Причем Гранта оказалась чуточку ШИРЕ фокуса 1, и короны премио (старый Д-класс)! Неожиданно!

    Так почему же тогда гранта кажется Узкой когда едешь на ней?

    1) Я не зря привел колею, т.к. думаю страх зацепить колесами бордюр например, иногда заставляет нас отступиться от того чтобы влезть в узкое место, где на Гранте уже можно попытаться проехать. И видно что на гранте колея относительно узкая — возможно она так же дает это ощущение «узости», т.е. возможности проехать в относительно узком месте дороги.

    2) следующим фактором, влияющим на ощущение ширины, думаю можно назвать обзор, короткий капот, да еще и визуально скошенный по краям — от этого кажется авто еще уже чем есть!

    Вот такие мои размышления по поводу Узкой Гранты! ))

    Ps: кстати, киа Рио тоже шириной ровно 1.7 м…

    Габаритные размеры автомобилей ВАЗ Granta. Подробные данные о длине, высоте и ширине автомобилей Лада (ВАЗ) Гранта в зависимости от модификации и года выпуска. Штатный дорожный просвет (клиренс) автомобилей Лада (ВАЗ) Гранта.

    Выберете ниже модель и модификацию:

    Модификация Длина Ширина Высота Дорожный просвет
    ВАЗ Granta Седан / 1.6 AT (98 л.с.) (2012) 4260 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Седан / 1.6 MT (106 л.с.) (2013) 4260 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Седан / 1.6 MT (82 л.с.) (2011) 4260 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Седан / 1.6 MT (87 л.с.) (2011) 4260 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Седан / 1.6 MT (98 л.с.) (2011) 4260 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Лифтбек / 1.6 AT (98 л.с.) (2014) 4247 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Лифтбек / 1.6 MT (106 л.с.) (2014) 4247 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм
    ВАЗ Granta Лифтбек / 1.6 MT (87 л.с.) (2014) 4247 мм 1700 мм 1500 мм 160 мм

    Отзывы владельцев:

    Skoda Kodiaq

    День добрый! Пишу свое личное мнение о Skoda Kodiaq, на которой накатал уже больше 27 тысяч км. Итак.

    Kia Soul

    Жена давно просила поменять RAV4 2010 года на новую машину, но выбрать подходящий вариант, с её подх.

    Renault Arkana

    Можете поздравить! Уже две недели катаюсь на новенькой Renault Arkana. Срок конечно небольшой, но эй.

    Subaru Forester

    Добренького времени суток. Почти год назад взял в салоне нового Subaru Forester, вот, созрел поделит.

    Новости дилеров:

    Новые автомобили и автомобили с пробегом — десятки тысяч объявлений по продаже. Отзывы автовладельцев. Технические характеристики и Комплектации. Сравнение моделей и Тест-Драйвы. Новости из мира автомобилей. Цены на новые авто. Акции и спецпредложения от автосалонов. Мы поможем Вам сделать свой выбор!

    Данный сайт носит информационно-справочный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой.

    Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС77-68106 от 21.12.2016. Выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций. 16+

    Новые модели Lada Granta: хэтчбек и универсал

    Вот уже несколько лет подряд LADA Granta является самым продаваемым автомобилем в России. И это неудивительно, поскольку ни один конкурент не может предложить за 400-500 тысяч современную машину с аналогичным функционалом. Однако, компания АвтоВАЗ решила не почивать на лаврах, а развивает свой успех, расширяя линейку Granta и предлагая потенциальному покупателю новые варианты кузова.

    Изначально автомобиль был выпущен исключительно как седан (2011 год). Через два года появился вариант с кузовом лифтбек, который благодаря трехобъемной компоновке и покатой задней двери позволял при необходимости загружать габаритный багаж, сохраняя при этом все преимущества седана. Наконец, в 2018 году на свет появились недостающие кузовные вариации – хэтчбек и универсал.

    Основные особенности Lada Granta хэтчбек и универсал

    • Геометрия. Это, по сути, единственное значимое отличие всех четырех версий Lada Granta, поскольку все они созданы на единой платформе «Гамма». Ширина, высота, колесная база – все эти параметры одинаковы. Машины различаются только конструкцией задней части. Хэтчбек и универсал существенно короче седана/лифтбека (на 342/324 и 150/132 мм соответственно) и имеют практически вертикальный задний профиль.
    • Ходовые качества. Все кузовные модификации оснащаются одним и тем же набором силовых установок и трансмиссий. Кроме того, их передняя часть абсолютно одинакова, а значит аэродинамическая эффективность идентичная. В результате единственным фактором, влияющим на ходовые качества, является вес. Поскольку разброс составляет всего 25 кг, то и различия в разгоне, максимальной скорости и расходе бензина – мизерные.
    • Комплектации и цены. Автомобили Lada Granta вне зависимости от варианта кузова доступны в 4 вариантах исполнения – Standart, Classic (+ пакет Optima), Comfort и Luxe (+ пакет Prestige). Набор установленных опций практически не меняется. Более того, даже цены одинаковых комплектаций почти не отличаются – разброс составляет около 25 тысяч. Поэтому выбирать следует, исходя исключительно из нужного вам типа кузова.

    Что купить?

    Если вам нужен максимальный объем багажника, и вы готовы за это платить габаритами кузова, то выбирайте классический седан. Это целых 520 литров изолированного объема (запахи от грузов не будут поступать в салон).

    Если же вам нужен большой багажник, но с возможностью перевозки крупногабаритных грузов, то альтернативой седана может стать лифтбек. Это наиболее вариативное решение, по длине примерно соответствующее седану. Объем багажника 440 литров.

    Желаете предельно компактную машину, на которой легко маневрировать и парковаться? Тогда новая Lada Granta хэтчбек будет вне конкуренции, поскольку ее длина менее 4 метров. А небольшой 240-литровый багажник можно всегда расширить, опустив кресла.

    Новая Granta в кузове универсал – это, по сути, удлиненный хэтчбек. Она все еще достаточно компактна, но объем багажника уже более существенный – 355 литров. Компромиссный вариант для тех, кому нужно чуть больше места для багажа.

    * Цены актуальны на момент публикации статьи

    ➤ Багажник Гранта Лифтбек — подробный обзор

    Лада Гранта Лифтбек построена на платформе от Гранта Седан, а значит, размеры кузова максимально приближены к «седановским».

    Ширина и высота прежние: 1700 х 1500 мм, а вот длина короче на целых 150 мм, и составляет 4246 мм.
    Внутри салона пропорции соблюдены, за исключением свободного пространства над головой пассажиров заднего ряда сидений. Его уменьшили на 8.0 см. В целом, дискомфорт не ощущается.
    Главный козырь модели Лифтбек — увеличенное пространствоa багажного отсека, несмотря на общее сокращение длины кузова. При сложенных сиденьях объем составляет 440 литров, в разложенном виде — 760 литров.

    Обзор багажника, что и где находится

    В базовой комплектации Лада Гранта Лифтбек отсутствует дистанционный привод для разблокировки дверей. В версиях Люкс на ключе установлена механическая кнопка.
    Чтобы разблокировать пятую дверь, достаточно один раз нажать на кнопку. Далее механическим воздействием руки поднять крышку. Заметим, что она не легкая, одного мизинца будет недостаточно, приложите усилие.
    Даже в сложенном виде багажник вместительный и внушительный. По периметру обшит войлочным, ворсистым материалом. Он служит одновременно обшивкой и обесшумкой.

    К сожалению, на полу не предусмотрен резиновый коврик, лишь ворсистый материал. При необходимости владелец может самостоятельно приобрести резиновое покрытие.
    Приподняв фальшполку, по центру увидим углубление для запасного колеса. Причем штатный радиус дисков составляет 14 дюймов, а уложить можно на все 16. Удобно и практично, так как появляется свободное место.
    Помимо полноценной покрышки, размещен механический домкрат, баллонный ключ. При желании можно уместить буксировочный трос, который нужно купить отдельно, в штатной комплектации он не поставляется.

    Размеры багажника Гранта Лифтбек в сантиметрах

    НаименованиеПараметры
    Сложенный вариант
    Ширина по стаканам задней стойки98,5 см
    По крыльям кузова с внутренней стороны130 см
    Высота полки64 см
    В разложенном положении
    Длина170 см
    Ширина110 см

    Размеры фальшпола багажника в Лада Гранта Лифтбек
    Параметры отсека для запасного колеса следующие:

    • диаметр: 80 – 81 см;
    • глубина посадки: 22 см.

    Однако использовать отсек для перевозки личных вещей не рекомендовано, так как он предназначен для хранения запасного колеса. Отсутствие запасного элемента шасси ставит под угрозу безопасность вождения транспортного средства.

    Сравнение размера багажника с другими марками

    Марка / модельОбъем сложенный / разложенный
    VolkswagenPassatVariant496 / 603 л
    ŠkodaSuperbCombi480 / 605 л
    SkodaOctaviaCombi420 / 588 л
    MitsubishiPajeroSport430 / 590 л
    Peugeot 408370 / 476 л

    У Гранта Лифтбек размеры багажника не самые худшие, несмотря на укороченный кузов. Модель успешно конкурирует со многими европейскими марками автомобилей.

    Особенности и недостатки багажного отсека

    • Чтобы полноценно разложить задний ряд сидений в ровную платформу потребуется извлечь подголовники. В противном случае они будут упираться в тыльную сторону передних сидений. Угол раскладки сидений не будет превышать 160 – 165°;
    • Чтобы дистанционно разблокировать замок задней двери необходимо дважды нажать на механическую кнопку брелока;
    • Для поднятия крышки багажника нужно приложить немало усилий, дверь умеренно тяжелая;
    • Цельный резиновый коврик на фальшполке непрактичен, так как при частом использовании запасного колеса, механического домкрата борта задевают ворсистую обшивку, изнашивая ее.

    Что влезет из габаритных грузов в багажник Лифтбека

    При сложенных сиденьях заднего ряда багажник вмещает четыре покрышки радиусом на 14 – 15 дюймов. Плюс, остается место по бокам для укладки инструментария, буксировочного троса, ножного насоса для подкачки колес.

    Для перевозки негабаритного груза, в пределах допустимой нагрузки, нужно временно демонтировать полку. Для этого нужно:

    1. Выкрутить крестообразной отверткой по два самореза с каждой из сторон у основания.
    2. Снять с верхних петель тросы.

    Советы владельцев

    • Чтобы обшивка фальшполки не изнашивалась преждевременно, купите составной полик в багажный отсек. В качестве альтернативного варианта выберите полик от Рено Логан Универсал.
    • С целью снижения уровня шума от ударов гравия и камней, установите дополнительную шумоизоляцию. Процесс оклейки несложный, под силу каждому автовладельцу. Наличие специального оборудования не нужно.
    • В штатной комплектации в Лада Гранта Седан и Лифтбек поставляется два ключа от замка зажигания: один черный, второй черный с красной прослойкой. Всегда храните последний, так как он отпирает и двери, и багажник. При утере восстановление окажется достаточно хлопотной процедурой.

    Отзывы

    Положительные
    1. Георгий: покупал Гранту Лифтбек уже перед выходом на пенсию. За городом дача, огород, фруктовый сад. С наступлением весны много работы, нужно перевозить инвентарь, овощи. В этом плане машина просто незаменима. Мои рекомендации огородникам.
    2. Сергей: для нашей небольшой семьи из четырех человек Лифтбек в самый раз. Вместительность багажника хорошая. При необходимости раскладываем задний ряд и транспортируем все, что нужно.
    3. Виталий: оставляю свой положительный отзыв о вместительности багажника Лада Гранта Лифтбек. По роду деятельности занимаюсь поставкой продукции в торговые точки. Чем больше заказ, тем больше прибыль. Все помещается.
    4. Георгий: покупал Лада Гранта Лифтбек не только за «новинку», а также и за вместительный багажник. Часто езжу с товарищами на рыбалку, без «хорошей укладки» никак. Мои рекомендации.
    5.Василий: семьей долго решали, что покупать Седан или Лифтбек, в конечном итоге выбрали последнюю модификацию кузова.
    6. Давид: предпочтение отдал в пользу Лифтбека по причине практичности, возможности перевозить больше вещей. При необходимости можно переночевать в салоне, предварительно разложив задний ряд сидений.
    7. Владислав: проживаю в сельской местности и для меня модификация кузова «Седан» не практична. В Лифтбек можно уместить достаточно много, а в разложенном положении еще больше.
    Отрицательные
    1. Виктор: ничего особенного в багажнике нет, он слишком узкий, всего 940 см в крайней точке между задними стаканами. В Рено Логан размеры шире на 15 см.
    2. Василий: модель еще сырая, много недоработок, слабая обесшумка. Чтобы устранить недостатки необходимо вложить средства. Лучше доложить несколько десятков тысяч и купить Рено Логан.
    3. Игорь: покупал машину в салоне полгода назад, нареканий не было. Спустя несколько десятков тысяч пробега чаще посещаю СТО по всякой мелочи, доработкам, устранении заводских дефектов. Буду продавать, пока не поздно.

    Вывод
    Размеру багажника Лада Гранта Лифтбек нужно отдать должное. Инженеры потрудились на славу, параметры выше ряда европейских марок: Фольксваген, Шкода, Опель, Сеат.
    Критика по поводу недостаточной обесшумки вполне заслужена, недоработка производителя. Учитывая невысокую стоимость работ, устранить дефект можно самостоятельно.

    Видео — Обзор багажника ЛАДЫ ГРАНТЫ ЛИФТБЕК

    Видео — Новая Лада Гранта Лифтбэк 2017 (обзор багажника плюсы и минусы)

    Black Fret приближаются к 1 миллиону долларов финансовой поддержки местным музыкантам

    [fusion_builder_container 100_percent = «no» equal_height_columns = «no» menu_anchor = «» hide_on_mobile = «малой видимости, средней видимости, большой видимости» class = «» id = «» background_color = «» background_image = «» background_position = ”Center center” background_repeat = ”no-repeat” fade = ”no” background_parallax = ”none” parallax_speed = ”0,3 ″ video_mp4 =” ”video_webm =” ”video_ogv =” ”video_url =” ”video_aspect_ratio =” 16: 9 ″ video_loop = ”Да” video_mute = ”да” overlay_color = ”” video_preview_image = ”” border_size = ”” border_color = ”” border_style = ”solid” padding_top = ”” padding_bottom = ”” padding_left = ”” padding_right = ””] [fusion_builder_row] [fusion_builder_column type = «2_3 ″ layout =» 1_1 ″ background_position = «left top» background_color = «» border_size = «» border_color = «» border_style = «solid» border_position = «all» spacing = «yes» background_image = «» background_repeat = «Без повтора» padding_top = «» padding_right = «» padding_bottom = «» padding_left = «» margin_top = «0px» margin_bottom = «0px» class = «» id = «» animation_typ e = ”” animation_speed = ”0.3 ″ animation_direction = «left» hide_on_mobile = «малый, средний, большой» center_content = «no» last = «no» min_height = «» hover_type = «none» link = «»] [fusion_text]

    BLACK FRET ПРИБЛИЖАЕТСЯ НА 1 МИЛЛИОН ДОЛЛАРОВ ФИНАНСОВОЙ ПОДДЕРЖКИ МЕСТНЫХ МУЗЫКАНТОВ ЗА ЧЕТЫРЕ ГОДА;


    ОБЪЯВЛЯЕТ НАЧАЛО СЕЗОНА 2018 ЯНВАРЯ. 20 AT THE MOHAWK
    Black Fret вручил остинским музыкантам гранты в размере 230 000 долларов на Четвертом ежегодном балу Black Fret Ball 9 декабря в переполненном зале театра Paramount

    (ОСТИН, ТЕХАС — декабрь.21, 2017, источник: Juice Consulting) — Остинская некоммерческая организация Black Fret прошла долгий путь всего за четыре коротких года, предоставив местной музыкальной сцене грант в размере 730 000 долларов. В сочетании с прямыми выплатами артистам за выступления и новой вторичной программой грантов общий финансовый эффект достигает более 1 миллиона долларов. На недавнем бале Black Fret Ball 9 декабря некоммерческая организация присудила номинантам в общей сложности 230 000 долларов. Шоу представляло живые выступления многих номинантов в полностью переполненном и восторженном доме в Paramount Theater.Среди основных получателей грантов, получивших по 18000 долларов, — The Bright Light Social Hour, Carolyn Wonderland, Эрик Тессмер, Джеки Венсон, Леопольд и его фантастика, Mobley, Сара Шарп, The Deer, Уоррен Худ и Whisky Shivers. Среди незначительных получателей гранта, каждый из которых получил по 5 555 долларов, были Акина Аддерли, Cowboy Diplomacy, Croy and the Boys, Daniel Eyes, David Ramirez, Greyhounds, Jane Ellen Bryant, Kinky Machine и Los Coast. Black Pistol Fire, который также был номинирован на грант, решил исключить себя из рассмотрения и попросил Black Fret выделить средства, которые они получили бы, среди незначительных получателей гранта.Black Fret Ball был представлен DELL. Дополнительные спонсоры включали Deloitte, GSD & M, Ben E. Keith, New York Life, SunPower, Zoho, Whole Foods, Personify и Burkhart Dentistry. Медиа-спонсоры вечера включали KUT / KUTX, Austin Way, CultureMap, Austin Chronicle, Austin Monthly, Tribeza и Do512.com. Для получения дополнительной информации о Black Fret посетите www.blackfret.org.

    «Мы безмерно благодарны за этот грант и безмерно в восторге от того, что Black Fret делает для будущего музыки Остина и музыкального сообщества в целом», — сказал крупный обладатель гранта Джек О’Брайен из The Bright Light Social Hour.«Black Fret — это не только маяк надежды и помощи, но и новаторский подход и воображение. Бал был волшебным и незабываемым проявлением единства и поддержки, и этот грант пойдет прямо на исполнение нашей мечты о независимой записи нашего флагманского альбома ».

    «Как музыкант вы много делаете, чтобы организовать свою жизнь, сохраняя надежду», — сказал крупный обладатель гранта Мобли (он же Энтони Уоткинс). «Когда я впервые услышал о Black Fret, это прозвучало слишком хорошо, чтобы быть правдой, и я отказался надеяться.Но по мере того, как я лучше узнал организаторов и участников, стало ясно, что все они действительно помогают музыкантам, и я позволил себе надеяться. Я безмерно благодарен за грант и особенно за то, что моя надежда была вознаграждена ».

    «Совершенно очевидно, что именно люди, которые любят свой город и его музыку, действительно имеют значение, — сказал Мэтт Отт, соучредитель Black Fret. «Наблюдение за тем, как наши замечательные артисты, наставники музыкальной индустрии и участники Black Fret собираются вместе, чтобы построить это сообщество поддержки, любви и отличной музыки, является свидетельством концепции, согласно которой, объединившись, мы можем поддерживать и развивать музыку и музыкантов, которых мы любим, которые помогают создавать Остин — отличное место для жизни.Каждый участник, который присоединяется к нам, помогает нам осуществить эту мечту и прекрасно проводит время, делая это, погружаясь в невероятную музыку на удивительных мероприятиях, одновременно предоставляя свой голос, номинируя свои любимые группы Остина ».

    [/ fusion_text] [fusion_imageframe image_id = «4671 ″ style_type =» none «stylecolor =» «hover_type =» none «borderize =» «bordercolor =» «borderradius =» «align =» center «lightbox =» no «gallery_id = ”” Lightbox_image = ”” alt = ”Местные музыканты” link = ”” linktarget = ”_ self” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” animation_type = ”” animation_direction = ”Left” animation_speed = ”0.3 ″ animation_offset = ””] https://www.blackfret.org/wp-content/uploads/2018/01/Black-Fret-Ball-2017-.jpg [/ fusion_imageframe] [fusion_text]

    2017 Художники Black Fret The Bright Light Social Hour получают крупный грант от соучредителя Black Fret Мэтта Отта и представителя штата Техас Джины Хинооса.

    [/ fusion_text] [fusion_text]

    «Для Black Fret вложить более миллиона долларов в карманы остинских музыкантов всего за четыре года — это огромное достижение, которое заметно изменило жизнь не только замечательных музыкантов нашего города, но и наших участников. — сказал Колин Кендрик, основатель Black Fret.«Мы видим, как создаются и выпускаются альбомы и песни, которых никогда бы не было, если бы не наши гранты Black Fret. И мы видим, как жизнь сотен участников Black Fret улучшилась благодаря тому, что они были подключены к музыкальной сцене действительно круто и интимно. Этот акт соединения и возникшее в результате сообщество — это обещание и сила Black Fret, воплощенная в реальность ».

    Black Fret также объявил подробности своего следующего крупного мероприятия, Black Fret Season Kickoff 2018, которое состоится в субботу, 20 января 2018 года, в Mohawk, расположенном по адресу: 912 Red River St., Остин, Техас 78701. Двери открываются в 19:00. На мероприятии выступят одни из самых выдающихся музыкантов Остина для покровителей местной музыки Остина — участников Black Fret и их гостей. Чтобы принять участие в мероприятии, вы можете присоединиться к Black Fret, зарегистрировавшись здесь: www.blackfret.org/join.

    Black Fret — это общественная благотворительная организация со штаб-квартирой в Остине, чья миссия — дать музыкантам возможность создавать и исполнять отличную новую музыку. Организация представляет собой новаторское развитие старой модели патронажа симфонических оркестров, ориентированной на поддержку популярной местной музыки.На сегодняшний день Black Fret наградил местных артистов Остина 730 000 долларов, и в 2018 году их ждет еще больше. Получатели гранта Black Fret открывают свои грантовые доллары, сочиняя, записывая и исполняя новую музыку, а также предоставляя общественные услуги другим некоммерческим организациям. На сегодняшний день благодаря грантам Black Fret было проведено 332 тура по США, написано 228 песен, записано 197 песен, 111 благотворительных выступлений, выпущено 101 песня и видео и 31 международный тур.

    [/ fusion_text] [fusion_imageframe image_id = ”4677 ″ style_type =” none ”stylecolor =” ”hover_type =” none ”Borderize =” ”bordercolor =” ”borderradius =” ”align =» center «lightbox =» no «gallery_id = ”” Lightbox_image = ”” alt = ”местные музыканты” link = ”” linktarget = ”_ self” hide_on_mobile = “малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” animation_type = ”” animation_direction = ”Left” animation_speed = ”0.3 ″ animation_offset = ””] https://www.blackfret.org/wp-content/uploads/2018/01/local-musICAL-2017-black-ball.jpg [/ fusion_imageframe] [fusion_text]

    Артисты Black Fret 2017 The Deer и Whiskey Shivers выступают вместе на Black Fret Ball 2017

    [/ fusion_text] [fusion_text]

    Помимо грантов, все номинанты Black Fret по-прежнему имеют доступ к индивидуальному наставничеству Консультативного совета Black Fret, в который входят некоторые из ведущих лидеров музыкальной индустрии Остина.В число консультантов входят Марк Аддисон, Хизер Олден, Коди Аллен, Рогги Бэр, Эван Блан, Пэт Кэссиди, Рини Коллинз, Майк Кроули, Джен Далтон, Уоффорд Дениус, Си Джей Эйрикссон, Джим Ино, Найджел Финли, Дэнни Гиллеспи, Уилл Хоффман, Дженнифер Хулихан. Террэни Джонсон, Лэйн Лауритцен, Терри Ликона, Уэстон Макгоуэн, Дэвис МакЛарти, Марша Милам, Мэтт Новески, Тим Палмер, Майкл Рамос, Питер Шварц, Крис «Френчи» Смит, Карлос Соса, Джо Сталлоне, Стюарт Салливан, Хизер Вагнер Рид, Дик Ривз, Грэм Уильямс, Кевин Уоммак и Расти Загст.До своей кончины в этом году Джордж Рейфф также был ценным советником. Для получения дополнительной информации посетите www.blackfret.org/about-black-fret/#advisors.

    В этом году Black Fret объявила о добавлении в состав группы Black Fret Artist 2014 года и международного бизнес-консультанта Эрин Айви в качестве первого директора по работе с участниками. В этой роли Айви отвечает за то, чтобы участники Black Fret продолжали наслаждаться лучшими музыкальными впечатлениями Остина, позволяя создавать и исполнять новую музыку наиболее выдающимися местными музыкантами города.Она привносит навыки, которые она использовала в качестве консультанта по бизнесу и управлению проектами для глобальных компаний из списка Fortune 500, чтобы укрепить основные членские операции Black Fret и стимулировать ее непрерывный рост.

    Black Fret получает постоянную поддержку от щедрых спонсоров, таких как ALL ATX, Dell Inc., Deloitte Consulting, New York Life, Ben Milam Whiskey, SunPower Inc., GSD & M, Ben E. Keith Distributors, Whole Foods, Personify, Gibson Brands, Департамент экономического развития города Остина — отдел музыки и развлечений, KUTX, The Austin Chronicle, DeMaris Entertainment, Juice Consulting, Nomad Sound, разные объекты аренды, театр Paramount, предприимчивые люди, водка ручной работы Tito’s, барбекю County Line, Shady Grove, Verts , Фрэнк, YETI, Biggs Electric, Social Flash Media и многие другие.

    О Black Fret:
    Основанная в 2013 году, Black Fret — это общественная благотворительная организация со штаб-квартирой в Остине, миссия которой — дать музыкантам возможность создавать и исполнять новую музыку. Организация представляет собой новаторское развитие старой модели патронажа симфонических оркестров, ориентированной на поддержку популярной местной музыки. Вместе ограниченное членство Black Fret создаст благотворительную организацию, способную предоставлять более миллиона долларов в год в виде грантов артистам Остина. Ежегодные членские взносы Black Fret составляют 1500 долларов, а после уплаты налогов — примерно до 100 долларов в месяц.Многие участники имеют доступ к программе корпоративных благотворительных пожертвований (например, предлагаемой Dell, Apple и другими крупными работодателями), которая может снизить ежемесячные расходы до менее чем 50 долларов в месяц. В обмен на ежегодные взносы участники получают возможность участвовать в различных частных мероприятиях, включая ежемесячные шоу в уютных залах и невероятное ежегодное шоу наград под названием The Black Fret Ball. Получатели грантов выбираются ежегодно в течение года, когда участники, советники и предыдущие получатели грантов номинируют, лоббируют, смотрят выступления и, наконец, голосуют за своих любимых артистов.Те, кто желает стать участником Black Fret, могут зарегистрироваться на сайте www.blackfret.org/join. Все членства обеспечивают вход для участника и гостя на все предстоящие мероприятия Black Fret 2017 года, включая Black Fret Ball. Для запросов, пожалуйста, напишите по адресу[email protected], а для получения дополнительной информации посетите www.blackfret.org.

    ###

    * ПРИМЕЧАНИЕ ДЛЯ СМИ:
    Чтобы запросить интервью относительно Black Fret, принять участие в предстоящем мероприятии 20 января, или для общих запросов прессы, пожалуйста, обращайтесь:

    [/ fusion_text] [fusion_builder_row_inner] [fusion_builder_column_inner type = ”1_2 ″ layout =” 1_2 ″ spacing = ”” center_content = ”no” hover_type = ”none” link = ”” min_height = ”” hide_on_mobile = ”малозаметный, средний -visibility, large-visibility ”class =” ”id =” ”background_color =” ”background_image =” ”background_position =» left top «background_repeat =» no-repeat «border_size =» 0 «border_color =» «border_style =» solid » padding_top = ”” padding_right = ”” padding_bottom = ”” padding_left = ”” dimension_margin = ”” animation_type = ”” animation_direction = ”left” animation_speed = ”0.3 ″ animation_offset = ”” last = ”no” border_position = ”all”] [fusion_text] Хизер Вагнер Рид
    713 208 3891
    [email protected] [/ fusion_text] [/ fusion_builder_column_inner] [fusion_builder_column_inner type = ”1 layout = «1_2 ″ spacing =» «center_content =» no «hover_type =» none «link =» «min_height =» «hide_on_mobile =» малой видимости, средней видимости, большой видимости «class =» «id =» » background_color = «» background_image = «» background_position = «left top» background_repeat = «no-repeat» border_size = «0 ″ border_color =» «border_style =» solid «padding_top =» «padding_right =» «padding_bottom =» «padding_left =» ”Dimension_margin =” ”animation_type =” ”animation_direction =” left ”animation_speed =” 0.3 ″ animation_offset = ”” last = ”no” border_position = ”all”] [fusion_text] Amber LaFrance
    469 877 1533
    [email protected] [/ fusion_text] [/ fusion_builder_column_inner] [/ fusion_builder_row_inner] [/ fusion_builder_row_inner] [/ fusion_ [fusion_builder_column type = «1_3 ″ layout =» 1_3 ″ last = «yes» spacing = «yes» center_content = «no» hide_on_mobile = «no» background_color = «# 000000 ″ background_image =» «background_repeat =» no-repeat «background_position = «Left top» hover_type = «none» link = «» border_position = «all» border_size = «» border_color = «» border_style = «solid» padding_top = «20px» padding_right = «20px» padding_bottom = «20px» padding_left = » 20px ”margin_top =” 0px ”margin_bottom =” ”animation_type =” 0 ″ animation_direction = ”down” animation_speed = ”0.1 ″ animation_offset = ”” class = ”” id = ”” min_height = ””] [fusion_title margin_top = ”0px” margin_bottom = ”” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” Size = ”3 ″ content_align =” center ”style_type =” none ”sep_color =” # ffffff ”] Стать участником [/ fusion_title] [fusion_button link =” https://www.blackfret.org/membership/ ” title = «» target = «_ self» alignment = «center» modal = «» hide_on_mobile = «малой видимости, средней видимости, большой видимости» class = «» id = «» color = «default» button_gradient_top_color = «» button_gradient_bottom_color = ”” button_gradient_top_color_hover = ”” button_gradient_bottom_color_hover = ”” accent_color = ”” accent_hover_color = ”” type = ”” bevel_color = ”” border_width = ”” size = ”” stretch = ”default” shape = ”” icon = ”” icon_position = «Left» icon_divider = «no» animation_type = «» animation_direction = «up» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ””] Присоединяйтесь к Black Fret [/ fusion_button] [fusion_separator style_type = ”single solid” top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” icon_circle_color = «» width = «» alignment = «center» class = «» id = «» /] [fusion_title size = «3 ″ content_align =» center «style_type =» none «sep_color =» # ffffff «margin_top =» 0px ”Margin_bottom =” ”class =” ”id =” ”] Подключиться к Black Fret [/ fusion_title] [fusion_social_links icons_boxed =” yes ”icons_boxed_radius =” 4px ”icon_colors =” # 000000 ″ box_colors = ”# af0000 ″ tooltip_placement =” ” rss = ”” facebook = ”https: // www.facebook.com/BlackFret/ ”twitter =” https://twitter.com/Blackfret ”instagram =” https://www.instagram.com/blackfret/ ”dribbble =” ”google =” ”linkedin =” ”blogger = ”” Tumblr = ”” reddit = ”” yahoo = ”” deviantart = ”” vimeo = ”https://vimeo.com/channels/blackfret” youtube = ”https://www.youtube.com/channel/UCiHAEss8uL3AEIsS54Uj9TA” pinterest = «» digg = «» flickr = «» forrst = «» myspace = «» skype = «» paypal = «» dropbox = «» soundcloud = «» vk = «» email = «[email protected] «show_custom = «No» alignment = «center» class = «» id = «» /] [fusion_separator style_type = «single solid» top_margin = «20px» bottom_margin = «20px» sep_color = «# ffffff» border_size = «» icon = » ”Icon_circle =” ”icon_circle_color =” ”width =” ”alignment =” center ”class =” ”id =” ”/] [fusion_title margin_top =” 0px ”margin_bottom =” ”hide_on_mobile =” малая видимость, средняя видимость, large-visibility ”class =” ”id =” ”size =” 3 ″ content_align = ”center” style_type = ”none” sep_color = ”# ffffff”] Последние новости [/ fusion_title] [fusion_recent_posts layout = ”default” hover_type = ” нет «columns =» ​​1 ″ Number_posts = »3 ″ offset =» 0 ″ cat_slug = »news» exclude_cats = »» thumbnail = «no» title = »yes» meta = «no» excrpt = «no» excerpt_length = »35 ″ strip_html =« да » hide_on_mobile = «малая видимость, средняя видимость, большая видимость» class = «» id = «» animation_type = «» animation_direction = «left» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ”” /] [fusion_separator style_type = ”single solid» top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” icon_circle_color = ”” width = ”” Alignment = ”center” class = ”” id = ”” /] [fusion_title size = ”3 ″ content_align =” center ”style_type =” none ”sep_color =” # ffffff ”margin_top =” 0px ”margin_bottom =” ”класс = ”” Id = ””] Свяжитесь с Black Fret [/ fusion_title] [fusion_text]

    Эл. Почта:
    [email protected]

    Почту можно отправлять по адресу:
    Black Fret
    PO Box 29628
    Austin, TX 78755

    [/ fusion_text] [fusion_separator style_type = ”single solid” top_margin = ”20px” bottom_margin = ”20px” sep_color = ”# ffffff” border_size = ”” icon = ”” icon_circle = ”” icon_circle_color = ”” width = ”” alignment = ”Center” class = ”” id = ”” /] [fusion_title margin_top = ”0px” margin_bottom = ”” hide_on_mobile = ”малой видимости, средней видимости, большой видимости” class = ”” id = ”” size = ”3 ″ content_align =” center ”style_type =” none ”sep_color =” # ffffff ”] Фотографии из Галлы Black Ball 2017 [/ fusion_title] [fusion_text]

    скоро будет…

    [/ fusion_text] [/ fusion_builder_column] [/ fusion_builder_row] [/ fusion_builder_container]

    Модели гитар

    OM и 14 ладов 000 от Thompson Guitars

    Гитары Preston Thompson OM и 14 ладов
    выглядят практически одинаково и обладают многими схожими качествами, включая превосходную отзывчивость и прекрасную сладость тона.Относительно меньшая глубина корпуса дает музыкантам возможность быстро воспроизводить звук, а также обеспечивает баланс между струнами и высокими частотами, которыми славятся эти модели.

    Разница между OM и 14-м ладом 000 — это масштаб. OM (модель оркестра) имеет более длинную шкалу 25,4 дюйма, такую ​​же, как у гитар-дредноутов. 14-ладовый 000 имеет меньшую длину шкалы 24,9 дюйма. Эта тонкая разница объясняет уникальные качества каждой модели. Большая длина шкалы OM обычно дает этим инструментам немного больше мощности и объема, что делает OM идеальным для игроков, играющих как с плоским медиатором, так и с пальцем.14 Fret 000 с более короткой шкалой идеально подходит для сборщиков пальцев и блюзовых исполнителей. Поскольку натяжение струн немного меньше, некоторые техники, такие как сгибание струн и риффы в стиле блюз, часто улучшаются. Флорентийский вырез также предлагается как для OM, так и для 000 14 Fret.

    Обе модели имеют верхнюю часть из красной ели (адирондак) (также доступны ель лутц и европейская ель), выбранные по тону и жесткости, продвинутое размещение распорок X, градуированная вручную толщина верха, довоенные резные зубчатые скобы ручной работы, нитроцеллюлоза лакированная отделка и проверенные временем конструктивные особенности, такие как соединения шейки «ласточкин хвост».

    В мартовском выпуске журнала Acoustic Guitar Magazine , выпущенном в марте 2015 года, был сделан обзор одной из наших гитар серии «Shipwreck» Brazilian Rosewood OM. «Обладая мощным и непосредственным голосом, глубоким резонансом и длительным сустейном, модель OM Brazilian Томпсона представляет собой разновидность волшебной гитары, с которой редко сталкиваешься, особенно в новом инструменте. Он сделан из наиболее почитаемого сочетания тонкой древесины: дека из ели Адирондак в сочетании с задней и боковыми стенками из бразильского палисандра.В результате получилось безупречное воссоздание плоской поверхности золотой эры ». Прочтите полную историю здесь: http://www.acousticguitar.com/Gear/Reviews/Thompson-OM-Brazilian

    ЗАПРОСИТЬ ТАМОЖЕННУЮ ЦИТАТУ

    Anderson Guitarworks

    Bobcat — это гитара Anderson насквозь, и поэтому каждый возмутительный атрибут Андерсона безупречен и находится в вашем распоряжении: плавная и быстрая, маслянистая игра Bobcat проста для игры и сгибания, пока как бы вы хотели его подтолкнуть.Невероятно резонансный, Bobcat звонит вечно, даже если он отключен от сети. Один аккорд, и вы узнаете, насколько большой, яркой, полной и гармоничной может быть гитара.

    Уникальная передняя бабка, расположенная на трех сторонах, с почти прямым натягом струны обеспечивает беспрецедентную легкость и стабильность настройки, предлагая гораздо более прочное соединение грифа с передней бабкой.

    По всей задней окружности тела находится гладкий, мягкий радиус среза для почти комфорта тела. Замечательно держать рыжую рыбу близко.Отобранное вручную высушенное в печи красное дерево означает, что общий вес Bobcat меньше, чем вы ожидаете от этого стиля инструмента. Так приятно надеть и играть всю ночь напролет. Уникальный дизайн нижнего рожка заимствован у модели Raven. Закругленный, укороченный и более глубокий срез, он слегка расширяется наружу, чтобы заметно облегчить доступ к самым высоким областям грифа, и хорошо уравновешивает центр тяжести Bobcat, когда он сидит во время игры. Никакого соскальзывания с ноги для Bobcat, просто сидите, садитесь и играйте с комфортом.

    Потайной мост, насадка и звукосниматели выглядят так-так-так круто и обеспечивают более естественный угол для руки и запястья, выбирающих струну, для более легкого движения. традиционный 3-х позиционный селектор и выбор настройки с двумя или тремя ручками. С горшками Push / Pull для отключения мощности для каждого звукоснимателя индивидуально. Добавление дополнительного VA Boost увеличит доступную тональную палитру до 16. Легкий бридж в стиле Tune-o-matic является стандартным и замечательным для игры, но также можно использовать дополнительный бридж в стиле винтажного тремоло, если вы того пожелаете.

    Мгновение — это все, что нужно, чтобы открыть свой разум и сердце, и как только вы услышите, насколько звучно и насколько легко играет Bobcat, вы совершенно потеряете рассудок, в хорошем смысле этого слова!

    Black Fret помогает музыкантам в Остине и за его пределами

    Заработать на жизнь в качестве музыканта может быть особенно сложно во времена консолидации лейблов, падения продаж и потоковых сервисов, но это никогда не было легко. Люди, которые исполняют и записывают музыку, вносят огромный вклад в культуру своего региона, но редко получают вознаграждение, которое отражает их вклад.Но двое мужчин из Остина, штат Техас, пытаются изменить это, привнося в местную популярную музыку модель патронажа в симфоническом стиле.

    Мэтт Отт и Колин Кендрик являются соучредителями Black Fret, организации, чья миссия — «дать музыкантам возможность создавать и исполнять отличную новую музыку». У них есть патронажная модель, когда члены организации вкладывают 1500 долларов и, в свою очередь, имеют право голоса в предоставлении значительных грантов своим любимым местным музыкантам. В прошлом году группа выделила гранты на сумму 150 000 долларов, а в декабре этого года надеется получить еще больше на своем ежегодном гала-мероприятии под названием «Черный шар».

    Я позвонил Отту и Кендрику, чтобы узнать подробности об их организации и о том, как, по их мнению, она может изменить жизнь не только в Остине, но и для музыкантов по всей стране. Наш разговор был слегка отредактирован для ясности и продолжительности.

    Шон Сетаро: Можете ли вы рассказать мне о своем личном опыте в музыке и благотворительности?

    Колин Кендрик: Мы с Мэттом дружим с 14 лет. Мы выросли в Остине в окружении музыкальной индустрии здесь, в городе.Многие наши друзья играли музыку в клубах. У нас совсем не было таланта, но мы были невероятно увлечены музыкальной сценой здесь, в Остине, и воочию наблюдали, что она делает с нашими друзьями — успехи и неудачи, горести, увеселения.

    Пробыв здесь всю жизнь, мы хорошо осведомлены о том, что произошло с музыкальной индустрией за последние 20 лет. Я закончил бакалавриат по аудиотехнике. Я работал в телешоу Austin City Limits , где я начал думать о создании чего-то вроде симфонии или оперы, но популярного.Мы с Мэттом вместе с другим нашим приятелем основали Austin Music Foundation, благотворительную организацию, которая предоставляет бизнес-наставничество и обучение местным группам здесь, в городе. Black Fret — это эволюция этого. После обучения и наставничества групп мы поняли, что у нас есть высший эшелон художественного мастерства, что даже с такими навыками этим людям нужна финансовая поддержка — так сказать, начальный капитал.

    Мэтт Отт: Я живу в Остине, штат Техас, с 1978 года.У нас не только большая страсть к музыке, но и большая страсть к тому, что музыка делает для нашего города. Люди часто замечают, что приехать в Остин и не насладиться живой музыкой — все равно что поехать в Нью-Йорк и не насладиться пивом или поехать в Калифорнию и не пить вино. Это часть того, кто был. Хранить здесь музыку как поистине яркую заботу близко и дорого моему сердцу.

    Setaro: Вы можете объяснить, как работает Black Fret?

    Отт: Модель Black Fret проста. Мы — модель, основанная на членах, когда наши участники присоединяются, и в силу присоединения они становятся покровителями местной музыки. Они получают привилегию номинировать группы, которые им нравятся, посещать множество мероприятий каждый год — в этом году их было более 30 — голосовать за тех, кто получит незначительный или большой грант, а затем отпраздновать награждение этих грантов на торжественное мероприятие, которое мы проводим каждую зиму.За первые два года предоставления грантов мы выделили 250 000 долларов США, а в этом году мы предоставим еще более 200 000 долларов США.

    Кендрик: После номинации группа получает возможность воспользоваться нашим консультативным советом, который представляет собой группу из более чем 40 профессионалов музыкальной индустрии в Остине, включая инженеров, продюсеров, агентов по бронированию, юристов в сфере развлечений, экспертов по лицензированию музыки и т. Д. ., чтобы у них был доступ к профессионалам музыкальной индустрии, которые могут помочь продвинуть их карьеру.

    После получения гранта у них по-прежнему есть доступ ко всем этим советникам, но теперь у них есть возможность разблокировать полученный грант, создав новую музыку, исполняя свою музыку за пределами Остина или выполняя общественные работы. То есть, например, они могут работать для другой некоммерческой организации в городе и получить грант на сумму более 1000 долларов.

    Это дает нам невероятный доступ к творческому процессу: сколько новой музыки создается, сколько общественных работ выполняется.Им выдают свои грантовые доллары, а затем они сообщают нам, на что они тратят эти грантовые доллары, будь то запись альбома или поддержка тура или оплата счета за электричество. Что они будут делать с этими грантовыми долларами, когда они их разблокируют и окажутся в карманах, решать им.

    Галерея: 2016 30 До 30 лет: Музыка

    31 изображений

    Setaro: Значит, ответственность происходит заранее, а не после?

    Кендрик: Совершенно верно.

    Ott: Нам нужен был контроль, который не позволял нам раздавать деньги группе, которая собиралась распасться после того, как пережила это с Austin Music Foundation. Мы пришли из среды разумной благотворительности, и наличие показателей, основанных на результатах, укрепляет нашу репутацию.

    Мы можем сказать вам точно, сколько новых песен мы профинансировали, сколько новых песен поступило в студию звукозаписи, сколько людей распространили свои собственные альбомы, сколько концертов было проведено в США.С. и в мире, сколько благотворительных выступлений дали наши артисты. У нас было более 40 концертов для других благотворительных организаций. Мы заплатили группам за выступления на этих благотворительных мероприятиях.

    Setaro: Вы, ребята, установили цену членства в 1500 долларов. Что заставило вас установить эту цену?

    Ott: Ценовая планка в 1500 долларов была достигнута несколькими способами. Мы хотели, чтобы это была эгалитарная организация, а не организация, в которой один покровитель местной музыки платит 10 000 долларов, а кто-то другой платит 50 долларов, и между ними существуют разные уровни признания.Мы думали, что если вы хотите поддерживать местную музыку через Black Fret, важно, чтобы все были равны. Независимо от того, зарабатываете ли вы 3 миллиона долларов в год или 30 000 долларов в год, вы можете быть равным покровителем. Поэтому мы искали ценовую категорию, которая могла бы соответствовать этому уровню. Мы действительно смотрим на это с двух точек зрения — вопрос материального воздействия на художника, а также ценность для мецената.

    Итак, при 1500 долларов в год с сотней участников, после оплаты мероприятий и оплаты музыкантов за их участие в мероприятиях и так далее, это дало нам 100000 долларов в качестве награды нашим музыкантам, что, по нашему мнению, было первой крупной ставкой в основание, которое мы действительно хотели разместить, чтобы завоевать доверие.

    Кендрик: После получения степени я работал в отделе управления капиталом в Price Waterhouse в Далласе. Многие люди пожертвовали тысячи долларов на благотворительность, отправились на ежегодный сбор средств и оказались в тени, потому что кто-то другой пожертвовал один процент от доверительного фонда, который они унаследовали. Мы хотели разрушить эти традиционные барьеры неравенства доходов и создать сообщество, и это то, что мы сделали.

    Люди приходят на наши мероприятия и говорят, что люди обнимают друг друга больше, чем когда-либо раньше.В конце концов, это работает, потому что это люди, которые действительно заботятся о музыке. Они могут зарабатывать 40 000 долларов в год и позволить себе стать членами. Они могут зарабатывать миллион долларов в год и позволить себе быть членами. Таким образом, частью этого является поиск людей, которые потратят время и силы, чтобы действительно принять участие.

    Setaro: Как вы набрали первоначальную базу участников для Black Fret?

    Отт: Изначально очевидно, что это были наши друзья.

    Кендрик: У нас много друзей [ смеется ].На самом деле, у нас была продуманная стратегия — молчать о выпуске Black Fret. Мы не хотели производить большой фурор, и сказали, что мы собирались сделать все эти великие дела, не имея денег, чтобы поддержать это. Так что мы держали это в секрете, пока не набрали 75 человек или около того, а затем начали немного обращаться к прессе. В течение года мы достигли нашей первой сотни членов. Именно тогда мы решили объявить нашу первую группу номинантов и объявить о том, что в декабре, девять месяцев спустя, мы собираемся разыграть 100 000 долларов.

    Setaro: Есть ли у вас ограничение на членство?

    Кендрик: Мы делаем. Разработанную нами модель мы называем «ограниченным справедливым патронажем». Ограниченное количество членов, вносящих равный вклад, чтобы стать меценатами. Откровенно говоря, мы считаем, что это довольно масштабируемая модель для множества различных проектов.

    Ott: Мы заявили, что максимальное количество участников составляет 1333 человека. А 1333 члена с доходом 1500 долларов в год — это на 500 долларов меньше 2 миллионов долларов. Это позволяет нам не только давать прямые гранты музыкантам, но и создавать фонды для финансирования будущих грантов и действительно стать учреждением.

    Setaro: Не могли бы вы рассказать о том, чтобы вывозить эту модель в другие города?

    Ott: В ближайшие несколько лет мы планируем вывести его в другие десять крупных музыкальных городов Северной Америки.

    Кендрик: Если у нас будет 1300 человек [на город], то вы будете иметь в виду 13 000 преданных фанатов музыки по всей стране. Мы будем выделять 20 миллионов долларов в год в виде грантов.

    Наше видение состоит в том, чтобы вы могли профинансировать 50 ваших любимых артистов в этом году, всего 500, а затем иметь возможность совершить поездку с этими артистами в эти города, что позволит им получить доступ к большим толпам, предоставив им самолеты, отели и ценные вещи. доступ к советникам на каждом из этих рынков.Фактически, мы думаем, что создаем низшую лигу музыки. Идея состоит в том, чтобы попытаться изменить экономику музыкальной индустрии. Профиль риска / доходности этикетки ужасен. Отсюда и подписался контракт на семь альбомов. У звукозаписывающего лейбла было , чтобы иметь такую ​​страховку на выздоровление, если группа действительно добьется успеха. Итак, мы пытаемся найти корни этого.

    Ott: Мне очень нравится аналогия с названием низшей лиги местной музыки, потому что мы намеренно создали модель, позволяющую музыкантам получать гранты, выступая за пределами своего внутреннего рынка.Так что, если вы артист Black Fret и получили грант в Остине, если вы пойдете играть на площадках Black Fret на восточном побережье, вы поедете в Нэшвилл, Мемфис, округ Колумбия, Нью-Йорк, Бостон, что у вас, вы? нам за это заплатят из вашего гранта. По сути, это поддержка туров, которую лейблы делали для определенного количества групп. Но даже в те времена на лейблах это не было обычным делом.

    Конечно, Black Fret всегда платит своим артистам за то, чтобы они играли. Так что, если вы собираетесь в один из этих городов и будете играть там шоу Black Fret, вам будет платить местное отделение Black Fret за это шоу.Вдобавок ко всему, если вы закажете публичное шоу с другими артистами Black Fret, в частности, присоединившись к лучшим артистам города, вы значительно быстрее увеличите свою фан-базу и достигнете этой критической массы, так что вы начнете привлекать внимание фестивальные туры и так далее.

    Кендрик: Это амбициозное решение. Мы работаем над этой концепцией 15 лет. Не для того, чтобы пощекотать себе рот, но я чувствую, что мы действительно поняли это. Он растет впечатляющими темпами.Нам нужно всего 13 000 членов по всей стране, и у нас уже есть три процента от них.

    Предстоит проделать большую работу, чтобы выяснить, как доставить его в каждый город — каковы лимиты членства, каковы взносы — но дело в том, что я не думаю, что это будет так сложно найти 13 000 человек, которые готовы тратить 100 долларов в месяц, чтобы вести невероятно насыщенную музыкальную жизнь. Черт, я бросал это на компакт-диски, когда зарабатывал себе на жизнь черпанием мороженого.

    Setaro: На какие основные цели грантополучатели обычно тратят свои грантовые деньги?

    Ott: По ходу дела учиться интересно.Написано 119 песен. Было записано 104 песни, было выпущено 46 новых песен для публики, 195 выступлений за пределами Остина, 11 международных выступлений, 44 выступления для других благотворительных организаций и так далее.

    Это даже не отражает всего, что сделал художник. Это просто отражает то, что им нужно сделать, чтобы разблокировать свои грантовые доллары на данный момент. После того, как они получили эти грантовые доллары, было удивительно видеть, что они сделали.

    Линкольн Дарем вернулся в студию и записал то, что он считает своим лучшим альбомом на сегодняшний день.Грэм Уилкинсон заплатил за ремонт своей гитары Taylor 1943 года.

    Эрин Айви только что закончила гастроли над альбомом, когда получила грант. Она подумала про себя, как я собираюсь разблокировать свои грантовые доллары? Я столкнулся с ней около десяти месяцев в году, и она сказала, что у нее был самый удивительный год, потому что она провела его, ища некоммерческие организации, чьи миссии ей нравились, и позвонила им по телефону, говоря: «Привет, я Эрин Айви. Могу я прийти и дать вам концерт бесплатно? » Она сказала, что это был один из самых эмоционально насыщенных лет как артистка, которые у нее были, потому что ей удалось получить 9000 долларов из своего гранта в 10 000 долларов, играя на благотворительные общественные организации.

    Kendrick: Если вам интересно, в чем заключаются истории успеха, то на самом деле мы только приближаемся к нашему третьему сезону пожертвований. Но наши группы уже подписаны лейблами, в том числе Universal Music Group. Вышло двадцать или тридцать новых релизов. Для меня Black Fret — это художественное превосходство. Мы хотим стоять рядом с симфонией и оперой и говорить, что это лучшие музыканты, которых мы можем найти. Это не аргумент, основанный на необходимости. Речь идет о том, чтобы найти тех людей, которые могут создавать невероятно красивое искусство, и помочь им в этом.

    Одна история для меня всегда пронизывает, что самый первый грант, который мы когда-либо выдавали, был Грэхему Уилкинсону. Грэм — белый растафарианец ростом шесть футов четыре дюйма — невероятно душевный, одухотворенный парень. Он приходил ко мне домой, потому что у нас не было офиса. Я вручаю ему чек. Через пятнадцать минут я получаю текстовое сообщение, в котором говорится: «Я хотел, чтобы вы знали, что я сижу перед вашим домом пятнадцать минут и плачу, потому что мне платят за продажу пива, а вы только что заплатили мне, чтобы я написал песню. Впервые когда-либо.”

    Одномолекулярный FRET показывает размер пор и механизм открытия механочувствительного ионного канала

    Очищенные мутанты MscL (рис. 3 — рисунок в приложении 1) были помечены Alexa Fluor 488 (AF488) и Alexa Fluor 568 (AF568) и преобразованы в липосомы ∼50 нм, состоящие из 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3. -фосфохолин (POPC) с 2% 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-биотинил (BPE) (рис. 1D). Затем липосомы были иммобилизованы на покровном стекле посредством взаимодействия биотин-авидин для измерений smFRET (рис. 1D).Чтобы получить доступ к открытому состоянию каналов, добавляли 1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфохолин или лизофосфатидилхолин (LPC) с молярным соотношением 25% (Perozo et al., 2002b, 2002a; Corry et al. , 2005b, 2010; Рисунок 1E) и инкубировали> 10 мин перед иммобилизацией. Непосредственно перед проведением экспериментов с smFRET спектры флуоресценции образцов (± LPC) были записаны с возбуждением на 488 нм, чтобы подтвердить, что каналы открываются с LPC, наблюдая за сдвигом пиков FRET. (Активность каналов также определяется путем наблюдения за открытием каналов при приложении отрицательного давления [всасывания] к патч-пипетке.Меченые белки для экспериментов с патч-клэмпом взяты из другой аликвоты, хотя и из той же партии, меченых белков для экспериментов с smFRET). Мы подчеркиваем, что, хотя smFRET применялся для изучения конформационных изменений каналов и переносчиков (Choi et al., 2010; Zhao et al., 2010, 2011; Akyuz et al., 2013), насколько нам известно, это Впервые smFRET был использован с каналами, реконструированными в липосомы.

    С помощью измерений smFRET мы наблюдали следы интенсивности флуоресценции с одним или двумя этапами фотообесцвечивания (Рисунок 3 — приложение к рисунку 2A, B).Это ожидаемый результат, поскольку MscL является гомопентамером, а мечение флуорофоров является стохастическим. Количество шагов фотообесцвечивания показывает количество флуорофоров, прикрепленных к каналу. Только следы, показывающие одну стадию фотообесцвечивания как в донорном, так и в акцепторном каналах, гарантируют, что в анализ был включен только один донорный и / или акцепторный флуорофор (Рисунок 3 — приложение к рисунку 2A). Доноры в большинстве случаев подвергались фотообесцвечиванию первыми, что приводило к одновременному падению интенсивности флуоресценции как в донорных, так и в акцепторных каналах (Рисунок 3 — приложение к рисунку 2A, B).Вычитание интенсивностей до и после фотообесцвечивания дает интенсивности донора (I D ) и акцептора (I A ), которые используются для расчета эффективности FRET. Обратите внимание, что интенсивности, I D и I A , автоматически устраняют прямое возбуждение акцептора (то есть утечку излучения акцептора в донорный канал). Однако утечка донорной эмиссии в акцепторный канал все же присутствует. Для измерения этой утечки каналы MscL были помечены только донорами, а коэффициент утечки (ℓ) был измерен экспериментально: ℓ = I D A / I D D ≈ 0.09, где I D A — интенсивность излучения донора в акцепторном канале, а I D D — интенсивность излучения донора в донорном канале. Кроме того, для определения фактической эффективности FRET была сделана еще одна инструментальная поправка с помощью поправочного коэффициента γ, который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. Он был рассчитан как отношение изменения интенсивности акцептора ΔI A к изменению интенсивности донора ΔI D при фотообесцвечивании акцептора: по следам, где акцептор фотообесцвечивался первым (Roy et al., 2008), мы оценили значение γ = ΔI A / ΔI D ≈ 0.89 ± 0.06 (рис. 3 — приложение к рисунку 2C).

    Мы проанализировали несколько сотен следов (варьирующихся от 134 до 577 следов) с одиночными шагами фотообесцвечивания в отсутствие и в присутствии LPC для каждого мутанта (Рисунок 1C, Рисунок 3). Здесь мы сосредоточимся на мутанте M42C для иллюстрации. Для отдельных этапов фотообесцвечивания M42C были проанализированы 428 и 577 следов в отсутствие и в присутствии LPC, соответственно.Скорректированные эффективности FRET были рассчитаны, а затем их распределение было построено и аппроксимировано гауссианами с помощью оценок максимального правдоподобия, показанных на рис. 3A, B, в то время как количество гауссиан было определено согласно скорректированному информационному критерию Акаике (AICc) и байесовскому информационному критерию. (BIC) (таблица 1; Akaike, 1974; Schwarz, 1978; Sugiura, 1978). В отсутствие LPC мы наблюдали три пика при E = 0,1, 0,28 и 0,63 соответственно (рис. 3А). В присутствии LPC третий пик, показывающий наивысшую эффективность FRET, уменьшается, оставляя в основном два гауссиана (E = 0.1 и 0,23, рис. 3Б). Этот переход (т.е. самый высокий пик уменьшается, а самый низкий пик увеличивается) более очевиден, когда мы построили график разницы между нормализованными распределениями FRET (∑ PX = 1, где X = + для в присутствии LPC и X = — для отсутствия LPC) в двух условиях, как показано на рисунке 3C: после добавления 25% LPC пик при E ∼0,6 исчез, но доля пика при E ∼0,1 увеличилась. Обратите внимание, что самый высокий пик при E ∼0,6 не исчезает полностью в присутствии 25% LPC, что согласуется с (Perozo et al., 2002b).

    Результаты FRET одиночной молекулы для MscL M42C.

    Распределение эффективности FRET для M42C в отсутствие ( A ) и ( B ) в присутствии LPC были построены и подогнаны с помощью гауссиан. ( C ) Разница между нормализованными распределениями FRET при двух условиях (± LPC), ΔP, подчеркивает уменьшение третьего пика при E ∼0.6 после добавления LPC. ( D ) Дисперсия между нормализованными распределениями FRET в двух условиях (± LPC), ΔP 2 , уменьшается по мере увеличения доли BPE в липосомах с 2% до 16%. ( E ) Гистограммы эффективности FRET в отсутствие (верхний ряд, -LPC) и присутствия (нижний ряд, + LPC) LPC для других пяти остатков (I25C, A27C, Y75C, Q80C и V82C), измеренных в текущее исследование.

    https://doi.org/10.7554/eLife.01834.005

    Наилучшая модель подгонки распределения эффективности FRET была определена путем расчета скорректированного информационного критерия Акаике и байесовского информационного критерия: AICc = −2⁡ln⁡LM + 2k + 2k (k + 1) N − k − 1, BIC = −2⁡ln⁡LM + k⁡ln⁡N, где L M — максимальное правдоподобие модели, k — количество параметров модели, N — количество точек данных, используемых при подборе (Akaike, 1974; Schwarz, 1978; Сугиура, 1978)

    https: // doi.org / 10.7554 / eLife.01834.009 −279,5
    Количество выступов — ln L M AICc BIC
    M42C; № LPC
    1 -1,9 0,3 8,4
    2 -43,4 -76,6 -56,4 3 4 −96,4 −64,3
    4 −58,1 −93,5 −49,5
    M42C; С LPC
    1 −190,9 −377,9 −369,2
    2 −279,5 −549,0 −565,1 −530.5
    4 −292,7 −563,0 −515,5

    В отсутствие LPC наличие трех пиков, а не двух, можно объяснить, рассматривая эффект связывания на липосомах. Поскольку канал MscL представляет собой гомопентамер, мы изначально ожидали два расстояния между донором и акцептором в каждом состоянии (R n и R f на рисунке 4A) и, таким образом, два пика для распределения эффективности FRET, предполагая, что все каналы закрываются при отсутствии LPC.Однако это предположение не обязательно верно, особенно в нашей ситуации, когда липосомы иммобилизованы, а белки реагируют на натяжение мембраны. Теории предсказывали и наблюдали в экспериментах, что иммобилизация липосом (или везикул) приводит к значительному натяжению мембраны и, возможно, разрыву (Zhdanov et al., 2006; Chung et al., 2009; Serro et al., 2012). В наших экспериментах ожидается, что натяжение мембраны будет высоким, ∼30-40 k B T, из-за сильного взаимодействия между BPE и поверхностью через биотин-нейтравидин (Miyamoto and Kollman, 1993; Rico and Moy, 2007). .При таком сильном взаимодействии гигантские однослойные пузырьки разрываются спонтанно, как это наблюдалось экспериментально (Chung et al., 2009). Следствием этого является то, что некоторые из каналов MscL переключаются в открытую конформацию при иммобилизации липосом. (Однако доля открытых каналов может быть разной для разных мутантов, даже если натяжение мембраны одинаково). Следовательно, гистограмма FRET для образца без LPC включает смесь закрытых и открытых каналов MscL. Чтобы проверить эту гипотезу, были проведены контрольные эксперименты по увеличению доли BPE в липосомах, руководствуясь теоретическим предсказанием (Zhdanov et al., 2006): если бы гипотеза была верна, натяжение мембраны в липосомах из-за иммобилизации было бы выше, больше каналов открывалось бы в отсутствие LPC, и, следовательно, разница между гистограммами FRET с LPC и без LPC была бы меньше. Мы варьировали доли BPE в липосомах от 2% до 16% и действительно наблюдали, что разница между образцами с LPC и без него уменьшается (Рисунок 3D). Мы количественно оценили разницу по (немасштабированной) дисперсии, ΔP2 = ∑i = 1N (Pi + −Pi−) 2, где PiX — распределение вероятностей эффективности FRET, i = 1NPiX = 1.Мы наблюдали, что дисперсия ΔP 2 уменьшилась на 98%, с 0,084 до 0,002, когда доля BPE в липосомах увеличилась с 2% до 16%, подтверждая гипотезу о том, что образец без LPC представляет собой смесь закрытых и открытых каналы.

    Перемещение остатков.

    ( A ) Каждый остаток (выделен зеленым) определяет описанную окружность (красный пунктирный круг) радиуса r (или диаметра D, где D, как показано, D закрыто , хотя при открытии будет D открыто ) с центром в центре поры ( O ).При активации канала белок расширяется (радиус изменяется с r закрыть на r открыть ) или, что эквивалентно, остаток перемещается на Δr = r открыто -r закрыто , измеренное от центра поры ( O ). ( B ) Эскиз MscL из закрытого состояния (синий пятиугольник) в открытое состояние (фиолетовый пятиугольник). Интересующий остаток (вершины пятиугольников) перемещает Δr из центра поры. ( C и D ) Трансляционные перемещения (Δr) остатков на TM1 и TM2, измеренные с помощью smFRET.Все остатки удаляются от центра поры, что свидетельствует в пользу модели спирального наклона.

    https://doi.org/10.7554/eLife.01834.010

    Простая оценка, основанная на кристаллической структуре MscL в закрытом состоянии (Chang et al., 1998) и ранее предсказанном / оцененном размере открытых пор (Cruickshank et al., 1997; Perozo et al., 2002a; Corry et al. ., 2010) указывает на то, что, вероятно, из-за ограниченного разрешения FRET средний пик (E = 0.28) представляет собой перекрытие двух пиков, соответствующих R n открытого состояния (R no ) и R f закрытого состояния (R fc ) (для R n и R f ). , Рисунок 4A, B). Геометрия белка (т.е. пятикратная симметрия) дает Rn = D⋅sin (π5) и Rf = D⋅sin (2π5), где D — диаметр белка. Возьмем для примера M42C: кристаллическая структура дает диаметр белка в закрытом состоянии (с использованием атомов C α ), D c = 4.4 нм, что дает Rfc = Dc⋅sin (2π5) = 4,2 нм. Ожидаемое изменение размера белка (ΔD) составляет от 2,5 до 4 нм (Cruickshank et al., 1997; Perozo et al., 2002a; Corry et al., 2010), с последним отчетом о 2,8 нм из ансамбля FRET. измерений (Corry et al., 2010). Тогда ожидаемое значение D o = D c + ΔD равно 7,2 нм, что дает Rno = Do⋅sin (π5) = 4,2 нм, точно так же, как R fc (ожидаемое значение R no равно 4,1– 4,9 нм с учетом ожидаемого диапазона из литературы).В приведенном выше простом расчете для оценок использовались положения атомов C α . Однако боковые цепи остатков и прикрепленных флуоресцентных зондов будут добавлять дополнительную длину порядка 2 нм, в результате чего вероятность перекрытия R fc и R no еще выше. Кроме того, было замечено, что ≤30% MscL представляют собой гексамеры вместо пентамеров в детергентах, таких как н-додецил-β-D-мальтопиранозид (DDM), используемых в текущем исследовании (Gandhi et al., 2011). Это приведет к «смазыванию» средних пиков FRET в отсутствие LPC. Поэтому, чтобы быть последовательными и точными, мы всегда используем самую высокую эффективность FRET (E nc и E no ) для расчета изменений расстояния (ΔR n ). С другой стороны, мы обнаружили, что все мутанты дают измерения E fo , совместимые (то есть в пределах ошибки) с окончательной моделью (за исключением того, что M42C немного отличается), как показано на рисунке 3 — приложение к рисунку 3.

    FRET между соседними каналами MscL на одной и той же липосоме было проблемой в предыдущих экспериментах по ансамблю FRET.Чтобы снизить вероятность того, что это произойдет, и эффективно решить проблему, мы применили две стратегии. Во-первых, мы использовали 5% меченых каналов вместе с 95% немеченых каналов для восстановления в липосомах. В результате у нас было в 16 раз меньшее молярное отношение меченых белков (пентамеров) к липидам, чем в ансамблевых экспериментах FRET: 1: 4000 против 1: 250 (Corry et al., 2005b, 2010), что значительно снижает вероятность взаимного -молекулярный FRET. Мы обнаружили, что добавление смеси меченого и немеченого белка помогает получить не более одного флуоресцентного канала на липосому, обеспечивая при этом эффективное включение каналов в липосомы.Кроме того, в анализ были включены только трассы, показывающие одну стадию фотообесцвечивания как в донорных, так и в акцепторных каналах, что помогает дополнительно удалить FRET между соседними каналами MscL в анализе. Эти стратегии значительно снижают вероятность того, что передача энергии происходит между двумя соседними каналами даже при наличии кластеризации MscL, упрощая интерпретацию результатов FRET.

    Еще одно замечание: мы использовали оценку максимального правдоподобия (MLE) (In Jae, 2003) для подгонки пиков.Этот метод был выбран, в частности, потому, что он не требует объединения данных перед подгонкой. Хотя существуют математические способы выбора «хороших» размеров бинов (Shimazaki and Shinomoto, 2007), выбор размера бинов на практике является субъективным, и на полученные пики могут влиять различные размеры бинов. После подбора MLE мы затем разделяем данные и строим гистограммы для целей презентации. То, как данные группируются, не меняет параметры подгонки.

    Биосенсор на основе FRET для измерения активации Gα13 в отдельных клетках

    Abstract

    Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) обеспечивает способ прямого наблюдения за активацией гетеротримерных G-белков рецепторами, связанными с G-белками (GPCR).С этой целью производятся биосенсоры на основе FRET, в которых используются субъединицы гетеротримерного G-белка, меченные флуоресцентными белками. Эти биосенсоры на основе FRET дополняют существующие косвенные способы наблюдения активации GPCR. Здесь мы сообщаем о вставке mTurquoise2 в несколько сайтов в субъединице Gα13 человека с целью разработки биосенсора активации Gα13 на основе FRET. Было обнаружено, что три флуоресцентно меченных варианта Gα13 являются функциональными на основании i) локализации на плазматической мембране и ii) способности рекрутировать p115-RhoGEF при активации рецептора LPA2.Меченые субъединицы Gα13 использовали в качестве донора FRET и объединяли с cp173Venus, слитой с субъединицей Gγ2, в качестве акцептора. Мы сконструировали биосенсоры Gα13, создав единственную плазмиду, которая продуцирует Gα13-mTurquoise2, Gβ1 и cp173Venus-Gγ2. Биосенсоры активации Gα13 показали быструю и устойчивую реакцию при использовании в первичных эндотелиальных клетках человека, подвергшихся действию тромбина, запускающих рецепторы, активируемые эндогенными протеазами (PAR). Этот ответ эффективно подавлялся RGS-доменом p115-RhoGEF, и из данных биосенсора мы сделали вывод, что это связано с активностью GAP.Наконец, мы продемонстрировали, что датчик Gα13 может использоваться для анализа эффективности связывания гетеротримерного G-белка в отдельных живых клетках. Мы пришли к выводу, что биосенсор Gα13 является ценным инструментом для измерения живых клеток, который исследует пространственно-временные аспекты активации Gα13.

    Образец цитирования: Mastop M, Reinhard NR, Zuconelli CR, Terwey F, Gadella TWJ Jr, van Unen J, et al. (2018) Биосенсор на основе FRET для измерения активации Gα13 в отдельных клетках. PLoS ONE 13 (3): e0193705.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705

    Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

    Поступила: 29 ноября 2017 г .; Одобрена в печать: 19 февраля 2018 г .; Опубликован: 5 марта 2018 г.

    Авторские права: © 2018 Mastop et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Плазмиды и информацию о плазмидах можно получить на сайте addgene (http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/). Большинство экспериментальных данных представлено в рукописи, а исходные данные депонированы: https://doi.org/10.5281/zenodo.1158456.

    Финансирование: JG было поддержано грантом NWO Chemical Sciences ECHO (711.013.009). MJWA получило финансовую поддержку от бразильского агентства по финансированию исследований CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) (грант: BEX 13247 / 13-1).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), являются членами большого семейства рецепторов, расположенных на мембране, около 750 генов, кодирующих GPCR, идентифицированы в геноме человека [1]. Эти семь трансмембранных белков могут воспринимать широкий спектр сигналов, включая свет, гормоны, ионы и нейротрансмиттеры [2].GPCR действуют как факторы обмена гуанина (GEF) [3] для гетеротримерных G-белков. Эти белковые комплексы состоят из субъединиц Gα, Gβ и Gγ. Гетеротример представляет собой белковый комплекс периферической мембраны за счет липидной модификации субъединиц Gα и Gγ [4].

    Активность GEF проявляется в субъединице Gα, которая может быть преобразована из неактивного состояния, связанного с GDP, в активное состояние, связанное с GTP [5]. Активация комплекса приводит к конформационным изменениям и в некоторых случаях к диссоциации субъединицы Gα от димера Gβγ [2,6,7].Как активированная GTP-связанная субъединица Gα, так и димер Gβγ способны активировать нижестоящие эффекторы [2].

    Можно различить почти двадцать различных субъединиц Gα, которые сгруппированы в четыре класса; Gi / o, Gs, Gq и G12 / 13 [2]. В этой рукописи мы будем использовать Gα13 для обозначения субъединицы и G13 для обозначения гетеротримеров, состоящих из Gα13, Gβ и Gγ, та же терминология будет использоваться для Gq / Gαq и Gi / Gαi, соответственно. Каждый класс субъединиц Gα активирует различные нижестоящие эффекторы [5].Лучше всего охарактеризованными эффекторами субъединиц Gα12 / Gα13 являются RhoGEF, которые активируют RhoA, например LARG, PDZ-RhoGEF и p115-RhoGEF [8,9]. В течение некоторого времени считалось, что активация GPCR субъединиц Gα12 / Gα13 является преобладающим способом активации RhoA. Эта точка зрения изменилась за последнее десятилетие с идентификацией RhoGEFs, которые могут активироваться Gαq [9,10]. В настоящее время ясно, что и Gαq, и Gα12 / Gα13 могут быстро активировать передачу сигналов RhoA в клетках [11,12], хотя и путем активации различных эффекторов.Поскольку класс Gq и класс G12 / 13 эффективно активируют RhoA, было трудно различить, какой из этих двух гетеротримерных комплексов G-белок активируется, когда измеряются только последующие эффекты. Еще больше усложняет ситуацию то, что GPCRs, которые активируют G12 / 13, часто также активируют Gq [13,14]. Тем не менее, ясно, что передача сигналов через Gq или G12 / 13 имеет разные физиологические эффекты [13,15,16]. Следовательно, необходимы инструменты, которые могут измерить активацию самого гетеротримерного G-белка.

    Прямое наблюдение активации гетеротримерного G-белка обычно проводят путем количественной оценки связывания радиоактивно меченных нуклеотидов [17]. Этот подход трудоемок, использует поврежденные клетки и не имеет временного разрешения. Более того, этот метод обычно менее подходит для Gq, Gs и G12 / 13 из-за их низкого уровня экспрессии по сравнению с Gi [18]. С другой стороны, оптические считывания, часто основанные на методах FRET и биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET), хорошо подходят для измерения активности передачи сигналов с высоким временным разрешением в интактных клетках [19,20].Несколько групп создали биосенсоры на основе BRET или FRET для обнаружения событий непосредственно после активированных GPCR [20–24]. Оптические биосенсоры, основанные на гетеротримерных G-белках, особенно подходят для регистрации активации GPCR [25]. Однако сообщалось только о нескольких оптических биосенсорах, сообщающих об активации Gα12 или Gα13.

    Sauliere et al. сообщили о биосенсоре на основе BRET для обнаружения активации активации Gα13, что позволяет обнаруживать предвзятый агонизм через рецептор ангиотензина II типа 1 (AT1R) [26].Однако этому подходу не хватает пространственного разрешения. Улучшенные люциферазы, такие как нанолюцифераза, позволили проводить измерения BRET отдельных клеток, но требуется более длительное время сбора данных, поэтому временное разрешение уменьшается [27]. Как правило, датчики на основе FRET имеют более высокую интенсивность излучения, что требует более короткого времени сбора данных для получения достаточного пространственного и временного разрешения. Таким образом, разработка основанного на FRET биосенсора, сообщающего об активации Gα13, будет реальным преимуществом для исследования передачи сигналов GPCR.Ранее мы сообщали об одинарных плазмидных системах, которые обеспечивают экспрессию мультимерного сенсора на основе FRET для Gαq и Gαi [28,29]. Здесь мы сообщаем о разработке, характеристике и применении единственной плазмиды, биосенсора на основе FRET для активации Gα13.

    Результаты

    Стратегия мечения Gα13 флуоресцентным белком

    Чтобы напрямую измерить активацию Gα13 с высоким пространственно-временным разрешением в живых клетках, мы стремились создать функциональную, меченную флуоресцентным белком (FP) субъединицу Gα13.Субъединицы Gα не могут быть помечены на N- или C-конце, так как они необходимы для взаимодействия с субъединицей Gβγ и GPCR [30]. Чтобы функционально пометить Gα13, FP должен быть вставлен в последовательность Gα13, как это было ранее сделано для других изоформ Gα [25,31].

    Первоначально мы использовали выравнивание последовательностей четырех классов Gα-белков и идентифицировали остатки Gαq [32] и Gαi [29], после которых мы ранее вставили mTurquoise2 (Рис. 1B, S1 Рис). Основываясь на гомологии последовательностей, мы выбрали вставку mTurquoise2 после остатка Q144 человеческого Gα13, обозначенного черным прямоугольником в выравнивании.При трансфекции плазмиды, кодирующей этот вариант, мы наблюдали цитоплазматическую флуоресценцию. Эта локализация, вероятно, отражает неправильную укладку или нацеливание субъединицы Gα, поскольку хорошо уложенные и функционально меченые варианты локализуются на плазматической мембране [31,32]. Изучение кристаллической структуры (PDB ID: 1ZCB) показало, что Q144 является частью α-спирали (αB2), которая, вероятно, будет разрушена после модификации или вставки [33].

    Рис. 1. Вставка флуоресцентного белка в различные положения в Gα13.

    (A) Белковая структура человеческого Gα13 (PDB ID: 1ZCB). Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку. Успешные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 в Gα13 розовым цветом и неудачные сайты оранжевым. (B) Частичное выравнивание последовательности белка (полное выравнивание см. S1 фиг.) Различных классов Gα. Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку (или люциферазе). Жирным шрифтом выделены сайты, которые ранее использовались для вставки Rluc [26].Вставка mTurquoise2-Δ9 в Gα13 после остатка Q144 (черный) была основана на гомологии с предыдущими вставками в Gαq и Gαi (черный). Удачные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 (R128, A129 и R140) в розовый и неудачные сайты (L106 и L143) в оранжевый. Цифры, указанные под выравниванием, соответствуют номерам вариантов Gα13, используемым во всей рукописи. Цвета под выравниванием совпадают с цветами αHelices, показанных на (A). (C) Конфокальные изображения меченых вариантов Gα13, временно экспрессируемых в клетках HeLa.Цифры в левом нижнем углу каждого изображения указывают количество клеток, которые показали локализацию плазматической мембраны из общего числа проанализированных клеток. Меченые варианты Gα13 также локализуются в структурах внутри клетки, которые предположительно являются эндомембранами. Ширина изображений 76 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g001

    Затем мы использовали структуру белка, чтобы выбрать ряд остатков, которые были рядом с предыдущими сайтами вставки и рядом с концом α- спираль (αA, αB2 или αB1).Мы также взяли с собой сайт вставки (L106), который ранее использовался для вставки люциферазы в Gα13 [26]. Мы использовали усеченный mTurquoise2, удалив последние 9 аминокислот, так как это хорошо работало в сенсоре Gi [29]. Сайты вставки выделены на структуре белка и в выравнивании последовательностей на фиг. 1A и 1B. Различные варианты пронумерованы как Gα13.1, Gα13.2, Gα13.3, Gα13.5 и Gα13.6 по всей рукописи.

    Плазмиды, кодирующие различные варианты с метками, трансфицировали в клетки HeLa, и мы наблюдали поразительные различия в локализации.Как показано на фиг. 1C, варианты 1 и 6 показали цитоплазматическую локализацию. Напротив, сильное мечение плазматической мембраны наблюдалось для вариантов Gα13.2, Gα13.3 и в меньшей степени для Gα13.5. Поскольку ожидается, что нативный Gα13 локализуется на плазматической мембране за счет пальмитоилирования [4], мы решили продолжить оптимизацию и характеристику вариантов 2, 3 и 5.

    Функциональность помеченных вариантов Gα13

    Правильная локализация меченых вариантов Gα13 не обязательно отражает функциональность в отношении активности в передаче сигналов, т.е.е. возможность обмена ВВП на GTP. Чтобы определить функциональность, мы обратились к динамическому клеточному анализу. Этот анализ основан на наблюдении, что эктопическая экспрессия Gα13 необходима для перемещения p115-RhoGEF на плазматическую мембрану после стимуляции GPCR [34]. Чтобы оценить функциональность Gα13, мы совместно экспрессировали рецептор LPA2-P2A-mCherry [22], p115-RhoGEF, помеченный SYFP1, и различные варианты Gα13, включая нетегированный нативный вариант (фиг. 2, S2, фиг.). Клетки, в которых Gα13 не был чрезмерно экспрессирован, не демонстрировали перемещения p115-RhoGEF после активации GPCR (фиг. 2B и 2C).Однако в присутствии нативного Gα13 было замечено перемещение p115-RhoGEF (рис. 2B и 2C). Эти данные согласуются с предыдущими данными и показывают, что функциональный Gα13 необходим для рекрутирования p115-RhoGEF на плазматическую мембрану. Затем аналогичные эксперименты были выполнены в присутствии Gα13 вариантов 2, 3 и 5, помеченных mTurquoise2Δ9. Во всех трех случаях наблюдалось устойчивое перемещение p115-RhoGEF (рис. 2). Напротив, перемещение не было очевидным, когда использовался вариант Gα13 (вариант 1), который не показал эффективной локализации на плазматической мембране (рис. 2B и 2C).Следовательно, мы наблюдали корреляцию между локализацией мембраны и функциональностью в анализе набора. В целом, результаты подтверждают мнение о том, что меченые варианты 2, 3 и 5 Gα13 могут быть активированы с помощью GPCR и способны рекрутировать p115-RhoGEF.

    Рис. 2. Способность меченых вариантов Gα13 рекрутировать p115-RhoGEF.

    (A) Конфокальные изображения репрезентативной клетки HeLa, экспрессирующей SYFP1-p115-RhoGEF, Gα13.2-mTurquoise2-Δ9 и LPA2-P2A-mCherry (здесь показан только SYFP1-p115-RhoGEF, для локализации других конструкций см. S2 рис.) (до (t = 0 с) и после (t = 100 с) добавления 3 мкМ LPA).Ширина картинок 67 мкм. (B) Средняя интенсивность цитоплазматической флуоресценции SYFP1-p115-RhoGEF с течением времени. Через 8 с добавляли 3 мкМ LPA. Все клетки временно экспрессировали рецептор LPA2-P2A-mCherry. Число отображаемых клеток: p115-RhoGEF n = 5, Gα13 немаркированный + p115-RhoGEF n = 15, Gα13.1 + p115-RhoGEF n = 27, Gα13.2 + p115-RhoGEF n = 28, Gα13,3 + p115-RhoGEF n = 24, Gα13,5 + p115-RhoGEF n = 20. Данные были получены из трех независимых экспериментов.(C) Количественная оценка интенсивности флуоресценции при t = 50 с для каждого варианта Gα13 относительно t = 0 с. Точками обозначены отдельные ячейки, а полосы ошибок показывают доверительные интервалы 95%. Количество проанализированных клеток такое же, как в (B).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g002

    Оценка меченых вариантов Gα13 для измерения активации Gα13

    Сконструировав несколько правильно локализующихся вариантов Gα13, способных рекрутировать p115-RhoGEF, мы исследовали, могут ли эти варианты использоваться для сообщения об активации G13.Используя подход на основе FRET (как описано для Gq [32]), мы отслеживали взаимодействие между различными сгенерированными конструкциями Gα13, меченными mTurquoise2, и димером Gβγ, состоящим из немеченых-Gβ и 173cpVenus-Gγ, на отдельных плазмидах. Эти конструкции позволяют измерять соотношение FRET акцептор (173cpVenus) –донор (mTurquoise2), где активация G13 приводит к изменению расстояния и / или ориентации между парой FRET, тем самым вызывая уменьшение отношения FRET.

    Здесь мы совместно экспрессировали немеченый LPA2-рецептор с одним из трех меченых вариантов Gα13, немаркированным Gβ и меченым Gγ.После активации рецептора LPA2 изменение соотношения FRET наблюдалось для всех трех выбранных вариантов Gα13 (рис. 3А). Вариант Gα13.2 показал наибольшее изменение отношения FRET, а вариант Gα13.5 — самое низкое (рис. 3A). Некоторые клетки, экспрессирующие вариант Gα13.3, показали более медленный ответ (рис. 3А).

    Рис. 3. Способность меченых вариантов Gα13 сообщать о динамической активации Gα13 с помощью ратиометрической визуализации FRET.

    (A) Ратиометрические следы FRET клеток HeLa, экспрессирующих рецептор LPA2 (без тегов), Gβ (без тегов), один из вариантов Gα13 (как указано в заголовке графиков), помеченных mTurquoise2-Δ9, и Gγ, помеченных cp173Venus.Серые линии представляют отдельные ячейки, а черный график представляет собой среднее значение, столбцы ошибок которого указывают доверительные интервалы 95%. LPA добавляли при t = 42-50 с, на что указывает стрелка. Количество проанализированных клеток составляет: Gα13,2-mTurquoise2-Δ9 n = 20, Gα13,3-mTurquoise2-Δ9 n = 16 и Gα13,5-mTurquoise2-Δ9 n = 11. Данные панели А приобретаются за несколько дней. (B) Ратиометрические следы FRET клеток HeLa, экспрессирующих рецептор LPA2 (без тегов), Gα13.2-mTurquoise2-Δ9 и либо Gγ, помеченный cp173Venus ( n = 38) (и немаркированный Gβ), либо Gβ, меченный mVenus ( n = 25) (и немаркированный Gγ). LPA добавляли при t = 50 с, на что указывает стрелка. Данные из панели B собираются в тот же день.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g003

    Недавно было сообщено о датчике FRET для Gα13, в котором использовались меченые Gα и субъединицы Gβ [35]. Поэтому мы также исследовали, приводит ли маркировка субъединицы Gβ вместо субъединицы Gγ к более высокому изменению соотношения FRET для наиболее эффективного варианта Gα13.Из рис. 3B можно сделать вывод, что мечение субъединицы Gγ с помощью акцептора FRET приводит к наибольшему изменению соотношения FRET при активации Gα13 через рецептор LPA2, что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями [32].

    Создание и характеристика биосенсоров FRET для активности Gα13

    Ранее мы показали для активационных биосенсоров Gαq [28] и Gαi [29], что одна плазмида экспрессии обеспечивает надежную коэкспрессию компонентов сенсора и упрощает трансфекцию.Поскольку все три меченых варианта Gα13 способны сообщать об активации Gα13 с использованием 173cpVenus-Gγ в качестве акцептора FRET, мы разработали одиночные плазмидные сенсоры с использованием каждого из вариантов Gα13. Фиг. 4A показывает схематический обзор конструкции плазмиды для сенсора Gα13. Анализ интенсивностей CFP и YFP из отдельных клеток показывает лучшую корреляцию для одной плазмидной системы по сравнению с клетками, трансфицированными отдельными плазмидами (рис. 4B).

    Рис. 4. Разработка и характеристика биосенсоров активации Gα13 на основе FRET.

    (A) Архитектура конструкции биосенсора Gα13, кодирующей Gβ-2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα13-mTurquoise2-Δ9, под контролем промотора CMV. (B) Эмиссию CFP и YFP измеряли из отдельных клеток, экспрессирующих сенсор Gα13.2 из одной плазмиды, или из клеток, трансфицированных отдельными плазмидами, кодирующими Gα13.2 и cp173Venus-Gγ 2 . R 2 — коэффициент корреляции. (C) Конфокальные изображения, показывающие локализацию Gα13 в вариантах сенсора (верхний, голубой) и cp173Venus-Gγ 2 (нижний, желтый) в клетках HeLa (для Gα13.2 расположение датчика в Hek293T и HUVEC см. S3 рис.). Ширина изображений 75 мкм. (D) Следы соотношения FRET для HUVEC, экспрессирующих различные биосенсоры Gα13, стимулированных тромбином при t = 100 с (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал). Соответствующие кривые YFP ​​и CFP см. На рис. S4. Количество проанализированных ячеек составляет: датчик Gα13.2 n = 16, датчик Gα13.3 n = 11, датчик Gα13.5 n = 16.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g004

    Как можно заключить из фиг. 4C, субклеточная локализация различных сенсоров Gα13, экспрессируемых в клетках HeLa, сходна.Как опубликовано, варианты Gα13 в основном расположены на плазматической мембране, а Gγ — на плазматической мембране и эндомембранах [28]. В клетках Hek293T, однако, временная экспрессия сенсора Gα13.2 приводит к очень круглым клеткам, которые легко отделяются (S3 Рис.), Что позволяет предположить, что очень высокая временная экспрессия сенсора может привести к усилению базальной активности Gα13.

    Затем мы оценили работу датчиков в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Известно, что HUVEC реагируют на тромбин, активируя эндогенные рецепторы, активируемые протеазой (PAR), что приводит к передаче сигналов Gα13-RhoA [11,36].Мы не наблюдали эффекта эктопической сенсорной экспрессии в HUVEC. Когда к HUVEC добавляли тромбин, датчик Gα13.2 показал наиболее выраженное изменение FRET (рис. 4D). Это согласуется с ранее описанными четко определенными изменениями FRET сенсора Gx13.2 после стимуляции S1P в HUVECs [11]. Основываясь на данных визуализации соотношения FRET в HUVEC и HeLa, мы выбрали датчик Gα13.2 в качестве предпочтительного биосенсора активации Gα13 из-за его высокой чувствительности и надежного изменения соотношения FRET при активации Gα13.

    Характеристика ингибирования Gα13 белком, активирующим ГТФазу

    По нашим данным, Gα13.2 достаточно чувствителен для обнаружения передачи сигналов G13, активируемых эндогенными рецепторами тромбина в HUVEC. Мы и другие [11,37,38] использовали домен регулятора передачи сигналов G-белка (RGS) p115-RhoGEF в качестве ингибитора передачи сигналов G13. Домен RGS проявляет активность GTPase Activating Protein (GAP) [39]. Однако неясно, связано ли ингибирование доменом RGS в клетках с активностью GAP или с конкурентным связыванием домена RGS и последующих эффекторов с Gα13. В последнем случае можно ожидать изменения соотношения FRET при наличии домена RGS.Чтобы понять механизм действия, мы использовали сенсор Gα13.2 и ко-экспрессировали связанный с мембраной RGS (Lck-mCherry-p115-RGS), который, как показано, эффективно ингибирует активацию RhoA [11].

    В присутствии домена RGS мы не наблюдали изменения соотношения FRET сенсора Gα13.2 после добавления тромбина к HUVEC (рис. 5A и 5B и S1 Movie). В контрольном образце (Lck-mCherry) мы действительно наблюдали изменение соотношения сенсора Gα13.2, вызванное тромбином (рис. 5A и 5B и S2 Movie), в то время как соотношения FRET в состоянии покоя были одинаковыми для обоих условий.Отсутствие ответа FRET в присутствии домена RGS, отражающее подавление активного GTP-связанного Gα13, свидетельствует о том, что активность GAP участвует в ингибирующем эффекте домена RGS. Кроме того, мы изучили индуцированное тромбином сокращение HUVEC и показали, что чрезмерная экспрессия домена RGS предотвращает сокращение клеток, даже приводя к общему увеличению площади клеток (рис. 5C и S3 Movie). Вместе эти данные показывают, что домен RGS ингибирует активацию Gα13 и, как следствие, активацию RhoA, которая эффективно блокирует сокращение клеток.

    Рис. 5. Влияние домена p115-RhoGEF RGS на активность Gα13.2 и морфологию клеток.

    (A) Нормализованные ратиометрические кривые (верхние графики) и соответствующие кривые YFP ​​и CFP (нижние графики) (пунктирные линии показывают 95% доверительный интервал) HUVEC, которые были трансфицированы либо датчиком Gα13.2 FRET, либо Lck-mCherry (контроль, n = 11) или датчиком Gα13.2 FRET и Lck-mCherry-RGS (+ RGS, n = 13). Клетки стимулировали при t = 110 с. (B) Ратиометрические изображения репрезентативных клеток, измеренные в (A).Холодные цвета представляют низкие отношения YFP / CFP, соответствующие отношениям эмиссии (ER) справа. (C) Изменение площади ячеек, измеренное в (B), визуализированное в соответствии с панелью LUT справа. Точечные диаграммы справа представляют отдельные измерения (± 95% ДИ) соответствующих клеток, измеренные в (A). Ширина изображения = 54 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g005

    Применение биосенсора Gα13.2 в анализах активации GPCR

    Опубликованные данные о сцеплении GPCRs с Gα13 часто основаны на косвенных измерениях, и поскольку нижестоящие сигнальные эффекты перекрываются с нижележащими сигнальными эффектами Gq, трудно сделать твердые выводы об участии любой из субъединиц [14].Наш новый датчик FRET позволяет напрямую наблюдать активацию Gα13. Поэтому мы оценили ответы Gαq и Gα13 на стимуляцию выбранных GPCR, опубликованных как сцепление с Gα13 [26,34,40,41]. Эти эксперименты проводили на клетках HeLa, временно экспрессирующих соответствующий GPCR. В качестве контроля стимулировались клетки, экспрессирующие только сенсор Gα13 или Gαq, что не вызывало заметного сенсорного ответа (рис. 6А). При стимуляции рецептора LPA2 (LPA2R) активируются как Gαq, так и Gα13, что соответствует опубликованным данным.Следует отметить, что ряд клеток (47 из 60 для Gαq и 23 из 37 для Gα13), временно экспрессирующих рецептор LPA2, не смогли показать ответ Gα13 или Gαq (рис. 6B). При стимуляции рецептора ангиотензина II типа 1 (AT1R) наблюдается заметный ответ датчика Gαq по сравнению с минимальным ответом датчика Gα13, который аналогичен контролю (сравните фиг. 6C и 6A). Рецептор кисспептина (KissR или GPR54) показал четкую реакцию сенсора Gαq и отсутствие ответа сенсора Gα13 при стимуляции (фиг. 6D).Вместе эти результаты показывают, что LPA2R связывается как с Gαq, так и с Gα13, тогда как AT1R и KissR связаны с Gαq и почти не связаны с Gα13. Более того, это показывает, что наш новый сенсор Gα13 действительно может быть использован для различения Gα13- и Gαq-связанной передачи сигналов GPCR.

    Рис. 6. Прямое наблюдение активации Gα13 и Gαq разными GPCR.

    Нормализованные соотношения-метрические следы FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gq (серая линия) или датчиком G13.2 (черная линия) (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал).(A) В качестве контроля измеряли клетки, экспрессирующие только датчик Gq ( n = 37) или G13.2 ( n = 20). Агонисты добавляли последовательно через 50, 150 и 230 секунд визуализации. (B) Соотношение следов клеток, трансфицированных немеченым рецептором LPA2 рядом с Gαq ( n = 13 (из 60 в целом)) или Gα13.2 ( n = 14 (из 37 в целом)) , стимулированный при t = 50 с. (C) Отношение следов клеток, трансфицированных рецептором ангиотензина II типа 1-P2A-mCherry, рядом с Gαq ( n = 22) или Gα13.2 ( n = 9) сенсор, стимулированный при t = 50 с. (D) Соотношение следов клеток, трансфицированных немаркированным рецептором поцелуя рядом с сенсором Gαq ( n = 13) или Gα13.2 ( n = 30), стимулированных при t = 50 с (указано стрелкой) .

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g006

    Обсуждение

    Комбинированная активация различных классов гетеротримерных G-белков с помощью GPCR определяет, какие сигнальные сети будут активированы.Известно, что для одного из классов G-белков, G12 / 13, его активация была чрезвычайно сложной. Здесь мы сообщаем о разработке, описании и применении биосенсора на основе FRET для активации Gα13. Этот новый инструмент можно использовать для изучения активации Gα13 GPCR в отдельных живых клетках. Кроме того, мы показываем, что датчик G13 достаточно чувствителен, чтобы сообщать об активации эндогенного рецептора в первичных клетках человека (HUVEC).

    До сих пор инструменты, доступные для изучения активации Gα13 в отдельных живых клетках, были ограничены.Стратегии на основе BRET использовались для изучения активации класса G12. С этой целью люцифераза Renilla reniformis (Rluc) была вставлена ​​в Gα13 после остатка Ile 108 [42] или Leu 106 [26]. Однако мы обнаружили, что вставка mTurquoise2 после остатка Leu 106 (Gα13.1) не приводит к функционально маркированной субъединице, возможно потому, что Leu106 является частью α-спирали.

    Три из пяти оцененных сайтов инсерции mTurquoise2 привели к локализации на плазматической мембране, помеченному Gα13, который был способен рекрутировать p115-RhoGEF на плазматическую мембрану.Локализованный в цитоплазме, меченый вариант Gα13.1 не был способен рекрутировать p115-RhoGEF, что указывает на то, что для функционирования требуется локализация плазматической мембраны. Поскольку все функциональные варианты Gα13 могут сообщать об активации G13, как это определено с помощью визуализации соотношения FRET, мы разработали одиночные плазмидные сенсоры для этих трех вариантов. В клетках HeLa локализация, как и ожидалось, Gα13 на плазматической мембране и Gγ на плазматической мембране и эндомембранах. Биосенсоры активации Gα13 экспрессировались в HUVEC и могли сообщать об активации G13 через эндогенные рецепторы, активируемые протеазой (PAR).Сенсор Gα13.2 является наиболее эффективным биосенсором Gα13, исходя из его чувствительности и величины изменения соотношения FRET при активации. Дальнейшее улучшение датчиков может быть достигнуто путем изменения пар FRET [43] или изменения их относительной ориентации путем круговой перестановки [44].

    Пока наша рукопись находилась в стадии подготовки, сообщалось о другом варианте Gα13, меченном mTurquoise2 [35]. В этом исследовании флуоресцентный белок был вставлен после остатка 127 Gα13, что очень похоже на наш Gα13.2 вариант, и он показал локализацию плазматической мембраны. Более того, Bodmann et al. наблюдали изменение FRET, когда вариант Gα13, меченный YFP, использовался в комбинации с субъединицей Gβ, меченной CFP, для сообщения об активации рецептора тромбоксана A2 [35]. Независимое наблюдение изменения FRET с использованием аналогичного помеченного варианта Gα13 подтверждает наше мнение о том, что биосенсор на основе G13.2 FRET является ценным инструментом для изучения активации Gα13.

    Преимущество нашего датчика FRET заключается в том, что обнаруживается более сильное изменение соотношения, чем для датчика, о котором сообщают Bodmann et al.2017. Хотя они обнаружили максимальное изменение коэффициента FRET на 10%, мы смогли достичь изменения коэффициента FRET до 25% (рис. 3). Это может быть связано с использованием меченого Gβ вместо субъединицы Gγ, поскольку мы также наблюдаем более низкое изменение соотношения FRET при использовании меченого Gβ (Рис. 3B). Примечательно, что Bodmann et al. обнаруживают увеличение FRET при стимуляции Gα13 (увеличение YFP, снижение интенсивности CFP), тогда как мы обнаруживаем снижение FRET при стимуляции Gα13 (рис. 3B). Все описанные нами сенсоры G-белка (Gαq, Gαi1,2,3 и Gα13) показывают снижение FRET при активации во всех испытанных до сих пор условиях [11,29,32], что соответствует диссоциации субъединиц Gα и Gβγ. .Более того, субъединицы Gα13, помеченные в разных сайтах (Gα13.2, Gα13.3 и Gα13.5), все демонстрируют снижение FRET (рис. 3). Одно заметное отличие состоит в том, что мы используем донора, помеченного Gα13, и Bodmann et al. используйте акцептор (YFP) с меткой Gα13. Однако неясно, как эта разница может приводить к противоположным изменениям FRET при активации, и поэтому у нас нет твердого объяснения различий в изменении FRET, наблюдаемых Bodmann et al. [35] и в этом исследовании.

    Преимущество сконструированного нами сенсора состоит в том, что он позволяет одновременно продуцировать три белка, составляющих гетеротример, из одной плазмиды, и что донор и акцептор присутствуют с четко определенной стехиометрией [28].Это очевидно из лучшей корреляции между интенсивностями эмиссии CFP и YFP по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид (рис. 4B). Более того, единая плазмидная система упрощает распространение и применение сенсора. Особенно в первичных клетках, таких как HUVEC, более сложно получить одновременную экспрессию белка из нескольких плазмид, тогда как временная экспрессия единственной сенсорной плазмиды в HUVEC была эффективной.

    RGS-домен p115-RhoGEF эффективно ингибирует опосредованную GPCR-Gα12 / 13 активацию RhoA в эндотелиальных клетках [11] и сокращение клеток, как показано на фиг. 5C.В этих условиях датчик Gα13.2 не показывал изменения отношения FRET, что свидетельствует об отсутствии активации. Отсутствие изменения FRET согласуется с идеей, что активность GAP домена RGS отключает активность Gα13 [39].

    Применяя сенсор Gα13.2 в клетках HeLa, мы показали, что и Gα13, и Gαq активируются через рецептор LPA2. Напротив, рецептор Kiss и рецептор AT1 вызывали преимущественно сенсорный ответ G? Q. По нашим данным невозможно судить, является ли минорный ответ Gα13 на активацию рецептора AT1 биологически значимым.GPCR, проанализированные в этом исследовании, сообщались как связанные с Gα13 и / или Gαq в других исследованиях [26,34,40,41]. Следует отметить, что временная экспрессия рецептора LPA2 показывает несколько нереагирующих с точки зрения активности Gαq или Gα13. Это можно объяснить недостаточным уровнем рецептора для достижения детектируемой активации.

    Поразительно, но рецептор Kiss не активировал биосенсор Gα13, указывая на то, что неспецифическое беспорядочное связывание GPCR с эктопически экспрессируемым биосенсором G-белка не обнаружено.Напротив, мы ранее наблюдали, что HUVEC, обработанные S1P, действительно показывают активацию Gα13, но не активацию Gαq [11]. В совокупности эти наблюдения предполагают, что наш набор биосенсоров на основе FRET обеспечивает способ определения селективности связывания GPCR по отношению к гетеротримерным G-белкам в живых клетках. Было бы целесообразно дополнить такие исследования большим количеством считываний ниже по течению, чтобы проверить возможное возмущение эктопически экспрессируемых сенсоров G-белка.

    Таким образом, результаты, полученные в этом исследовании, указывают на то, что Gα13.Биосенсор 2 представляет собой чувствительный датчик активации Gα13 для визуализации живых клеток, который подходит для применения в первичных клетках и способен обнаруживать эндогенную активацию GPCR.

    Материалы и методы

    Клонирование / конструирование плазмиды

    mTurquoise2-Δ9 было вставлено в последовательность Gα13 с использованием ранее описанной стратегии [29]. ПЦР выполняли с последовательностью mTurquoise2, чтобы усечь ее и фланкировать ее сайтами AgeI с использованием праймеров Fw 5’-ATACCGGTTCTATGGTGAGCAAGGGCG-3 ’и Rv 5’-TAACCGGTGATCCCGGCGGC -3’.Чтобы определить, в какие позиции мы хотели вставить mTurquoise2 в Gα13, мы использовали Pymol, чтобы посмотреть на структуру Gα13, и мы использовали ClustalW для выравнивания нескольких классов Gα. ПЦР с полным вектором была проведена на векторе pcDNA, кодирующем Gα13 человека (заказанном на cDNA.org), чтобы ввести сайт рестрикции AgeI в то место, где мы хотели вставить mTurquoise2, с использованием праймеров Fw 5′-ATACCGGTCATATTCCCTGGGGAGACAAC-3 ‘и Rv 5 ‘- ATACCGGTAAGCTTCTCTCGAGCATCAAC-3′ для Gα13.1, праймеры Fw 5’-ATACCGGTGCCCCCATGGCAGCCC-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTCCGGGTATCAAACGACATCATCTTATC-3′ для Gα13.2, праймеры Fw 5’-ATACCGGTCCCATGGCAGCCCAAGG-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTGGCCCGGGTATCAAACGAC-3′ для Gα13.3, праймеры Fw 5’-ATACCGGTGTTTTCTTAC’AATATCTAGTCCTCCT и Rv 5 ‘-GTACTAGGTCCT и RVTACTACGT-3’ -CTACTGT и RCCT-3 ‘-CTACTACGT-CCT-3’ -CTACTGT-CCT-3 ‘-CTACT-G-CCT-3′ 5’-ATCCGGTCAATATCTTCCTGCTATAAGAGCA-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTTAAGAAAACCCTTGTTTCCACC-3’ для Gα13.6. Вектор пкДНК Gα13, включающий сайт AgeI и продукт ПЦР mTq2, разрезали с помощью AgeI и лигировали, в результате чего получали Gα13, меченный mTurquoise2. Следует отметить, что клонирование варианта Gα13.4 со вставкой mTurquoise2-Δ9 после T139 не удалось.

    Мы использовали GFP-p115-RhoGEF (любезный подарок Кита Берриджа, UNC, Чапел-Хилл, США) в качестве матрицы для амплификации p115-RhoGEF с праймерами Fw 5′- AACAGATCTCTTGGTACCGAGCTCGGATC-3 ‘и Rv 5’-AGCGTCGACCCA ‘. Продукт ПЦР, фланкированный сайтами рестрикции BglII и SalI, использовали для клонирования p115-RhoGEF в вектор C1 типа clontech, генерируя mVenus-p115-RhoGEF.

    Немеченый рецептор LPA2 был заказан на cDNA.org. Для создания конструкции N1 LPA2 рецептор-P2A-mCherry в стиле clontech проводили ПЦР с использованием праймеров Fw 5’-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ’и Rv 5’-TATGTCGACTTGGGTGGAGTCATCAGTG-3’.Конструкция N1-P2A-mCherry, описанная ранее [22], и продукт ПЦР рецептора LPA2 переваривали EcoRI и SalI, и лигирование приводило к конструкции рецептор LPA2-P2A-mCherry.

    Варианты одиночного плазмидного сенсора G13 были сконструированы, как описано ранее, с помощью ПЦР с перекрывающимся удлинением [29,45]. Первые ПЦР были выполнены на ранее опубликованном датчике Gαq [28] с использованием праймера A Fw 5′-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и праймера B Rv 5′-GTCCGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG-3’ и на вариантах Gα13GATA с меткой mTurquoise2 ‘-3ACGATCATC-FwGATA с тегом mTurquoise2’-ACT ‘и праймер D Rv 5′-ATCAGCGGGTTTAAACG-3’.Вторую ПЦР проводили на смеси обоих продуктов ПЦР с использованием primerA и primerD. Этот второй продукт ПЦР и сенсор Gαq расщепляли SacI и XbaI, и продукт ПЦР лигировали в сенсор, в результате чего получали сенсор одиночной плазмиды G13.

    Lck-mCherry-p115-RhoGEF-RGS был сконструирован, как описано ранее [11]. Домен p115-RhoGEF-RGS (аминокислота 1-252) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Fw 5’-GAGATCAGATCTATGGAAGACTTCGCCCGAG-3 ’и Rv 5’-GAGATCGAATTCTTAGTTCCCCATCACCTTTTTC-3’. Продукт ПЦР и вектор C1 Lck-mCherry в стиле clontech переваривали BglII и EcoRI, и лигирование приводило к вектору C1 стиля clontech, кодирующему Lck-mCherry-p115-RhoGEF-RGS.

    Немеченый рецептор Kiss был приобретен на сайте www.cDNA.org.

    rAT1aR-mVenus был любезным подарком Петера Варнаи (Университет Земмельвейса, Венгрия). Кодирующая последовательность AT1R была вставлена ​​в mCherry-N1 с пептидом P2A для получения AT1R-P2A-mCherry.

    Культура клеток и подготовка проб

    клеток HeLa (CCL-2, American Tissue Culture Collection; Manassas, VA, USA) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco, каталожный № 61965–059) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, кат. 10270–106), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в 7% CO 2 .Для микроскопических экспериментов клетки выращивали на круглых покровных стеклах Ø 24 мм, толщиной 0,13–0,16 мм (Menzel, каталожный № 360208) до 50% слияния и трансфицировали плазмидной ДНК размером 500 нг, 1 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный № 11668–019) или 4,5 мкл PEI (1 мг / мл) в воде (pH 7,3) и 100 мкл OptiMEM (Gibco, каталожный № 31985–047) на чашку Ø 35 мм с покровным стеклом Ø 24 мм. Через день после трансфекции покровное стекло помещали в камеру для клеток (Attofluor, Invitrogen). Среда для микроскопии (20 мМ HEPES (pH = 7,4), 137 мМ NaCL, 5.4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 0,8 мМ MgCl2 и 20 мМ глюкозы) добавляли к покровному стеклу в камере для клеток. Логометрические эксперименты FRET проводили при 37 ° C.

    Первичные HUVEC, полученные от Lonza (Verviers, Бельгия), высевали в культуральные колбы, покрытые фибронектином (FN). HUVEC, выращенные в среде EGM-2, дополненные одиночными квотами (Lonza) при 37 ° C в 5% CO 2 . Для микроскопических экспериментов HUVEC трансфицировали в пассаже № 4 или № 5 с помощью системы трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и набора для трансфекции Neon (Invitrogen) и выращивали на покрытых FN круглых покровных стеклах Ø 24 мм, 0.Толщиной 13–0,16 мм (Menzel, каталожный № 360208). Для трансфекции использовали 2 мкг плазмидной ДНК и генерировали одиночный импульс при 1300 В в течение 30 мс. [11]. Логометрические эксперименты FRET проводили при 37 ° C в среде EGM-2 и в 5% CO 2 .

    Конфокальная микроскопия

    Для получения конфокальных изображений живых клеток HeLa, временно экспрессирующих либо меченый вариант Gα13, либо сенсор одиночной плазмиды G13, конфокальный микроскоп Nikon A1, оснащенный масляным иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри. Для проверки локализации меченых вариантов Gα13 образцы возбуждали лазерной линией 457 нм, использовали дихроичное зеркало 457/514 и излучение фильтровали через фильтр 482 / 35BP. Для проверки локализации сенсорных конструкций одиночной плазмиды G13 образцы возбуждали лазерной линией 440 нм (CFP) и 514 нм (YFP), использовали дихроичное зеркало 457/514 и излучение фильтровали через 482 / 35BP (CFP). ) или 540 / 30BP (YFP) соответственно.Изображения были получены в режиме последовательного строчного сканирования, чтобы избежать проступания.

    Анализ набора p115-RhoGEF

    Для анализа набора p115-RhoGEF клетки HeLa культивировали в среде RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и L-глутамина (2 мМ) (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия) и хранили при 7 ° C в 5% -ной среде. CO 2 атмосфера. Клетки собирали, и 50 000 клеток / лунку высевали на восьми-луночные μ-слайды (Ibidi). Через 24 часа клетки временно трансфицировали 0.25 мкг рецептора LPA2-P2A-mCherry, вариантов SYFP1-p115-RhoGEF и Gα13, меченных mTurquoise2 (Gα13.1, Gα13.2, Gα13.3, Gα13.5). Трансфекцию клеток HeLa проводили с использованием Lipofectamine 3000 и Plus Reagent в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Через 24 часа после трансфекции ростовую среду заменяли средой RPMI, не содержащей фенолового красного, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов. На протяжении всех измерений клетки хранили при 37 ° C.Клетки стимулировали олеоил-L-α-лизофосфатидовой кислотой (10 мкМ, Sigma) в указанный момент времени. Конфокальные изображения получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Мангейм, Германия), оснащенного водно-иммерсионным объективом HCX PL APO 63 ×, N.A. 1.2. mTurquoise2 возбуждали на длине волны 458 нм, а излучение регистрировалось в диапазоне 465-500 нм; SYFP1 возбуждали на длине волны 514 нм, а эмиссию регистрировали в диапазоне 520-550 нм; mCherry возбуждали на длине волны 561 нм, а эмиссия регистрировалась в диапазоне 600-670 нм.Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Анализ изображений проводился с Фиджи.

    Широкопольная микроскопия

    Ратиометрическая визуализация FRET клеток HeLa.

    Ратиометрические эксперименты FRET были выполнены на широкопольном флуоресцентном микроскопе (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH) [32], оборудованном ксеноновой дуговой лампой с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK) и программным обеспечением Metamorph 6.1, для 240 с или 288 с (элементы управления на рис. 6A) и с интервалом времени 2 с.Интенсивность флуоресценции донора и акцептора регистрировали при времени экспозиции 200 мс на изображение с использованием объектива с 40-кратным увеличением (масляно-иммерсионный Plan-Neoflor 40 × / 1,30; Carl Zeiss GmbH). Использовали клетки HeLa, экспрессирующие cp173Venus-Gγ (или немаркированный Gγ на рис. 3B), немаркированный Gβ (или меченный mVenus Gβ на рис. 3B) и один из меченых mTurquoise2 вариантов Gα13 из нескольких плазмид или экспрессирующие одиночный Gq-сенсор плазмиды или один вариантов датчика G13. GPCR экспрессируется из отдельной плазмиды, которая представляет собой немеченый рецептор LPA2, немеченый рецептор Kiss или рецептор ангиотензина II типа 1-P2A-mCherry.Флуорофоры возбуждали светом 420 нм (ширина щели 30 нм), излучение mTq2 регистрировалось фильтром BP470 / 30, излучение YFP ​​регистрировалось фильтром BP535 / 30, а излучение RFP регистрировалось фильтром BP620 / 60 путем поворота фильтра. колесо. Через 50 с клетки HeLa (если не указано иное) стимулировали конечной концентрацией 3 мкМ LPA (Sigma), 100 нМ амида Kiss-1 (112–121) (Phoenix Pharmaceuticals) или 10 мкМ ангиотензина (Sigma). Кривые были нормализованы к средней интенсивности первых 5 записанных кадров.ImageJ использовался для выполнения коррекции фона и расчета средней интенсивности каждой ячейки для каждой временной точки. Клетки, не показавшие видимого ответа, не использовали для анализа. Общее количество отображаемых клеток и количество проанализированных клеток («респонденты») указаны в подписях к рисункам.

    Ratiometric FRET imaging HUVECs.

    Для выполнения ратиометрических FRET-экспериментов на HUVEC мы использовали то же оборудование микроскопии и настройки фильтров, которые использовались для выполнения ратиометрической FRET-визуализации клеток HeLa, однако есть некоторые различия в способах записи данных.Визуализация HUVEC производится в течение 1230 с с интервалом времени 10 с, и визуализация выполняется при 37 ° C в среде EGM-2 и в 5% CO 2 . Через 110 секунд HUVEC стимулировали конечной концентрацией тромбина 1 Ед / мл (Haematologic Technologies). Процедура обработки изображений, которая использовалась для отображения изменения площади клеток во время микроскопии живых клеток HUVEC, описана в другом месте [11]). Чтобы показать соотношение FRET на изображениях клеток, использовали imageJ. Сначала мы преобразовали CFP и стек YFP в 32-битный тип и скорректировали фоновый сигнал.Затем стопки были разделены для получения стопки YFP / CFP. Мы использовали стек CFP для создания двоичной маски и умножили эту маску на стек YFP / CFP. Наконец, мы применили плавный фильтр для уменьшения шума и использовали таблицу поиска (LUT) для визуализации изменений в соотношении FRET.

    Дополнительная информация

    S1 Рис. Полное аминокислотное выравнивание четырех классов человеческих Gα-субъединиц гетеротримерных G-белков.

    Обратите внимание, что аминокислотная последовательность Gαs соответствует короткой изоформе.Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку (или люциферазе). Жирным шрифтом выделены сайты, которые ранее использовались для вставки Rluc (Saulière et al., 2012). Вставка mTurquoise2-Δ9 в Gα13 после остатка Q144 (черный) была основана на гомологии с предыдущими вставками в Gαq и Gαi (черный). Удачные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 (R128, A129 и R140) в розовый и неудачные сайты (L106 и L143) в оранжевый.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s001

    (PNG)

    S3 Рис. Изображения с конфокальной микроскопии клеток Hek293T (слева) или изображения HUVEC, полученные с помощью широкопольной микроскопии, оба экспрессируют датчик G13.2.

    Верхние изображения показывают локализацию Gα13.2, а нижние изображения показывают локализацию Gγ. Клетки Hek293T возбуждали светом 457 нм (CFP) и 514 нм (YFP), и, соответственно, для обнаружения испускаемого света использовали 482 / 35BP и 540 / 30BP. Ширина изображений 70 мкм. Клетки HUVEC возбуждали светом 420 нм (CFP) и 490 нм (YFP), и, соответственно, для обнаружения испускаемого света использовали 470 / 30BP и 535 / 30BP.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s003

    (PNG)

    S4 Рис. Следы CFP и YFP HUVEC, экспрессирующих различные биосенсоры G13, стимулированных 1 ед. / Мл тромбина при t = 100 с (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал).

    Количество проанализированных ячеек: датчик G13.2 n = 16, датчик G13.3 n = 11, датчик G13.5 n = 16.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s004

    (PNG)

    Благодарности

    Мы благодарим сотрудников наших лабораторий за их постоянный интерес и поддержку этого проекта.Плазмида с rAT1aR-mVenus была любезным подарком от Питера Варнаи (Университет Земмельвейса, Венгрия), а GFP-p115-RhoGEF предоставлен Кейт Берридж (UNC, Чапел-Хилл, США).

    Ссылки

    1. 1. Вассилатис Д.К., Хоманн Дж. Г., Зенг Х., Ли Ф., Ранчалис Дж. Э., Мортруд М. Т. и др. Репертуары рецепторов, связанных с G-белками, человека и мыши. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 4903–8. pmid: 12679517
    2. 2. Wettschureck N, Offermanns S. G-белки млекопитающих и их специфические для клеточного типа функции.Physiol Rev.2005; 85: 1159–204. pmid: 16183910
    3. 3. Ренс-Домиано С., Хамм Х. Структурные и функциональные взаимоотношения гетеротримерных G-белков. FASEB J. 1995; 9: 1059–66. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7649405 pmid: 7649405
    4. 4. Wedegaertner PB, Wilson PT, Bourne HR. Липидные модификации тримерных G-белков. J Biol Chem. 1995; 270: 503–6. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7822269 pmid: 7822269
    5. 5. Хеплер-младший, Гилман АГ.G белки. Trends Biochem Sci. 1992; 17: 383–7. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1455506 pmid: 1455506
    6. 6. Франк М., Тюмер Л., Лозе М. Дж., Бюнеман М. G Активация белка без диссоциации субъединицы зависит от G {альфа} (i) -специфической области. J Biol Chem. 2005; 280: 24584–90. pmid: 15866880
    7. 7. Левицки А., Кляйн С. Диссоциация субъединицы G-белка не является неотъемлемой частью действия G-белка. Chembiochem. 2002; 3: 815–8. pmid: 12210980
    8. 8.Зилер С. Регулирование белков RhoGEF рецепторами, сопряженными с G12 / 13. Br J Pharmacol. 2009; 158: 41–9. pmid: 19226283
    9. 9. Aittaleb M, Богут, Калифорния, Tesmer JJG. Структура и функция факторов обмена генов нуклеотидов, регулируемых гетеротримерным G-белком. Mol Pharmacol. 2010; 77: 111–25. pmid: 19880753
    10. 10. Рохас Р.Дж., Йохе М.Э., Гершбург С., Кавано Т., Козаса Т., Сондек Дж. Галфак непосредственно активирует p63RhoGEF и Trio через консервативное расширение гомологичного домена плекстрина, ассоциированного с Dbl.J Biol Chem. 2007. 282: 29201–10. pmid: 17606614
    11. 11. Рейнхард Н.Р., Мастоп М., Инь Т., Ву Й., Босма Е.К., Гаделла TWJ и др. Баланс между путями Gα i -Cdc42 / Rac и Gα 12/13 -RhoA определяет регуляцию эндотелиального барьера с помощью сфингозин-1-фосфата. Ван Хаастерт П., редактор. Mol Biol Cell. 2017; mbc.E17-03-0136. pmid: 28954861 ​​
    12. 12. ван Унен Дж., Инь Т., Ву И.И., Мастоп М., Гаделла TWJ, Годхарт Дж. Кинетика рекрутирования и аллостерической активации изоформ ARHGEF25 гетеротримерным G-белком Gαq.Sci Rep.2016; 6: 36825. pmid: 27833100
    13. 13. Worzfeld T, Wettschureck N, Offermanns S. Передача сигналов, опосредованная G (12) / G (13), в физиологии и болезнях млекопитающих. Trends Pharmacol Sci. 2008; 29: 582–9. pmid: 18814923
    14. 14. Riobo NA, Manning DR. Рецепторы, связанные с гетеротримерными G-белками семейства G12. Trends Pharmacol Sci. 2005. 26: 146–54. pmid: 15749160
    15. 15. Takefuji M, Wirth A, Lukasova M, Takefuji S, Boettger T., Braun T. и др.G (13) -опосредованный сигнальный путь необходим для сердечного ремоделирования, вызванного перегрузкой давлением, и сердечной недостаточности. Тираж. 2012; 126: 1972–82. pmid: 22972902
    16. 16. Wirth A, Benyó Z, Lukasova M, Leutgeb B, Wettschureck N, Gorbey S и др. G12-G13-LARG-опосредованная передача сигналов в гладких мышцах сосудов необходима для индуцированной солью гипертензии. Nat Med. 2008; 14: 64–8. pmid: 18084302
    17. 17. Миллиган Г. Принципы: расширение возможностей анализа связывания [35S] GTP gamma S.Trends Pharmacol Sci. 2003. 24: 87–90. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12559773 pmid: 12559773
    18. 18. Странный PG. Использование анализа связывания GTPγS ([35S] GTPγS и Eu-GTPγS) для анализа активности лиганда и эффективности в отношении рецепторов, связанных с G-белком. Br J Pharmacol. 2010; 161: 1238–49. pmid: 20662841
    19. 19. ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С.Дж., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками, с помощью биосенсоров с резонансным переносом энергии в живых организмах.Mol Pharmacol. 2015; 88: 589–95. pmid: 25972446
    20. 20. Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансного переноса энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации рецепторов, связанных с G-белками, и передачи сигналов. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612
    21. 21. Клистер Т., Мехта С., Чжан Дж. Одноклеточный анализ передачи сигнала G-белка. J Biol Chem. 2015; 290: 6681–8. pmid: 25605723
    22. 22. ван Унен Дж., Рашидфаррохи А., Хугендорн Э., Постма М., Гаделла TWJ, Гоэдхарт Дж.Количественный одноклеточный анализ сигнальных путей, активируемых сразу после подтипов гистаминовых рецепторов. Mol Pharmacol. 2016; 90: 162–76. pmid: 27358232
    23. 23. Салахпур А., Эспиноза С., Масри Б., Лам В., Барак Л.С., Гайнетдинов Р.Р. Биосенсоры BRET для изучения биологии, фармакологии GPCR и передачи сигналов. Фронт-эндокринол (Лозанна). 2012; 3: 105. pmid: 22952466
    24. 24. Hébert TE, Galés C, Rebois RV. Обнаружение и визуализация белок-белковых взаимодействий во время опосредованной G-белком передачи сигнала in vivo и in situ с использованием методов, основанных на флуоресценции.Cell Biochem Biophys. 2006; 45: 85–109. pmid: 16679566
    25. 25. Джанетопулос С., Девреотес П. Мониторинг опосредованной рецептором активации гетеротримерных G-белков с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Методы. 2002; 27: 366–73. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12217653 pmid: 12217653
    26. 26. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol.2012; 8: 622–30. pmid: 22634635
    27. 27. Goyet E, Bouquier N, Ollendorff V, Perroy J. Быстрая визуализация одноклеточных BRET с высоким разрешением. Научный доклад 2016; 6: 28231. pmid: 27302735
    28. 28. Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I., Hink MA, Gadella TWJ Jr. Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET. PLoS One. 2011; 6: e27321. pmid: 22114669
    29. 29. ван Унен Дж., Штумпф А.Д., Шмид Б., Рейнхард Н.Р., Хордийк П.Л., Хоффманн С. и др.Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках. PLoS One. 2016; 11: e0146789. pmid: 26799488
    30. 30. Wall MA, Coleman DE, Lee E, Iñiguez-Lluhi JA, Posner BA, Gilman AG и др. Структура гетеротримера G-белка Gi альфа 1 бета 1 гамма 2. Клетка. 1995; 83: 1047–58. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8521505 pmid: 8521505
    31. 31. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Gialpha и Gbeta определяют селективность активации G-белка альфа2-адренорецепторами.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103: 212–7. pmid: 16371464
    32. 32. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9:32. Pmid: 21619590
    33. 33. Kreutz B, Yau DM, Nance MR, Tanabe S, Tesmer JJG, Kozasa T. Новый подход к производству функциональных субъединиц G альфа дает активированные и деактивированные структуры белков G альфа (12/13).Биохимия. 2006; 45: 167–74. pmid: 16388592
    34. 34. Meyer BH, Freuler F, Guerini D, Siehler S. Обратимая транслокация p115-RhoGEF с помощью рецепторов, связанных с G (12/13). J Cell Biochem. 2008; 104: 1660–70. pmid: 18320579
    35. 35. Бодманн Э.Л., Кретт А.Л., Бюнеманн М. Усиление рецепторных ответов, вызванных длительным связыванием Gα13 и лейкемией RhoGEF. FASEB J. 2017; 31: 3663–3676. pmid: 28465324
    36. 36. Рейнхард Н.Р., ван Хелден С.Ф., Энтони Э.К., Инь Т., Ву Ю.И., Годхарт Дж. И др.Пространственно-временной анализ активации RhoA / B / C в первичных эндотелиальных клетках человека. Научный доклад 2016; 6: 25502. pmid: 27147504
    37. 37. Келли П., Стеммле Л.Н., Мэдден Дж. Ф., Филдс Т.А., Даака Ю., Кейси П.Дж. Роль семейства G12 гетеротримерных G-белков в инвазии рака простаты. J Biol Chem. 2006; 281: 26483–90. pmid: 16787920
    38. 38. Мартин С.Б., Махон Г.М., Клингер М.Б., Кей Р.Дж., Саймонс М., Дер С.Дж. и др. Рецептор тромбина, PAR-1, вызывает трансформацию путем активации Rho-опосредованных сигнальных путей.Онкоген. 2001; 20: 1953–63. pmid: 11360179
    39. 39. Kozasa T, Jiang X, Hart MJ, Sternweis PM, Singer WD, Gilman AG и др. p115 RhoGEF, белок, активирующий ГТФазу для Galpha12 и Galpha13. Наука. 1998; 280: 2109–11. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9641915 pmid: 9641915
    40. 40. Иноуэ А., Исигуро Дж., Китамура Х., Арима Н., Окутани М., Шуто А. и др. Анализ выделения TGFα: точный и универсальный метод обнаружения активации GPCR. Нат методы.2012; 9: 1021–9. pmid: 22983457
    41. 41. Навенот Дж.М., Фуджи Н., Пайпер СК. Активация Rho и Rho-ассоциированной киназы продуктом гена-супрессора метастазирования GPR54 и KiSS1 вызывает изменения морфологии клеток и способствует апоптозу. Mol Pharmacol. 2009. 75: 1300–6. pmid: 19286835
    42. 42. Ayoub MA, Trinquet E, Pfleger KDG, Pin J-P. Дифференциальные способы ассоциации рецептора тромбина PAR1 с Galphai1, Galpha12 и бета-аррестином 1. FASEB J. 2010; 24: 3522–35.pmid: 20410441
    43. 43. Mastop M, Bindels DS, Shaner NC, Postma M, Gadella TWJ Jr, Goedhart J. Характеристика спектрально разнообразного набора флуоресцентных белков как акцепторов FRET для mTurquoise2. Научный доклад 2017; 7: 11999. pmid: 28931898
    44. 44. Фриц Р.Д., Летцельтер М., Рейманн А., Мартин К., Фуско Л., Рицма Л. и др. Универсальный набор инструментов для создания чувствительных биосенсоров FRET для визуализации сигналов во времени и пространстве. Sci Signal. 2013; 6: RS12. pmid: 23882122
    45. 45.Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез с помощью ПЦР-управляемого удлинения перекрытия. Nat Protoc. 2007; 2: 924–32. pmid: 17446874
    Серия

    Streaming Concert с участием 10 великих сиэтлских исполнителей и групп

    Вот горячий совет о серии потоковых концертов с участием некоторых из лучших музыкантов Сиэтла — читайте дальше!

    Сиэтл известен как отличный город для музыки, но COVID-19 серьезно повлиял на этот творческий сектор, оставив наших талантливых артистов без концертов, а нашу публику без радости от концертов и фестивалей живой музыки, поскольку наши сцены пока замолкают.Поэтому некоторые недавно объявленные хорошие новости были очень желанными: новое отделение Black Fret в Сиэтле объявило о раунде грантового финансирования 2020 года для поддержки местных музыкантов.

    Black Fret была основана в Остине в 2013 году как благотворительная организация для оказания прямой поддержки и гонораров за выступления остинских музыкантов, на сегодняшний день распределив более 1,75 миллиона долларов. Отделение в Сиэтле знаменует собой начало запланированной национальной экспансии и официально началось в феврале 2020 года, когда пандемия начала менять привычный нам ландшафт.Хотя некоторые планы на будущее пока отложены, эти гранты помогут поддержать музыкантов Сиэтла, когда они больше всего в этом нуждаются.

    Поздравления получателям грантов Black Fret Seattle 2020:
    Bearaxe, Chong The Nomad, Whitney Mongé, Naked Giants, Sera Cahoone, Smokey Brights, Stephanie Anne Johnson and the Hidogs, The Black Tones, Tomo Nakayama и Tres Leches .

    Каждый артист или группа получат грант в размере 5000 долларов, который они могут использовать по своему усмотрению для поддержки своего карьерного роста, и каждый из лауреатов 2020 года будет представлен в серии концертов, транслируемых в прямом эфире из Nectar в районе Фремонт в Сиэтле.

    Найдите ссылки и информацию на странице мероприятия Nectar . Все концерты проходят в , 20:00 по тихоокеанскому стандартному времени, .

    Каждая выставка будет приносить пользу другой местной некоммерческой организации, выбранной артистом.

    Концертный состав:

    Среда 9/9 Чонг Кочевник (в интересах Проекта Окра)

    Среда, 16 сентября, Обнаженные гиганты (на благо фермы Nurturing Roots Farm)

    Среда, 23 сентября Стефани Энн Джонсон и Hidogs (пользуется Feed 253)

    Среда, 30 сентября, Смоки Брайтс (в интересах King County Equity Now)

    Вторник, 6 октября Беараксе ( в интересах Общества молодых женщин, получившего расширение прав и возможностей )

    Среда, 14 октября Томо Накаяма (в рамках программы взаимной помощи округа Южный Кинг и Ист-Сайда)

    Среда 21.10 Сера Кахун (в интересах гендерного центра Ingersoll)

    Среда 28.10. Черные тона ( в пользу Центрального районного форума искусства и идей)

    , среда, 11/11 Трес-Лешес (, в пользу Сомоса, Сиэтл, )

    18 ноября, среда, Уитни Монге (, Лэнгстон Сиэтл )

    АУДИО И ВИДЕО ПЛЕЙЛИСТЫ

    Если вы хотите послушать музыкантов 2020 года, вы можете проверить этот плейлист Spotify или просмотреть видеоролик.

    Надеюсь, вы присоединитесь к нам на концертах!

    Верхнее фото: Чонг Кочевник из Visit Seattle Uncharted: Сиэтл

    Об авторе

    Трейси Уикершем

    Трейси Викершем — старший директор по культурному туризму Visit Seattle. Диджей-волонтер и ведущий длительной музыкальной программы на KBCS 91.3 FM, она провела 6 лет в правлении 4Culture, поддерживая искусство, наследие, общественное искусство и сохранение исторического наследия в округе Кинг. Вы часто найдете ее в тракторной таверне, где она играет с великолепными музыкальными группами, исследует один из красивых парков региона или в одном из многочисленных концертных залов Сиэтла.

    Другие сообщения Tracey Wickersham .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.