Параметры лада х рей: Лада Х Рей кросс технические характеристики Lada XRAY Cross 2020-2021, Москва

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. Помимо исследования взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера. расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость передачи резонансной энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) по сравнению с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые данные указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора являются надежными только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Фёрстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от испускания флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. Ячейки с использованием стандартного освещения светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо исключить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение излучения донора с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен иметь низкую поляризационную анизотропию, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, широкий спектр методов может быть использован для выполнения самого измерения.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может происходить самотушение, что влияет на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения эмиссии донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они регистрируются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получается путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времен жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Структурная информация из экспериментов с одномолекулярными FRET с использованием системы быстрого нанопозиционирования

J Vis Exp. 2017; (120): 54782.

Тило Дёрфлер

¹ Институт биофизики Ульмского университета

Тобиас Эйлерт

¹ Институт биофизики Ульмского университета

Карлхайнц 9

Институт биофизики Ульмского университета 8 Университет

Джулия Надь

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

Йенс Михаэлис

¹ Институт биофизики, Ульмский университет

¹ Институт биофизики, Ульмский университет 905 905, равный номер

.

Авторские права © 2017, Журнал визуализированных экспериментов Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) можно использовать для получения структурной информации о биомолекулярных комплексах в реальном времени. Таким образом, несколько измерений smFRET используются для локализации неизвестного положения красителя внутри белкового комплекса посредством трилатерации. Для получения количественной информации система нанопозиционирования (NPS) использует вероятностный анализ данных для объединения структурной информации из рентгеновской кристаллографии с данными флуоресценции одиночных молекул для расчета не только наиболее вероятного положения, но и полного трехмерного распределения вероятностей. , названный апостериорным, что указывает на экспериментальную неопределенность.Эта концепция была обобщена для анализа сетей smFRET, содержащих множество молекул красителя. Последняя версия NPS, Fast-NPS, включает новый алгоритм, использующий оценку байесовских параметров на основе выборки методом Монте-Карло цепи Маркова и параллельного темперирования, который позволяет анализировать большие сети smFRET за сравнительно короткое время. Более того, Fast-NPS позволяет рассчитывать апостериор, выбирая одну из пяти различных моделей для каждого красителя, которые учитывают различное пространственное и ориентационное поведение, демонстрируемое молекулами красителя из-за их локального окружения.

Здесь мы представляем подробный протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS. Мы предоставляем подробные инструкции по получению трех входных параметров Fast-NPS: значений smFRET, а также квантового выхода и анизотропии молекул красителя. Недавно NPS был использован для выяснения архитектуры архейного открытого промоторного комплекса. Эти данные используются для демонстрации влияния пяти различных моделей красителей на апостериорное распределение.

Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 120, Система нанопозиционирования, Fast-NPS, флуоресценция одиночных молекул, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночных молекул, структурная биология

Введение

Определение структуры биомолекулы является ключевым предварительным условием для понимания его функции.Два хорошо зарекомендовавших себя метода определения структуры — криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография1,2. Сегодня оба метода предоставляют структурную информацию с высоким разрешением и разрешением вплоть до ангстрема. Эти два метода широко используются для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно совершенствовались на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур по-прежнему представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, в частности, когда исследуются большие, динамические и переходные комплексы3.

Чтобы изучить динамику макромолекулярных комплексов и, в частности, взаимосвязь между структурой и функцией, методологии исследования отдельных молекул предоставили полезную информацию4. Было разработано несколько новых стратегий, обеспечивающих ортогональный подход к получению структурной и динамической информации. Примерами являются высокоскоростной AFM5, механическое манипулирование6, флуоресцентная микроскопия локализации7, а также одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 8,9. С самого начала FRET был назван молекулярной линейкой из-за зависимости расстояния от масштаба биомакромолекул10.

Одним из особенно интересных приложений smFRET является использование информации о расстоянии, полученной из измерений smFRET, для вывода структурной информации11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Благодаря высокому временному разрешению smFRET положение мобильных частей белковой структуры может быть локализовано. Однако для извлечения количественной информации из данных smFRET во время измерения необходимо определить важные поправочные параметры о молекулах красителя24. С этими поправочными коэффициентами эффективность FRET E _FRET может быть рассчитана по формуле

,

, где I _A и I _D — интенсивности флуоресценции донорной и акцепторной молекул. соответственно (см. Рисунок 2 ).Β-фактор учитывает перекрестные помехи, утечку донорного излучения в акцепторный канал и рассчитывается как

, где I ‘ _A и I’ _D — интенсивности флуоресценции донора и молекула-акцептор после фотообесцвечивания молекулы-акцептора.

γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также разницу в квантовом выходе флуоресценции донорного и акцепторного красителей.Он рассчитывается по каждому индивидуальному временному графику с помощью

. Обратите внимание, что в этом описании не учитывается прямое возбуждение акцепторной молекулы, которое иногда становится важным и требует корректировки. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно возбуждать как донор, так и акцептор по чередующейся схеме25, чтобы различать фотофизические изменения и структурную динамику.

Для получения не только количественной эффективности smFRET, но и количественной структурной информации в 2008 году была введена система нанопозиционирования (NPS).Название было выбрано на основе его сходства со спутниковой системой глобального позиционирования (GPS). NPS — это гибридный метод, сочетающий данные smFRET и рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных положений красителя в биомакромолекулярных комплексах. Кристаллическая структура служит опорным кадром, а результаты smFRET используются для получения информации о расстоянии между неизвестным положением флуорофора ( антенна ) и положением, известным из кристаллической структуры ( сателлит ).В последовательных экспериментах измеряются расстояния между антенной и несколькими спутниками, и положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы анализа, основанной на оценке байесовских параметров. В результате вычисляется не только наиболее вероятное положение антенны, но и ее полное трехмерное распределение неопределенности, так называемое апостериорное, визуализируемое в достоверных объемах. Кроме того, NPS был расширен, чтобы обеспечить возможность анализа полных сетей smFRET27.

NPS использовался для решения ряда важных вопросов в эукариотической транскрипции, а именно пути восходящей ДНК, нематричной ДНК и возникающей мРНК в комплексе элонгации РНК-полимеразы II12,28, также демонстрируя эффект факторы инициации транскрипции26 и динамическая архитектура открытого промоторного комплекса29.Более того, NPS использовали для выяснения структуры открытого комплекса РНК-полимеразы архей 30 и, в частности, положения фактора инициации транскрипции TFE, который конкурентно связывается с тем же сайтом, что и фактор элонгации транскрипции Spt4 / 531.

С тех пор было опубликовано несколько структурных подходов на основе smFRET15,18,21,23. При сравнении различных структурных методов на основе smFRET становится ясно, что кажущаяся точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя.Следует отметить, что молекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

С этой целью был введен Fast-NPS32. Fast-NPS использует усовершенствованный алгоритм выборки, значительно сокращающий время вычислений. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнять структурный анализ, и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей красителя, которые будут описаны ниже. Самая консервативная модель, получившая название classic , предполагает, что краситель занимает только одну, но неизвестную позицию.В этом положении флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется его соответствующей (зависящей от времени) анизотропией флуоресценции. Ориентация конуса неизвестна, что приводит к большой погрешности при преобразовании измеренной эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель консервативна, поскольку она обеспечивает наименьшую точность по сравнению с другими моделями красителей. Только для очень коротких расстояний допущения, сделанные классической моделью, должны приводить к заметно неправильному определению местоположения.Для типичных значений smFRET правильная позиция всегда заключена в сравнительно большой достоверный объем.

Однако, поскольку желательна более высокая точность, важно разработать и испытать альтернативные модели красителей, которые могут помочь повысить точность. Если краситель вращается намного быстрее, чем время его собственной флуоресценции, можно применить так называемую модель iso . Здесь коэффициент ориентации κ ² (необходимый для расчета характеристического изотропного радиуса Ферстера

) установлен равным 2/3.В результате рассчитанные достоверные объемы почти на два порядка меньше, чем в классической модели32. В случае, если флуорофор находится в среде, которая обеспечивает не только быструю переориентацию, но и дополнительное быстрое движение во всем доступном объеме, следует использовать модель meanpos-iso . В этой модели краситель эффективно занимает только одно среднее положение, где пространственное усреднение учитывается путем преобразования полиномиального расстояния15. Эта модель применима, например, если (обычно гидрофобный) краситель прикреплен к гидрофильной области, e.г., ДНК. Применение модели meanpos-iso приводит к дальнейшему уменьшению размера достоверных объемов примерно в два раза. Однако краситель, связанный с белком, может обратимо связываться с несколькими гидрофобными участками в своем стерически доступном объеме (AV). Флуорофор, который мгновенно переключается между этими областями, но внутри одной области подвергается свободному вращению и быстрому локализованному движению, лучше всего описывается моделью var-meanpos-iso . Для аналогичной ситуации, в которой краситель не может свободно вращаться, применяется модель var-meanpos .Более подробную информацию об этих моделях можно найти в нашей недавней публикации32.

Эти модели обладают обширным репертуаром, специально предназначенным для учета различных сред, с которыми может столкнуться краситель, и их разумное применение оптимизирует точность его локализации. В Fast-NPS каждая молекула красителя, прикрепленная к определенному положению, может быть отнесена к отдельной модели, так что партнерам FRET разрешено иметь разные модели. Это обеспечивает безграничное моделирование, приближенное к природе. Однако важно проводить строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации моделей, по-прежнему согласуется с экспериментальными данными.Эти тесты включены в программное обеспечение Fast-NPS.

Чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным, требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, необходимо определить изотропные радиусы Фёрстера для каждой пары красителей (

). Следовательно, необходимо измерять квантовый выход (QY) донорного красителя, спектры излучения донорной флуоресценции и спектры поглощения акцептора. Эти измерения можно проводить в большом количестве, используя стандартный спектрометр и стандартный флуоресцентный спектрометр.Для каждой пары R ₀ затем вычисляется с помощью бесплатного программного обеспечения PhotochemCAD и может использоваться в анализе NPS. Более того, анизотропия флуоресценции (с временным разрешением) молекул красителя должна быть получена с использованием поляризационного (и временного) флуоресцентного спектрометра. Однако наиболее важными входными параметрами для Fast-NPS являются эффективности smFRET, измеренные на установке для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, такой как флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRFM).

Здесь мы представляем пошаговый протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS (, рис. 1, ).

Протокол

1. Предварительные условия и лабораторное оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка измерительной камеры изображена на Рисунок 3 . Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца), герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Измерительная камера устанавливается на специальный держатель образца.Размеры камеры для образцов и металлического держателя соответствуют стандартному предметному стеклу из кварцевого стекла для микроскопии (76 мм x 26 мм).

1. Вырежьте предметные стекла из кварцевого стекла с помощью алмазного сверла (0,75 мм) в положениях, указанных на Рисунок 4 . Конструкция слайдов из кварцевого стекла асимметрична, чтобы различать две стороны каждого слайда. ПРИМЕЧАНИЕ. Кварцевые предметные стекла можно использовать повторно после измерения до появления царапин на поверхности.

2. Для установки камер используйте индивидуальные металлические держатели образцов, как показано на Рисунок 5 .Держатели образцов содержат две резьбы (M4) для соединения впускной и выпускной трубок для проточной камеры. Кроме того, используйте резьбу (M3), чтобы установить камеру для образца на металлический держатель, а также резьбу (M3), чтобы закрепить держатель призмы на нижней половине металлического держателя.

3. Выполните измерения smFRET на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения призменного типа (TIRFM) (, рис. 6, ). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM включает три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донорных и акцепторных молекул красителя, а также синий лазер (491 нм. , твердотельный лазер с диодной накачкой) для обесцвечивания фоновых флуоресцентных примесей на камере для образца перед измерением smFRET.Три лазерных луча пространственно объединены и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Флуоресцентный свет собирается объективом с высокой апертурой, разделяется на донорный и акцепторный каналы с помощью дихроичного зеркала и проецируется на две камеры EM-CCD. Камера для образца прикреплена к микрометрическому столику, позволяющему перемещаться в направлениях x и y с помощью двух шаговых двигателей. Третий пьезодвигатель используется вместе с ИК-лазером и позиционно-чувствительным детектором для создания системы автоматической фокусировки, обеспечивающей оптимальную фокусировку на протяжении всего эксперимента.

   1. Используйте переменное лазерное возбуждение (ALEX), когда наблюдается динамика временных траекторий FRET ²⁵ . Такая динамика может быть вызвана либо конформационными изменениями внутри молекул, либо флуктуациями яркости акцептора и мерцанием акцептора. ПРИМЕЧАНИЕ: ALEX позволяет различать эти две возможные причины и предотвращает неправильную интерпретацию динамических траекторий FRET. Однако из соображений простоты протокольная часть ограничивается анализом фильмов, снятых без ALEX.Внимание: лазеры класса 3B используются в установке флуоресценции одиночных молекул. Перед запуском системы убедитесь, что приняты соответствующие меры безопасности при работе с лазером в соответствии с постановлениями местного правительства.

4. Выполните измерение поглощения, используемое для определения квантового выхода на спектрометре UV-VIS (см. Материалы и методы).

5. Выполните измерение спектра излучения донорной флуоресценции, спектра поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентном спектрометре (см. Материалы и методы).

6. Подготовьте камеры для проб в соответствии с опубликованными процедурами 33. В качестве альтернативы можно использовать процедуру, описанную в [34].

7. Пометьте исследуемые образцы парой молекул донорно-акцепторного красителя, подходящей для smFRET, и убедитесь, что на поверхности камеры для образцов имеется фрагмент биотина для иммобилизации. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы локализовать неизвестное положение красителя антенны с помощью программного обеспечения Fast-NPS, необходимы различные образцы конструкций. Каждая конструкция должна иметь одну метку в неизвестном положении окраски антенны и одну метку в спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры.Для получения точных результатов требуются по крайней мере три различных конструкции с красителями, прикрепленными к позиции антенны, и три различных позиции спутника. Измерения между антеннами, а также между спутниками также полезны для повышения точности, однако для этого требуется обмен молекулами красителя, который необходимо правильно ввести в анализ.

2. Установка проточных камер в специальный держатель

1. Протяните силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм, внешний диаметр 2,4 мм) в полые винты с выступом (M4) и обрежьте трубку с обоих концов прямо, оставив выступ 1 см с обеих сторон острым лезвием бритвы.Отрегулируйте выступ трубки примерно на 2 мм с одной стороны винта с выступом.

2. Установите проточную камеру в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в предметном стекле из кварцевого стекла совпадали с резьбой держателя образца. Осторожно затяните впускные и выпускные винты, чтобы убедиться, что вход и выход камеры для пробы по-прежнему проницаемы. Осторожно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение проточной камеры.

3. Обрезанная силиконовая трубка (0.58 мм ВД, 0,96 мм ВД) на куски длиной 20 см. Вставьте одну из частей во входной и выходной винт измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубопровод с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ. Собранные камеры для проб можно хранить при комнатной температуре до двух недель.

3. Измерение smFRET на микроскопе TIRF

1. Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца 500 мкл PBS. Постоянно предотвращайте попадание пузырьков воздуха в камеру для образцов, создавая каплю на конце впускной трубки перед переходом на другой буферный раствор.

2. Промойте камеру для образцов раствором 100 мкл нейтравидина (0,5 мг / мл в PBS) и инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.

3. Вымойте раствор нейтравидина 500 мкл PBS.

4. Навинтите металлический держатель призмы на камеру для образца.

5. Установите камеру для образца на микрометрический столик TIRF-микроскопа. Убедитесь, что камера для образцов установлена ​​горизонтально как можно прямо перед объективом, чтобы избежать расфокусировки во время процесса сканирования.

6. Запустите программное обеспечение для управления камерами EM-CCD и программное обеспечение для управления пьезодвигателями сцены.

7. Отрегулируйте фокус объектива микроскопа, глядя на отражение ИК-лазера.

8. Поместите призму (PS991, n = 1,52) поверх металлического держателя призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы убедиться, что лазерные лучи попадают в призму, затем используйте клей и инкубируйте с УФ-светом в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ. Установленную призму можно повторно использовать после очистки.

9. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Настройка сбора данных» и определите следующие параметры сбора данных: время интеграции 100 мс, 401 кадр / видеоролик (зеленая камера), 400 кадров / видеоролик (красная камера), коэффициент усиления электронного умножителя 225, предварительный — усиление 5x и скорость считывания 3 МГц при 14 битах.

10. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите желаемое имя для файлов измерений, e.грамм. , год-месяц-день. В настройках программы зайдите в райдер «Автосохранение», включите «Автосохранение» и выберите формат файла * .sif для получения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки как файл.

11. Включите функцию «Автоинкремент» (установите начальное значение на 1). Включите привязку оператора к имени файла. Используйте «ДОН» и «АСС» для донорного и акцепторного каналов соответственно. Выберите «_» в качестве разделителя.

12. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Видео», чтобы запустить прямое изображение с камеры и обесцветить фоновую флуоресценцию путем сканирования камеры для образца с использованием максимальной интенсивности лазера всех трех лазеров (вместе ≈ 3000 Вт / см ² для 10 с на поле зрения).

13. Выключите синий лазер. Уменьшите интенсивность зеленого лазера примерно до 200 Вт / см ² и примерно до 40 мВт / см ² для красного лазера, если используется переменное лазерное возбуждение (ALEX).

14. Разбавьте биотинилированный флуоресцентный образец до концентрации 50–100 пМ. Загрузите 100 мкл раствора. При связывании образец иммобилизируется на поверхности камеры. ПРИМЕЧАНИЕ. Следите за тем, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга.

15. При необходимости загрузите в камеру дополнительные 100 мкл пробы, в 2 раза более концентрированной.

16. Закройте впускной и выпускной трубопроводы измерительной камеры зажимами после завершения загрузки.

17. Выключите все лазеры и используйте пьезодвигатели для перемещения проточной камеры на два поля зрения дальше.

18. В программном обеспечении управления камерой щелкните «Take signal», чтобы начать запись видео и одновременно включить лазер.Убедитесь, что к концу пленки обесцвечивается более 80% молекул, регулируя мощность лазера.

19. Повторите шаги 3.17 и 3.18 для всей области предварительно обесцвеченной камеры для образца.

4. Получение карты трансформации («beadmap»)

1. Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1.1, 1.2 и 2.

2. Используйте флуоресцентные мультиспектральные шарики, покрытые авидином, которые показывают флуоресцентное излучение в донорный и акцепторный каналы.Вихревую смесь в течение 1 мин, затем разбавьте 50 мкл смеси в 50 мкл ddH ₂ О. Еще раз перемешайте на вортексе в течение 1 мин, обработайте ультразвуком 1-2 мин, затем встряхните еще 10 сек.

3. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (Раздел 3.5–3.10).

4. Загрузите 100 мкл (1 объем камеры) разбавленных 1: 2 флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 минут, чтобы флуоресцентные шарики связались с поверхностью.

5. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но измените длину видеоролика на 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера), а коэффициент усиления электронного умножителя на 10.

6. Установите для интенсивности зеленого лазера значение 20 Вт / см ² .

7. Сделайте один видеоролик в поле зрения примерно с 50-100 бусин.

5. Обработка и анализ данных smFRET

1. Используйте специально написанное программное обеспечение SM FRET для анализа диаграммы направленности (см. Материалы и методы) и полученных фильмов. Запустите программу viewPlot1.m.

2. Щелкните «Анализ» | «Анализ партии», снимите флажок «ALEX», если он не использовался.Для лучшей производительности выберите «высокий» порог нахождения пика. Нажимаем «ОК».

3. Выберите «НЕТ», когда вас спросят, анализировалась ли карта уже. Просмотрите папку, содержащую полученный beadmap, и выберите файл * .sif (дважды щелкнув по нему). В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Если диаграмма направленности уже была проанализирована в ходе предыдущего измерения, выберите здесь «ДА» и выберите сохраненную карту разбивки, перейдя в нужную папку и дважды щелкнув файл карты схемы * .map.Продолжите с шага 5.8.

4. Выберите два одиночных шарика, расположенных в противоположных углах поля зрения. Интенсивность пикселей имеет цветовую кодировку от темно-синего (низкая интенсивность) до темно-красного (высокая интенсивность).

5. Щелкните по центру первой бусинки. Если центр молекулы можно четко определить по цветовой кодировке, выберите «ДА» или нажмите «НЕТ» и выберите другую пару молекул.

6. Расположите перекрестие на пикселе, показывающем максимальную интенсивность, и нажмите «СОХРАНИТЬ».Повторите процесс со вторым каналом.

7. Щелкните по молекуле в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. ПРИМЕЧАНИЕ. Относительный сдвиг пикселей двух каналов отображается в командном окне, и карта преобразования автоматически сохраняется как файл * .map в папку, содержащую файл beadmap * .sif.

8. Чтобы загрузить фильмы-доноры и акцепторы (* .sif) для «пакетного анализа», перейдите в папку, выберите все фильмы, которые необходимо проанализировать, и нажмите «OK».В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетный анализ завершен, когда последняя дорожка, отображаемая в командном окне, начинается с «Завершенный анализ…». Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, в котором также указывается относительный сдвиг донорного и акцепторного каналов, определенный из карты трансформации.

9. Чтобы загрузить пакетные файлы фильмов, щелкните Файл | Загрузить. Снимите отметку с опции «ALEX», если она не использовалась. Установите гладкость на 10 и нажмите «ОК».Выберите папку, содержащую файлы * .ttr, и нажмите «выбрать все» и «ОК» в следующем контекстном меню.

10. Если отображаемая кривая имеет характерные фазы smFRET ( Рисунок 2 ), нажмите кнопку переключения «Не выбрано» и сначала выберите момент времени начала события FRET, перемещая линию с помощью курсора мыши и щелкнув левой кнопкой мыши. Затем выберите момент времени обесцвечивания молекулы-акцептора и, наконец, момент времени обесцвечивания молекулы-донора.

11. В следующем окне эффективность FRET отображается синим цветом. Чтобы выбрать кривую, нажмите кнопку «Да», в противном случае выберите «Нет». Чтобы повторно получить доступ к временной шкале, нажмите кнопку «Назад».

12. Повторяйте процедуру до последней молекулы фильма.

13. После анализа последней молекулы в фильме сохраните выбранные следы, нажав «Файл | Сохранить». Сохраните выбранные трассы в той же папке, что и файлы * .sif.

14. Повторите шаги 5.10-5,13 за все приобретенные фильмы.

15. Выполнить программу comb_fret_results.m . Выберите папку, содержащую файлы * .res и все файлы * .FRETonly_trace. Сохраните молекулярные файлы FRET и FRET как файлы MW.dat и FRW.dat соответственно. ПРИМЕЧАНИЕ. Файлы * .dat сохраняются как файлы ASCII. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого кадра FRET. Шестой столбец содержит скорректированную покадровую эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбец и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET.Третий столбец содержит молекулярную эффективность FRET.

6. Отображение данных smFRET в гистограммах

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы извлечь среднюю эффективность smFRET всех записанных данных smFRET, покадровые данные или данные по молекулам наносятся на гистограммы и анализируются с использованием гауссовских аппроксимаций для ( множественные) пики. Далее протокол использует коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение.

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Щелкните File | Import | multiple ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите «ОК». Подтвердите вариант ввода нажатием «ОК» без изменений.

2. Выберите третий столбец C (Y), содержащий исправленные значения эффективности FRET, щелкните столбец правой кнопкой мыши и выберите «График | Статистика | Гистограмма». В окне гистограммы дважды щелкните столбцы, отмените выбор «автоматическое разбиение» и выберите желаемый размер интервала, e.грамм. , 0,05. Также выберите начальное и конечное значения, , например, -0,025 и 1,025.

3. Выберите столбцы гистограммы, щелкнув их левой кнопкой мыши. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Перейти к рабочему листу корзины». Выберите столбец «Количество», щелкнув его левой кнопкой мыши, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «График | Столбец / столбец / круговая диаграмма | Столбец».

4. На столбчатой ​​диаграмме перейдите в диалоговое окно Анализ | Подгонка | Подгонка нелинейной кривой | Открыть. Выберите «Гауссиан» в разделе «Функция», затем перейдите к набору «Параметры».Отмените выбор автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите «Подогнать». ПРИМЕЧАНИЕ. Функция подгонки, а также детали подгонки теперь отображаются на столбчатой ​​диаграмме. Значение «xc» дает центр функции подбора, , то есть — средняя эффективность FRET, которая служит входным параметром для программного обеспечения NPS.

7. Измерение квантового выхода

1. Выполните определение квантового выхода относительным методом, аналогичным процедуре, описанной Würth et al. 35, используя в качестве стандарта родамин 101, растворенный в этаноле (QY = 91,5%).

2. Запишите спектры поглощения на спектрометре UV-VIS, используя объем 80 мкл в кювете для поглощения с длиной пути 1 см. Поглощение на длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции, должно быть ≤ 0,05.

3. Запишите спектры излучения на спектрометре с ламповой калибровкой, работающем в режиме счета фотонов. Выполните измерения с поляризаторами Глана-Томпсона в возбуждении (0 °) и эмиссии (54.7 °) (условия магического угла) с использованием спектральной ширины полосы около 5 нм и 2,5 нм для монохроматора возбуждения и излучения соответственно. Измерьте образцы после их переноса во флюоресцентную кювету с длиной пути 3 мм, следя за тем, чтобы скорость счета не превышала 10 ⁶ с ^-1 .

   1. Рассчитайте квантовый выход согласно

, где n и n _Std — показатели преломления растворителя образца и стандарта соответственно.f (λ) и f_Std (λ) — интенсивности флуоресценции образца и стандарта на длине волны λ. A (λ _от ) и A ^std (λ _от ) — это оптическая плотность образца и эталона на длине волны возбуждения, а Φ _std — квантовый выход стандарта.

8. Расчет изотропного радиуса Ферстера

1. Рассчитайте изотропный радиус Ферстера (

   ) на основе спектра излучения донорной молекулы, спектра поглощения молекулы акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления среды.Используйте бесплатную программу PhotochemCAD для расчета

   . Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение36.

9. Измерение анизотропии

1. Определите стационарную анизотропию флуоресценции по записям спектров флуоресценции с различными настройками поляризатора возбуждения / излучения (V / V, V / H, H / V, H / H) 36 .

2. Рассчитайте G-фактор, который корректирует артефакты поляризации прибора, для каждой длины волны из отношения

и используйте его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны:

, где I _xy указывает интенсивность для поляризации возбуждения x и поляризации излучения y .

1. Усредните значения по спектральному диапазону излучения для расчета стационарной анизотропии флуоресценции.

10. Установка программного обеспечения Fast-NPS

1. Загрузите UCSF Chimera с http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке.

2. Перейдите на сайт «Института биофизики» при Ульмском университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Загрузите текущую версию Fast-NPS и распакуйте ее в любую папку.Откройте подпапку «Распространяемый компонент» и установите распространяемый пакет Visual C ++, который подходит для системы.

11. Центрирование файла pdb

1. Откройте интересующие файлы pdb в Chimera. Выберите все атомы макромолекулярного комплекса и вычислите координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Оси / Плоскости / Центроиды | Определить центроид… | Хорошо).

2. Откройте журнал ответов (Избранное | Журнал ответов) и инструмент преобразования (Инструменты | Движение | Трансформировать координаты).Введите координаты центроида, показанного в журнале ответов, в текстовое поле «Сдвиг» окна преобразования координат и измените знак каждой координаты. Нажмите «Применить» и сохраните файл с помощью «Сохранить PDB» (Файл | Сохранить PDB).

12. Настройка приоритетных позиций

ПРИМЕЧАНИЕ. Все значения указаны в ангстремах.

1. Запустите язык технических вычислений и измените текущую папку на локальную папку Fast-NPS. Введите в командном окне: FastNPS.

2. Создайте новый файл вакансии в Менеджере проектов (Проект | Новый).

3. Установите предыдущую позицию (Инструменты | Модель красителя до).

4. В панели «Предыдущие основы» определите пространственное разрешение предыдущей позиции, введя ее значение (рекомендуется 2).

5. Исключите внутреннюю часть макромолекулы, установив флажок и нажав кнопку «загрузить PDB». Выберите и загрузите центрированный файл PDB, как описано в Разделе 11.

6. Укажите приблизительный диаметр (рекомендуется 13 Å, см. Обсуждение) красителя, указав его значение.

7. Введите расстояние скелетонизации, , т.е. расстояние, на которое молекула красителя может проникнуть в макромолекулу (рекомендуется 2 Å).

8. В панели «Максимальный предыдущий размер» введите минимальные и максимальные координаты предыдущей позиции (рекомендуется: x в [-150,150], y в [-150,150] и z в [-150,150]).

9. При определении сателлита активируйте флажок «присоединение через гибкий линкер» на панели «предыдущие основы» и введите в панель «линкер» координаты атома (в центрированном файле pdb), в котором находится молекула красителя. прилагается.Далее укажите длину и диаметр линкера, введя их значения (рекомендуются 13 Å и 4,5 Å, см. Обсуждение). В случае антенны пропустите этот пункт.

10. Нажать кнопку «рассчитать доступный объем».

11. Сохраните предыдущее положение и при необходимости экспортируйте его для целей визуализации с помощью такого программного обеспечения, как Chimera.

13. Определение сетевой геометрии

1. Откройте окно определения измерений (Режим | Редактировать геометрию).

2. Создайте новую молекулу красителя, нажав кнопку «Новый» в панели «Красители».

3. Задайте анизотропию флуоресценции (Раздел 9), введя значение и выбрав модель красителя в раскрывающемся меню «Модель красителя».

4. Нажмите кнопку «Загрузить», выберите соответствующую позицию и установите флажок активировать краситель. Повторите эту процедуру для всех красителей, , то есть для всех антенн, а также для всех спутников.

5. После создания всех красителей определите размеры.Создайте новое измерение, нажав «Создать» на панели «Измерения».

6. Выберите партнеров FRET в раскрывающихся меню «Dye1» и «Dye2» ниже.

7. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Ферстера этой пары красителей.

8. Наконец, отметьте флажок активации измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. ПРИМЕЧАНИЕ. Часто сеть становится все более сложной, так что пользователь может запутаться.Во избежание ошибок проверьте сеть визуально, нажав кнопку «Проверить сеть». На рисунке показаны активированные красители и измерения с помощью линий, соединяющих красители FRET.

14. Расчет

1. Откройте окно расчета (режим | Расчет).

2. Если каждому красителю в сети назначена определенная модель, выберите «Определено пользователем» и запустите расчет, нажав «Расчет». Чтобы использовать все красители в одной модели, выберите одну из пяти моделей (классическая, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso и var-meanpos) и продолжайте.ПРИМЕЧАНИЕ. В командном окне будет отображаться ход расчета. Fast-NPS сделает это во всплывающем сообщении, когда расчет будет завершен.

15. Визуализация результатов

1. Чтобы экспортировать достоверные объемы красителей, откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).

2. Экспортные плотности красителей:

   1. Экспортные красители по отдельности или все одновременно. Чтобы экспортировать отдельный краситель, выберите его на панели «Отображаемые красители» и нажмите «Экспорт плотности».Введите разрешение (рекомендуется 2) и выберите тип файла для экспорта. Справа отображается плотность и некоторые ее математические характеристики.

   2. Чтобы экспортировать все красители одновременно, нажмите «Пакетный экспорт».

3. Откройте получившиеся файлы плотности в Chimera.

16. Проверка согласованности выбранной комбинации моделей

1. Откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).Если на панели «Информация о расчетах» в текстовом поле «Согласованность» отображается значение ниже 90%, текущая модель не отражает в достаточной степени измеренную эффективность smFRET и, следовательно, является несовместимой.

2. В случае несоответствия нажмите кнопку «Детальная согласованность». Найдите измерения со значением ниже 90%. Если в этих измерениях преимущественно задействованы один или несколько красителей, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрите различные модели красителей для этих красителей и повторно запустите расчет Fast-NPS.

Репрезентативные результаты

Транскрипция — это первый шаг в экспрессии генов у всех организмов. У архей транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразой (РНКП). По сравнению с эукариотами, RNAP архей имеет поразительное структурное сходство со своими эукариотическими аналогами, но при этом имеет более простой механизм транскрипции. Таким образом, археи можно использовать в качестве модельной системы для изучения инициации транскрипции эукариот с помощью РНК-полимеразы II (Pol II). Недавно полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей была определена из одномолекулярных FRET и NPS.Данные анализа NPS были использованы для построения модели полного открытого промоторного комплекса архей, которая дает полезные сведения о механизме инициации транскрипции.

Чтобы выяснить эту структуру, была измерена эффективность smFRET между неизвестными молекулами антенного красителя, расположенными внутри открытого промоторного комплекса, и несколькими известными молекулами красителя-сателлита, которые были включены в пять ссылочных сайтов в RNAP, положения которых известны из кристаллографических структур (pdb-ID). : 2WAQ) 37.Антенные красители были прикреплены к любому из различных положений нематричной ДНК, TFB, TBP или TFE. Полная сеть, использованная в этом исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний.

Рисунок 7 изображает модель полного комплекса открытого промотора архей, построенного на основе анализа NPS. Он состоит из двухцепочечной промоторной ДНК (светлый и темно-синий), РНК-полимеразы (серый) и факторов инициации транскрипции TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый).Модель накладывается на результаты анализа NPS, достоверные объемы, которые были рассчитаны с использованием классической модели (A), модели iso (B), модели meanpos-iso (C), модели var-meanpos-iso. (D) и модель var-meanpos (E).

Рисунок 1: Рабочий процесс сбора и обработки параметров, необходимых для расчета Fast-NPS. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фиг. 2: Примерная временная диаграмма интенсивности флуоресценции для события smFRET. Интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерные фазы, а именно: I: smFRET, II: флуоресценция донора после фотообесцвечивания акцептора, III: фоновая флуоресценция после фотообесцвечивания донора. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на индивидуальный металлический держатель с держателями из акрилового стекла.Сэндвич-конструкция проточной камеры включает предметное стекло из кварцевого стекла (плавленого кварца) с двумя отверстиями для присоединения впускной и выпускной трубок, герметизирующую пленку и покровное стекло, закрывающее проточную камеру. Призма для освещения TIRF устанавливается на нижнюю половину проточной камеры. Полые винты с язычком обеспечивают вход и выход для проточной камеры. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подготовка предметного стекла из кварцевого стекла и герметизирующей пленки. Механический чертеж предметного стекла из кварцевого стекла с указанием положения отверстий (в миллиметрах). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Размеры алюминиевого держателя призмы, держателя акрилового стекла и алюминиевой монтажной рамы указаны в миллиметрах. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Схематическое изображение призменной установки TIRF, используемой для экспериментов smFRET. Сокращения для обозначения оптических компонентов: A — диафрагма; DM — дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, линза; М, зеркало; О, объективный; П — призма; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; Т, телескоп. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Результаты моделирования различных предположений модели. Все изображения показывают полимеразу РНК архей (pdb-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью промоторной ДНК (тДНК и нтДНК синим и голубым соответственно), TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый). ) в археологическом открытом комплексе 30.Надежные объемы накладываются на результаты моделирования NPS ( A ) классической модели, ( B ) iso-модели, ( C ) модели meanpos-iso, ( D ) var-meanpos- iso и ( E ) модель var-meanpos. Все объемы показаны с достоверностью 68%. Классическая сеть и сеть var-meanpos согласуются с данными smFRET. Напротив, сети, в которых для всех красителей выбрана модель iso, meanpos-iso или var-meanpos-iso, не соответствуют измеренным данным.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Мы представляем установку и экспериментальную процедуру для точного определения эффективности FRET между красителями, прикрепленными через гибкие линкеры к биомакромолекулам, то есть , нуклеиновым кислотам и / или белкам.

Для обеспечения точных измерений smFRET (Раздел 3) очень важно исключить воздух из проточной камеры в любой момент во время измерения. Кроме того, следите за тем, чтобы не перегружать проточную камеру флуорофорами.Флуорофоры должны быть четко разделены для обеспечения правильного анализа. Поскольку пары smFRET, которые не показывают обесцвечивание донора, должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения обесцвечиваются в конце фильма. Чтобы учесть неоднородности в образце, β-фактор и γ-фактор, корректирующие перекрестные помехи и относительную эффективность обнаружения донорного и акцепторного каналов, соответственно, рассчитываются для каждой пары FRET отдельно.

Настройки камеры (время интегрирования, коэффициент усиления электронного умножителя, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорость считывания, описанные в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, обеспечивающие наилучший компромисс между отношением сигнал / шум, динамическим диапазоном и временным разрешением. Их необходимо перенастроить для разных экспериментов или при использовании другого оборудования. Количество кадров должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить обесцвечивание большей части донорных молекул в течение времени наблюдения.

Для измерений на флуоресцентном спектрометре (разделы с 7 по 9) должен быть найден хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектральным разрешением записанных данных.С этой целью щели на пути возбуждения и излучения флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого инструмента и концентрации образца.

Кроме того, мы представляем метод анализа Fast-NPS для получения структурной информации о переходных или динамических макромолекулярных комплексах. NPS был применен для выявления пути нематричной цепи ДНК и положения факторов инициации транскрипции в открытом комплексе архейной РНК-полимеразы. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояний, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный недавно реализованным механизмом отбора проб (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. в стадии подготовки), сокращает время, необходимое для анализа этой сложной сети smFRET, примерно на 2 порядка по сравнению с исходным глобальным методом NPS27. Надежность алгоритма основана на сэмплере «Метрополис внутри Гиббса» в сочетании с параллельной схемой темперирования. Fast-NPS показывает точную воспроизводимость сетевых результатов и согласуется с результатами, опубликованными ранее30.

Было опубликовано несколько различных методов, нацеленных на вывод структурной информации из измерений smFRET11,12,13,14,15,16,17,18.Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель красителя. Таким образом, красители, которые не соответствуют предположениям, сделанным соответствующей моделью, не могут быть использованы или приводят к ложной структурной информации. Fast-NPS, напротив, позволяет подбирать для каждой молекулы красителя отдельную модель. Это помогает учесть различное конформационное поведение как самой молекулы красителя, так и линкера, используемого для ее прикрепления. Локальное молекулярное окружение молекулы красителя, а также ее физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящей.

Для анализируемой сети smFRET комплекса инициации архей изотропное предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению размера вероятных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим усреднением положения для всех молекул красителя медиана всех вероятных размеров объема (при 95%) уменьшается до менее 0,5 нм ³ . Однако эти задние молекулы красителя больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая на то, что сделанные предположения приводят к ложной структурной информации.Напротив, апостериорные уровни, определенные в классической модели, согласуются с определенной эффективностью smFRET.

Поскольку предположение об изотропном и / или динамическом усреднении положения для всех красителей приводит к несоответствиям, Fast-NPS позволяет использовать априорные молекулы красителя, в которых каждому красителю может быть назначена одна из пяти моделей. В каждой модели используется один и тот же доступный объем. Алгоритм расчета АВ красителя делает несколько предположений. Сначала пространственная форма флуорофора аппроксимируется сферой.Таким образом, следует использовать диаметр, учитывающий ширину, высоту и толщину флуорофора (раздел 12). Далее форма линкера аппроксимируется гибким стержнем. Значения, представленные в разделе 12, были вычислены для красителя Alexa 647, присоединенного через линкер 12-C. На сегодняшний день невозможно точно определить априори, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрию эксперимента, и поэтому все модели должны быть протестированы. Как правило, выбирают модель, которая дает наименьший возможный апостериорный размер, но при этом согласуется с данными.Чтобы проверить, согласуется ли выбор моделей с данными smFRET, мы вычисляем как апостериорную, так и вероятность. Согласованность означает, что более 90% образцов, собранных в апостериорной области, находятся в пределах 95% доверительного интервала правдоподобия.

Хотя верно, что чем ниже анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET также необходимо учитывать геометрическое расположение молекул красителя. Таким образом, хотя представление молекул красителя с низкой анизотропией флуоресценции с помощью изомодели является типичным первым выбором, тест на консистенцию предоставляет более прямые средства для выбора правильной модели красителя.Оптимальный выбор моделей красителей может привести к резкому увеличению точности локализации и в то же время сохранить согласованность сети с ее данными FRET.

Таким образом, Fast-NPS позволяет получать структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексах. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, это позволяет отслеживать очень гибкие или переходные комплексы, что значительно расширяет наше понимание механизмов сложных биологических процессов.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Б. Грюхманна за механические чертежи проточной камеры. Кроме того, мы хотим выразить нашу благодарность Максу Бекерсу и Флориану Дрекслеру за содержательные комментарии и обсуждения, касающиеся NPS и лежащего в основе механизма выборки.

Список литературы

• Cheng Y. Крио-ЭМ одиночных частиц с кристаллографическим разрешением. Клетка. 2015; 161: 450–457.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гарман Э. Ф. Разработки в области рентгеноструктурного определения структуры биологических макромолекул. Наука. 2014. 343 (6175): 1102–1108. [PubMed] [Google Scholar]
• Сали А. Итоги первого семинара рабочей группы по гибридным / интеграционным методам wwPDB. Состав. 2015; 23: 1156–1167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хопфнер К.П., Михаэлис Дж. Механизмы транслоказ нуклеиновых кислот: уроки структурной биологии и биофизики одиночных молекул.Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 87–95. [PubMed] [Google Scholar]
• Андо Т., Учихаши Т., Кодера Н. Высокоскоростной АСМ и приложения к биомолекулярным системам. Анну Рев Биофиз. 2013; 42: 393–414. [PubMed] [Google Scholar]
• Нойман К.К.С., Надь А. Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Йылдыз А. Миозин V ходит из рук в руки: визуализация одного флуорофора с помощью 1.5-нм локализация. Наука. 2003. 300 (5628): 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
• Джу К., Бальчи Х, Ишицука Ю., Бураначай С., Ха Т. Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии. Анну Рев Биохим. 2008. 77 (1): 51–76. [PubMed] [Google Scholar]
• Hohlbein J, Craggs TD, Cordes T. Возбуждение с помощью переменного лазера: FRET одной молекулы и не только. Chem Soc Rev.2014; 43 (4): 1156–1171. [PubMed] [Google Scholar]
• Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1967; 58 (2): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rasnik I, Myong S, Cheng W., Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера Helicase Rep E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением : Одномолекулярные исследования флуоресцентно меченых ферментов. J Mol Biol. 2004. 336 (2): 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
• Андрека Дж. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc Natl Acad Sci U S A.2008. 105 (1): 135–140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. FRETsg: Построение модели биомолекулярной структуры на основе нескольких экспериментов FRET. Comput Phys Commun. 2004. 158 (3): 150–157. [Google Scholar]
• Маргиттай М. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции показывает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (26): 15516–15521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Калинин С.Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Нат методы. 2012. 9 (12): 1218–1227. [PubMed] [Google Scholar]
• Choi J. N6-метиладенозин в мРНК нарушает отбор тРНК и динамику удлинения трансляции. Nat Struct Mol Biol. 2015; 23 (август 2015): 110–115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Свенссон Б. Трилатерация зондов, связанных с функциональными рианодиновыми рецепторами, на основе FRET. Биофиз Дж. 2014; 107 (9): 2037–2048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Стивенсон Дж. Д., Кеньон Дж. К., Симмонс М. Ф., Lever AML.Характеристика трехмерной структуры РНК с помощью одиночной молекулы FRET. Методы. 2016. С. 1–11.
• Ли Н.К. Точные измерения FRET в отдельных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88 (4): 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McCann JJ, Choi UB, Zheng L, Weninger K, Bowen ME. Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул. Биофиз Дж. 2010; 99 (3): 961–970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Brunger AT, Strop P, Vrljic M, Chu S, Weninger KR.Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct Biol. 2011; 173: 497–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schuler B. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J нанобоитехнология. 2013; 11 (Приложение 1): 1–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Choi UB. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat Struct Mol Biol. 2010. 17 (3): 318–324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Дейл Р.Э., Эйзингер Дж., Блумберг В.Е.Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Биофиз Дж. 1979; 26 (2): 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kapanidis AN. Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005. 38 (7): 523–533. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A. Система нанопозиционирования для анализа структуры макромолекул. Нат методы. 2008. 5 (11): 965–971. [PubMed] [Google Scholar]
• Muschielok A, Michaelis J.Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys Chem B. 2011; 115 (41): 11927–11937. [PubMed] [Google Scholar]
• Andrecka J. Система нано-позиционирования выявляет направление восходящей и неэлементной ДНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II. Nucleic Acids Res. 2009. 37 (17): 5803–5809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Трейтлейн Б. Динамическая архитектура комплекса открытого промотора с минимальной РНК-полимеразой II.Mol Cell. 2012. 46 (2): 136–146. [PubMed] [Google Scholar]
• Надь Дж. Полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей из одной молекулы. FRET и NPS. Nat Commun. 2015; 6: 6161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Grohmann D, et al. Фактор инициации TFE и фактор элонгации Spt4 / 5 конкурируют за зажим RNAP во время инициации и удлинения транскрипции. Mol Cell. 2011. 43 (2): 263–274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Beckers M, Drechsler F, Eilert T., Nagy J, Michaelis J.Количественная структурная информация из FRET одной молекулы. Фарадей Обсуди. 2015; 184: 117–129. [PubMed] [Google Scholar]
• Беннинк М.Л. Разворачивание отдельных нуклеосом путем растягивания отдельных волокон хроматина с помощью оптического пинцета. Nat Struct Biol. 2001. 8 (7): 606–610. [PubMed] [Google Scholar]
• Chandradoss SD. Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков. J Vis Exp. 2014. с. e50549. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
• Würth C, Grabolle M, Pauli J, Spieles M, Resch-Genger U.Относительное и абсолютное определение квантовых выходов флуоресценции прозрачных образцов. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1535–1550. [PubMed] [Google Scholar]
• Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. [Google Scholar]
• Корхин Ю. Эволюция сложных РНК-полимераз: Полная структура РНК-полимеразы архей. PLoS Biol. 2009; 7 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз

Технология FRET может предоставить ценную информацию о динамике и характере активности фермента. Ранние зонды FRET для активации каспазы использовали гибридный белок, то есть белок повышенной голубой флуоресценции (ECFP) в качестве донора FRET, и белок повышенной желтой флуоресценции (EYFP) в качестве акцептора FRET, связанный пептидами, содержащими расщепление каспазы-3. последовательность, DEVD (Luo, Yu, Pu, & Chang, 2001; Rehm et al., 2002; Tyas et al., 2000). Наиболее важной особенностью зонда FRET является специфичность к молекуле-мишени. Коэффициент молярной экстинкции акцепторного белка является важным фактором для определения эффективности FRET; однако молярный коэффициент экстинкции EYFP, обычного флуоресцентного белка в акцепторах FRET, демонстрирует высокую чувствительность к протонам и ионам хлора, особенно в физиологических условиях (Jayaraman, Haggie, Wachter, Remington, & Verkman, 2000; Llopis, McCaffery, Miyawaki, Farquhar, & Tsien, 1998).В нескольких сообщениях предполагалось, что закисление происходит во время апоптоза (Matsuyama, Llopis, Deveraux, Tsien, & Reed, 2000; Perez-Sala, Collado-Escobar, & Mollinedo, 1995; Vincent, TenBroeke, & Maiese, 1999) и что хлорид / бикарбонатный обменник участвует в апоптотических событиях (Araki et al., 2002; Maeno, Ishizaki, Kanaseki, Hazama, & Okada, 2000). Поскольку изменение концентрации хлоридов также происходит в нейронах, крайне важно использовать нечувствительный к хлоридам индикатор для мониторинга активации каспаз в нейронах.Из-за этих особенностей исследователи должны быть осторожны в использовании EYFP в качестве акцептора FRET, особенно для визуализации апоптоза in vivo .

Чтобы преодолеть эти ограничения, Венера использовалась в качестве акцептора FRET в зонде SCAT3 (рис. 12.1; Takemoto et al., 2003), потому что он показывает низкую чувствительность к протонам и ионам хлора (Nagai et al., 2002). Действительно, SCAT3 показал высокую стабильность in vitro и в живых клетках по сравнению с ранее описанным зондом ECFP-EYFP (Takemoto et al., 2003). Разработка индикаторов SCAT3 позволила исследователям отслеживать активацию каспаз в живых клетках и in vivo в режиме реального времени (Campbell & Okamoto, 2013; Koto, Kuranaga, & Miura, 2009; Kuranaga et al., 2011; Nakajima, Kuranaga, Сугимура, Мияваки и Миура, 2011; Огуши и др., 2010; Такемото и др., 2007; Ямагути и др., 2011).

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Ориентационно-зависимая система FRET выявляет различия в структурах и гибкости дуплексов ДНК с разрывом и разрывом | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Различия в структурах и гибкости дуплексов ДНК играют важную роль в распознавании ДНК-связывающими белками.Здесь мы описываем новый метод структурного анализа дуплексов ДНК с использованием ориентационной зависимости Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET). Сначала мы проанализировали канонический дуплекс B-формы и получили правильные структурные параметры. Экспериментальные значения эффективности FRET превосходно согласуются со значениями, теоретически рассчитанными с использованием определенных параметров. Затем мы исследовали дуплексы ДНК с разрывом и разрывом, которые являются ключевыми промежуточными звеньями в системах репарации ДНК. Было успешно выявлено влияние размера зазора на конструкции и гибкость.Поскольку наш метод прост и чувствителен, его можно широко использовать для анализа структур ДНК, содержащих повреждения и неприродные молекулы.

ВВЕДЕНИЕ

Структурные аномалии в двойных спиральных структурах ДНК играют важную роль в биологических процессах, позволяя, например, ферментам репарации ДНК находить поврежденные участки среди огромного количества интактных пар оснований. Недавние исследования показали, что ДНК-связывающие белки могут распознавать различия в структуре и гибкости дуплексов ДНК (1,2).Рентгеновская кристаллография и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) — мощные инструменты для анализа структур ДНК, но эти методы требуют большого количества образцов и отнимают много времени. Кроме того, обнаруженные рентгеновские кристаллические структуры могут не отражать структуры, обнаруженные в биологической среде. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — универсальный инструмент для структурного анализа нуклеиновых кислот, поскольку его эффективность сильно зависит от относительного расстояния и ориентации между донором и акцептором (3-13).В большинстве исследований ДНК на основе FRET анализировалась только зависимость от расстояния, поскольку ориентацию красителя трудно контролировать, хотя нескольким группам удалось наблюдать зависимость от ориентации с помощью каркасов ДНК (14-18). Ранее мы сообщали о новой системе FRET, в которой донор и акцептор включены в ДНК через линкеры d-треонинола (19). Используя каркас d-треонинола, различные красители были включены в ДНК в фиксированных ориентациях (20). Наблюдаемые эффективности FRET показали ориентационную зависимость, которая согласовывалась с теоретическими значениями, рассчитанными на основе заявленных параметров для дуплекса B-формы, хотя разница все еще оставалась из-за изгиба, вызванного последовательностями A-тракта.Здесь мы применили эту систему FRET для анализа двойных спиральных структур ДНК. В отличие от предыдущего исследования, мы определили структурные параметры различных структур ДНК из экспериментально определенной эффективности FRET. Сначала мы проанализировали каноническую двойную спираль B-формы с помощью зависимой от ориентации FRET, а затем оценили дуплексы ДНК с разрывом и разрывом, которые являются ключевыми промежуточными продуктами в системах репарации ДНК (21,22). Не только структуры, но и гибкость ДНК в растворе были выявлены с помощью ориентационно-зависимого FRET.Насколько нам известно, различия между структурами и гибкостью дуплексов с зазорами и зазорами выявлены впервые.

Последовательности олигонуклеотидов, используемых в этом исследовании, показаны на рисунке 1. Пирен и перилен были включены в ДНК через d-треонинол в качестве донора и акцептора, соответственно. Было трудно контролировать ориентацию красителя, потому что красители обычно вводились в концевые или внеспиральные позиции ДНК. Напротив, молекулы могут интеркалировать между парами оснований, когда они вводятся в средние положения ДНК через d-треонинол (23).Следовательно, их ориентацию можно строго контролировать посредством взаимодействия стэкинга с соседними парами оснований. Никакие базовые сайты не были включены в противоположные позиции красителей, потому что мы обнаружили, что дополнительное включение красителей не искажает структуры ДНК. Мы варьировали количество пар оснований между донором пирена и акцептором перилена и измеряли эффективность FRET. График FRET эффективности в зависимости от количества пар оснований затем соответствовал структурным параметрам, полученным на основе цилиндрической модели дуплекса B-формы.У нашего метода есть несколько преимуществ; (i) подробные структурные параметры в растворе могут быть легко получены с использованием не только зависимости от расстояния, но и ориентационной зависимости FRET. (ii) Так как ориентация строго контролируется в нашей системе FRET, экспериментальные значения эффективности FRET показали отличное согласие с теоретически рассчитанными значениями ( см. ниже ). Следовательно, даже изгиб и гибкость дуплекса ДНК можно оценить, отслеживая отклонения от модели цилиндра.(iii) Пары красителей с относительно длинным радиусом Фёрстера могут использоваться с нашим методом, чтобы можно было анализировать большие структуры ДНК.

Рисунок 1.

( A ) Химическая структура донора и акцептора. ( B ) Последовательности олигонуклеотидов, использованные в этом исследовании. Также показаны схематические изображения канонических дуплексов и дуплексов с разрывами / промежутками.

Рисунок 1.

( A ) Химическая структура донора и акцептора. ( B ) Последовательности олигонуклеотидов, использованные в этом исследовании.Также показаны схематические изображения канонических дуплексов и дуплексов с разрывами / промежутками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Олигонуклеотиды

Все обычные фосфорамидитные мономеры, колонки из стекла с контролируемыми порами (CPG), реагенты для синтеза ДНК и картриджи Poly-Pak II были приобретены у Glen Research. Другие реагенты для синтеза мономеров фосфорамидита были закуплены у Tokyo Chemical Industry, Wako and Aldrich. Нативные олигодезоксирибонуклеотиды (ODN) были приобретены в Integrated DNA Technologies.

ОДН, конъюгированные с красителем, были синтезированы на автоматическом синтезаторе ДНК (H-8-SE, Gene World), как мы сообщали ранее (24,25). ODN очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали с помощью MALDI-TOF MS (Autoflex II, Bruker Daltonics) и ВЭЖХ.

Данные MALDI-TOFMS для модифицированной ДНК были следующими: RnP1: Obsd. 10220 (Вычислено для [RnP1 + H ⁺ ]: 10220). RnP2: Obsd. 10219 (Вычислено для [RnP2 + H ⁺ ]: 10220). RnP3: Obsd. 10220 (Вычислено для [RnP3 + H ⁺ ]: 10220).RnP4: Obsd. 10220 (Вычислено для [RnP4 + H ⁺ ]: 10220). cRnE1: Obsd. 10257 (Вычислено для [cRnE1 + H ⁺ ]: 10257). cRnE2: обср. 10257 (Вычислено для [cRnE2 + H ⁺ ]: 10257). cRnE3: Obsd. 10257 (Вычислено для [cRnE3 + H ⁺ ]: 10257). cRnE4: обср. 10257 (Вычислено для [cRnE4 + H ⁺ ]: 10257). AtP1: ​​Obsd. 10297 (вычислено для [AtP1 + H ⁺ ]: 10300). AtP2: Obsd. 10300 (Вычислено для [AtP2 + H ⁺ ]: 10300). AtP3: Obsd. 10298 (вычислено для [AtP3 + H ⁺ ]: 10300).AtP4: Obsd. 10299 (Вычислено для [AtP4 + H ⁺ ]: 10300). AtP5: Obsd. 10300 (Вычислено для [AtP5 + H ⁺ ]: 10300). cAtE1: Obsd. 10168 (рассчитано для [cAtE1 + H ⁺ ]: 10170). cAtE2: Obsd. 10169 (рассчитано для [cAtE2 + H ⁺ ]: 10170). cAtE3: Obsd. 10169 (рассчитано для [cAtE3 + H ⁺ ]: 10170). cRnE1s: обср. 3184 (Вычислено для [cRnE1s + H ⁺ ]: 3184). cRnE2s: обср. 3487 (Вычислено для [cRnE2s + H ⁺ ]: 3488). cRnE3s: Obsd. 3816 (Вычислено для [cRnE3s + H ⁺ ]: 3817).cRnE4s: обср. 4130 (Вычислено для [cRnE4s + H ⁺ ]: 4130).

Спектроскопические измерения

Спектры флуоресценции

измерены на моделях JASCO FP-6500 и FP-8500. Длина волны возбуждения 345 нм. Ширина полосы составляет 3 нм (FP-6500) или 2,5 нм (FP-8500) для возбуждения и излучения. Перед измерением образцы растворов, содержащих дуплекс ДНК, нагревали до 80 ° C, затем медленно охлаждали до 20 или 0 ° C со скоростью 2,5 ° C мин. ^-1 . Растворы образцов содержали 100 мМ NaCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7.0 и 0,2 мкМ донорной цепи (RnP1-4 или AtP1-5) и 0,4 мкМ акцепторной цепи (cRnE1-4 или cAtE1-3). Для анализа дуплексов с разрывом и разрывом использовали 0,2 мкМ донорной цепи (RnP1-4), 0,4 мкМ акцепторной цепи (cRnE1s-4s) и 0,6 мкМ Nt23-17.

Измерение температуры плавления

Кривые плавления были измерены с помощью UV-1800 (Shimadzu) путем мониторинга поглощения при 260 нм в зависимости от температуры. Для дуплекса с зазубринами или зазорами кривую плавления получали на приборе JASCO модели FP-6500 путем измерения интенсивности излучения при 500 нм при возбуждении 345 нм.Температуру плавления ( T _м ) определяли по максимуму в первой производной кривой плавления. Кривые нагрева и охлаждения были измерены, и расчетное значение T _м с оказалось в пределах 1,0 ° C. Изменение температуры составляло 0,5 ° C мин. ^-1 для поглощения или 1,0 ° C мин. ^-1 для излучения. Растворы образцов для анализов плавления по оптической плотности содержали 100 мМ NaCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7, 1,0 мкМ каждая ДНК.Растворы образцов для анализа плавления из эмиссии содержали 100 мМ NaCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7, 0,2 мкМ донорную цепь (RnP1-4), 0,4 мкМ акцепторную цепь (cRnE1s-4s) и 0,6 мкМ Nt23-17.

Расчет эффективности FRET

Эффективность FRET (Φ _T ) была экспериментально определена по уменьшению эмиссии доноров:

\ begin {уравнение *} {\ Phi _T} = 1 — {I_ {DA}} / {I_D} \ end {уравнение *}

где I _DA — интенсивность излучения дуплекса, содержащего донор и акцептор, при 405 нм, а I _D — это интенсивность излучения дуплекса только для донора при 405 нм.2} \ end {уравнение *}

, где R — расстояние между донором и акцептором, а R ₀ — радиус Ферстера (расстояние, при котором Φ _T = 0,5). Дж (λ) представляет собой интеграл спектрального перекрытия между испусканием донора и поглощением акцептора на λ нм. n — показатель преломления, который обычно принимается равным 1,4 для биомолекул (26), а Φ _D — это квантовый выход донора. Фактор ориентации, κ ² , был рассчитан из приведенного выше уравнения, где θ _T — угол между переходными диполями донора и акцептора, а θ _D и θ _A — углы между этими диполями и вектором разделения.2} {\ theta _T} \ end {уравнение *}

Используя эти уравнения, можно рассчитать эффективность FRET по расстоянию ( R ) и углу ( θ _T ) между красителями.

Для анализа двойных спиральных структур мы использовали три переменных: подъем на пару оснований ( a в Å), угол на пару оснований ( b дюймов) и угол между красителями и фланкирующими парами оснований ( c дюймов). °). Следовательно, расстояние и угол могут быть выражены с помощью числа пар оснований ( n ) между донором и акцептором следующим образом:

\ begin {уравнение *} R = a \ times (n + 1) \ end {уравнение *}

\ begin {уравнение *} {\ theta _T} = b \ times (n — 1) + c \ end {уравнение *}

Эти три переменные были определены путем подбора экспериментальных значений эффективности FRET со значениями, рассчитанными по этим уравнениям. .Значения были определены методом наименьших квадратов с использованием инструмента Solver в Microsoft Excel. Ошибки оценивались по стандартным ошибкам, вычисленным с помощью KaleidaGraph (программа Synergy).

Для анализа дуплекса с зазубринами мы предположили равновесие между составными и разложенными структурами. В многослойной структуре предполагалось, что структура такая же, как у дуплекса без зазубрины. В несложенном дуплексе предполагалась рандомизированная ориентация ( κ ² = 2/3).Процент составленных и разложенных структур оценивался методом наименьших квадратов с использованием инструмента «Решатель» в Excel.

Для анализа дуплексов с промежутками 3 нт мы предположили, что ориентация не была фиксированной и, таким образом, фактор ориентации ( κ ² ) составлял 2/3. Расстояние ( R ) было рассчитано по следующему уравнению:

\ begin {уравнение *} R = d \ times (n — 2) + e \ end {уравнение *}

, где d (в Å) — рост на пару оснований в дуплексной части 3-нуклеотидной структуры.А e (в Å) — это длина 3-н. Зазора (то есть расстояние между дуплексными областями).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сначала мы проанализировали структуру канонического дуплекса, чтобы проверить точность нашего метода. Мы синтезировали четыре цепи, связывающие пирен (RnP1-4), и четыре дополнительные цепи, связывающие перилен (cRnE1-4), показанные на рисунке 1. Две пары оснований, фланкирующие пирен, были идентичны во всех дуплексах, и это привело к квантовым выходам пирена, которые находятся в пределах экспериментальных ошибка для всех дуплексов (дополнительный рисунок S1).Число пар оснований между двумя красителями можно варьировать от 4 до 19 п.н., комбинируя эти цепи соответствующим образом (дополнительная таблица S1). Мы измерили флуоресцентные эмиссионные спектры дуплексов (дополнительный рисунок S2) и рассчитали эффективность FRET по уменьшению эмиссии доноров. Эффективность FRET между красителями в канонических дуплексах как функция расстояния в парах оснований не монотонна, а периодична, демонстрируя ориентационную зависимость FRET (Рисунок 2B). Для расчета эффективности FRET использовались три переменные: подъем, вращение и сумма углов между красителями и соседними парами оснований (рис. 2А).Параметры определялись методом наименьших квадратов. Теоретически рассчитанные значения эффективности FRET с использованием этих параметров показаны линией на рисунке 2B.

Рисунок 2.

Анализ структурных параметров канонического дуплекса ДНК. ( A ) Уравнения, используемые для расчета расстояния и угла между красителями. ( B ) График FRET канонического дуплекса ДНК. По оси абсцисс отложено количество пар оснований между донором и акцептором. Экспериментальные данные показаны кружками.Линия — это эффективности FRET, теоретически рассчитанные с использованием определенных параметров, показанных на вставке.

Рисунок 2.

Анализ структурных параметров канонического дуплекса ДНК. ( A ) Уравнения, используемые для расчета расстояния и угла между красителями. ( B ) График FRET канонического дуплекса ДНК. По оси абсцисс отложено количество пар оснований между донором и акцептором. Экспериментальные данные показаны кружками. Линия — это эффективности FRET, теоретически рассчитанные с использованием определенных параметров, показанных на вставке.

Следует отметить, что большая ошибка от теоретически рассчитанного значения наблюдалась на уровне 8 б.п. Хотя мы рассчитали эффективность FRET, предположив, что относительный угол между красителями имеет гауссовское распределение, все же наблюдались большие различия при разделении пар оснований, отличных от 8 пар оснований (дополнительный рисунок S3). Таким образом, мы пришли к выводу, что разница в 8 п.н. не была вызвана неполной фиксацией ориентации красителя. На основании теоретического анализа было сообщено, что приближение точечного диполя не работает, когда расстояние между молекулами невелико.Следовательно, фактор ориентации не может быть равен нулю, даже если молекулы перпендикулярны (27). Мы полагаем, что большая разница между экспериментально определенной эффективностью FRET при 8 п.н. и эффективностью, ожидаемой на основе цилиндрической модели, связана с ненулевым фактором ориентации, вызванным неудачей дипольного приближения. По этим причинам мы не использовали эффективность FRET на уровне 8 п.н. для определения структурных параметров. Для других разделений пар оснований экспериментальные значения хорошо согласуются с кривой, построенной на основе модели B-формы ДНК (рис. 2B), ясно демонстрируя, что ориентация красителей строго контролируется в нашей системе.Рост на пару оснований, рассчитанный на основе данных FRET, составил 3,6 ± 0,03 Å, а вращение на пару оснований было 32 ± 1 °, почти идентично таковому для дуплекса ДНК канонической B-формы (3,4 Å и 34 °, соответственно). Разницу подъема можно объяснить показателем преломления. Между ростом и показателем преломления существует обратно пропорциональная зависимость. Если показатель преломления установлен на 1,5, рост на пару оснований уменьшается до 3,4 Å. Разница в росте на пару оснований указывает на то, что показатель преломления естественных пар оснований выше 1.4. Напротив, угол поворота не зависит от физических параметров. Рентгеновская кристаллография показала, что угол поворота сильно зависит от последовательности, хотя средний угол обычно составляет 34–36 ° (28–30). Следовательно, отличие от типичного угла поворота может быть связано с его сильной зависимостью от последовательности. Насколько нам известно, ранее не сообщалось о системе FRET, зависящей от ориентации, демонстрирующей такое превосходное согласие с теорией на больших расстояниях.

Мы также проанализировали дуплекс, содержащий A-тракт, используя аналогичную систему (дополнительный рисунок S4).В случае дуплекса A-тракта наблюдались большие различия между экспериментальной эффективностью FRET и расчетными значениями, основанными на модели цилиндра B-формы. В частности, наблюдаемая эффективность на больших расстояниях была выше ожидаемых значений. Как сообщалось ранее, A-тракт индуцирует изгиб ДНК (31-33), так что фактическое расстояние между донором и акцептором короче, чем ожидалось из модели цилиндра. Хотя требуется более подробное исследование, чтобы прояснить детальную структуру A-тракта, с помощью нашей системы FRET было четко обнаружено изгибание.

Впоследствии мы проанализировали дуплексы ДНК с зазубринами и разрывами, используя нашу систему FRET. Дуплексы с разрывом и разрывом получали путем гибридизации коротких цепей, содержащих акцептор (cRnE1s-4s) и цепей, содержащих донор (RnP1-4), с более длинной ДНК (Nt17-23), как показано на рисунке 1. Эффективность FRET дуплексов с разрывом показала немонотонная зависимость от количества пар оснований между донорными и акцепторными красителями (рис. 3). Это указывало на то, что относительная ориентация донора и акцептора не усреднялась.Положения минимумов и максимумов на графике FRET были такими же, как у канонического дуплекса, показывая, что, несмотря на разрыв, дуплекс сохраняет каноническую геометрию дуплекса B-формы. Однако дуплекс с разрывами имел более низкий максимум и более высокий минимум по сравнению с каноническим дуплексом. Эта ослабленная ориентационная зависимость убедительно указывает на то, что зарубка придает гибкость. Более высокая гибкость разорванного дуплекса наблюдалась также при использовании других методик, таких как гель-электрофорез и ЯМР (34–37).Мы проанализировали конформационную гибкость дуплекса с разрывами, просто предположив равновесие между сложенными и неупакованными дуплексными конформациями (36,38). Наши расчеты показали, что, когда 26% дуплексов приняли разнесенную структуру в зазубрине, расчетные значения эффективности показали лучшее согласие с экспериментальными значениями. Это приблизительный расчет, поскольку трудно оценить точные факторы ориентации разнесенной конструкции. Однако мы считаем, что это предположение полезно для оценки относительной гибкости различных структур ДНК.Из этих результатов мы пришли к выводу, что разорванный дуплекс имеет более высокую конформационную гибкость, чем канонический дуплекс. Рентгеновская кристаллография показала, что дуплекс с разрывами принимает дуплекс B-формы (39). Наше исследование также показывает, что разорванный дуплекс принимает конформацию B-формы в растворе и может обеспечить меру повышенной гибкости разорванного дуплекса ДНК по сравнению с интактным дуплексом.

Рисунок 3.

График FRET разрубленных (синий) и канонических (красный) дуплексов.Кривая синей линии была построена исходя из предположения, что 26% дуплексов имеют разнесенную структуру.

Рисунок 3.

График FRET для дуплексов с разрывами (синий) и канонических (красный). Кривая синей линии была построена исходя из предположения, что 26% дуплексов имеют разнесенную структуру.

Затем мы исследовали структуру дуплексов с разрывом. График FRET дуплекса с одним нуклеотидным разрывом показан на рисунке 4A. Минимумы на графиках FRET были разными в дуплексах с разрывами и дуплексах с промежутками в 1 нт; минимум наблюдался на 8 п.н. с дуплексом с разрывом и на 6 нуклеотидах с дуплексом с разрывом в 1 нуклеотид.Этот сдвиг убедительно указывал на то, что введение зазора изменило ориентацию между двумя красителями. Поскольку ориентационная зависимость эффективности FRET наблюдалась для дуплексов с зазором в 1 нт, две области дуплекса, разделенные зазором в 1 нт, складываются в стопку. Разница в ориентации красителя по сравнению с дуплексом с трещинами, вероятно, связана с вращением и / или изгибом в зазоре. Фактически, анализ ЯМР показал, что существует две конформации с 1-нуклеотидным дуплексом; один близок к B-ДНК, а другой изогнут (37).Интересно, что снижение эффективности FRET наблюдалось на 6, 10 и 14 н. В случае дуплекса с разрывом в 1 н. Поскольку мы использовали четыре типа последовательностей с разрывом, как показано в дополнительной таблице S4, этот результат показал, что структура дуплекса ДНК с разрывом в 1 нт зависит от его последовательности.

Рис. 4.

( A ) FRET-графики дуплекса с зазубринами и дуплекса с зазором в 1 нт. Красной линией показана аппроксимирующая кривая, используемая для определения структурных параметров канонического дуплекса.Пунктирной линией показана теоретическая кривая, предполагающая усредненную ориентацию красителей в каноническом дуплексе. ( B ) Графики FRET дуплексов с промежутками в 2 и 3 н. Кривая оранжевого цвета рассчитывалась исходя из предположения, что эффективность FRET дуплексов с промежутками 3 нт зависит не от ориентации, а от расстояния между красителями. Определенные структурные параметры дуплекса с зазором 3 н. При 20 ° C показаны на вставке. См. Дополнительный рисунок S7 для получения информации о структурных параметрах, определенных на основе эффективности FRET при 0 ° C.

Рисунок 4.

( A ) Графики FRET дуплекса с зазубринами и дуплекса с зазором в 1 нт. Красной линией показана аппроксимирующая кривая, используемая для определения структурных параметров канонического дуплекса. Пунктирной линией показана теоретическая кривая, предполагающая усредненную ориентацию красителей в каноническом дуплексе. ( B ) Графики FRET дуплексов с промежутками в 2 и 3 н. Кривая оранжевого цвета рассчитывалась исходя из предположения, что эффективность FRET дуплексов с промежутками 3 нт зависит не от ориентации, а от расстояния между красителями. Определенные структурные параметры дуплекса с зазором 3 н. При 20 ° C показаны на вставке.См. Дополнительный рисунок S7 для получения информации о структурных параметрах, определенных на основе эффективности FRET при 0 ° C.

График FRET структуры с зазором 2 нт показал меньшую ориентационную зависимость. Эффективность FRET монотонно снижалась по мере увеличения количества нуклеотидов между красителями (рис. 4В, зеленые кружки). Таким образом, стэкинг-взаимодействия между двумя дуплексами очень слабые, когда имеется промежуток в 2 н. Когда зазор составлял 3 нт, почти не наблюдалось ориентационной зависимости (рис. 4В, оранжевые кружки), что указывает на небольшую укладку и усредненную ориентацию красителя.Сходные результаты были получены при использовании гель-электрофореза, когда электрофоретическая подвижность уменьшалась за счет вставки двух или более нуклеотидных разрывов (36,40). Мы оценили длину 3-нуклеотидного промежутка и комплекса из трех олигонуклеотидов, предположив случайную ориентацию. Эффективность FRET дуплексов с промежутками в 3 нт. Превосходно согласуется с моделью, основанной на этом предположении (рис. 4В, оранжевые кружки и линия). Длина зазора в 3 н. Была оценена как 23 ± 1 Å, что указывает на то, что основания с зазором растянуты.Масуко и др. . ранее сообщалось об уравнении для расчета длины зазора с помощью системы FRET, зависящей от расстояния (6). Согласно их уравнению, длина промежутка в 3 нт была рассчитана как 19,1 Å, что меньше нашего результата. Мы также измерили спектры излучения и определили эффективность FRET при 0 ° C (дополнительный рисунок S7). Всего 3-нуклеотидные дуплексы с зазором при 0 ° C показали более высокую эффективность FRET, чем таковые при 20 ° C, а длина 3-нуклеотидного зазора при 0 ° C была оценена как 19 ± 2 Å.Эти результаты показали, что эффект дыхания акцепторной цепи или высокая подвижность 3-нуклеотидного промежутка могут способствовать растяжению ДНК. Напротив, длина двойной спирали увеличивается на 2,8 ± 0,2 Å на пару оснований, что намного короче, чем у канонического дуплекса (3,6 ± 0,03 Å). Повышение представляет собой усредненное увеличение расстояния между донором и акцептором, а уменьшение, вероятно, связано с перемещением 3-нт. Промежутка, вставленного между двойными спиралями. Исходя из этих результатов, мы пришли к выводу, что два дуплекса свободно перемещаются, когда между областями вставлен промежуток в 3 н.

Для дальнейшего исследования взаимодействия двух двойных спиралей в стопку с помощью FRET были определены температуры плавления ( T _м с) дуплексов. Кривые плавления получали путем мониторинга интенсивности излучения при 500 нм с длиной волны возбуждения 345 нм, так что отслеживалась только гибридизация короткой цепи, содержащей перилен (дополнительный рисунок S8). Это позволило оценить взаимодействие между двумя спиралями, поскольку температура плавления периленсодержащей нити зависит от того, складываются ли эти два дуплекса в стопку. T _м с разорванных дуплексов были намного выше, чем у разорванных дуплексов, что подтверждает нашу гипотезу о том, что в разорванных дуплексах происходит стабильное стэкинг-взаимодействие (рис. 5). T _м с дуплексов с зазором 1 и 2 н. Были в пределах экспериментальной ошибки, хотя T _м cRnE3 немного уменьшились. Этот результат показал, что стэкинг-взаимодействие между двумя дуплексами, разделенными разрывом в 1 нт, является слабым, тогда как его сила частично зависит от его последовательности (41).Кроме того, дуплексы с разрывами 3 н. Показали те же T _m s, что и дуплексы с разрывами 2 н., Подтверждая, что два дуплекса больше не укладываются в стопку в этих структурах. В целом, анализы плавления подтверждают выводы, сделанные из FRET, что дуплексы не складываются прочно, когда они разделены промежутком в 2 нт.

Рисунок 5.

Температуры плавления нити, содержащей перилен, в контексте дуплекса с разрывом или разрывом. Эти температуры плавления определяли по кривым плавления, полученным путем мониторинга эмиссии 500 нм при возбуждении 345 нм, так что наблюдается только плавление цепи, содержащей перилен.

Рис. 5.

Температуры плавления нити, содержащей перилен, в контексте дуплекса с разрывом или разрывом. Эти температуры плавления определяли по кривым плавления, полученным путем мониторинга эмиссии 500 нм при возбуждении 345 нм, так что наблюдается только плавление цепи, содержащей перилен.

В заключение, мы разработали новый метод анализа структур ДНК с использованием ориентированной системы FRET. С помощью этой системы были точно получены структурные параметры канонического дуплекса B-формы.Большое отклонение от модели цилиндра, вероятно, из-за изгиба, наблюдалось с дуплексом A-тракта. Более того, детально выявлены различия в структуре и гибкости дуплексов с разрывом и разрывом. Хотя дуплекс с надрезом обладает высокой гибкостью, он сохраняет каноническую геометрию B-формы. Однако введение зазора в 1 нт изменило ориентацию красителя, хотя зависимость от ориентации все еще наблюдалась. Дуплексы с зазором 2 и 3 нуклеотида практически не показали ориентационной зависимости на графике FRET, что указывает на слабую укладку между двумя дуплексами, разделенными зазором.Ферменты репарации ДНК, такие как лигазы и ДНК-полимеразы, могут распознавать дуплексы с разрывом или разрывом, хотя распознавание разрывов зависит от размера разрыва (42–45). Различия в структуре и гибкости, которые были выявлены в этом исследовании, вероятно, позволяют распознавать эти ферменты. Важно отметить, что наши результаты продемонстрировали, что ориентация красителей строго контролируется в нашей системе FRET. Кроме того, другие пары красителей могут быть включены в ДНК через d-треонинол. Мы уверены, что наша система FRET окажется легким и универсальным инструментом для анализа структур ДНК в растворе.Эта система могла бы, например, использоваться для анализа структур дуплексов ДНК с различными типами повреждений, такими как радиационно-индуцированные поражения, эпигенетически модифицированные азотистые основания и неприродные молекулы (46,47). Более того, с помощью этой системы FRET можно анализировать структурные изменения в дуплексах ДНК, вызванные связыванием белков.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

PRESTO от Японского агентства науки и технологий; JSPS KAKENHI [JP16H05925, JP25248037]; Фонд Asahi Glass.Финансирование платы за открытый доступ: Фонд Asahi Glass.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Ян

Вт.

Структура и механизм распознавания повреждений ДНК

.

Cell Res.

2008

;

18

:

184

—

197

.2.

Герман

МВт

,

Johnson

C.N.

,

Весна

A.M.

Распознавание поврежденной ДНК: структура и динамические маркеры

.

Med. Res. Ред.

2012

;

32

:

659

—

683

.3.

Клегг

р.М.

[18] Флуоресцентный резонансный перенос энергии и нуклеиновые кислоты

.

Methods Enzymol.

1992

;

211

:

353

—

388

.4.

Preus

с.

,

Wilhelmsson

L.M.

Развитие количественных методов исследования нуклеиновых кислот на основе FRET

.

Chembiochem

.

2012

;

13

:

1990

—

2001

.5.

Норман

D.G.

,

Grainger

R.J.

,

Ухрин

D.

,

Lilley

D.M.J.

Расположение цианина-3 на двухцепочечной ДНК: важность для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии

.

Биохимия

.

2000

;

39

:

6317

—

6324

.6.

Масуко

м.

,

Ohuchi

S.

,

Sode

K.

,

Ohtani

H.

,

Shimadzu

A.

Перенос энергии резонанса флуоресценции от пиреновых меток на периленовые для анализов гибридизации нуклеиновых кислот в условиях гомогенного раствора

.

Nucleic Acids Res.

2000

;

28

:

e34

.7.

Виденгрен

Дж.

,

Schweinberger

E.

,

Berger

S.

,

Seidel

C.A.M.

Две новые концепции для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии: теория и экспериментальные реализации

.

J. Phys. Chem. А

.

2001

;

105

:

6851

—

6866

.8.

Дитрих

А.

,

Buschmann

V.

,

Müller

C.

,

Sauer

M.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) и конкурирующие процессы в донорно-акцепторных цепях ДНК: сравнительное исследование ансамблевых и одномолекулярных данных

.

Rev. Mol. Biotechnol.

2002

;

82

:

211

—

231

.9.

Ли

с.

,

Lee

J.

,

Hohng

S.

Одномолекулярный трехцветный FRET с незначительным спектральным перекрытием и длительным временем наблюдения

.

PLoS One

.

2010

;

5

:

e12270

.10.

Di Fiori

Н.

,

Меллер

А.

Влияние взаимодействий краситель-краситель на пространственное разрешение измерений FRET одиночных молекул в нуклеиновых кислотах

.

Biophys. J.

2010

;

98

:

2265

—

2272

. 11.

Купстат

А.

,

Ritschel

T.

,

Kumke

M.U.

ДНК-олигонуклеотиды, конъюгированные с оксазиновым красителем: резонансный перенос энергии Ферстера с учетом молекулярных взаимодействий краситель-ДНК

.

Биоконъюг. Chem.

2011

;

22

:

2546

—

2557

. 12.

Форстер

т.

Energiewanderung und fluoreszenz

.

Naturwissenschaften

.

1946

;

33

:

166

—

175

. 13.

Возняк

А.К.

,

Schröder

G.F.

,

Grubmüller

H.

,

Seidel

C.A.M.

,

Oesterhelt

F.

Одномолекулярный FRET измеряет изгибы и изгибы ДНК

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2008

;

105

:

18337

—

18342

.14.

Льюис

F.D.

,

Zhang

L.

,

Zuo

X.

Контроль ориентации резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием ДНК в качестве спирального каркаса

.

J. Am. Chem. Soc.

2005

;

127

:

10002

—

10003

.15.

Икбал

А.

,

Арслан

S.

,

Okumus

B.

,

Wilson

T.J.

,

Giraud

G.

,

Norman

D.G.

,

га

T.

,

Lilley

D.M.J.

Зависимость от ориентации в переносе флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, концевыми присоединенными к двухцепочечным нуклеиновым кислотам

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2008

;

105

:

11176

—

11181

. 16.

Börjesson

к.

,

Preus

S.

,

El-Sagheer

A.H.

,

Brown

T.

,

Albinsson

B.

,

Wilhelmsson

L.M.

Аналог оснований нуклеиновой кислоты FRET-пара, облегчающая подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты

.

J. Am. Chem. Soc.

2009

;

131

:

4288

—

4293

. 17.

Preus

с.

,

Kilså

K.

,

Miannay

F.-A.

,

Альбинссон

Б.

,

Вильгельмссон

Л.М.

FRETmatrix: общая методология моделирования и анализа FRET в нуклеиновых кислотах

.

Nucleic Acids Res.

2013

;

41

:

e18

. 18.

Fessl

т.

,

Lilley

D.M.J.

Измерение изменения закрутки спирального соединения в РНК с использованием ориентационной зависимости FRET

.

Biophys. J.

2013

;

105

:

2175

—

2181

.19.

Като

т.

,

Кашида

Х.

,

Кишида

Х.

,

Яда

Х.

,

Окамото

Х.

,

Асанума

Х.

Разработка надежной модельной системы FRET с использованием суррогатов оснований, связывающих флуорофоры, для строгого контроля их положения и ориентации в дуплексе ДНК

.

J. Am. Chem. Soc.

2013

;

135

:

741

—

750

.20.

Кашида

H.

,

Лян

X.G.

,

Асанума

Х.

Рациональный дизайн функциональной ДНК с нерибозным ациклическим каркасом

.

Curr. Орг. Chem.

2009

;

13

:

1065

—

1084

.21.

Санкар

А.

,

Lindsey-Boltz

L.A.

,

Ünsal-Kaçmaz

K.

,

Linn

S.

Молекулярные механизмы репарации ДНК млекопитающих и контрольные точки повреждений ДНК

.

Annu. Rev. Biochem.

2004

;

73

:

39

—

85

. 22.

Линдаль

т.

,

Дерево

Р. Д.

Контроль качества путем репарации ДНК

.

Наука

.

1999

;

286

:

1897

—

1905

. 23.

Лян

Х.

,

Asanuma

H.

,

Kashida

H.

,

Takasu

A.

,

Sakamoto

T.

,

Kawai

G.

,

Komiyama

M.

ЯМР-исследование светочувствительной ДНК, связывающей азобензол. Определение абсолютной конфигурации двух диастереомеров и определение структуры их дуплексов в транс-форме

.

J. Am. Chem. Soc.

2003

;

125

:

16408

—

16415

. 24.

Асанума

H.

,

Akahane

M.

,

Kondo

N.

,

Osawa

T.

,

Kato

T.

,

Kashida

H.

Линейный зонд без тушителя с множеством флуорофоров на ациклическом каркасе

.

Chem. Sci.

2012

;

3

:

3165

—

3169

. 25.

Дои

т.

,

Sakakibara

T.

,

Kashida

H.

,

Araki

Y.

,

Wada

T.

,

Asanuma

H.

Гетероселективный ДНК-подобный дуплекс, стабилизированный донорно-акцепторными взаимодействиями

.

Chem. Евро. J.

2015

;

21

:

15974

—

15980

. 26.

Лакович

Дж.Р.

Принципы флуоресцентной спектроскопии

.

2006

;

NY

:

Springer

. 27.

Муньос-Лоса

А.

,

Curutchet

C.

,

Krueger

B.P.

,

Hartsell

L.R.

,

Mennucci

B.

Беспокойство по поводу FRET: отказ от приближения идеального диполя

.

Biophys. J.

2009

;

96

:

4779

—

4788

. 28.

Дикерсон

R.E.

,

Дрю

Х.Р.

Структура додекамера B-ДНК

.

J. Mol. Биол.

1981

;

149

:

761

—

786

. 29.

Ларсен

т.А.

,

Копка

М.Л.

,

Дикерсон

R.E.

Анализ кристаллической структуры додекамера B-ДНК CGTGAATTCACG

.

Биохимия

.

1991

;

30

:

4443

—

4449

.30.

Grzeskowiak

к.

Последовательно-зависимые структурные вариации в B-ДНК

.

Chem. Биол.

1996

;

3

:

785

—

790

. 31.

Wu

Х.-М.

,

Crothers

D.M.

Локус последовательного и индуцированного белками изгиба ДНК

.

Природа

.

1984

;

308

:

509

—

513

. 32.

Нельсон

H.СМ.

,

Finch

J.T.

,

Луизи

Б.Ф.

,

Клуг

А.

Структура олиго (dA) · олиго (dT) тракта и его биологические последствия

.

Природа

.

1987

;

330

:

221

—

226

. 33.

DiGabriele

г. н.э.

г. ,

Steitz

Т.А.

ДНК-додекамер, содержащий адениновый тракт, кристаллизуется в уникальной решетке и демонстрирует новый изгиб

.

J. Mol. Биол.

1993

;

231

:

1024

—

1039

. 34.

Феррер

P.

,

Bednar

J.

,

Stasiak

A.Z.

,

Katritch

V.

,

Michoud

D.

,

Stasiak

A.

,

Dubochet

J.

Противоионы, напротив, влияют на длину персистентности ДНК с разрывами и без разрывов1

.

J. Mol. Биол.

1997

;

266

:

711

—

721

.35.

Чжан

Ю.

,

Crothers

D.М.

Высокопроизводительный подход к обнаружению изгиба ДНК и гибкости на основе циклизации

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2003

;

100

:

3161

—

3166

. 36.

Яковчук

P.

,

Протозанова

Е.

,

Франк-Каменецкий

М.Д.

Вклады укладки оснований и спаривания оснований в термическую стабильность двойной спирали ДНК

.

Nucleic Acids Res.

2006

;

34

:

564

—

574

0,37.

Рулон

В.

,

Ketterlé

C.

,

Faibis

V.

,

Fazakerley

G.V.

,

Boulard

Y.

Конформации структур ДНК с разрывами и разрывами по данным ЯМР и молекулярно-динамического моделирования в воде

.

Биохимия

.

1998

;

37

:

4059

—

4070

. 38.

Протозанова

E.

,

Яковчук

П.

,

Франк-Каменецкий

М.Д.

Равновесие с накоплением и без стэка в месте разрыва ДНК

.

J. Mol. Биол.

2004

;

342

:

775

—

785

.39.

Аймами

Дж.

,

Coll

M.

,

van der Marel

G.A.

,

Van Boom

J.H.

,

Wang

A.H.

,

Rich

A.

Молекулярная структура разорванной ДНК: субстрат для ферментов репарации ДНК

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1990

;

87

:

2526

—

2530

.40.

Мельницы

J.B.

,

Cooper

J.P.

,

Hagerman

P.J.

Электрофоретическое доказательство того, что одноцепочечные области из 1 или более нуклеотидов резко увеличивают гибкость ДНК

.

Биохимия

.

1994

;

33

:

1797

—

1803

.42.

Коричневый

Дж.А.

,

Упаковка

L.R.

,

Sanman

L.E.

,

Suo

Z.

Эффективность и точность ДНК-полимераз человека λ и β во время синтеза ДНК с заполнением пробелов

.

Ремонт ДНК

.

2011

;

10

:

24

—

33

. 43.

Карими-Бушери

F.

,

Ли

Дж.

,

Weinfeld

M.

,

Tomkinson

A.E.

Ремонт разрывов и разрывов в цепях ДНК, содержащих 3΄-фосфатные и 5΄-гидроксильные концы, очищенными ферментами млекопитающих

.

Nucleic Acids Res.

1998

;

26

:

4395

—

4400

. 44.

Ho

C.K.

,

Ван Эттен

J.Л.

,

Шуман

С.

Характеристика АТФ-зависимой ДНК-лигазы, кодируемой вирусом хлореллы PBCV-1

.

J. Virol.

1997

;

71

:

1931

—

1937

. 45.

Лю

Ю.

,

Борода

W.A.

,

Ударная

D.D.

,

Прасад

р.

,

Hou

E.W.

,

Wilson

S.H.

Ферментативная специфичность ДНК-полимеразы β и лоскутной эндонуклеазы 1 поддерживает синтез ДНК для эксцизионной репарации длинного патч-основания

.

J. Biol. Chem.

2005

;

280

:

3665

—

3674

. 46.

Ворота

К.С.

Обзор химических процессов, повреждающих клеточную ДНК: спонтанный гидролиз, алкилирование и реакции с радикалами

.

Chem. Res. Toxicol.

2009

;

22

:

1747

—

1760

. 47.

Карелл

т.

,

Brandmayr

C.

,

Hienzsch

A.

,

Müller

M.

,

Pearson

D.

,

Reiter

V.

000

Thoma 4 Большой палец

п.

,

Вагнера

М.

Структура и функции неканонических азотистых оснований

.

Angew. Chem. Int. Эд.

2012

;

51

:

7110

—

7131

.

© Автор (ы) 2017. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Оценка степени молекулярного контакта между поверхностями целлюлозных волокон с помощью микроскопии FRET

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

Следующее краткое введение в теорию Фёрстера было взято из книги Б.W. Van der Meer (Meer 2013) и частично основан на оригинальных статьях Фёрстера. Эффективность передачи энергии между донорным и акцепторным красителем зависит от расстояния между двумя молекулами и, в принципе, определяется радиусом Ферстера (\ (\ text {R} _0 \)). Радиус Ферстера можно рассчитать для любой комбинации донорных и акцепторных молекул, как показано в дополнительной информации (Таблица S1). \ (\ text {R} _0 \) специфичен для каждой пары донор-акцептор в конкретной системе.6} \ end {align} $$

(1)

где r обозначает расстояние между донором и акцептором, а \ (\ text {R} _0 \) обозначает радиус Ферстера пары донор-акцептор. На практике эффективность FRET может быть измерена различными методами, которые могут быть реализованы либо в установках микроскопии, либо измерены с помощью спектрофотометрии, оба из которых были использованы в этой статье.

Независимо от метода измерения, процесс FRET может быть обнаружен по различным аспектам эффекта.FRET изменяет интенсивность излучения донора (гашение донора), интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора), время жизни флуоресценции донора (измерения времени жизни) и поляризацию света (измерения анизотропии). Здесь мы использовали два из наиболее распространенных метода измерения FRET, а именно тушение донора (DQ) и акцепторную чувствительность (AS). Тушение донора измеряет уменьшение флуоресценции донора из-за FRET. Чувствительность акцептора измеряет увеличение флуоресценции акцептора из-за FRET.Хотя DQ является показателем для FRET, нельзя быть уверенным в этом, поскольку существуют другие механизмы, такие как гашение концентрации, которые могут дезактивировать возбужденный донор. С другой стороны, AS предоставляет убедительные доказательства для FRET, поскольку флуоресценция акцептора может быть увеличена только за счет некоторого рода передачи энергии (Meer 2013). Отличный обзор реализации и подводных камней метода предоставлен Broussard et al. (2013). Здесь следует упомянуть одну важную часть использования FRET — это тщательно проверять, действительно ли сигнал действителен, особенно когда спектроскопические данные недоступны.Это можно сделать, используя отрицательные контроли, динамический FRET или применяя более одного метода FRET.

Материалы

Красители 7- (диэтиламино) кумарин-3-карбогидразид (DCCH, Purity \ (95 {\%} \), CAS: 100343-98-4) и флуоресцеин-5-тиосемикарбазид (FTSC, Purity \ (99 {\%} \), CAS: 76863-28-0) были куплены у Santacruz Biotechnology. Растворители N, N-диметилформамид (DMF), тетрагидрофуран (THF) и ацетонитрил были приобретены в VWR. Все химические вещества использовались без дополнительной очистки.Поли (2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA) для производства тонких пленок был приобретен у Sigma Aldrich. Модельные пленки наносились на фольгу из ПЭТФ. Используемая целлюлоза представляла собой небеленую крафт-целлюлозу из мягкой древесины промышленного производства.

Подготовка образцов

Для исследования волокон целлюлозы [беленая крафт-древесина, соотношение ель / сосна (90/10)] образцы готовили, как описано Thomson et al. (2007). Волокна окрашивали в 15 мл раствора любого из красителей в ДМФА (1 ммоль / л и 0.2 ммоль / л) в течение ночи при pH 5, регулируемом добавлением HCl. Красители образуют метастабильную связь с восстанавливающим концом молекулы целлюлозы, и при добавлении HCl это равновесие смещается в сторону метастабильных видов связи. После окрашивания к раствору немедленно добавляли боргидрат натрия \ (\ hbox {NaBH} _4 \) (0,02 ммоль \ (\ text {NaBH} _4 \) на 0,5 г волокон) и давали ему прореагировать в течение 1 часа. Боргидрат натрия приводит к восстановительному аминированию красителей с целлюлозой, что приводит к ковалентной связи между реагентами.После этого восстановительного аминирования образцы сначала промывали в ДМФ и снова промывали экстракцией Сокслета ацетонитрилом в течение не менее 4 часов для удаления любого нековалентно связанного красителя. Впоследствии окрашенные волокна хранили в водном буферном растворе с pH 9 с использованием буры 0,4 г / л. Волокнистые связки были приготовлены путем скрещивания одного окрашенного DCCH волокна и одного окрашенного FTSC волокна в капле воды (pH 9) и последующей их сушки в листообразователе Rapid Köthen. Затем для микроскопии связки волокон переносили на предметные стекла.Перекрестки волокон (отрицательный контроль для FRET) получали путем простого пересечения двух волокон и покрытия их покровным стеклом для микроскопии.

Модельные пленки были приготовлены методом докторблейдинга \ (500 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) \ (10 ​​{\%} \) pHema в растворе 95/5 EtOH / h3O, смешанном с растворенными красителями. в THF на полиэтиленовую пленку. Это привело к ок. \ (1.5 \, {\ upmu} \ hbox {m} \) толстая пленка. Для обеспечения щелочных условий к раствору добавляли объем \ (12 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) триэтиламина. Фольга ПЭТ была очищена ацетоном перед нанесением лака.\ circ \ hbox {C} \) для \ (3 \, \ hbox {h} \) для установления контакта. Концентрации и применяемые методы измерения для образцов можно увидеть в Таблице 1.

Таблица 1 Концентрации и параметры для измерений FRET

FRET из спектрофотометрии

Спектры флуоресценции были записаны на RF-5301PC, спектрофлуорофотометре от Shimadzu. Эксперименты FRET проводились с концентрациями молекул, указанными в таблице 1. Также были приняты меры для минимизации воздействия окружающего света на любой из образцов, чтобы избежать фотообесцвечивания.Модельные пленки, с одной стороны, были исследованы с использованием этой установки флуорометрии, а с другой стороны, они были исследованы с помощью широкоугольного микроскопа с наборами фильтров, показанными в таблице 2. Спектры пленок pHema были записаны с использованием установки, показанной на рис. 3. Образцы исследовали под углом, который позволяет избежать обнаружения непосредственно отраженного света и измеряет только флуоресценцию, исходящую от образца.

Рис. 3

Установка для измерения пленок pHema во флуорометрии.В и настройка объясняется более подробно. Он был выбран таким образом, чтобы отраженный (REFL) луч, следующий за возбуждением (EX) образца, не попадал в детектор, и регистрировался только сигнал флуоресценции, испускаемый (EM) непосредственно от образца. a — c Образцы донора, акцептора и донора-акцептора во время их исследования

Эффективность передачи энергии FRET рассчитывается по измеренным спектрам и поясняется на рис.4. За счет передачи энергии излучение донора гасится (\ (\ text {I} _ {DA} \)) относительно нормального излучения донора (\ (\ text {I} _ {D} \) ). Энергия, не испускаемая донором, затем передается акцептору и увеличивает (или сенсибилизирует) излучение (\ (\ text {I} _ {AD} \)) по сравнению с нормальной чувствительностью акцептора (\ (\ text {I}) _ {A} \)). Спектральное перекрытие, показанное на рис. 4, является необходимым требованием для FRET и в значительной степени определяет диапазон расстояний эффекта, как можно увидеть в уравнении.{1/6} $$

(2)

\ (\ text {R} _0 \) — радиус Ферстера, k — фактор ориентации, n — показатель преломления, (\ (\ text {Q} _ {D} \)) — квантовый выход донора и J интеграл перекрытия. Радиус Ферстера определяет расстояние передачи энергии, поскольку известно, что количественное определение FRET возможно только в пределах расстояний от \ ((\ frac {1} {2} — 2) \ text {R} _0 \), как также показано на рис. 2. Подробное описание того, как определить радиус Ферстера, можно найти в FRET — Förster Resonance Energy Transfer Мединца и Хильдебрандта (Meer 2013).

Рис. 4

Спектры возбуждения и излучения типичной донорно-акцепторной пары. FRET влияет на интенсивность излучения донора (тушение донора) и интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора). Также показано спектральное перекрытие донорного излучения и спектра возбуждения акцептора.

Спектры флуоресцентного излучения DCCH и FTSC частично перекрываются, как показано на рис. 7. Следовательно, для точного измерения эффективности FRET спектры должны быть спектрально несмешанными.Для этого в спектрометре мы подогнали эмиссионные пики и использовали площадь под пиками как интенсивность подобранного сигнала. Практически это было сделано путем подгонки гауссовых пиков к зарегистрированным спектрам излучения чистого донорного образца (в результате получилось \ (\ text {I} _ {D} \)), чистого акцепторного образца (в результате \ (\ text {I}) _ {A} \)) и образец, представляющий интерес (в результате были \ (\ text {I} _ {DA} \) и \ (\ text {I} _ {AD} \)), как на рис. 11. Полные параметры подгонки можно найти в дополнительной информации (Рисунок S3 и Таблица S2).Полученная информация об интенсивности использовалась с уравнениями. 3 и 4, чтобы получить эффективность FRET. Для тушения доноров (уравнение 3) и акцепторной чувствительности (уравнение 4) использовались следующие уравнения.

$$ \ begin {выравнивание} \ eta _ {FRET} = 1 — \ frac {I_ {DA}} {I_D} \ end {выравнивание} $$

(3)

$$ \ begin {align} \ eta _ {FRET} = \ left (\ frac {I_ {AD}} {I_A} — 1 \ right) \ frac {\ epsilon _A} {\ epsilon _D} \ end { выровнено} $$

(4)

\ (\ epsilon _ {A} \) и \ (\ epsilon _ {D} \) — коэффициенты экстинкции акцептора и донора на длине волны возбуждения (Meer 2013; Clegg 1992, 1995).Отношение \ (\ frac {\ epsilon _ {A}} {\ epsilon _ {D}} \) было определено равным 0,02, и его можно найти в дополнительной информации (Таблица S1). Чувствительность акцептора и эмиссия донора схематически показаны на рис. 4.

FRET из оптической микроскопии

Бумажные волокна были исследованы с использованием установки для широкопольной микроскопии (WM), снабженной наборами фильтров, показанными в таблице 2. WM работал с Галогенная лампа 50 Вт и КМОП-детектор от QI Imaging (Optimos).

Таблица 2 Наборы фильтров, используемые для флуоресцентной микроскопии

Как интенсивность лампы, так и чувствительность детектора показывают зависимость от длины волны и были скорректированы путем расчета поправочных коэффициентов из спектра излучения лампы, сложенного с фильтрами возбуждения и коэффициентом экстинкции. и чувствительность детектора, сложенная с фильтрами излучения и спектрами излучения.Эти поправочные коэффициенты были применены к записанным изображениям, чтобы получить истинное представление об измеренной интенсивности.

Схематическое изображение окрашенных волокон и пленок pHema можно увидеть на рис. 5. Изображения имеют ложный цвет, чтобы подчеркнуть различия в волокнах / пленках. Образцы исследовались при увеличении в \ (400 \ раз \) для волокон и \ (50 \ раз \) в случае пленок. Чтобы минимизировать фоновый шум, микроскоп использовался в коробке, окруженной черной тканью.

Рис. 5

Ложные цветные изображения a волоконной связи и b пересечения pHema, измеренные с помощью широкоугольного флуоресцентного микроскопа. В b также показаны типичные области интереса для алгоритмов Xia. Области выбраны так, чтобы минимизировать рассеянный свет от другого волокна / пленки.

При использовании микроскопа спектральные характеристики меняют на пространственную информацию, и теряется преимущество применения этого простого метода подбора, описанного выше.Здесь Гордон и др. Разработали сложный алгоритм, который приводит к полностью скорректированной оценке эффективности FRET. (1998). В методе используются изображения, записанные с помощью трех различных наборов фильтров из Таблицы 2 трех разных образцов. Обычно в результате получается всего девять изображений, но при расположении, показанном на рис.5, можно получить ту же информацию только из трех изображений вместо этого, поскольку на каждом изображении автоматически присутствует чистый донор, чистый акцептор и область FRET. включены.Подробное описание алгоритма см. В исходной статье (Gordon et al. 1998). Вкратце, этот метод вычисляет интенсивность FRET, скорректированную для всех возможных сценариев спектрального просвечивания, в соответствии со следующими уравнениями.

$$ \ begin {align} {\ overline {Afa}} = \ frac {Af — \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right) Ff} {1 — \ left (\ frac {Fa} { Aa} \ right) \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right)} \ end {align} $$

(5)

$$ \ begin {align} FRET1 = \ frac {\ left (Ff — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) Df — {\ overline {Afa}} \ left [\ left (\ frac {Fa} {Aa} \ right) — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] \ right)} {G \ left [ 1 — \ left (\ frac {Da} {Fa} \ right) \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ right]} \ end {align} $$

(6)

$$ \ begin {align} {\ overline {Dfd}} = Df + FRET1 \ left [1 — G \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] — {\ overline {Afa} } \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ end {align} $$

(7)

$$ \ begin {align} FRETN = \ frac {FRET1} {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}} \ end {выравнивается} $$

(8)

Уравнения состоят из переменных, состоящих из двух букв.Первая буква обозначает использованный набор фильтров, как показано в таблице 2, вторая буква — исследуемый образец (d = только донор, a = только акцептор, f = область FRET). Например. Следовательно, Af означает область FRET (связанная область), исследованная с помощью набора акцепторных фильтров. Переменные представляют собой измеренные значения интенсивности света из вышеупомянутых изображений микроскопа, записанные как 16-битные значения серого. \ ({\ overline {Afa}} \) относится к сигналу акцептора, который был бы, если бы донор не присутствовал и, следовательно, не происходил FRET.Точно так же \ ({\ overline {Dfd}} \) относится к донорскому сигналу, который был бы, если бы не присутствовал акцептор и, следовательно, не было бы FRET. На изображениях были выбраны интересующие области, как показано на рис. 5b. Оценка производилась по пикселям. G — фактор, связывающий потерю донорного сигнала с увеличением сигнала акцептора (см. Дополнительную информацию в таблице S3). В этой работе мы использовали несколько иной алгоритм Xia et al. который отличается только нормализацией значения \ (\ text {N} _ {\ text {FRET}} \), но в остальном эквивалентен алгоритму Гордона (Xia and Liu 2001).

$$ \ begin {выровнено} N_ {FRET} = \ frac {FRET1} {\ sqrt {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}}} [-] \ end {выровнено} $$

(9)

Рис. 6

Демонстрация анализа FRET пересечения волокон a a и b a. В и можно увидеть две типичные проблемы с анализом. Сначала высокий сигнал FRET часто обнаруживался на краях как области склеивания, так и волокон. Во-вторых, сильный ложноположительный сигнал FRET можно увидеть в области, которая явно не может показать FRET.На микроскопическом изображении можно увидеть метод эрозии, использованный для анализа.

Для возможности воспроизведения области молекулярного контакта был разработан метод, позволяющий всегда выбирать подходящую область. Метод состоял в том, чтобы вручную нарисовать ROI (интересующую область), захватив «оптически связанную» область на рис. 6. Затем мы применили эрозию изображения, чтобы избежать краев и, таким образом, получить размытую область интереса (рис. 6, нижние изображения), которая затем использовали для оценки интенсивности FRET. Избегать краев было необходимо, потому что области экстремальной интенсивности, по-видимому, дают ложноположительный сигнал FRET.Кроме того, ложные срабатывания также были обнаружены в областях, на которых невозможно показать FRET, таких как область, показанная на фиг. 6a, которая не находится в связанной области.

Другие эксперименты FRET

Здесь следует упомянуть, что другие эксперименты FRET также использовались. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM, Leica TCS SPE) с фотоумножителем от Hamamatsu был использован для исследования фотообесцвечивания акцептора и сенсибилизированного излучения акцептора в связях волокно-волокно. Идея заключалась в том, что благодаря превосходной настройке будет достигнуто лучшее соотношение сигнал / шум.

Роль диффузии ориентации и разделения флуорофоров в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это широко используемый метод одиночных молекул для измерения наноразмерных расстояний от изменений безызлучательного переноса энергии между донорными и акцепторными флуорофорами. Для макромолекул и комплексов эта наблюдаемая эффективность переноса используется для вывода изменений в молекулярной конформации в различных экспериментальных условиях.Однако иногда наблюдаются сдвиги в эффективности FRET даже при наличии убедительных экспериментальных доказательств того, что конформационное состояние молекулы не изменилось. Мы исследуем способы, которыми такие расхождения могут возникнуть из-за кинетических эффектов. Мы показываем, что значительные сдвиги могут возникнуть из-за взаимодействия между кинетикой возбуждения, ориентационной диффузией флуорофоров, разделительной диффузией флуорофоров и неизлучающим тушением.

Образец цитирования: Wallace B, Atzberger PJ (2017) Фёрстеровский резонансный перенос энергии: роль диффузии ориентации и разделения флуорофора в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET.PLoS ONE 12 (5): e0177122. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122

Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

Поступила: 15.11.2016; Одобрена: 21 апреля 2017 г .; Опубликовано: 19 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Wallace, Atzberger. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные, использованные в исследовании, представлены непосредственно в документе.

Финансирование: Эта работа была поддержана карьерным грантом Национального научного фонда 0956210, Национальным научным фондом: Отдел математических наук 1616353 (www.nsf.gov) и Министерством энергетики передовых научных исследований в области вычислительной техники CM4 DESC0009254 (http: // science.energy.gov/ascr/).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

1 Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — широко используемый метод измерения одиночных молекул для измерения расстояний внутри и между молекулами [1, 2]. FRET основан на безызлучательном переносе энергии между возбужденной молекулой донора и молекулой акцептора. Ферстер разработал теорию безызлучательного переноса, основанную на диполь-дипольных взаимодействиях [1, 3]. Для расстояния разноса R теория Ферстера предсказывает масштабирование эффективности передачи энергии как ∼ ( R / R ₀ ) ⁻⁶ .На практике обычно R ₀ ∼ 1 нм [1–3]. Экспериментальная реализация с использованием FRET в качестве «спектроскопической линейки» для измерения расстояний внутри отдельных молекул была введена в экспериментах Страйера и Хогланда в 1960-х годах [2, 4, 5]. С этого времени FRET продолжала развиваться и стала универсальным инструментом, широко используемым в биологических науках и биотехнологиях [6–10].

В биологических науках FRET используется для сообщения о межбелковых взаимодействиях [11, 12].На уровне одной молекулы FRET использовался для измерения расстояний между метками при характеристике структур и динамики макромолекул, включая РНК, ДНК, белки и их молекулярные комплексы [6, 13-15]. Измерения FRET, зависящие от времени, были разработаны для характеристики кинетики реакции ферментов [6, 16–18], взаимодействий лиганд-рецептор [7, 19–21], конформационной динамики белков [13, 22, 23] и движения молекул моторные белки [24, 25].

Многие типы молекул могут быть использованы для образования пары акцептор-донор в FRET.Некоторые молекулы обладают фотофизикой, которая приводит к тушению без излучения при взаимодействии с окружающими химическими частицами или внутримолекулярными химическими группами [26–30]. Это дает возможность использовать зонды FRET для сообщения о локальной концентрации химических веществ, таких как ионы металлов [26, 31] в воде или ионы Ca ⁺ , высвобождаемые во время нейрональной активности [15]. В развивающейся биотехнологии FRET также используется для разработки новых типов высокоточных сенсоров для обнаружения одиночных молекул и высокопроизводительных анализов для скрининга [7, 8, 20].

В однопарном FRET (spFRET) одна пара акцепторных и донорных молекул используется для измерения внутримолекулярных расстояний [4]. Чтобы охарактеризовать различные молекулярные конформационные состояния или гетерогенные состояния субпопуляций, используют ратиометрический анализ для оценки эффективности переноса E [18, 32]. При повторных измерениях это обычно отображается в виде гистограммы значений эффективности E . В различных экспериментальных условиях, таких как введение денатуранта, сдвиги в наблюдаемой гистограмме эффективности интерпретируются как изменения в конформационном состоянии молекулы [6, 14, 23, 33].В недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было замечено, что в некоторых ситуациях такие сдвиги FRET могут происходить даже тогда, когда нет явных изменений в конформационном состоянии. Это открытие подтверждается экспериментами, в которых рентгеновское рассеяние молекул указывает на отсутствие конформационных изменений или вовлеченная молекулярная структура по своей природе жесткая, такая как полипролиновая цепь [34, 35]. Прецедент такого изменения эффективности обусловлен свойствами среды. Эксперименты, подобные тем, что были выполнены Жангом, Фу, Лаковичем и другими [36, 37], демонстрируют, что присутствие посторонних частиц (в частности, серебра в их исследованиях) может влиять на донорно-акцепторное взаимодействие.Более того, результаты Макарова и Плакско [38] предполагают, что для гибкого полимера не только конформационное состояние, но и сквозная кинетика могут влиять на наблюдаемую эффективность FRET.

Это представляет собой важный вопрос характеристики того, как могут происходить сдвиги в эффективности FRET при очевидном отсутствии каких-либо изменений в конформационном состоянии. Мы исследуем с помощью теории и стохастического моделирования роль, которую играет кинетика возбуждения, ориентационная диффузия флуорофоров, разделительная диффузия флуорофоров и неизлучающее тушение.Наши результаты нацелены на количественную оценку величины этих эффектов и помочь определить режимы, в которых эти факторы могут повлиять на экспериментальные измерения.

2 Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

2.1 Эффективность передачи

КПД FRET — это доля энергии, которая без излучения передается от донора к молекуле акцептора. Первоначально предполагается, что энергия может быть испущена только как донорный фотон или без излучения передана акцептору, чтобы в конечном итоге испускаться как акцепторный фотон.В этом случае эффективность переноса связана со скоростями испускания фотонов донора и акцептора κ _A и κ _D (1) Мы проиллюстрируем процесс донорно-акцепторного переноса на рис. 1.

Рис. 1. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET).

Молекула-донор возбуждается до более высокого энергетического состояния адсорбированным фотоном. Донор возвращается в свое основное состояние, испуская фотон или передавая энергию молекуле акцептора.Возбужденное состояние акцепторной молекулы релаксирует за счет испускания фотонов. Показаны два широко используемых донорно-акцепторных красителя Cy 3 и Cy 5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g001

Для некоторых систем может быть важно учитывать также дополнительные фотохимические состояния, как в [39, 40], или передачу энергии от столкновений с другими молекулами. в растворе, что приводит к безизлучающему тушению [28–30]. Мы рассмотрим некоторые из этих эффектов в следующих разделах.

Теория Ферстера предсказывает, что скорость безызлучательного переноса κ _T зависит от расстояния разделения донор-акцептор R как (2) Это основано на диполь-дипольных взаимодействиях и разделительных расстояниях, меньших длины волны излучающего фотона [1–3]. τ _D = 1/ κ _D обозначает среднее время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.Характерное расстояние Ферстера R ₀ зависит от фотофизики молекул донора и акцептора через (3) N _A — число Авогодроса, κ ² фактор, связанный с относительной ориентацией диполь-диполей донор-акцептор [5, 41], Φ _D — квантовый выход флуоресценция донора при отсутствии акцептора, J — интеграл перекрытия, связанный со спектром адсорбции донора и акцептора, n — показатель преломления.Более подробно см. [1–3, 5, 10, 42].

Когда вся переданная энергия немедленно излучается как акцепторный фотон, мы имеем κ _A = κ _T . Тогда зависимость эффективности FRET от расстояния может быть выражена как (4) Теория Ферстера имеет важную полезность, заключающуюся в том, что расстояние между донорами и акцепторами R может быть определено из наблюдений E . Для получения R ₀ в принципе требуется только знание некоторых свойств фотофизики донорных и акцепторных молекул.Это позволяет использовать FRET в качестве эффективной линейки наноразмеров для молекулярных систем [4, 23, 24, 27, 43].

2.2 Однопарный FRET для молекул, диффундирующих в свободном растворе

Чтобы получить измерения отдельных молекул для свободно диффундирующих молекул, донор обычно возбуждается, ожидая, пока отдельная молекула диффундирует в фокус лазерного луча [6, 18, 23, 24]. Когда молекула находится в области, достаточно близкой к фокальной точке лазера (в пределах фокального объема), донор возбуждается с высокой вероятностью, и происходит последовательность эмиссии донорных и акцепторных фотонов, см. Рис. 2.Пока молекула находится в фокальном объеме, можно подсчитать количество обнаруженных донорных и акцепторных фотонов n _D , n _A . Это позволяет сделать пропорционально-метрическую оценку эффективности переноса как [18, 32] (5) Эти экспериментальные данные для эффективности FRET затем обычно объединяются для формирования гистограммы наблюдаемых эффективностей передачи энергии E . Мы отмечаем, что на практике для таких экспериментов существует ряд важных соображений, таких как разработка критериев того, когда такая последовательность излучений должна считаться значительным событием FRET или когда есть короткие длительности в фокусном объеме или дробовой шум. .

Рис. 2. Одномолекулярное событие FRET.

Событие FRET начинается, когда молекула, помеченная парой донора и акцептора, диффундирует в объем достаточно большой лазерной интенсивности вблизи фокальной точки (слева). Подсчет зарегистрированного излучения фотонов для акцептора n _A и донора n _D регистрируется до тех пор, пока молекула не диффундирует за пределы фокального объема (вверху справа). Во время возбуждения донора либо испускается фотон, либо энергия безызлучательно передается акцептору и испускается со скоростью, зависящей от конформации молекулы (внизу справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g002

Гистограмма эффективности дает характеристику относительных пропорций различных конформационных состояний или субпопуляций молекул, встречающихся во время измерения. Для случая гомогенных молекул в одном и том же конформационном состоянии ожидается, что гистограмма эффективности покажет узкий пик вокруг характеристической эффективности FRET, соответствующей донарно-акцепторному разделению конформации.Тогда естественно рассматривать изменения в конформационном состоянии молекулы, ища сдвиги в положении пика на гистограмме FRET. Это широко используется в экспериментальной практике для характеристики биомолекулярных систем [6, 13, 14, 22].

Однако в недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было обнаружено, что при некоторых обстоятельствах может происходить значительный сдвиг в гистограмме эффективности FRET, в то время как нет явного изменения в конформационном состоянии. Мы используем теорию и стохастическое моделирование, чтобы исследовать роль кинетики.Сначала мы исследуем роль вращательной и поступательной диффузии флуорофоров на шкале времени кинетики возбуждения донорных и акцепторных молекул. Затем мы рассмотрим роль дополнительных эффектов, таких как тушение без излучения.

3 Важность донорно-акцепторной кинетики

3.1 Донорно-акцепторное возбуждение и релаксация

Мы рассматриваем роль кинетики донорного и акцепторного возбуждения, переноса энергии и релаксации. Мы моделируем событие возбуждения донора как происходящее со скоростью κ _D = 1/ τ _D . τ _D — это среднее время жизни возбуждения донора в отсутствие акцептора. Молекула-донор в возбужденном состоянии либо релаксирует, испуская фотон со скоростью κ _D , либо передавая энергию молекуле-акцептору со скоростью κ _T в соответствии с уравнением (2) . Подчеркнем, что на практике коэффициент κ _T зависит от ряда факторов.Это включает расстояние R между донором и акцептором. Это также зависит от относительной ориентации донора и акцептора, которая захватывается членом κ ² в уравнении (3).

Мы исследуем, как такая зависимость передачи энергии от конфигурации донора и акцептора конкурирует с другими кинетиками возбуждения и релаксации. С этой целью мы разрабатываем стохастическую модель кинетики возбуждения-релаксации и выполняем моделирование вращательной и поступательной диффузии акцепторных и донорных молекул.Мы исследовали влияние этих эффектов на эффективный κ _T и наблюдали эффективность передачи FRET E .

3.2 Донорно-акцепторная ориентационная диффузия

Взаимная ориентация дипольных моментов молекул донора и акцептора может существенно влиять на эффективность передачи энергии [5, 41, 42, 44, 45]. Это видно из фактора κ ² , который вносит вклад в уравнение (3). Фактор κ определяется как [5, 41, 42] (6) Символы и обозначают единичные векторы, представляющие ориентацию дипольных моментов акцепторных и донорных молекул.Указывает единичный вектор разделения, указывающий от донора к акцептору.

Вклады эффектов ориентации часто аппроксимируются усреднением в предположении, что ориентация быстро распространяется изотропно в масштабе времени, намного превышающем время возбуждения донора. Часто используется усредненный фактор ориентации 〈 κ ² 〉 = 2/3, [41, 42]. Однако во многих ситуациях ориентационная диффузия может быть сопоставима с временной шкалой возбуждений или, исходя из стерики молекулярного уровня, она может не быть изотропной выборкой всех ориентаций [12, 41, 44, 46].Кроме того, даже для быстрой диффузии экспериментальные измерения часто включают небольшую выборку значений κ ² , которые могут находиться в диапазоне от 0 до 4. Это выборка из распределения с нерегулярными и асимметричными характеристиками, см. Рис. 3.

Рис. 3. Распределение фактора ориентации κ ² .

Показаны случайные акцепторно-донорные ориентации для κ ² , которые распределены между 0 и 4. Распределение показывает хорошо известный касп при κ ² = 1 (см. Вставку).Большая часть распределения находится между κ ² = 0 и κ ² = 1 со значительным смещением в сторону κ ² = 0. Гистограмма была построена из 10 ⁷ случайных ориентаций красителя. пары.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g003

Мы исследуем роль диффузии ориентации и ее роль в наблюдаемой эффективности FRET, приводящей к возможным сдвигам. Поскольку важен только относительный угол между донором и акцептором, мы можем моделировать вращательную диффузию броуновским движением по поверхности сферы [47].Это может быть выражено в сферических координатах случайным процессом (7) D _R обозначает коэффициент диффузии на поверхности, а ρ радиус сферы. Уравнения следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48, 49]. Символы и обозначают независимые броуновские движения. Для сферы радиусом ρ конфигурация, связанная со сферическими координатами (Θ _t , Φ _t ), должна интерпретироваться в картосовых координатах как X _t = ρ sin (Θ _t ) cos (Φ _t ), Y _t = ρ sin (Θ _t ) sin (Φ _{) sin (Φ , и Z t = ρ cos (Θ t ).}

Мы выполняем моделирование путем численного вычисления временных шагов, приближающих стохастический процесс в уравнении (7). Это достигается путем проецирования броуновского движения на поверхность сферы. В частности, мы используем пошаговую процедуру по времени (8) (9) Генерируется на каждом шаге как трехмерная гауссова случайная величина с независимыми компонентами, имеющими нулевое среднее значение и единицу дисперсии. Мы отмечаем, что этот подход позволяет избежать осложнений, связанных со сферическими координатами, за счет исключения необходимости переключать карты координат, когда конфигурации приближаются к вырождениям около полюсов сферы [50].

Мы характеризуем временной масштаб вращательной диффузии как τ _R = 4 π ² ρ ² / D _R . Мы используем для красителя длину ρ = 1 нм и окружность сферы 2 πρ . Окружность сферы служит опорной шкалой длины для шкалы времени диффузии τ _R . Мы проводим стохастическое моделирование с использованием этих параметров с шагом по времени не более Δ t = τ _R /500.

Мы рассматриваем случай, когда акцептор и донор могут свободно вращаться, но удерживаются на фиксированном расстоянии R . Возьмем R = R ₀ , так что для идеального усреднения по всем конфигурациям ориентации эффективность передачи составляет E = 0,5. Рассмотрим динамику вращения относительно времени жизни возбуждения донора, характеризующуюся τ _D / τ _R .

Мы рассматриваем как быструю вращательную диффузию, где большинство конфигураций хорошо отбираются за время жизни донора τ _D / τ _R ≫ 1, так и медленную вращательную диффузию, где только очень ограниченное подмножество конфигураций отбираются за время жизни донора τ _D / τ _R ≪ 1. Для медленной вращательной диффузии мы обнаружили, что ограниченная выборка за время жизни донора может привести к значительным сдвигам наблюдаемого FRET переместите E в сторону более низкого КПД, см. рис. 4.

Рис. 4. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

Сверху вниз красители с уменьшающейся вращательной диффузией, имеющие характерные времена диффузии τ _R / τ _D = 19,5, 97,5, 195,0, 975. Средние значения эффективности в каждом случае соответственно равны E = 0,486, E = 0,456, E = 0,438 и E = 0,403. Сдвиг средней эффективности от самой медленной к самой быстрой рассмотренной диффузии составляет около 20%.Примечательной особенностью уменьшения коэффициента диффузии является расширение распределения наблюдаемых значений эффективности. Эталонный КПД E ₀ = 0,5 обозначен красной линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g004

Все конфигурации ориентации одинаково вероятны, и коэффициент κ ² линейно влияет на эффективность переноса в уравнении (3). Как следствие, проявленный сдвиг является результатом чисто кинетических эффектов.В частности, для наиболее быстрой вращательной диффузии донор и акцептор имеют больше возможностей занять ориентацию, благоприятную для передачи энергии. Другими словами, когда диффузия велика, донор и акцептор успевают диффундировать, чтобы встретить конфигурации, которые находятся в «золотом пятне», имеющем наибольшие шансы инициировать передачу энергии. Когда вращательная диффузия намного медленнее, чем время жизни донора, ориентация донора и акцептора остается близкой к начальной начальной конфигурации, которая в первую очередь определяет скорость передачи энергии.Это проявляется как сдвиг значений κ ² в сторону меньших значений, соответствующих менее эффективному переносу, когда вращательная диффузия медленная относительно срока службы донора, см. Рис. 5.

Рис. 5. Фактор ориентации во время переноса.

Показаны факторы κ ² , которые возникли при моделировании во время передачи энергии от донора к акцептору. Сравним случай медленной вращательной диффузии τ _D / τ _R = 0.001 и быстрая вращательная диффузия τ _D / τ _R = 0,05. Для медленной вращательной диффузии κ ² факторов демонстрируют значительный сдвиг в сторону меньших значений. Это следствие того, что быстрая вращательная диффузия дает больше возможностей быть в благоприятных ориентациях для передачи энергии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g005

Изменение эффективности переноса в результате кинетики вращения может быть значительным.Для относительно быстрой вращательной диффузии в масштабе времени τ _R / τ _D = 19,5, мы находим, что передача энергии составляет E = 0,486. Это близко к тому моменту, когда ориентация полностью усредняется, чтобы получить передачу энергии E = 0,5. Для шкалы времени медленной вращательной диффузии τ _R / τ _D = 975 эффективность передачи E = 0.403. В этом случае кинетика вращения привела к сдвигу в средней эффективности переноса на 17%.

Наши результаты указывают на то, что эффективность передачи FRET E может демонстрировать значительный сдвиг без какого-либо изменения конформационного состояния измеряемой молекулы. Эти изменения возникают исключительно из-за разной скорости вращательной диффузии. На практике это может происходить из-за изменений вязкости окружающего растворителя или из-за временных событий связывания с молекулами, присутствующими в растворителе, которые временно ограничивают вращение донора и акцептора.Мы показываем сдвиги, которые могут возникнуть из-за этих эффектов в диапазоне коэффициентов диффузии на рис. 6.

Рис. 6. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

По мере того, как вращательная диффузия уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется. На вставке мы показываем процентное смещение, измеренное как % смещение = | E _obs — E ₀ | / E ₀ где мы берем эталонный КПД E ₀ = 0.5. Первые несколько точек данных имеют τ _D / τ _R = 0,001, 0,003 и 0,005.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g006

3.3 Донорно-акцепторная диффузия на расстоянии

Мы рассматриваем роль относительной поступательной диффузии донорных и акцепторных молекул. Нас особенно интересует случай, когда измеряемое конформационное состояние молекулы включает выборку по ансамблю различных конфигураций.В этом случае донор и акцептор могут претерпевать значительную трансляционную диффузию за время жизни донора [51, 52]. Например, для неупорядоченного белка или полимера, подвергнутого различным условиям сольватации, FRET может использоваться для определения радиуса инерции [35, 53–55]. Когда ансамбль конфигураций остается неизменным, мы исследуем роль кинетики, связанной с диффузией расстояния разделения.

Мы моделируем диффузию разделительного расстояния R случайным процессом. (10) γ обозначает эффективное сопротивление, Φ потенциал свободной энергии для расстояния разноса R , D _S эффективный коэффициент диффузии при разделении и W _t броуновское движение.Уравнение следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48]. Мы моделируем разделение донорной и акцепторной меток, прикрепленных к полимеру, с помощью потенциала свободной энергии. (11) Мы параметризуем модель, используя коэффициент диффузии D _S и принимаем сопротивление γ = k _B T / D _S где k _{Bolt B постоянная и T — температура.Чтобы смоделировать, что происходит, когда расстояние разделения приближается к нулю, мы избегаем отрицательных длин с помощью отражающего граничного условия в нуле [49]. Мы характеризуем эту диффузионную динамику шкалой времени τ S = ℓ ² / D S , где ℓ — это та же длина, что и в уравнении (11). Параметры, используемые по умолчанию в нашем моделировании, приведены в таблице 1.}

В состоянии равновесия этот процесс диффузии имеет разделительное распределение (12) где — статистическая сумма [56].Для моделирования этого процесса мы генерируем временные шаги, используя метод Эйлера-Мараюмы [57]. (13) η ⁿ генерируется на каждом временном шаге как независимая стандартная гауссова случайная величина с нулевым средним и единичной дисперсией. Длительность временного шага обозначается Δ t . На практике мы используем временной шаг с Δ t = τ _S /10 ⁴ . Чтобы дать некоторое представление о флуктуациях разделения и в качестве подтверждения наших методов моделирования, мы показываем численные результаты для равновесного распределения на рис.7.

Рис. 7. Равновесное распределение расстояний между донорами и акцепторами.

Результаты моделирования шагов акцепторно-донорных меток диффузии полимера (гистограмма) сравниваются с предсказанным распределением расстояний разделения из уравнения (12) (красная кривая). Результаты получены из 1,8 × 10 ⁶ выбранных шагов моделирования, соответствующих среднему значению μ = R ₀ и дисперсии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g007

Мы рассматриваем роль кинетики разделения донора и акцептора в течение времени жизни возбуждения донора. Мы рассматриваем эффективность переноса для различных скоростей разделения диффузии D _S относительно времени жизни донора τ _D . Это может быть охарактеризовано как τ _D / τ _S , где τ _S = ℓ ² / D _906.

Мы обнаружили, что уменьшение коэффициента диффузии разделения приводит к значительному сдвигу в эффективности переноса FRET, см. Рис. 8. Мы также обнаружили, что по мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение наблюдаемых эффективностей значительно расширяется. Для самого быстрого трансляционного коэффициента диффузии у нас есть средняя эффективность переноса E = 0,723 по сравнению с рассматриваемым самым медленным поступательным коэффициентом диффузии E = 0,508. Это дает относительный сдвиг в эффективности передачи FRET на 30%.

Рис. 8. Коэффициент диффузии разделения и эффективность переноса FRET.

Коэффициент диффузии отрыва соответствует τ _D / τ _S = 0,69, 0,07 и 0,007. У них средняя эффективность передачи соответственно E = 0,723, E = 0,553 и E = 0,508. Это соответствует относительному сдвигу на 30% в эффективности переноса. По мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение эффективностей переноса значительно расширяется.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g008

Набор конфигураций одинаков как для самой быстрой, так и для самой медленной диффузии, поэтому изменение эффективности переноса происходит исключительно из-за кинетических эффектов. В течение времени жизни донора диффузия влияет на то, насколько вероятно, что донор и акцептор встретят конфигурации, благоприятные для передачи энергии. В случае медленной диффузии скорость передачи энергии в первую очередь определяется исходной конфигурацией донора и акцептора.

В случае быстрой диффузии относительно времени жизни донора, донор и акцептор имеют больше возможностей встретить благоприятные конфигурации для передачи энергии. Эта разница в том, как часто встречаются такие «зоны наилучшего восприятия» для передачи энергии в течение срока службы донора, подтверждается наблюдаемыми разделительными расстояниями, которые возникают во время передачи энергии, см. Рис. 9.

Рис. 9. Расстояние разделения во время передачи энергии.

Показаны расстояния разделения, которые имели место при моделировании во время передачи энергии.Сравним случай медленной диффузии на расстояние τ _D / τ _S = 0,007 и быстрой дистанционной диффузии τ _D / τ _{S . В случае быстрой диффузии мы видим, что передача энергии происходит гораздо чаще при меньших разделительных расстояниях.}

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g009

Мы видим, что для самого быстрого коэффициента диффузии во время передачи энергии возникают значительно меньшие разделительные расстояния, что в среднем дает большую эффективность FRET.В случае самого медленного коэффициента диффузии мы видим, что распределение разделительных расстояний шире и более точно соответствует равновесному распределению разделительных расстояний, поскольку скорость передачи энергии в значительной степени определяется исходной конфигурацией донора и акцептора. Мы показываем сдвиги в передаче энергии для широкого диапазона коэффициентов диффузии разделения на рис. 10.

Рис. 10. Распространение расстояний и сдвиги в эффективности передачи FRET.

По мере того, как расстояние диффузии уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется.На вставке мы показываем сдвиг как относительный процент, равный % shift = | E _obs — E ₀ | / E ₀ с эталонной эффективностью E ₀ = 0,5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g010

3.4 Роль тушения без выбросов

Мы также рассматриваем случай, когда донор может снять возбуждение через неизлучающий путь [29]. Одним из возможных механизмов является динамическое тушение, когда донор высвобождается, вступая в контакт с химическими частицами, диффундирующими в окружающем растворе [26–28].У некоторых доноров есть фотофизика, на которую существенно влияет присутствие ионов. Это используется в некоторых экспериментах в качестве репортера концентрации ионов [15, 26, 31].

Мы принимаем эти эффекты во внимание, развивая некоторую теорию того, как дополнительный неизлучающий путь может изменить наблюдаемую эффективность FRET. Неизлучающий путь гашения можно смоделировать в нашей кинетике, убивая некоторую часть событий девозбуждения донора, которые привели бы к передаче энергии акцептору и, в конечном итоге, испусканию акцепторных фотонов.Для эффективности передачи FRET это соответствует увеличению уравнения (5) до (14) Величина 1 — α дает долю девозбуждений доноров, которые приводят к тому или иному типу события тушения без излучения. Дает соответствующую смещенную эффективность FRET при включении пути тушения.

Случай α = 1 соответствует ситуации, когда не излучающие тушения не происходят. В этом случае у нас есть. В случае α = 0, все наблюдаемые девозбуждения приводят к неизлучающим событиям тушения вместо девозбуждения донора через события передачи FRET и испускание акцепторных фотонов.В этом случае мы имеем, см. Рис. 11.

Рис. 11. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Наблюдаемая эффективность переноса FRET показана при включении дополнительного неизлучающего пути в донорно-акцепторную кинетику. Для различных скоростей α неизлучающих событий гашения результаты показывают, как повышается эталонная эффективность переноса E в случае отсутствия гашения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g011

Эффективность FRET удобно выразить как (15) где . Это обеспечивает эталон f , соответствующий отношению эмиссии донора к эмиссии акцептора, когда нет неизлучающего тушения. Эталонная фракция f связана с эталонной эффективностью передачи FRET E как f = E ^-1 -1. Сдвиг в процентах наблюдаемой эффективности FRET, возникающий в результате гашения, определяется как (16) Мы видим, что процентное изменение FRET, которое происходит из-за гашения, зависит от эталонной эффективности передачи FRET E .Фактически, возникающий сдвиг становится все более чувствительным по мере уменьшения E , см. Рис. 12.

Рис. 12. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Относительное процентное изменение эффективности переноса показано, когда тушение без излучения происходит как часть донорно-акцепторной кинетики.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g012

4 Обсуждение

Мы показали несколько различных способов, с помощью которых эффективность FRET может быть изменена как следствие кинетических эффектов, в то время как лежащее в основе молекулярное конформационное состояние фактически осталось прежним.Мы рассматриваем, как такие кинетические механизмы соотносятся с некоторыми недавними экспериментами, исследующими причины сдвигов в эффективности FRET [19, 34, 35, 58].

FRET часто используется для измерения конформационных изменений или фолдинга белков, поскольку денатурирующие условия меняются [22, 35, 53]. В недавней работе Липмана, Плакско и др. [35] радиус вращения полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ) рассматривается в условиях сольватации, которые дают случайные спирали. В отличие от белков, не ожидается, что ансамбль конфигураций полимера PEG существенно изменится при изменении денатуранта.Это подтверждается экспериментами по измерениям рассеяния рентгеновских лучей, которые действительно показывают, что радиус вращения ПЭГ остается неизменным при изменении денатуранта [35, 58]. Это обеспечивает полезный контроль для исследования FRET, поскольку условия денатуранта меняются.

Интересным открытием является то, что измерения FRET в одних и тех же условиях показывают значительный сдвиг в измеренной эффективности передачи. Для полимера ПЭГ с массой 3 кДа в денатуранте GuHcl в диапазоне концентраций от 0 до 6 М молярный сдвиг наблюдался в эффективности переноса примерно на 20%, на основании ссылки E ₀ = 0.5. Для того же полимера в денатуранте , мочевина в диапазоне концентраций от 0 до 8M, наблюдали сдвиг в эффективности на ~ 24% по сравнению с E ₀ = 0,5. Аналогичные сдвиги были обнаружены для экспериментов, проведенных с использованием ПЭГ 5 кДа [35].

Наши результаты показывают, что значительные сдвиги могут происходить в наблюдаемой эффективности FRET, даже когда нет никаких основных изменений в конформационном ансамбле. Мы показали, как эффективность переноса может изменяться исключительно из-за кинетических эффектов, возникающих из-за изменения скорости диффузии ориентации акцептор-донор, диффузии расстояния между донором и акцептором, а также из-за неизлучающего тушения.Для диффузии расстояния разделения донор-акцептор мы обнаружили, что такие кинетические эффекты могут вызывать сдвиги в эффективности до 48%. Это произошло, когда шкала времени диффузии на расстоянии приблизилась к шкале времени жизни донора, см. Рис. 10.

Один из способов объяснить экспериментально наблюдаемые сдвиги — рассмотреть, как денатурирующий агент увеличивает вязкость растворителя [35, 59]. Ожидается, что изменения вязкости растворителя будут тесно связаны с изменениями скорости диффузии, как предполагает соотношение Стокса-Эйнштейна [49].Такой механизм теоретически исследован в работах [58, 60]. Мы обсуждаем здесь, как результаты нашего моделирования соотносятся с изменениями вязкости растворителя.

Предполагаемое изменение объемной вязкости растворителя при изменении концентрации денатуранта мочевины при 8M составляет 1,66, а для GuHcl 6M коэффициент 1,61 согласно экспериментам [59]. Чтобы связать вязкость с коэффициентом диффузии, можно использовать соотношение Стокса-Эйнштейна D = k _B T / γ .Сопротивление определяется выражением γ = 6 πμa , где μ — вязкость растворителя, а a — эталонная шкала длины, характеризующая размер диффундирующей молекулы. Это говорит о том, что увеличение вязкости растворителя в 1,61 раза снижает коэффициент диффузии в 0,6 раза.

В нашем моделировании, взяв за основу τ _D / τ _S = 0,1, такое изменение вязкости сдвигает эффективность переноса на ∼12%.Этот вклад, обусловленный исключительно диффузионной кинетикой разделения донора и акцептора, составляет примерно половину сдвига ∼24%, наблюдаемого для 8M , мочевины и ∼20%, наблюдаемого для 6M GuHcl в [35]. Это согласуется с выводами [58], предполагающими, что другие механизмы также могут играть роль в наблюдаемом изменении эффективности переноса.

При интерпретации этих эффектов существует ряд потенциальных тонкостей. С одной стороны, донорные и акцепторные молекулы сравнимы по размеру с молекулами, денатурирующими вязкость, и изменения коэффициента диффузии, возможно, могут быть более значительными из-за более сложных взаимодействий, чем предполагалось при использовании простой объемной теории вязкости и диффузии [61–63].Другое соображение — это роль неизлучающего тушения, вызванного столкновительным контактом молекул денатуранта с донором [29]. В сочетании с кинетическими изменениями диффузии даже небольшое количество возбуждений, приводящее к тушению <5%, привело бы к общему комбинированному сдвигу на ~ 20% в наблюдаемой эффективности переноса, см. Рис. 12.

5 Заключение

Мы показали, что кинетика может играть значительную роль в изменении наблюдаемой эффективности переноса FRET, даже если нет основного изменения в конформационном состоянии измеряемой молекулы.Мы обнаружили, что изменение ориентации диффузии может в самых крайних случаях изменить эффективность переноса до 20%. Для рассматриваемой диффузии расстояние разделения донор-акцептор мы обнаружили в самых крайних случаях сдвиги до 48%. Наши данные о расстоянии донор-акцептор согласуются с исследованиями Макарова и Плакско [38]. Отметим, что наши результаты, касающиеся ориентационной диффузии, учитывают дополнительные эффекты, которых нет в [38], и могут предложить некоторое объяснение сдвигов FRET, которые наблюдаются в жестких полипролиновых цепях [34, 35].Мы обнаружили, что диффузионная кинетика как ориентации, так и разделения демонстрирует отчетливую подпись на гистограмме наблюдаемой эффективности переноса в виде уширения пиков. Мы также обнаружили, что неизлучающие тушения, которые происходят даже на умеренном уровне, могут привести к значительным сдвигам в наблюдаемой эффективности переноса. Обсуждаемые нами механизмы имеют потенциально важные последствия при интерпретации измерений FRET, особенно в отношении выводов из изменений расстояния FRET и того, как это связано с изменениями конформационного состояния молекул.При анализе измерений FRET мы надеемся, что наши результаты предоставят несколько полезных ориентиров, которые помогут определить значимость наблюдаемых сдвигов и роль кинетических эффектов.

Благодарности

Авторы P.J.A и B.W благодарят за поддержку исследовательского гранта NSF CAREER — 0956210, NSF DMS — 1616353 и DOE ASCR CM4 DESC0009254. Авторы также хотели бы поблагодарить А. Саймона, Э. Липмана и К. Плакско за полезные обсуждения и предложения. Признавая вышеперечисленное, авторы берут на себя полную ответственность за содержание и комментарии в рукописи.

Вклад авторов

1. Концептуализация: PJA BW.
2. Расследование: PJA BW.
3. Методология: PJA BW.
4. Написание — первоначальный черновик: PJA BW.
5. Написание — просмотр и редактирование: PJA BW.

Ссылки

1. 1. Forster TH. Механизмы передачи энергии электронного возбуждения. Дополнение к радиационным исследованиям. 1960; 2: 326–339.
2. 2. Clegg RM. История FRET: от зачатия до родов. В: CD G, JR L, редакторы. Обзоры в Флуоресценции. т. 3. Springer; 2006. с. 1–45.
3. 3. Форстер Т. 10-я лекция в память о Спайерсе. Механизмы передачи электронного возбуждения. Обсудите Faraday Soc. 1959; 27 (0): 7–17.
4. 4. Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1967. 58 (2): 719–726. pmid: 5233469
5. 5. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. FRET — резонансный перенос энергии Форстера: от теории к приложениям. 1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 23–62.
6. 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул. Наука. 1999. 283 (5408): 1676–1683. pmid: 10073925
7. 7. Сонг Й., Мадахар В., Ляо Дж. Развитие FRET-анализа в платформу для количественной и высокопроизводительной технологии скрининга белок-белковых взаимодействий.Анналы биомедицинской инженерии. 2011. 39 (4): 1224–1234. pmid: 21174150
8. 8. Plaxco KW, Soh HT. Биосенсоры на основе переключателей: новый подход к молекулярному обнаружению in vivo в реальном времени. Тенденции в биотехнологии. 2011; 29 (1): 1–5. pmid: 21106266
9. 9. Хаас Э., Качальски-Кацир Э., Стейнберг И.З. Броуновское движение концов олигопептидных цепей в растворе, оцениваемое по передаче энергии между концами цепи. Биополимеры. 1978. 17 (1): 11–31.
10. 10.Рахман ММ. Введение в перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET). Научный журнал физики. 2012 ;.
11. 11. Назаров П.В., Кохорст РБМ, Вос В.Л., Апанасович В.В., Хемминга М.А. Исследование FRET мембранных белков: подгонка на основе моделирования для анализа внедрения и ассоциации мембранных белков. Биофизический журнал. 2006. 91 (2): 454–466. pmid: 16632512
12. 12. Поршень DW, Kremers GJ. Флуоресцентный белок FRET: хорошее, плохое и уродливое.Направления биохимических наук. 2007. 32 (9): 407–414. pmid: 17764955
13. 13. Агафонов Р.В., Неграшов И.В., Ткачев Ю.В., Блейкли С.Е., Титус М.А., Томас Д.Д. и др. Структурная динамика спирали реле миозина по данным EPR и FRET с временным разрешением. Труды Национальной академии наук. 2009. 106 (51): 21625–21630.
14. 14. Эдидин М. Флуоресцентный резонансный перенос энергии: методы измерения молекулярной конформации и молекулярной близости. В: Текущие протоколы в иммунологии.John Wiley & Sons, Inc.; 2001. с. -. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.im1810s52.
15. 15. Ueda Y, Kwok S, Hayashi Y. Применение зондов FRET в анализе нейрональной пластичности. Границы в нейронных цепях. 2013; 7: 163–. pmid: 24133415
16. 16. Ха Т, Тинг А.Ю., Лян Дж., Колдуэлл В.Б., Дениз А.А., Chemla DS и др. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1998. 96 (3): 893–898.
17. 17. Шреста Д., Дженей А., Надь П., Вереб Г., Сёллёси Дж. Понимание FRET как исследовательского инструмента для исследований сотовой связи. Международный журнал молекулярных наук. 2015. 16 (4): 6718–6756. pmid: 25815593
18. 18. Дениз А.А., Дахан М., Грюнвелл Дж.Р., Ха Т, Фаулхабер А.Е., Chemla DS и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Фёрстера от расстояния и субпопуляций. Труды Национальной академии наук.1999. 96 (7): 3670–3675.
19. 19. Вайс С. Измерение конформационной динамики биомолекул с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Nat Struct Mol Biol. 2000. 7 (9): 724–729.
20. 20. Вентилятор C, Plaxco KW, Heeger AJ. Биосенсоры на основе донорно-акцепторных расстояний, модулируемых связыванием. Тенденции в биотехнологии. 2005. 23 (4): 186–192. pmid: 15780710
21. 21. Ни Q, Чжан Дж. Динамическая визуализация сотовой передачи сигналов. В: Эндо И., Нагамуне Т., редакторы.Нано / микробиотехнология. Берлин, Гейдельберг: Springer Berlin Heidelberg; 2010. с. 79–97. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1007/10_2008_48.
22. 22. Шулер Б., Липман Э.А., Итон Вашингтон. Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белков с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Природа. 2002; 419 (6908): 743–747. pmid: 12384704
23. 23. Hofmann H, Hillger F, Pfeil SH, Hoffmann A, Streich D, Haenni D, et al. Одномолекулярная спектроскопия сворачивания белка в шаперониновой клетке.Труды Национальной академии наук. 2010. 107 (26): 11793–11798.
24. 24. Wickersham CE, Cash KJ, Pfeil SH, Bruck I, Kaplan DL, Plaxco KW и др. Отслеживание молекулярного двигателя с помощью оптического кодировщика в наномасштабе. Nano Lett. 2010. 10 (3): 1022–1027. pmid: 20121107
25. 25. Мори Т., Вале Р.Д., Томишиге М. Как кинезин ждет между шагами. Природа. 2007. 450 (7170): 750–754. pmid: 18004302
26. 26. Лю Б., Цзэн Ф., Ву Г., Ву С. Наночастицы как каркас для основанного на FRET ратиометрического обнаружения ионов ртути в воде с квантовыми точками в качестве доноров.Аналитик. 2012. 137 (16): 3717–3724. pmid: 22737682
27. 27. Ли Х., Рен Х, Инь Л., Баласубраманиан С., Кленерман Д. Измерение динамики одиночных молекул нуклеиновых кислот в растворе с помощью двухцветной фильтрованной ратиометрической флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2004. 101 (40): 14425–14430. pmid: 15452356
28. 28. Marras SAE, Kramer FR, Tyagi S. Эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции и контактно-опосредованного тушения в олигонуклеотидных зондах.Исследования нуклеиновых кислот. 2002; 30 (21): e122 – e122. pmid: 12409481
29. 29. Чанг Х.С., Луи Дж. М., Итон, Вашингтон. Различение динамики белка и фотофизики красителя в экспериментах с одномолекулярным FRET. Биофизический журнал. 2009. 98 (4): 696–706.
30. 30. Стейнберг И.З., Качальски Э. Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательной передаче энергии. Журнал химической физики. 1968. 48 (6): 2404–2410.
31. 31. Дин KM, Qin Y, Palmer AE. Визуализация ионов металлов в клетках: обзор аналитических методов, подходов и зондов. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Исследование молекулярных клеток. 2012; 1823 (9): 1406–1415.
32. 32. Ha T, Enderle T, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Weiss S. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1996. 93 (13): 6264–6268. pmid: 86

33. 33. Нат А., Саммалкорпи М., ДеВитт Д., Трекслер А., Эльбаум-Гарфинкль С., О’Херн С. и др. Конформационные ансамбли альфа-синуклеина и тау-белка: сочетание одномолекулярного FRET и моделирования. Биофизический журнал. 2012; 103 (9): 1940–1949. pmid: 23199922
34. 34. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.2005. 102 (8): 2754–2759. pmid: 15699337
35. 35. Уоткинс Х.М., Саймон А.Дж., Сосник Т.Р., Липман Э.А., Хьелм Р.П., Плакско К.В. Отрицательный контроль с произвольной катушкой воспроизводит несоответствие между измерениями рассеяния и FRET размеров денатурированного белка. Труды Национальной академии наук. 2015; 112 (21): 6631–6636.
36. 36. Lakowicz JR, Kuśba J, Shen Y, Malicka J, D’Auria S, Gryczynski Z и др. Влияние металлических частиц серебра на резонансную передачу энергии между флуорофорами, связанными с ДНК.Журнал флуоресценции. 2003. 13 (1): 69–77.
37. 37. Чжан Дж., Фу Й., Лакович Дж. Р. Улучшенная передача энергии резонанса Фёрстера (FRET) на отдельной металлической частице. Журнал физической химии C. 2007; 111 (1): 50–56.
38. 38. Макаров Д.Е., Plaxco KW. Измерение расстояний в развернутых биополимерах с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции: влияние динамики полимерных цепей на наблюдаемую эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции. Журнал химической физики.2009; 131 (8).
39. 39. Камли Б.А., Браун FLH, Липман Е.А. Перенос Фёрстера за предел слабого возбуждения. Журнал химической физики. 2009; 131 (10).
40. 40. Муньос-Лоса А., Крутчет С., Крюгер Б. П., Харцелл Л. Р., Меннуччи Б. Беспокойство по поводу FRET: отказ идеального дипольного приближения. Биофизический журнал. 2009. 96 (12): 4779–4788.
41. 41. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. Оптимизация коэффициента ориентации по каппа-квадрату для более точных измерений FRET в FRET — резонансная передача энергии Форстера: от теории к приложениям.1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 63–104.
42. 42. Эндрюс Д.Л., Демидов А.А. Глава 14: Теоретические основы и разработка приложений. В кн .: Резонансная передача энергии. В то время как 2009. с. 461–499.
43. 43. Саху Х. Ферстер резонансный перенос энергии — спектроскопический нанолинейка: принцип и приложения. Журнал фотохимии и фотобиологии C: обзоры фотохимии. 2011; 12 (1): 20–30.
44. 44. Валчевска-Шевц К, Корри Б.Учет диффузии и ориентации красителя при связывании измерений FRET с расстояниями: три простых вычислительных метода. Phys Chem Chem Phys. 2014. 16 (24): 12317–12326. pmid: 24824374
45. 45. Икбал А., Арслан С., Окумус Б., Уилсон Т.Дж., Жиро Г., Норман Д.Г. и др. Зависимость от ориентации в переносе флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, концевыми присоединенными к двухцепочечным нуклеиновым кислотам. Труды Национальной академии наук. 2008. 105 (32): 11176–11181.
46. 46.Клозе Д., Клар Дж. П., Громанн Д., Кей К.В.М, Вернер Ф., Штайнхофф Х.Дж. Моделирование и реальность: сравнение прогнозов расстояния In Silico с измерениями DEER и FRET. PLoS ONE. 2012; 7 (6): e39492–. pmid: 22761805
47. 47. Brillinger DR. Частица, случайно перемещающаяся по сфере. Журнал теоретической вероятности. 1997. 10 (2): 429–443.
48. 48. Оксендал Б. Стохастические дифференциальные уравнения: Введение. Springer; 2000.
49. 49. Гардинер CW.Справочник по стохастическим методам. Серия по синергетике. Springer; 1985.
50. 50. Сигурдссон Дж. К., Атцбергер П. Дж. Гидродинамическое связывание включений частиц, встроенных в изогнутые двухслойные липидные мембраны. Мягкая материя. 2016; 12 (32): 6685–6707. pmid: 27373277
51. 51. Гурунатан К., Левитус М. Флуктуационная спектроскопия FRET диффундирующих биополимеров: вклад конформационной динамики и поступательной диффузии. J. Phys Chem B. 2010; 114 (2): 980–986. pmid: 20030305
52. 52.Бадали Д., Градинару СС. Влияние броуновского движения флуоресцентных зондов на измерение наноразмерных расстояний с помощью резонансной передачи энергии Фёрстера. Журнал химической физики. 2011; 134 (22): 225102. pmid: 21682537
53. 53. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Труды Национальной академии наук. 2007. 104 (5): 1528–1533.
54. 54.Хаас Э. Ансамблевые методы FRET в исследованиях белков с внутренними нарушениями. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред. Анализ внутренне нарушенных белков: том 1, методы и экспериментальные инструменты. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 2012. с. 467–498. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-61779-927-3_28.
55. 55. Шулер Б., Мюллер-Шпет С., Соранно А., Неттелс Д. Применение конфокального одномолекулярного FRET к внутренне неупорядоченным белкам. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред.Анализ внутренне нарушенных белков: том 2, методы и экспериментальные инструменты. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Спрингер Нью-Йорк; 2012. с. 21–45. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_2.
56. 56. Reichl LE. Современный курс статистической физики. Jon Wiley and Sons Inc .; 1997.
57. 57. Э. КП, Платен Э. Численное решение стохастических дифференциальных уравнений. Springer-Verlag; 1992.
58. 58. Ю Т.Ю., Мейсбергер С., Хиншоу Дж., Поллак Л., Харан Дж., Сосник Т.Р. и др.Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и FRET-спектроскопия одиночных молекул дают сильно различающиеся представления о низкоденатурантном развернутом состоянии. Журнал молекулярной биологии. 2012; 418 (3-4): 226–236. pmid: 22306460
59. 59. Кавахара К., Танфорд С. Вязкость и плотность водных растворов мочевины и гидрохлорида гуанидина. Журнал биологической химии. 1966. 241 (13): 3228–3232. pmid: 5
60. 6
61. 60. Мурацугу А., Ватанабе Дж., Киношита С. Влияние диффузии на резонансный перенос энергии Фёрстера в маловязком растворе.Журнал химической физики. 2014; 140 (21): 214508. pmid: 24
7
62. 61. Ли З. Критический размер частиц, при котором соотношение Стокса-Эйнштейна нарушается. Phys Rev E. 2009; 80 (6): 061204–.
63. 62. Шарма М., Яшонат С. Нарушение связи Стокса – Эйнштейна: роль взаимодействий в размерной зависимости самодиффузии.

    No related posts.