Новое поколение лада 4х4: Какой должна быть новая Lada 4×4. АвтоВАЗ советуется с покупателями — Новокубанск Новокубанский район

Содержание

модернизация серийного внедорожника и создание нового поколения

В 2015 году LADA 4х4 вошла в первую десятку рейтинга самых продаваемых автомобилей в России, заняв по итогам 6 месяцев 8-ю строчку рейтинга. С января по июнь 2015 года продано 19 724 внедорожника, что на 1048 машин больше, чем в прошлом году, когда модель не входила в ТОР-10.

Учитывая популярность легендарной модели, АВТОВАЗ продолжает реализацию программы обновления LADA 4х4. За последние два года в конструкцию и технологию было внесено более 10 улучшений.

— В линии окраски внедрена технология нанесения катафорезного грунта; начато применение вторичного полиэфирного грунта – благодаря этому стойкость покрытия возросла примерно в 5 раз.

— С внедрением дневных ходовых огней улучшилась активная безопасность LADA 4х4.

— Автомобиль получил новые опции: кондиционер, обогрев передних сидений, электростеклоподъемники, атермальные стекла.

— В системе охлаждения двигателя появились пружинные хомуты, что повысило герметичность системы.

— Благодаря внедрению карданных валов с шарнирами равных угловых скоростей улучшен виброакустический комфорт.

— Увеличена длина щеток стеклоочистителя, с 330 до 410 мм, что расширило зону очистки ветрового стекла.

— Применены двухструйные жиклеры омывателя лобового стекла (повышена эффективность омывателя).

— В системе подвески силового агрегата установлен динамический виброгаситель, что повысило комфорт автомобиля.

-Улучшен механизм открывания капота: тросик получил более прочную оболочку.

На 2015-2016 годы запланирован ряд нововведений, которые улучшат комфорт и качество автомобиля.

— Предусмотрено применение ступичного узла по типу переднеприводных автомобилей. Это избавит автомобиль от увеличенного осевого зазора в ступичных подшипниках и необходимости регулировки каждые 5000-10000 км.

— Перенос точки крепления катушек задних ремней безопасности, внедрение новых ремней позволит исключить дребезжание катушки и заедание ремня.

— На двери задка появится новая литая обивка, что позволит устранить дребезг и потертости на пластике.

— Планируется изготовление нового потока штампов наружной панели боковины: это стабилизирует кузовные зазоры и снизит усилие закрывания двери. На автомобиле появится модуль гидропривода сцепления, благодаря чему повысится герметичность и надёжность узла.

— Пятидверная LADA 4х4 вслед за трехдверной модификацией получит АБС и систему крепления детских кресел ISOFIX.

— Продолжатся и работы по улучшению виброакустического комфорта.

— Автомобиль получит новую решетку радиатора и плафон подсветки багажника.

Параллельно с улучшением серийной LADA 4х4 АВТОВАЗ разрабатывает новое поколение внедорожника. К этой работе привлечены участники фан-клубов LADA 4х4. В июне 2015 года группа владельцев LADA 4х4 посетила научно-технический центр АВТОВАЗа. Эксперты фан-клуба ознакомились с макетами перспективного автомобиля и подтвердили, что инженеры АВТОВАЗа работают в верном направлении, создавая современный, просторный автомобиль с высоким уровнем проходимости. Кроме того, сотрудники АВТОВАЗа и владельцы LADA 4х4 совместно выработали 11 наиболее важных направлений модернизации выпускаемой сегодня модели: повышение коррозионной стойкости кузова, улучшение характеристик мотора, снижение шумов и вибраций, оптимизация электросхемы и т.д. АВТОВАЗ и фан-клуб договорились о регулярных встречах – это поможет улучшить легендарный внедорожник и повысит клиентоориентированность компании.

Группа «АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО «АВТОВАЗ”, а также в Ижевске – ООО «LADA Ижевск».

Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

Озвучены сроки выхода на рынок нового поколения Lada 4×4 2024

Накануне в Сети появилась информация о том, что руководство «АвтоВАЗа» приняло решение о переименовании внедорожника Lada 4×4 в Niva Legend. Подобное решение было принято после того, как имя Niva вернулось в право пользования отечественным автопроизводителем.

Актуальная Lada 4×4

Теперь же поступила информация относительно того, когда с конвейера завода может быть спущено новое поколение автомобиля. По данным, которые были опубликованы в одной из групп в социальной сети, где происходит обсуждение новостей, связанных с российскими автомобилями, появления Lada Niva NG можно ожидать не ранее, чем в 2024 году, а не в 2022-2023 годах, как предварительно планировал автопроизводитель.

Новая Lada Niva NG 2024 (рендер)

Неназванный источник, который делится всей информацией, связанной с выпуском новой Lada Niva 3, сказал, что основная причина задержки выпуска авто никак не связана с пандемией коронавируса или подобными трудностями. Дело в том, что разработчик не сумел утвердить дизайн машины и специалистам компании в последний момент пришлось полностью перекраивать внешность будущей новинки.

О перспективах выпуска обновленного внедорожника ранее уже появлялась информация в Сети. Так, известно, что производиться новая модель будет на базе абсолютно новой архитектуры – CMF-B-LS, которая является разработкой французского Renault. В конце прошлого года конвейер «АвтоВАЗа» уже начал весьма серьезно обновляться. Как известно, линия В0 будет полностью модернизирована и к 2023 году на предприятии появится возможность организовывать выпуск новых автомобилей, построенных на основе современной «тележки» от французского производителя. Именно она и запланирована в качестве базиса для производства Lada Niva. Соответственно, ожидать появления следующего поколения легендарного внедорожника ранее 2024 года не приходится.

В то же время, технические характеристики машины, по всей видимости, «АвтоВАЗ» менять не будет. Как ранее уже сообщали представители российской компании, по их мнению, взаимодействие силового агрегата и трансмиссии, а также адаптация автомобиля к отечественным условиям эксплуатации, являются одними из самых лучших в классе. В случае принятия решения об их обновлении «АвтоВАЗу» придется менять абсолютно все, что может привести к неоправданно резкому подорожанию внедорожника.

Автор: Константин Старченко

Все, что известно о новом поколении Лада Нива 4х4

Lada 4×4 (Niva) могут построить на платформе Renault Duster

На АвтоВАЗ обдумывают, какую платформу все же должна получить модель внедорожника второго поколения Lada 4×4 (Лада Нива). Как стало известно по сообщению ТАСС, следующее поколение знаменитого отечественного внедорожника может получить зарубежную основу – архитектуру для среднеразмерных машин CMFB-LS.

Смотрите также: Lada-Duster, новое поколение Нивы будет сделано на иностранных запчастях

Об этом информационному агентству сообщил президент компании Николя Мор: «Очевидно, мы работаем над преемником существующей модели Lada 4×4, и мы рассматриваем потенциальную синергию с альянсом Renault-Nissan, включая возможное использование общей платформы».

При этом глава подчеркнул, что компания не желает сделать из внедорожника кроссовер, его выдающиеся внедорожные качества будут сохранены.

Также отечественный автопроизводитель, большая доля которого уже несколько лет принадлежит альянсу Renault-Nissan-Mitsubishi, скоро завершит

«работы по технико-экономическому обоснованию адаптации глобальной платформы альянса (Renault-Nissan-Mitsubishi) CMFB-LS для автомобиля Lada 4х4 до вехи Concept Freeze («финальное утверждение концепции»)». Проводимая работа позволит изучить целесообразность использования зарубежной платформы, подсчитать затрачиваемые на ее реализацию средства и сделать вывод относительно того, нужна ли она на этом автомобиле.

Платформа Common Module Family (сокращенно CMF) получит три разновидности для автомобилей различных классов:

CMF-A – для сегмента компактных малолитражных моделей

CMF-B – для среднеразмерного класса

CMF -C/D – для автомобилей классов C и D.

Платформа CMFB-LS – модульная платформа автомобилей В-класса, (схожа с архитектурой B0, устанавливаемой на Логан, но более современная). Подразумевается возможность установки современной электроники.

Приставка «LS» означает Low specifications – «простая спецификация». Есть еще версия «HS» High specifications (сложная спецификация), которая подразумевает установку большего количества электроники для моделей вроде Qashqai и X-Trail.

Кстати, как было известно ранее, АвтоВАЗ намеревался взять на доработку новое шасси Duster, чтобы своими силами внести корректировки и повысить проходимость будущего кроссовера до привычной «нивовской». Напоминает подход, использовавшийся при адаптации первой модели ВАЗ в истории – Fiat 124.

Также стоит отметить, что, по убеждению Николя Мора, новинка должна стать глобальным проектом, реализовывать который можно будет не только на российском рынке, но и по всему миру. Столь глобальные планы могут легко перевесить чашу весов на сторону зарубежного аналога российской платформы. Тем более что французская модель CMFB отлично показала себя на внедорожниках Renault Duster, кроссоверах Kadjar, японских Qashqai и X-Trail.

Отметим, что слухи о смене платформы на зарубежный аналог ожидаемого внедорожника нового поколения Лада Нива, появление которого затянулось на неопределенный срок (легенду стоило бы поменять уже давно, а не мариновать ее 40 лет практически в неизменном виде), уже как полгода кочуют из одного уважаемого российского издания в другое. Платформа – от Duster, двигатель на ней – поперечного расположения.

Также, как сообщалось ранее, в новой Ниве будут использовать зарубежные запчасти (вариаторная КПП и система полного привода от Renault Duster), в том числе и иностранные двигатели, которые можно будет встретить под капотом наряду с отечественными моторами.

Смотрите также: Лада Урбан 4х4: Практичный тест-драйв внедорожника Нива

Как мы писали осенью 2017 года, наши инженеры подготовят и внедорожную версию: «Ее отличиями станет улучшенная геометрическая проходимость (вероятно, этот момент будет достигнут благодаря использованию более «злого», утилитарного обвеса) и система полного привода отечественной разработки. Но и здесь основа вновь останется зарубежной – шестиступенчатая механика от внедорожника Duster, постоянным полным приводом с «понижайкой» займутся тольяттинцы».

При взгляде на новую Ниву 4х4 в глаза сразу бросается капот прямоугольной формы и характерные для легендарной модели поворотники. Lada кроссовер выглядит мускулисто и брутально: этому способствуют крупные выштамповки по бокам кузова, крупные колесные диски и светодиодная оптика, используемая на авто в большом количестве.

В задних стойках новой Нивы предусмотрены отверстия, отсылающие к Lada 4х4. Кузов кажется трёхдверным, но при более внимательном рассмотрении можно увидеть замаскированные ручки, поэтому дверей всё же пять (эта особенность, как заявил Маттин, останется и на серийной версии).

Со слов представителя компании, представленный дизайн нового внедорожника ВАЗ является практически окончательным вариантом: изменения, если они и будут произведены, окажутся незначительными и касающимися мелких деталей.

Технические характеристики

Новый кроссовер ВАЗа построен на той же платформе, что и Renault Duster второго поколения, уже доступный на европейском рынке. Исходя из этого, авто получит усовершенствованную подвеску, расширенный набор электроники и регулируемую по вылету рулевую колонку.

Вопрос, касающийся трансмиссии новой модели, по-прежнему остаётся открытым. Основная задача, стоящая перед конструкторами, заключается в сохранении параметров проходимости, присущих классической Ниве. Для этой цели планировалось с нуля разработать собственную полноприводную трансмиссию с возможностью повышения крутящего момента. Однако реализация этой неплохой задумки упирается в финансовую составляющую: работы по разработке трансмиссии для платформы Дастера обойдутся в круглую сумму, ввиду чего окупаемость машины займет намного больший период времени. Вероятнее всего, от этой идеи руководство компании откажется, а кроссовер ВАЗ унаследует от Renault Duster полный привод с короткой первой передачей взамен понижающей.

Двигатель Lada 4х4 Vision

Вопрос о силовом агрегате автомобиля так же остается открытым: предложено несколько решений, но они либо являются слишком дорогими и экономически невыгодными, либо несоответствующими техническому заданию.

Если рассматривать существующий модельный ряд, то в моторной гамме для новой Лады 4х4 нет подходящего по всем критериям варианта. С учетом доработки может подойти мотор от ВАЗ 21238, мощность которого может быть увеличена до 140 л. с., но этот двигатель не соответствует современным европейским нормам по выбросу вредных веществ в атмосферу (как довести агрегат до ума, инженеры АвтоВАЗа пока не придумали).

Новые силовые агрегаты заводом не разрабатываются в принципе: все моторы, устанавливаемые на выпускаемые модели, являются доработанными версиями уже существующих механизмов.

Руководство компании рассматривало вариант по оснащению Лада 4х4 Vision 1,3-литровым двигателем TCe, принадлежащим Renault-Nissan, но в таком случае это существенно увеличит итоговую стоимость авто, так как агрегат необходимо импортировать, а программы локализации нет.

Сейчас на ВАЗовском заводе собирают моторы Nissan h5M, однако из-за недостаточных объёмов производства проект балансирует на грани убыточности. В настоящее время ведутся переговоры по поводу увеличения количества изготавливаемых двигателей h5M с 300 тысяч штук до 1 миллиона. Если договоренности получится достигнуть, кроссовер станет оснащаться именно этим силовым агрегатом.

Серийное производство

Представленная на автосалоне Лада Визион – это концепт, который был полностью разработан в России. Выпуск серийного автомобиля запланирован на 2021 год. За это время какие-то особенности модели могут быть изменены и доработаны, но основные черты, отраженные в концепте, останутся прежними.

Какой окажется цена внедорожника, пока говорить рано: к примеру, если всё же вариант с разработкой трансмиссии утвердят, то стоить новинка будет больше Дастера. Но даже если за основу будет взят Duster, рассчитывать на большую разницу в цене с ним вряд ли следует. Получается, что с выходом Лада 4х4 Vision имидж дешевого внедорожника с хорошими характеристиками проходимости, который был присущ классической Ладе, останется в прошлом.

Видео Lada 4×4 Vision

Новую Lada 4×4 будут выпускать в Казахстане в России — CARobka.ru

Новое поколение внедорожника Lada 4×4 будет выпускаться на новом производстве полного цикла в Казахстане. Об этом заявил генеральный директор АО «АЗИЯ АВТО Казахстан» Ержан Мандиев.

В ноябре 2013 года представители АВТОВАЗа и «АЗИЯ АВТО» заложили на месте будущего производства в Усть-Каменогорске символический камень. А реальное положение вещей (с поправкой на выпавший снег) по большей части отражает следующее фото.

Первые автомобили с конвейера нового производства АО «АЗИЯ АВТО Казахстан» начнут сходить в 2015 году, — это будут Granta и Kalina второго поколения. Позднее к ним присоединится и новая Lada 4×4. Цикл реализации всего проекта рассчитан до 2020 года — именно к этому сроку предприятие должно выйти на проектную мощность в 120 000 автомобилей в год.

В 2015 году здесь будет крупнейший в Казахстане автомобильный завод. Стартовую мощность пока не называют, но к 2020 году предприятие должно выпускать 120 000 автомобилей Lada и альянса Renault-Nissan. Автомобили будут поставляться в азиатскую часть России — Сибирь и Дальний Восток.

«Новая генерация Lada 4×4 должна быть представлена в 2017 году, и она станет одной из трех моделей в основе линейки нашего производства полного цикла», — цитирует Ержана Мандиева агентство «Автостат». Генеральный директор предприятия отметил, что помимо этого в Казахстане планируется выпускать и модели альянса Renault-Nissan, и видение того, какие это будут модели, уже есть, однако точная номенклатура будет выработана в 2014 году.

«АЗИЯ АВТО» выпускает Lada 4×4 нынешнего поколения, а также почти весь модельный ряд брендов Kia, Chevrolet и Skoda, включая всё ещё недоступный россиянам недорогой лифтбэк Rapid. Но новый завод будет ориентирован на Lada, Renault и Nissan, позволив к 2020 году довести годовой объём производства АВТОВАЗа на всех площадках до цифры более 1 миллиона авто.

Сейчас АО «АЗИЯ АВТО Казахстан» на имеющихся производственных мощностях собирает автомобили нынешнего поколения Lada 4×4 (ранее — ВАЗ-2121 «Нива») по методу крупноузловой сборки SKD. Пока это производство планируется сохранить — Lada 4×4 занимает 64% сегмента компактных внедорожников в Казахстане, а в общем марке Lada принадлежит около 40% казахстанского авторынка. Весной 2013 года стало известно, что новое поколение Lada 4×4, которое также планируется собирать в Казахстане, появится в конце 2017 года. Технических подробностей об автомобиле пока нет, дизайн нового внедорожника тоже неизвестен, но мы будет держать вас в курсе…

Пётр Прусов, создатель автомобиля ВАЗ-2121 «Нива», главный конструктор Волжского автозавода (1998 — 2003 гг.) («АВТОСТАТ»)

В апреле 2017 года исполняется 40 лет с начала производства легендарного российского внедорожника «Нива», который последние 12 лет выпускается под названием LADA 4×4. К сожалению, создатель революционной для своего времени разработки (это был первый в мире внедорожник с несущим кузовом), выдающийся инженер, бывший главный конструктор завода Пётр Михайлович Прусов буквально пару недель не дожил до юбилея своего детища…

Пётр Михайлович Прусов (1942 – 2017 гг.) – главный конструктор ВАЗа (1998 – 2003 гг.), доктор технических наук, почетный конструктор РФ, обладатель огромного количества свидетельств и патентов на изобретения, представитель той эпохи, когда автомобили создавались с нуля, а не копировались в условиях глобализации платформ.

Имя Петра Прусова широко известно в автомобильном мире за рубежом. Помимо «Нивы», он принимал участие в разработке многих других моделей Волжского автозавода: ВАЗ-1111 «Ока», семейства ВАЗ-2110 и Samara 2, ВАЗ-2123, семейства Kalina и др. За свою жизнь Прусов дал огромное количество интервью, общался со множеством выдающихся людей, награжден большим количеством профессиональных наград и званий. Прусов – создатель Совета главных конструкторов автомобильных заводов, его первый председатель.

В 2003 году Пётр Михайлович ушел на пенсию, но всегда продолжал заниматься делами завода. Он активно участвовал в создании GM-AVTOVAZ, где до сих пор выпускается Chevrolet Niva. Непосредственно при его участии были созданы производственные площадки по сборке автомобилей LADA в Казахстане и Чечне.

В период с 2007 по 2014 гг. Прусов также являлся ведущим инженером-конструктором по омологации автомобилей на АВТОВАЗе. Всего пару месяцев назад он был назначен советником вице-президента по социальной политике и персоналу, чтобы принять участие в подготовке празднования юбилея «Нивы».

У Петра Михайловича был огромный опыт работы с ведущими мировыми автопроизводителями. Незадолго до его смерти мы встретились с ним у него дома, где вспомнили некоторые моменты его богатой биографии и попытались заглянуть в будущее…

С разрешения, которое Пётр Михайлович Прусов успел дать еще при жизни, мы публикуем отрывки из нашей беседы…

О сотрудничестве с лидерами мирового автопрома

Наиболее честное сотрудничество было при разработке так называемого «Спутника» (ВАЗ-2108 – прим.). Тогда было заключено два контракта: один – конструкторский, с фирмой Porsche, второй – технологический, с представителями FIAT. Были созданы рабочие группы в Италии и в Вайсзахе (Германия), работа шла тесно. Как всегда, на первых порах были сложности с «притиркой» характеров. Должен сказать, что когда я туда приехал, эти трудности потихоньку ушли. В основном они пришлись на долю Якова Рафаиловаича Непомнящего (заместитель главного конструктора ВАЗа в 1976 – 1981 гг. – прим.).

Потому что немцы – они и есть немцы. Они ставят вопрос и надеются, что на следующий день получат ответ. Ну, а Яков Рафаилович придерживался тактики такой, что ему надо было сначала в Россию, на ВАЗ, послать документы на согласование, это согласование получить и только тогда сформулировать ответ… На этой почве периодически возникали недоразумения, немцы даже начали требовать увеличения стоимости контракта.

Но когда на Porsche прибыл я, все изменилось. Споров, конечно, и потом хватало, потому что за любым вопросом стояли немалые деньги, но нам в итоге всегда удавалось находить общий язык. Многие участники наших рабочих групп стали впоследствии на Porsche первыми лицами. Например, Хорст Мархарт, который у нас в группе отвечал за экономику и финансы, стал позже директором инженерного центра и вице-президентом и членом правления Porsche.

У немцев была интересная тактика. Приходит, к примеру, прототип, они говорят: «Не годится!». Про один говорят «не годится», про другой – то же самое. Я не спорил, говорил: «Хорошо. Раз не годится – значит, денег вы не тратите, резервируем депозит». Но когда общая сумма «резерва» уже превысила полтора миллиона дойчмарок, они поняли, что с такой тактикой надо заканчивать. Хотя шумели все равно по-прежнему…

О немецком юморе

… Юмор у немцев был специфический. В конце недели мы ходили в паб. Там за кружкой пива они мне говорили, что это не они такие упрямые, это у них работа такая вредная.

Я тогда жил в небольшом городке Эберсхайм. А у них существовал такой день, типа нашего 1 апреля, когда ездить по указателям было невозможно, потому что все указатели специально были перепутаны – и направления, и названия. Но уже на следующий день все указатели обычно стоят правильные и все смотрят в нужном направлении.

Ну, вот однажды я приехал на работу, приходят немцы, здороваются и смотрят на меня внимательно. Я уже решил, что у меня что-то с лицом. Говорю: «У меня что-то с лицом не так?». Отвечают: «Нет, с лицом все в порядке. А вы, господин Прусов, на указателе не заметили, как называется та деревня, в которую вы въезжали?». Я говорю: «А что на нее смотреть? Эберсхайм!». «Нет, — говорят, — поедете обратно, обязательно посмотрите!». Еду обратно, смотрю, а указатель гласит: «Петерсхайм». То есть они поменяли указатель! Правда, утром действительно вернули городу прежнее название, и все указатели работали уже нормально.

…Когда я там выходил на прогулку, то сначала со всеми здоровался по-немецки. Мне не отвечал никто. Через некоторое время все стали здороваться со мной по-немецки. Тогда я стал с ними здороваться по-русски. И через некоторое время все стали здороваться со мной по-русски. А однажды в пивбаре мне показали мужика, который должен был про меня «оперу» писать – то есть сообщать уполномоченному лицу куда следует. Так вот немецкие жители и говорят мне: «Если он про тебя плохо напишет, мы его из этой деревни выгоним!».

О заимствованиях технологий у иностранцев

Иностранные концерны помогали ВАЗу проводить испытания автомобилей. Например, Porsche участвовал и в южных испытаниях, и в северных. Скажу больше, мы тогда от Porsche получили полную программу всех испытаний, которые компания проводила для своих автомобилей. Можно сказать, мы ее позаимствовали, но сделали это официально, не делая из этого секрета. Просто посмотрели, как они работают, кое-что у них запросили, и они нам дали, не возражая.

Поэтому, если вы возьмете наш каталог испытаний, допустим 1987 года, то увидите, что это полный каталог испытаний Porsche, только написанный русскими буквами. Они об этом знали, конечно. Позже я по этому поводу подписал и официальные документы. Но еще до подписания мы рассудили так: если бы они были против, то не дали бы то, что мы у них просили, а раз дали – значит, можем пользоваться.

Мы перенимали опыт у всех – не только у Porsche, но и у того же Opel. Так, например, у «Опеля» мы взяли саму последовательность испытаний, подход.

Много мы позаимствовали у Bosch – по системам впрыска, управления двигателем. Потому что мы сначала ориентировались на систему Bosch. Позже, когда уже ушли на сотрудничество с GM, перешли на систему GM. Но в конечном итоге все равно вернулись на Bosch.

Об Opel и GM

…Уход из России для Opel, безусловно, потеря. Но, являясь, по сути, американской, компания должна была играть в игру по тем правилам, которые существуют. Это политика. Им разрешили оставить лишь GM-AVTOVAZ.

И кстати, должен сказать, что при всем том, что происходит, я считаю GM-AVTOVAZ успешным проектом. И когда меня спрашивали еще тогда, в 2005 году, как я отношусь к тому, что американцы взяли платформу «Нивы» как таковую, я говорил: «Понимаю, что наш ребенок будет, наверное, лучше обут, одет, но вопрос в том, будут ли его любить так, как мы?». И должен сказать, без всяких оговорок, что любили – и любят.

О будущем LADA 4х4, «Нивы» и Chevrolet Niva 2

Наиболее реальный сценарий такой: автомобиль на базе LADA 4×4 (то, что я называю «Нивой») заканчивает свое существование. Французы считают, что новый автомобиль (новое поколение LADA 4х4 New Generation – прим.) будет на базе Duster. Я об этом знаю еще с декабря 2016 года. В ближайшее время выйдет приказ, где будет сказано, что работа над тем, что мы называем «Нива», прекратится.

Я беседовал по этому вопросу с Николя Мором, но решение зависит не от него. Может ли получиться такой автомобиль на базе Duster? Может. Но это будет все-таки не джип, а неплохой кроссовер. Кроме того, на этой платформе уже созданы, по крайней мере, три автомобиля.

По договоренностям с GM, еще в 2005 году АВТОВАЗ должен был прекратить выпуск «Нивы» (то есть LADA 4×4 – прим.), но так получилось, что автомобиль производят до сих пор.

Куда же денется сама платформа «Нивы» (права на которую и на бренд «Нива» принадлежат GM – прим.)? Продать ее кому-нибудь теоретически, конечно, можно. Но наиболее вероятно, что ее просто похоронят.

«Ниву» надо было менять давно, я об этом все время говорил. Потому что автомобиль – не коньяк, с возрастом он лучше не становится. Если бы мы заменили ее в 2012 году (на новое поколение LADA 4х4 – прим.), то сегодня вопроса по ней бы не стояло.

Что касается Chevrolet Niva 2, думаю, что GM все-таки хотели бы иметь этот проект, хотя они, конечно, и опаздывают. И хотя им обещана поддержка от нашего государства, но уверенно сказать, что этот проект состоится, я пока не могу. Думаю, что нет.

О принципе единой платформы

Это дает свои выгоды, но я не сторонник такого явления, как «глобализация платформ». Да, она дает рационализацию производства, его удешевление, но с точки зрения инженера, я считаю, в этом вопросе надо придерживаться золотой середины.

Об инженерных ресурсах и НТЦ

…Через год станет известно, что такое НТЦ. Я думаю, что НТЦ АВТОВАЗа через год может стать подразделением Renault. Это не так плохо при одном условии: если есть бойцы. Как там у Высоцкого говорится – «настоящих буйных мало, вот и нету мужиков…»

Основные российские инженерные компетенции пока еще остаются на ВАЗе. И то, что есть в НАМИ – это тоже вазовское. Если даже на АВТОВАЗе мы потеряем свою компетенцию и станем подразделением Renault, то это не благодаря той политике, которую ведет, например, Грюбель (Харальд Грюбель, вице-президент по техническому развития АВТОВАЗа – прим.). Как я уже сказал, есть определенные причины для этого.

Меня больше всего в этой системе беспокоит то, что мы стали соглашателями. Сейчас я бы не стал больше эту тему обсуждать, но согласен вернуться к ней через год…

Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Abstract

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с субсекундной кинетикой. Генетически закодированные биосенсоры на основе резонансной передачи энергии Ферстера (FRET) идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о создании и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1, Gα _i2 и Gα _i3.Для обеспечения количественной долгосрочной визуализации биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном требуются флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами. Поэтому мы используем самый яркий и наиболее фотостабильный вариант CFP, mTurquoise2, в качестве донора, слитого с субъединицей Gα _i, и cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ ₂, в качестве акцептора. Конструкции биосенсоров Gα _i FRET экспрессируются вместе с Gβ ₁ из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенными вариациями в клетках млекопитающих.Датчики Gα _i FRET показали устойчивый ответ на активацию эндогенных или сверхэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась токсином коклюша. Более того, мы наблюдали активацию сенсора Gα _i FRET в отдельных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецептор LPA ₂, M ₃ и BK ₂. Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном диапазоне времени.Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα _i1, Gα _i2 и Gα _i3 будет полезно для измерений на живых клетках, которые проверяют активацию Gα _i.

Образец цитирования: van Unen J, Stumpf AD, Schmid B, Reinhard NR, Hordijk PL, Hoffmann C, et al. (2016) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gα _i1, Gα _i2 и Gα _i3 в отдельных клетках. PLoS ONE 11 (1): e0146789.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789

Редактор: Микель Гарсиа-Маркос, Медицинский факультет Бостонского университета, США

Поступила: 25 сентября 2015 г .; Дата принятия: 22 декабря 2015 г .; Опубликован: 22 января 2016 г.

Авторские права: © 2016 van Unen et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Подкласс Gα _i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у людей, Gα _i1,2,3, кодируемых генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1] и активируется широким диапазоном Рецепторы, сопряженные с G-белком.G-белки семейства Gα _i участвуют во многих патологиях, от участия в ожирении и диабете [2], функций иммунной системы [3] до их критических ролей на нескольких этапах биологии рака [4–7]. . Активация Gα _i преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако недавно активация Gα _i была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K / Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

Измерение активации Gα _i обычно проводят путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования дальше по течению, такие измерения лишены пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11–13].

Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением можно использовать генетически закодированные биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14].Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы донора к молекуле акцептора, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям в эффективности RET, которые могут быть определены количественно.

Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с миллисекундным разрешением, что может использоваться для определения межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров.Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

Gα _i был успешно помечен люциферазой в различных внутренних сайтах и использован для измерения BRET между различными субъединицами Gα _i и GPCR [16–19] или Gγ [19]. Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα _i1, Gα _i2 и Gα _i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23].Чтобы получить надежные измерения FRET, которые проверяют активацию Gα _i, мы соединили Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным циановым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25]. В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутированную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ ₂, который ранее использовался в качестве акцептора в единственной плазмиде Gα _q FRET сенсора [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию для облегчения протоколов трансфекции и обеспечения четко определенного соотношения экспрессии донора и акцептора в клетках [27].Эта стратегия экспрессии должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию создания, валидацию и описание этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3. Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет характеризовать фармакологические лекарственные средства и определять on- и off-кинетику для агонистов и антагонистов на Gα _i-связанных GPCR.

Результаты

Создание конструкций

Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα _i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC. Этот сайт встраивания, который, как было ранее показано, сохраняет скорости обмена нуклеотидов и GTPase реакции, сопоставимые с белками дикого типа [20]. Gα _i1 -mTq2 отображает локализацию плазматической мембраны при экспрессии в клетках HeLa (рис. 1A).Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα _i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации комплекса гетеротримерного G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21]. Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα _q достигается с cpVenus-Gγ ₂ [26]. Поскольку Gα _i имеет высокую структурную гомологию с Gα _q и сайт, в который вставлен mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET.Следовательно, чтобы ввести меченый гетеротримерный G-протеиновый комплекс в клетки, мы совместно экспрессировали Gα _i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ ₂ и немаркированным Gβ ₁ [26]. Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α ₂ (α ₂ AR) с UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, отражающую потерю FRET. Утрата FRET может быть интерпретирована как диссоциация гетеротримеров или изменение относительной конформации донора и акцептора.Чтобы обеспечить устойчивую коэкспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как мы сообщали ранее для сенсора Gα _q (рис. 1B) [26]. Эта стратегия использует вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα _i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ ₂) в отдельных клетках, при минимизации гетерогенности межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα _i1 -mTq2 неправильно локализован в цитоплазме многих клеток (Рис. 1C).Субъединица Gα _i1 миристоилирована и требует наличия остатка глицина сразу после ее исходного метионина. Детальный анализ плазмидной последовательности выявил дополнительный стартовый кодон для Gα _i1 -mTq2 перед нативным стартовым кодоном, генерируемый последовательностью IRES (фиг. 1B). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα _i1 -mTq2 транслируется из вышележащего метионина в последовательности IRES, что не приводит к образованию миристоилированного белка.Мы удалили вышестоящий метионин с помощью ПЦР с полным вектором (см. Материалы и методы), в результате чего остался только нативный стартовый кодон Gα _i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования. Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованный Gα _i1 -mTq2 (рис. 1B и 1C). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα _i2 и датчик Gα _i3. Чтобы изучить коэкспрессию трех субъединиц (Gα _i1 -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (рис. 1D).Флуоресценция CFP и YFP в стратегии трансфекции с одной плазмидой имела коэффициент детерминации r ², равный 0,64, тогда как трансфекции с тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r ², равный 0,36, между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3: 1 выше и ниже последовательности IRES, что, как ранее было показано, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα _q FRET. датчик [27].Наконец, отдельные плазмидные конструкции упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα _i -сенсорами.

Рис. 1. Разработка и характеристика нового датчика Gα _i1.

(A) Типичное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα _i1, слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -CFP, управляемую промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα _i1. Предлагаемая трансляция белка показана в строке под последовательностью ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ ₂ ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1.0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правый столбец ) датчика Gα _i1.(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ ₂ и Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмиды ( слева, ) по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид ( справа, ). Точки отображают интенсивность CFP и YFP, количественно определенную для отдельных отдельных ячеек. R ² — коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0146789.g001

Показатели в анализах активации GPCR

Для тестирования нового биосенсора Gα _i1 при визуализации живых клеток мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связан с Gα _i1, адренергическим рецептором α ₂ (α ₂ AR). Клетки HeLa, которые, как было показано ранее, эндогенно содержат АР α ₂ [20], были трансфицированы биосенсором Gα _i1. При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα _i1, которое было возвращено к исходному уровню добавлением 60 мкМ α ₂ AR. антагонист Йохимбин (рис. 2А). Токсин коклюша (PTX), как было показано, инактивирует передачу сигналов Gα _i в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα _i [28], что предотвращает его взаимодействие с GPCR. Активация Gα _i1 была полностью отменена инкубацией в течение ночи с PTX, показывая, что слитый белок Gα _i1 -mTq2 все еще остается чувствительным к PTX (рис. 2A). Чтобы подтвердить, что датчик можно использовать для анализа активации эндогенных рецепторов в первичных клетках Gα _i1, мы повторили этот эксперимент на HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека).Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало стойкое снижение отношения FRET для Gα _i1 -сенсора (рис. 2B), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ. Затем, чтобы изучить, насколько надежен датчик Gα _i1 на других анализах активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связаны с Gα _i. Рецептор брадикинина 2B (BK _2B) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA ₂) [31,32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M ₃) [33,34] были совместно трансфицированы с биосенсор Gα _i1 в клетках HeLa.После стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение соотношения FRET биосенсора Gα _i1 (рис. 2C). Рецептор M ₃ также показал полное восстановление отношения FRET до исходного уровня после добавления антагониста атропина. Рецептор M ₃ в основном известен своей передачей сигналов через Gα _q. Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα _i через рецептор M ₃ [19,33–36], что согласуется с нашими наблюдениями.

Рис. 2. Характеристики Gα _i -сенсоров в анализах передачи сигналов GPCR одиночной клетки.

(A) Эксперименты по визуализации соотношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1. Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP / CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфического агониста α ₂ AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα _i1 -сенсоре в клетках, стимулированных UK-14304.(B) Эксперименты по визуализации отношения FRET в Huvecs, трансфицированных датчиком Gα _i1. Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат). Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα _i1 -сенсоре в S1P-стимулированных клетках. (C) Эксперименты по визуализации отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1 и BK _2B ( вверху справа ), LPA ₂ ( вверху слева ), M ₃ ( внизу справа ) и β ₂ AR-2A2-m Черри ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK _2B), 1 мкМ лизофосфатидной кислоты (LPA ₂), 100 мкМ карбахолина и (M ₃) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β ₂ AR).Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK _2B, LPA ₂ и M ₃, демонстрируют четкое изменение соотношения YFP / CFP FRET при добавлении их соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β ₂ AR не изменяет FRET. передаточное отношение датчика Gα _i1. В контрольных условиях клетки HeLa, трансфицированные только сенсором Gα _i1, получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i2 или датчиком Gα _i3.Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) коклюшного токсина (PTX) устраняет ответ на биосенсоры Gα _i2 и Gα _i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t = 32 с, и антагонист добавляли при 90 213 t 90 214 = 152 с, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 секунд.Временные графики показывают среднее изменение отношения флуоресценции YFP / CFP (± s.e.m). Средние кривые состоят из данных по меньшей мере 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным количеством клеток ( n ) на условие.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g002

В условиях контроля, например В отсутствие сверхэкспрессированного GPCR мы стимулировали клетки HeLa соответствующим агонистом и антагонистом и наблюдали лишь очень незначительный ответ на сенсоре Gα _i1 в случае стимуляции LPA.Скорее всего, это связано с активацией эндогенных рецепторов LPA в клетках HeLa [37]. Когда мы котрансфицировали адренергический рецептор β ₂ (β ₂ AR), ни одна из клеток не показала активацию Gα _i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (рис. 2С). Следует отметить, что β ₂ AR является классическим активатором Gα _s, но при определенных условиях сообщалось о переходе на Gα _i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и сходные условия (сверхэкспрессия β ₂ AR и гетеротримерные сенсоры G-белка) [19].Также в этом случае не наблюдалась активация Gα _i1 при стимуляции β ₂ AR (и только небольшая активация Gα _i2 и Gα _i3, которая была> 10 раз ниже, чем активация альфа-2C. адренорецептор, сильный активатор Gα _i).

Чтобы проверить работоспособность биосенсоров Gα _i2 и Gα _i3, мы трансфицировали клетки HeLa их соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα _i1 на рис. 2А, мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, и сигнал вернулся к исходному уровню при добавлении 60 мкМ йохимбина (рис. 2D).В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα _и. И Gα _i2 -mTq2, и Gα _i3 -mTq2 все еще чувствительны к лечению PTX, как показано по исчезновению ответа FRET после инкубации с PTX в течение ночи (рис. 2D).

Быстрые кинетические измерения

Чтобы более подробно изучить субсекундную кинетику активации Gα _i1 в живых клетках, клетки HEK293 котрансфицировали с помощью Gα _i1 -сенсора и α ₂ AR или рецептора аденозина A1, соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET одной клетки показывают быструю потерю отношения FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После отмывания лиганда сигнал FRET возвращается к исходным уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (рис. 3A). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после непродолжительного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) (рис. 3B).

Рис 3.Характеристики датчика Gα _i1 при кинетических измерениях.

(A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и α ₂ AR, многократно стимулировали 20 мкМ норэпинефрина в течение интервалов, обозначенных короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, выполненных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET.(B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что показано короткой горизонтальной линией. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, выполненных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET. (C) Увеличенное изображение он-кинетики активации Gα _i1, показывающее нормализованное соотношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0.18 (R = 0,99). (D) График разброса, показывающий средние экспоненциальные константы времени (тау) объединенных данных из (n = 10) индивидуальных подборов клеток HEK293, трансфицированных Gα _i1 -сенсором, и α ₂ AR, стимулированных 100 мкМ норэпинефрина или объединенных данные (n = 14) по индивидуальным подборам Gα _i1 -сенсора и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно. Планки погрешностей указывают 95% доверительный интервал.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g003

Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки кинетики активации Gα _i1 с субсекундным разрешением (рис. 3C), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. 3А. Кривая была подогнана к однокомпонентной функции экспоненциального затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

Чтобы оценить точную динамическую кинетику Gα _i1 -сенсора, клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина).Каждый индивидуальный ответ был подогнан к однокомпонентной экспоненте, что привело к средним значениям τ для α ₂ AR, равным 887 мс, и для аденозина A1, равным 963 мс (рис. 3D), что соответствует периодам полувыведения 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями активации G-белка с помощью FRET [21,40,41].

Заключительные замечания

В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1, Gα _i2, Gα _i3.Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорским флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора FRET Gα _q обеспечивает самый большой динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримеров (Gα _i -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂) были сконфигурированы на одной плазмиде, что обеспечивало устойчивую коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью ратиометрической визуализации FRET одной клетки.Стандартизованная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-белка повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями. Примером в данной статье является надежная работа датчика Gα _i1 в трех разных лабораториях без оптимизации экспериментальных условий.

Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримеров, что может влиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα _i в первичных клетках через эндогенные GPCR. Кроме того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 между различными GPCR, связанными с Gα _и, что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα _i. сигнальные пути [42].

Методы

Конструирование флуоресцентных слитых белков

Для вставки mTurquoise2-Δ9 (здесь сокращенно mTq2) [25] в белки Gα _i1, Gα _i2 и Gα _i3, версию mTq2 с сайтами рестрикции Age1 на N-конце и C-конце. был сконструирован путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5′-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3 ‘и обратным праймером 5′-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3’. Чтобы ввести Age1-сайт в Gα _i1 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha _i1 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3 ‘и обратным праймером 5’-ATaccggtCGCCGTC -3 ‘.Чтобы ввести Age1-сайт в Gα _i2 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha _i2 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3 ‘и обратным праймером 5’- TAaccGAGTGGG -3 ‘. КДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha _i3 с сайтом Age1, была синтезирована Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα _i1, Gα _i2 и Gα _i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к получению RnGalpha _i1, помеченного mTq2 после позиции 121, и HsGalpha _i2,3. mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченному Gα _i1,2,3 [20].

Для создания варианта 1.0 сенсора Gα _i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα _i1 с прямым праймером 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ‘и обратным праймером 5′-TATggatccAGCTTAGAAGAGACCACAGTC-3’ для введения a Сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем было выполнено тройное лигирование с продуктом ПЦР (разрезанным с помощью BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ ₁ -T2A-cp173Venus-Gγ ₂ [43] (разрезанный с помощью BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG -IRES [44] (вырезано с помощью NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-MATT-Gα _i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации плазматической мембраны), pGβ ₁ и cp173Venus-Gγ ₂ (рис. 1B).

Чтобы сконструировать вариант 2.0 сенсора Gα _i1, мы выполнили ПЦР с мутагенезом с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямым 5′-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-‘3 и 5’-GCTCAGTGTGCAGCCCATATTATCGTCGTC.Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα _i1 -mTq2 (правильно расположен на плазматической мембране), pGβ и cpVenus-Gγ ₂ (рис. 1B).

Чтобы создать единый плазмидный сенсор для Gα _i2 и Gα _i3, мы выполнили ПЦР с расширением перекрывания [45]. Gα _i2 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3’ и обратным праймером ‘5 -TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, и Gα _{i3 -mTgTgTgTgTgat 5-i3} -mACTgTGTGat 5 амплифицировали с прямым и обратным праймером acgatGTGatGat с прямым и обратным праймером acgatGatGat праймер ‘5 -TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3’.Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одиночном плазмиде Gα _q -сенсора с прямым праймером «5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3» и обратным праймером «5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag -3». Впоследствии описанный выше продукт ПЦР Gα _i2 -mTq2 или Gα _i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР датчика Gα _q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3 ‘и обратный праймер’ 5- TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3 ‘и прямой праймер’ 5- GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и обратный праймер’ 5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3 ‘соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в основную цепь сенсора Gα _q с помощью SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus -Gγ ₂ -IRES-Gα _i2 -mTurquoise2-Δ9 и — _{1 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα _i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα _i1 -mCitrine и HsGα _i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα _i1 отличается только одной аминокислотой от Gα _i1 человека (S98A). Рецептор LPA ₂ был получен с cDNA.org. BK ₂ R [46], α ₂ AR [21], M ₃ R [47] и рецептор A1 [48] были описаны ранее. β ₂ AR-P2A-mCherry — подарок от Анны Пьетрашевской (Амстердамский университет).}

Культура клеток и подготовка проб

клеток HeLa (Американская коллекция культур тканей: Манассас, штат Вирджиния, США) культивировали в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды) с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллином (100 Ед / мл). ) и стрептомицин (100 мкг / мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

Клетки трансфицировали в 35-миллиметровой чашке со стеклянным покровным стеклом 24 мм Ø # 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), используя 1-2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5-1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл. OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37 ° C и 5% CO ₂ покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL ₂, 0,8 мМ MgCl ₂ и 20 мМ глюкозы). Вся микроскопия живых клеток проводилась при 37 ° C.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Verviers, Бельгия). HUVEC использовали в пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Один импульс генерировали при 1300 В в течение 30 мс для микропорации HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 клетки HEK293 культивировали в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия) в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина (2 мМ). (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) и хранили при 37 ° C в атмосфере 7% CO2.Клетки собирали и высевали на 24-миллиметровые покровные стекла, покрытые D-полилизином, при ~ 40% конфлюентности. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α ₂ AR или аденозин A1) и 3,0 мкг pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с использованием реагента для трансфекции Effectene ^® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперслили с этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютерной системы. Устройство быстрой суперфузии с электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

Широкопольная микроскопия

Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены на рис. 2A, 2C и 2D) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды), выдерживали при 37 ° C, снабжали иммерсионным масляным объективом (Plan-Neoflor 40 × / 1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновую дуговую лампу с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с заряженной связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Tucson, AZ, США). Типичное время экспозиции составляло от 75 мс до 150 мс, а интервал камеры был установлен на 4×4. Флуорофоры возбуждались светом 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражались на образец дихроичным зеркалом 455DCLP, эмиссия CFP регистрировалась фильтром BP470 / 30, а эмиссия YFP регистрировалась фильтром BP535 / 30 путем вращения колеса фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражался на образец дихроичным 515DCXR, а излучение регистрировалось фильтром BP535 / 30. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, просачивание эмиссии CFP в канал YFP (55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на рис. 2B) микроскоп Zeiss Observer Z1 использовался в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) с 40x NA 1.3 масляный иммерсионный объектив и возбуждающий источник света HXP 120 В. CFP возбуждали через куб фильтра FRET (Exciter ET 436 / 20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на прикрепленный адаптер двойной камеры (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Эмиссионные волны с длинами волн 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Длина волны излучения 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40 м (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США), а затем фиксируется второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений производилось с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и утечку эмиссии CFP в канале YFP (62% от интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 (результаты представлены на рис. 3) визуализация проводилась на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия), оборудованном масляным иммерсионным объективом 63x и фотометрическая система с двойным излучением (Till Photonics), описанная ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом от полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP / CFP) регистрировались одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на длине волны 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировались фотодиодами и оцифровывались с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были подогнаны к однокомпонентной функции экспоненциального затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени tau [39]. Полупериод активации (t _1/2) определяется как τ * ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкм), йохимбином (60 мкм), брадикинином (1 мкм), LPA (1 мкм), карбахолом (100 мкм), атропином (10 мкм), изопротеренолом (10 мкм), пропранололом (10 мкм), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здоровья) использовался для анализа необработанных изображений микроскопии. Дальнейшая обработка данных была выполнена в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика были выполнены с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

Конфокальная микроскопия

клеток HeLa, трансфицированных указанными конструкциями, получали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оснащенного иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

Образцы

последовательно возбуждали лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP482 / 35; Эмиссию YFP фильтровали через эмиссионный фильтр BP540 / 30. Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал.

Благодарности

Мы благодарим Eelco Hoogendoorn (Амстердамский университет) и Marten Postma (Амстердамский университет) за помощь в анализе данных.Мы благодарим Йоррита Броертьеса (магистранта Амстердамского университета) и Денниса Ботмана (магистра наук Амстердамского университета) за создание Gα _i1 -mTurquoise2 и Gα _i2 -mTurquoise2 соответственно. Мы благодарим Мерел Аджобо-Херманс, Анну Пьетрашевскую и Скотта Гибсона за предоставленные плазмиды.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JvU PLH CH JG TWG. Проведены эксперименты: JvU ADS BS NRR. Проанализированы данные: JvU ADS BS NRR CH JG.Написал статью: JvU ADS BS NRR PLH CH TWG JG.

Ссылки

1. Суки В.Н., Абрамовиц Дж., Маттера Р., Кодина Дж., Бирнбаумер Л. Геном человека кодирует по крайней мере три неаллеллических G-белка с субъединицами альфа i-типа. FEBS Lett. 1987; 220: 187–192. pmid: 2440724
2. Kimple ME, Neuman JC, Linnemann AK, Casey PJ. Ингибирующие G-белки и их рецепторы: новые терапевтические мишени при ожирении и диабете. Exp Mol Med. 2014; 46: e102. pmid: 24946790
3.Ван И, Ли Й, Ши Г. Регулирующая функция гетеротримерных белков G в иммунной системе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2013; 61: 309–319.
4. Дорсам РТ, Гуткинд Ж.С. Рецепторы, сопряженные с G-белком, и рак. Нат Рев Рак. 2007; 7: 79–94. pmid: 17251915
5. Даака Ю. Белки G при раке: парадигма рака простаты. Sci STKE. 2004; 2004: re2. pmid: 14734786
6. Appleton KM, Bigham KJ, Lindsey CC, Hazard S, Lirjoni J, Parnham S и др.Разработка ингибиторов гетеротримерных субъединиц Gαi. Bioorg Med Chem. 2014; 22: 3423–3434. pmid: 24818958
7. Раймонд Дж. Р., Эпплтон К. М., Пирс Дж. Ю., Петерсон Ю. К.. Подавление сообщения GNAI2 при раке яичников. J Ovarian Res. 2014; 7: 6. pmid: 24423449
8. Гарсия А., Ким С., Бхавараджу К., Шенвалдер С.М., Кунапули С.П. Роль фосфоинозитид-3-киназы бета в агрегации тромбоцитов и генерации тромбоксана А2, опосредованной сигнальными путями Gi. Биохим Дж.2010. 429: 369–377. pmid: 20441566
9. la Sala A, Gadina M, Kelsall BL. G (i) -зависимое ингибирование продукции IL-12 опосредуется активацией пути фосфатидилинозитол-3-киназа-протеин-3-киназа B / Akt и JNK. J Immunol. 2005; 175: 2994–2999. pmid: 16116186
10. Kue PF, Daaka Y. Существенная роль G-белков в росте клеток рака простаты и передаче сигналов. J Urol. 2000. 164: 2162–2167. pmid: 11061948
11. Hur EM, Kim KT.Передача сигналов рецептора, связанного с G-белком, и перекрестные помехи: достижение быстроты и специфичности. Сотовый сигнал. 2002; 14: 397–405. pmid: 11882384
12. Брюс ДжиЭ, Штрауб С.В., Йол Д.И. Перекрестные помехи между передачей сигналов цАМФ и Са2 + в невозбудимых клетках. Клеточный кальций. 2003. 34: 431–444. pmid: 14572802
13. Фей Д., Краучер Д. Р., Колч В., Холоденко Б. Н.. Перекрестные помехи и переключатели сигналов в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ. Front Physiol. 2012; 3: 355. pmid: 23060802
14.Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансного переноса энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации рецепторов, связанных с G-белками, и передачи сигналов. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612
15. ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов GPCR с помощью RET-биосенсоров в живых организмах. Mol Pharmacol. 2015. 88 (3): 589–595.
16. Гейлс С., Ван Дурм Дж.Дж., Шаак С., Понтье С., Першрансье Й., Одет М. и др.Исследование структурных перестроек, вызванных активацией, в предварительно собранных комплексах рецептор-G-белок. Nat Struct Mol Biol. 2006. 13: 778–786. pmid: 16₈
17. Gales C, Rebois RV, Hogue M, Trieu P, Breit A, Hébert TE и др. Мониторинг в реальном времени взаимодействий рецепторов и G-белков в живых клетках. Нат методы. 2005; 2: 177–184. pmid: 15782186
18. Ayoub MA, Maurel D, Binet V, Fink M, Prezeau L, Ansanay H, et al. Анализ в реальном времени вызванной агонистами активации протеазо-активированного комплекса рецептор 1 / Galphai1, измеренный с помощью биолюминесцентного резонансного переноса энергии в живых клетках.Mol Pharmacol. 2007. 71: 1329–1340. pmid: 17267663
19. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012; 8: 623–631.
20. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка α2-адренорецепторами. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212.
21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединиц, а не с диссоциацией. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003; 100: 16077.
22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Датчик цАМФ на основе mTurquoise как для FLIM, так и для логометрического считывания имеет улучшенный динамический диапазон. PLoS ONE. 2011; 6: e19170. pmid: 21559477
23. Спарта Б, Парджетт М, Минге М, Дистор К, Белл Дж, Олбек Дж.Для импульсов активности киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), необходимы механизмы рецепторного уровня. J Biol Chem. 2015; 290: 24784–24792. pmid: 26304118
24. Hamers D, van Voorst Vader L, Borst JW, Goedhart J. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений. Протоплазма. 2014; 251: 333–347. pmid: 24337770
25. Goedhart J, Stetten von D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA и др.Структурно-управляемая эволюция голубых флуоресцентных белков в направлении квантового выхода 93%. Nature Communications. 2012; 3: 751. pmid: 22434194
26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9: 32. pmid: 21619590
27. Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I, Hink MA, Gadella TWJ. Количественная совместная экспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET.Дельпрато А.М., редактор. PLoS ONE. 2011; 6: e27321. pmid: 22114669
28. Бернс DL. Субъединичная структура и ферментативная активность токсина коклюша. Microbiol Sci. 1988. 5: 285–287. pmid: 2
8
29. Ван Ф., Ван Броклин Дж. Р., Хобсон Дж. П., Мовафаг С., Жуковска-Гройец З., Мильстиен С. и др. Сфингозин-1-фосфат стимулирует миграцию клеток через рецептор клеточной поверхности, связанный с G (i). Возможное участие в ангиогенезе. J Biol Chem. 1999; 274: 35343–35350. pmid: 10585401
30.Ляо JK, Homcy CJ. Белки G семейства G alpha i и G alpha q связывают рецептор брадикинина с высвобождением релаксирующего фактора эндотелия. J Clin Invest. 1993; 92: 2168–2172. pmid: 8227332
31. ван Корвен EJ, Groenink A, Jalink K, Eichholtz T., Moolenaar WH. Пролиферация клеток, индуцированная лизофосфатидатом: идентификация и анализ сигнальных путей, опосредованных G-белками. Клетка. 1989; 59: 45–54. pmid: 2551506
32. An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl EJ.Характеристика нового подтипа человеческого рецептора, связанного с G-белком, для лизофосфатидной кислоты. J Biol Chem. 1998; 273: 7906–7910. pmid: 9525886
33. Offermanns S, Wieland T, Homann D, Sandmann J, Bombien E, Spicher K и др. Трансфицированные мускариновые рецепторы ацетилхолина селективно связываются с белками G Gi-типа и Gq / 11. Mol Pharmacol. 1994; 45: 890–898. pmid: 81
34. Akam EC, Challiss RA, Nahorski SR. Профили активации G (q / 11) и G (i / o) в клетках СНО, экспрессирующих человеческие мускариновые рецепторы ацетилхолина: зависимость от агониста, а также от подтипа рецептора.Br J Pharmacol. 2001; 132: 950–958. pmid: 11181437
35. Хорниголд, округ Колумбия, Мистри Р., Раймонд П.Д., Бланк Д.Л., Челлисс Р.Дж. Доказательства перекрестного взаимодействия между мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами M2 и M3 в регуляции вторичного мессенджера и внеклеточных сигнальных путей передачи сигналов киназы в клетках яичников китайского хомячка. Br J Pharmacol. 2003. 138: 1340–1350. pmid: 12711635
36. Blaukat A, Barac A, Cross MJ, Offermanns S, Dikic I. G-белок-связанный рецептор-опосредованная активация митоген-активируемой протеинкиназы через взаимодействие сигналов Galpha (q) и Galpha (i).Молекулярная и клеточная биология. 2000. 20: 6837–6848. pmid: 10958680
37. Jongsma M, Matas-Rico E, Rzadkowski A, Jalink K, Moolenaar WH. LPA — хеморепеллент для клеток меланомы B16: действие через рецептор LPA5, повышающий цАМФ. PLoS ONE. 2011; 6: e29260. pmid: 22195035
38. Хилл SJ, Бейкер JG. Взлеты и падения переключения Gs- на Gi-белок. Br J Pharmacol. 2003; 138: 1188–1189. pmid: 12711616
39. Hoffmann C, Gaietta G, Bünemann M, Adams SR, Oberdorff-Maass S, Behr B и др.Подход FRET на основе FlAsH для определения активации рецепторов, связанных с G-белками, в живых клетках. Нат методы. 2005. 2: 171–176. pmid: 15782185
40. Хайн П., Роша Ф., Хоффманн С., Дорш С., Николаев В.О., Энгельгардт С. и др. Активация GS ограничена по времени при инициировании передачи сигналов, опосредованной рецептором. Журнал биологической химии. 2006; 281: 33345–33351. pmid: 16963443
41. Hoffmann C, Nuber S, Zabel U, Ziegler N, Winkler C, Hein P и др. Сравнение кинетики активации M3-ACh-рецептора и конститутивно активного мутантного рецептора в живых клетках.Mol Pharmacol. 2012; 82 (2): 236–245 pmid: 22564786
42. Деванатан В., Хагедорн И., Келер Д., Пекса К., Черпокова Д., Крафт П. и др. Белок Gαi2 тромбоцитов является важным медиатором тромбовоспалительного поражения органов у мышей. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 6491–6496. pmid: 25944935
43. Нагаи Т., Ямада С., Томинага Т., Итикава М., Мияваки А. Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca (2+) за счет циркулярно пермутированных желтых флуоресцентных белков.Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 10554–10559. pmid: 15247428
44. Мартин П., Албагли О., Погги М.С., Булукос К.Е., Погнонец П. Разработка нового бицистронного ретровирусного вектора с сильной активностью IRES. BMC Biotechnol. 2006; 6: 4. pmid: 16409632
45. Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез с помощью ПЦР-управляемого удлинения перекрытия. Nat Protoc. 2007; 2: 924–932. pmid: 17446874
46. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, Gadella TWJ.Регулирование заякоривания мембраны PLCbeta1a его субстратом фосфатидилинозитол (4,5) -бисфосфатом. Журнал клеточной науки. 2008; 121: 3770–3777. pmid: 18957514
47. Ziegler N, Bätz J, Zabel U, Lohse MJ, Hoffmann C. Датчики на основе FRET для человеческих рецепторов M1-, M3- и M5-ацетилхолина. Bioorg Med Chem. 2011; 19: 1048–1054. pmid: 20716489
48. Klotz KN, Hessling J, Hegler J, Owman C, Kull B., Fredholm BB, et al. Сравнительная фармакология подтипов аденозиновых рецепторов человека — характеристика стабильно трансфицированных рецепторов в клетках СНО.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1998; 357: 1–9. pmid: 9459566

(PDF) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

18. Аюб М.А., Маурел Д., Бине В., Финк М., Презо Л., Ансанай Х и др. Анализ в реальном времени индуцированной агонистом-

активации протеазно-активированного рецепторного 1 / белкового комплекса Galphai1, измеренный с помощью биолюминесцентного резонансного переноса энергии в живых клетках.Mol Pharmacol. 2007; 71: 1329–1340. DOI: 10.1124 /

mol.106.030304 PMID: 17267663

19. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT, et al. Расшифровка сплетения комплекса предвзятого агонизма

выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012; 8:

623–631. DOI: 10,1038 / nchembio.961

20. Гибсон С.К., Гилман АГ. Обе субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка с помощью α2-адрен-

ергических рецепторов.Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212. DOI: 10.1073 /

pnas.0509763102

21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединицы

, а не с диссоциацией. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003;

100: 16077. doi: 10.1073 / pnas.2536719100

22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Улучшен датчик цАМФ на основе mTurquoise для

как FLIM, так и ратиометрическое считывание динамический диапазон.PLoS ONE. 2011; 6: e19170. DOI: 10.

1371 / journal.pone.0019170 PMID: 21559477

23. Спарта Б., Паргетт М., Минге М., Дистор К., Белл Г., Олбек Дж. Необходимы механизмы рецепторного уровня

для активности киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), стимулированной эпидермальным фактором роста (EGF)

импульсов. J Biol Chem. 2015; 290: 24784–24792. doi: 10.1074 / jbc.M115.662247 PMID: 26304118

24. Хамерс Д., ван Ворст Вейдер Л., Борст Дж. В., Годхарт Дж. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений.Протоплазма. 2014; 251: 333–347. doi: 10.1007 / s00709-013-0590-z PMID:

24337770

25. Годхарт Дж., Стеттен фон Д., Нуарклерк-Савойе М., Лелимусен М., Джузен Л., Хинк М.А. и др. Структура

управляла эволюцией голубых флуоресцентных белков до квантового выхода 93%. Nature Communica-

сообщений. 2012; 3: 751. doi: 10.1038 / ncomms1738 PMID: 22434194

26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al.

Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках.BMC Biol. 2011; 9: 32.

doi: 10.1186 / 1741-7007-9-32 PMID: 21619590

27. Goedhart J, van Weeren L., Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I, Hink MA, Gadella TWJ. Количественный анализ

Коэкспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET. Delprato

AM, редактор. PLoS ONE. 2011; 6: e27321. PMID: 22114669

28. Burns DL. Субъединичная структура и ферментативная активность токсина коклюша. Microbiol Sci. 1988; 5: 285–287.

PMID: 2

29.Ван Ф., Ван Броклин Дж. Р., Хобсон Дж. П., Мовафаг С., Жуковска-Гройец З., Мильстиен С. и др. Сфингозин

1-фосфат стимулирует миграцию клеток через рецептор на поверхности клетки, связанный с G (i). Возможное участие в ангиогенезе. J Biol Chem. 1999; 274: 35343–35350. PMID: 10585401

30. Ляо JK, Homcy CJ. Белки G семейства G alpha i и G alpha q связывают рецептор брадикинина

с высвобождением релаксирующего фактора, производного от эндотелия. J Clin Invest.1993; 92: 2168–2172. DOI: 10.1172 /

JCI116818 PMID: 8227332

31. ван Корвен EJ, Groenink A, Jalink K, Eichholtz T, Moolenaar WH. Индуцированная лизофосфатидатом пролиферация клеток pro-

: идентификация и анализ сигнальных путей, опосредованных G-белками. Клетка. 1989; 59:

45–54. PMID: 2551506

32. An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl EJ. Характеристика нового подтипа человеческого рецептора

, связанного с G-белком, для лизофосфатидной кислоты.J Biol Chem. 1998; 273: 7906–7910. PMID: 9525886

33. Offermanns S, Wieland T, Homann D, Sandmann J, Bombien E, Spicher K и др. Трансфицированные рецепторы мускатного ацетилхолина

селективно связываются с белками G Gi-типа и Gq / 11. Mol Pharmacol. 1994;

45: 890–898. PMID: 81

34. Akam EC, Challiss RA, Nahorski SR. Профили активации G (q / 11) и G (i / o) в клетках СНО, экспрессирующих

человеческих мускариновых ацетилхолиновых рецепторов: зависимость от агониста, а также от подтипа рецептора.Br J

Pharmacol. 2001; 132: 950–958. DOI: 10.1038 / sj.bjp.0703892 PMID: 11181437

35. Хорниголд, округ Колумбия, Мистри Р., Раймонд, Полицейский, Бланк Дж. Л., Челлисс РАДж. Доказательства перекрестного взаимодействия между M2 и

мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами M3 в регуляции вторичного мессенджера и внеклеточного сигнала —

регулируемые пути передачи сигналов киназ в клетках яичников китайского хомячка. Br J Pharmacol. 2003; 138:

1340–1350. DOI: 10.1038 / sj.bjp.0705178 PMID: 12711635

36.Blaukat A, Barac A, Cross MJ, Offermanns S, Dikic I. G-белок-связанный рецептор-опосредованный митоген-

активировал активацию протеинкиназы через взаимодействие сигналов Galpha (q) и Galpha (i). Молекулярный

и клеточная биология. 2000; 20: 6837–6848. PMID: 10958680

Новое поколение датчиков FRET для Gα

Активация

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0146789 22 января 2016 г. 13/14

Обзор Mercedes-Benz G550 4×4 Squared: жизнь преувеличена

Карабкаясь по покрытым мхом камням и спускаясь по скользким насыпям, мы медленно продвигаемся вперед, турбо-катушка и хриплый выхлоп издают звуки, которые можно услышать только из-за грохота известняка под нашими колесами.Где-то ближе к вершине вершины рыжий ястреб кричит, предупреждая, когда наша ведущая машина движется на север по гребню. Это был отличный день, чтобы покататься на внедорожнике за четверть миллиона долларов, и, судя по бороде Зевса, он казался таким же счастливым, как и мы.

С тем же успехом мы могли бы оказаться в самом сердце Шварцвальда в Германии, несмотря на то, что вокруг нас покрыты лесным покровом, туманом, мхом и горами. Внедорожный парк «Грязная черепаха» на севере Кентукки включает 270 акров трасс и бесконечные внедорожные испытания, и с парнями из All-Terrain Outfitters, выступающими в качестве ведущих эвакуационных автомобилей / корректировщиков, мы были готовы поставить воплощение Mercedes 4×4². -Benz G-Wagen через его шаги.

В то время как большая часть широкой публики либо ахнула от отвращения, либо аплодировала при виде нашего негабаритного немецкого арендатора, близкие друзья разинули рот, узнав, что да, мы действительно возьмем этот внедорожник за четверть миллиона долларов на бездорожье. Естественно, мы проигнорировали как ненавистников, так и неверующих, тестируя G550 4×4² и в качестве повседневного водителя, и в качестве поливающего грязью катка Biturbo.

Построенный настолько крутым и жестоким, насколько это возможно, последний ура уходящему поколению G-Wagen — это проявление экстремизма и простоты.Этот демилитаризованный G-Wagen с роскошной кабиной и подкреплением Unimog, возможно, является одним из самых выгодных грузовиков, которые можно купить за деньги — при условии, что у кого-то его чертовски много.

Mercedes-Benz G550 4×4 в квадрате развивает 416 л.с. и 450 фунт-фут крутящего момента.

Оснащенный всем, от арок из углеродного волокна до регулируемой двухтрубной подвески KW, 4×4² упакован так, чтобы выглядеть и выполнять роль самонадеянного мощного игрока.К сожалению, поскольку большинство людей, которые могут купить одного из этих зверей, гораздо более склонны к прогулкам по городу, чем к тому, чтобы научиться последовательно открывать шкафчики G, первая часть нашего обзора останется зарезервированной для впечатлений от вождения на улице.

На дороге и в городской среде внедорожник 4×4² возвышается над большинством своих соотечественников-транспортных средств. Тем не менее, несмотря на его заметную подъемную силу, громадные размеры и неизбежную слабину рулевого управления, как только вы привыкнете к 7-футовой 4-дюймовой высоте и почти такой же ширине этого G, управлять им становится невероятно просто.Просто помните, что есть причина, по которой этот резервуар имеет квадратную форму, и что большинство парковочных площадок не вмещают его, поэтому поиск подходящей парковки может занять некоторое время.

И мы не шутим, когда говорим просто. Нет проекционного дисплея или настроек привода, которые можно было бы переключать. Черт, на этой машине нет даже круиз-контроля — только педали тормоза и газа, руль и несколько причудливых переключателей из сплава для различных климатических условий и потребностей вождения. Органы управления водителя следуют той же философии, что и прямые линии тела G.Это невероятно упрощенный подход старой школы к управлению автомобилем, глоток свежего воздуха для воинов выходного дня.

Что касается опций, наш G был оснащен одним апгрейдом за 6500 долларов: потрясающий оттенок металлической краски паприки. Покрытый этим румяным красноватым оттенком, с карбоновыми крыльями, громоздкими над ярко-красными большими тормозами, двухтрубными амортизаторами и пружинами, выглядывающими из-за эксклюзивных 22-дюймовых легкосплавных колесных дисков, вы получите много зрелища со всем этим V8 Biturbo. также.

И пошло.Раздавите дроссельную заслонку, и золотники V8 Mercedes с принудительной подачей и центрально установленные турбины доведут до крещендо 416 л.с. и 450 фунт-фут крутящего момента. Когда вы это сделаете, ожидайте, что показатели эффективности упадут до однозначных цифр, что является обычным явлением, когда вы набираете скорость на рампе, благодаря столь же внушительной снаряженной массе 4×4² и постоянной полноприводной трансмиссии. Осторожно обращайтесь с дроссельной заслонкой, и Агентство по охране окружающей среды решит, что вы также справитесь с расходом в 11 миль на галлон в городе и на шоссе.

Из-за экстремальной геометрии подвески и калибровки рулевого управления величина люфта, ощущаемого во время вождения, может поначалу немного сбивать с толку тех, кто никогда раньше не пилотировал поднятый внедорожник.Хотя переход на спортивную настройку с электронным демпфированием уменьшает крен и отскок кузова, может потребоваться некоторая точная настройка регулируемых койловеров KW, если вам не нужна потрясающая твердость Focus RS.

В интерьере G действительно есть доля роскоши Mercedes-Benz и полезных технологий. Подогреваемые и вентилируемые сиденья из микрозамши с подогревом 4×4² с регулируемой подушкой и рядами плотно сплетенного углеродного волокна являются хорошими примерами, но в салоне также есть то, что мы называем странным выбором.

Например, распашная задняя дверь дает вам ширину всего 36 дюймов благодаря ограниченному диапазону поворота, увеличенной защелке фиксатора и глубине самой двери. Без возможности открываться с обеих сторон, как некоторые рефрижераторы и фургоны, этот огромный закрытый портал делает погрузку чрезвычайно сложной.

Другие неприятности включают автоматическое опускание, но не подъем, окна и люк в крыше, нерегулируемые задние сиденья, которые оставляют только 41,9 дюйма ограниченного пространства для ног, и неудобное, почти полностью вертикальное сиденье.Наконец, парковка чего-то такого большого без камеры с обзором на 360 градусов также может быть немного нервной. G имеет радиус поворота, как у паровоза, и со снаряженной массой в 6825 фунтов он тоже кажется таким же тяжелым.

Городские головокружения и неудобства дизайна, мы подошли к содержательной внедорожной части нашего обзора, области, где 4×4² ныряет головой вперед с вилкой и ножом наготове. На протяжении десятилетий Geländewagen был предпочтительным автомобилем для военных по всему миру, и во многом это связано с его тройкой блокировок дифференциалов.Хотя рекомендуется сохранить передний рундук на случай чрезвычайных обстоятельств из-за ограниченной маневренности, шума и т. Д., Сильные дожди и усыпанные известняком тропы потребовали его немедленного включения при выходе на наш первый след.

Поездка по бездорожью в таких крайностях, наслаждаясь всеми удобствами Mercedes-Benz за 250 000 долларов, ощущается как чистка персидскими шелковыми нитками. Назовите подъем на холм с того дня, и этот монстр превзошел его, в то время как вентилируемые сиденья охлаждали наши задницы, а Моцарт окутывал наши барабанные перепонки симфоническим блаженством.

Обладая усиленной передней защитной пластиной, портальными осями, раздвинутыми и заправленными выхлопными трубами с обеих сторон и массивной стойкой Mansfield из нержавеющей стали сзади, этот G может понравиться многим, если вам нравится стандартная внедорожная привлекательность. Колесная артикуляция, точки отрыва, складывающиеся боковые зеркала с электроприводом, низкие настройки и 18-дюймовый клиренс — все это делает 4×4² чрезвычайно грозной машиной для бездорожья, которая издает булькающие звуки выхлопа каждый раз, когда вы давите на газ.

Единственными препятствиями, с которыми мы столкнулись во время нашего почти пятичасового теста на бездорожье, был радиус поворота автомобиля, которому приходилось постоянно беспокоиться о ширине 86 внедорожника.2-дюймовая ширина и проблемы с дорожным просветом из-за руля Mansfield сзади, плюс недостаточное сцепление шин Pirelli Scorpion All-Terrain во время подъемов. И немного придирок: также несколько раз передняя камера на ходовой части могла бы пригодиться при взлете на вершину холма, особенно когда безопасное положение наблюдателя недоступно.

Для покупателей роскошных внедорожников 4×4², без сомнения, один из самых беззастенчивых и крутых вариантов, которые можно купить за деньги. Человек, который не раз, а дважды спас G-Wagen от вымирания, однажды сказал, что главная причина, по которой он любит внедорожник больше, чем любой другой автомобиль, не в том, что он такой грозный для бездорожья или роскоши, а в том, что он выглядит как он был разработан 5-летним мальчиком.Эта демилитаризованная немецкая машина, большая, квадратная и построенная, чтобы выдерживать испытания, — это транспортное средство, которое люди любят или ненавидят не только из-за его ненасытной жажды бензина премиум-класса, но почти полностью основанного на внешнем виде.

То, что начиналось как неудавшаяся военная машина, превратилось в монстра. И хотя новое поколение несколько отошло от своих 40-летних корней, вы должны уважать тот факт, что этот внедорожник — одна из величайших историй глобального автомобильного успеха в истории. Несовершенный, непрактичный, дорогой, грозный, внушительный, неприятный, неэффективный, уродливый, безумный, потрясающий — все эти слова можно использовать для описания версии Geländewagen 4×4².И знаешь, что? Ему действительно наплевать, что вы думаете об этом или о человеке, который его пилотирует.

Информация о модели автомобиля

В ПРОДАЖЕ: Сейчас

БАЗОВАЯ ЦЕНА: 230 000 долларов США

ИСПЫТАННАЯ ЦЕНА: 250 000 долларов США (оценка)

ТРАНСМИССИЯ: 4,0-литровый двухцилиндровый двигатель V8, семиступенчатая автоматическая коробка передач, 4WD

МОЩНОСТЬ: 416 л.с. при 5250-5500 об / мин; 450 фунт-фут при 2250–4750 об / мин

ВЕС CURB: 6 694 фунта

ЭКОНОМИЯ ТОПЛИВА: 11/11/11 миль на галлон

ЗА: неудержимо

Минусы: смешно

Этот контент создается и поддерживается третьей стороной и импортируется на эту страницу, чтобы помочь пользователям указать свои адреса электронной почты.Вы можете найти больше информации об этом и подобном контенте на сайте piano.io.

Mercedes-Benz Spied Testing Hardcore 4×4 Версия G63 AMG 6×6

Каждый раз, когда упоминается название G63 AMG 6×6, люди склонны сходить с ума. Не только мы это заметили. Немецкий автопроизводитель слишком хорошо знает потенциал шестиколесного монстра, поэтому теперь они работают над … G63 AMG 4×4. Подождите, разве G63 AMG не является полноприводным автомобилем по определению?
Мы знаем, что это может показаться немного запутанным, но новая модель имеет смысл.Видите ли, шестиколесный автомобиль выводит возможности стандартного автомобиля на пересеченной местности, если мы можем его так назвать, на совершенно новый уровень, но имеет один серьезный недостаток: он слишком массивен, чтобы справиться с ним в повседневной жизни, когда дороги залиты камри и маленькими детьми.

Таким образом, Mercedes-Benz хочет дать нам лучшее из обоих миров, сочетая нормальную длину и ширину G-класса с экстравагантными трюками G63 AMG 6X6. О да, и кровати больше нет.

Хотя это звучит довольно нелепо, пока мы назовем шпионский прототип G63 AMG 4X4.Не волнуйтесь, немцы со временем придумают собственное имя. Может, окрестят G63 OMG. Технические детали
Галерея шпионских фотографий выше позволяет увидеть, насколько выше 4X4 по сравнению с G63 AMG, который мы все знаем. Судя по внешнему виду прототипа, мы ожидаем, что это будет заимствовано у шестиколесной портальной оси.

Точно так же, как шарнирное управление с рециркуляцией обеспечивает долговечность вождения по бездорожью, портальные мосты — военное решение — серьезно увеличивают дорожный просвет.Вместо того, чтобы быть центрированными на оси вала, как на, колеса размещены ниже, перемещение обеспечивается портальными шестернями на головках оси.

На английском языке это означает, что стандартная высота дорожного просвета G-класса 210 мм (7,9 дюйма) составляет колоссальные 460 мм (18,1 дюйма) для 6×6. Чтобы получить представление о том, что допускают такие характеристики, мы упомянем, что изменение увеличивает глубину брода Gelandewagen с 600 мм (23,6 дюйма) до полного метра (39,4 дюйма). Достаточно, чтобы выйти из машины и поиграть в акваланг…

А вот у G63 AMG 4×4 скачок дорожного просвета будет меньше. То же самое можно сказать и о колесах, которые больше, чем у обычного AMG, но не стоит ожидать чудовищных 37-дюймовых шин модели 6×6. В реальном мире
Наши сердца переполняются радостью, когда мы видим, как немецкие инженеры работают над такой внедорожной техникой. Мы не уверены, насколько увеличенная ширина колеи поможет G63 AMG 4×4 справиться с дополнительной высотой, но помимо этого автомобиль будет укротителем земель.

Увы, прежде чем мы закончим рассказ о том, как AMG создает официальный лифт-комплект для своего G-класса мощностью 536 л.с. (544 л.с.), мы не можем не подумать о социальной составляющей.

Точно так же, как рэперы обращаются к оберткам, чтобы превратить свои G63 AMG в swagmobile или что-то в этом роде, G63 AMG 6×6 имеет свою долю клиентов, позирующих, а не бездорожных. Дэн Билзериан — такой же хороший пример, и хотя эти люди действительно помогают доить дойную корову из военных источников, они ничего не делают, чтобы улучшить репутацию иконы внедорожников.

Mercedes G63 AMG 4×4 — это тот автомобиль, который просто играет в своей собственной лиге, поэтому мы ожидаем, что он будет продаваться быстрее, чем вы можете сказать «профессиональное скалолазание».

Обзор первого привода Chevy Tahoe Diesel 2021 года: Range queen

внедорожники GM с кузовом на раме всегда были большими, но Chevy Tahoe 2021 года — огромных . По мере того, как этот трехрядный самосвал в своем последнем поколении постепенно растет, всегда есть опасения, что чем больше, тем больше жажда. Поскольку в настоящее время в этом сегменте нет электрификации, остается один вариант, который поможет уменьшить вновь обретенную массу Tahoe: дизельный двигатель.И это работает.

Под капотом находится 3,0-литровый рядный шестицилиндровый дизельный двигатель Duramax с турбонаддувом. Обладая 277 лошадиными силами и 460 фунт-фут крутящего момента, он не выиграет соревнований по выхлопной трубе у двигателей конкурентов, таких как газовый V6 с двойным турбонаддувом в Ford Expedition (375 л.с., 470 фунт-футов). , но дело не в этом. Chevy поместил Duramax в Tahoe, чтобы сохранить возможности внедорожника, в то же время значительно повысив экономию топлива.

Если ваши предвзятые представления о дизельных двигателях связаны с большим количеством болтовни, чем братская вечеринка, Chevy Duramax перенесет вас в 21 век.Независимо от того, запускаю ли я его из кабины или удаленно из своей столовой, этот рядный шестицилиндровый двигатель работает плавно и почти бесшумно, на самом деле он излучает традиционную дизельную атмосферу только тогда, когда я достаточно близко к капоту. Вибрации сиденья немногочисленны и редки, если они вообще существуют. Покупатели, обеспокоенные отказом от бензина, не должны особо беспокоиться о NVH.

Ощущение беззаботности продолжается и в дороге. По городу звук дизельного двигателя с передним басом не сильно отличается от некоторых песен конкурентов, и это не похоже на то, что он набирает громкость, чтобы перегружать радио.На шоссе он сливается с фоном, который проникает внутрь небольшого ветра и шума шин, оставляя мне и моим воображаемым пассажирам довольно прохладное место, чтобы сжечь несколько миль между штатами.

И горения будет много. В то время как варианты 2WD рассчитаны на 21 милю на галлон по городу и шоссе на 28 миль на галлон, варианты с полным приводом, такие как мой тестер, не сильно отстают от города на 20 миль на галлон и шоссе на 26 миль на галлон. Мой реальный опыт показывает еще более многообещающие цифры; во время пары сотен миль на межштатных автомагистралях Мичиган со скоростью 70 миль в час я регулярно вижу отрезки от 30 до 32 миль на галлон, когда поток движения придерживается ограничения скорости, сужаясь до все еще впечатляющих 27 или 28, когда все поднимаются темпы.400 миль на цистерну легко достижимо, и при правильных обстоятельствах я мог бы выжать 500.

Люди используют эти левиафаны не только для перевозки людей и грузов — люди также используют их для буксировки. К счастью, Chevrolet не пришлось экономить на этом отделе с дизельным двигателем, который в форме 2WD может буксировать до 8 200 фунтов, а мой тестер 4WD немного отстает от этого — 90 9 8 8 000 фунтов.

Я рад, что передо мной этот тестер RST-trim, потому что это, по сути, полная противоположность газового варианта High Country, на котором я ненадолго ездил в начале этого года.В то время как HC ошибся в сторону роскоши, RST (который означает, я не шучу, Rally Sport Truck) немного более гоночный, с черными внутренними и внешними элементами, насколько может видеть глаз, устраняя практически все хромированные элементы. отличный эффект. Этот монохромный наряд продолжается внутри, с несколькими штрихами красной строчки, чтобы оживить вещи. Независимо от того, куда попадают мои руки, я нахожу мягкую кожу или достаточно мягкий и пестрый пластик, в основном подходящий для внедорожника, который стоит около 50 000 долларов (RST приближает это к 60 долларам).

Первый ряд — не единственный ряд, который нянчится со своими жителями. В то время как роскошный пакет моего тестера за 2820 долларов включает в себя многоместное сиденье второго ряда, дополнительные 370 долларов заменяют его на два отдельных капитанских кресла с большим пространством для ног, чем я могу встряхнуть. Черт, даже сиденья третьего ряда с электроприводом складывания достаточно удобны для моей 6-футовой рамы в поездке. С другой стороны, было бы лучше, было бы таким большим предложением, учитывая, что кузов и колесная база примерно на 7 дюймов больше, чем раньше, с почти ногами нового места для ног для тех, кто на обратном пути.

Увеличить изображение

Салон Tahoe чертовски просторен и очень удобен.

Эндрю Крок / Roadshow

Я также взволнован поездкой на этом Tahoe RST, потому что он включает в себя базовую подвеску Chevrolet, а не дорогие пневматические или магнитные системы на более дорогих моделях. Несмотря на то, что у них не так много амортизатора для толчков, статические амортизаторы работают превосходно, поглощая изрядную часть неприятностей на дороге и передавая самые сильные удары и дрожь только тем, кто находится внутри.В сочетании с новой независимой задней подвеской, независимо от того, есть ли в ней варианты, это самый комфортный из всех, когда-либо существовавших на Tahoe. Работа остается плавной благодаря педалям тормоза и газа, которые очень легко настраиваются, а также 10-ступенчатой автоматической коробке передач, которая всегда находится на правильной передаче или в нескольких шагах от нее.

Развитие Tahoe окупается и другими способами. Место для хранения вещей за третьим рядом увеличилось на 66% до 25,5 кубических футов, а грузовой пол ниже для облегчения толкания. В каждом дверном кармане есть пара слоев подносов и подстаканников, а также два подстаканника на центральной консоли и хитрость: электрическая выдвижная центральная консоль за 350 долларов с секретным отделением под обычным подлокотником.Если мне нужно опустить сиденья третьего ряда, чтобы кто-то другой мог бросить больше мусора в спину, я могу сделать это, не вставая со своего места, благодаря умным переключателям на потолке.

Как и любая другая отделка Тахо, дизельные варианты оснащены отличными технологиями. Новейшая информационно-развлекательная система Chevrolet — которая мне всегда нравилась благодаря простой графике, быстрому отклику и солидному набору функций — входит в стандартную комплектацию, а мой тестер оснащен самым большим экраном из предлагаемых, 10,2 дюйма. Он включает в себя обычные тарифы, такие как беспроводные Apple CarPlay и Android Auto, а также точку доступа Wi-Fi 4G LTE и беспроводное зарядное устройство (во всех комплектациях, за исключением базового LS).Занять детей — это обновление для задних сидений за 2490 долларов, которое включает в себя пару 12,6-дюймовых сенсорных экранов в среднем ряду. Независимо от местоположения у пассажиров есть много возможностей для зарядки благодаря двум USB-портам в каждом ряду.

Последняя версия информационно-развлекательной системы Шевроле быстрая, красивая и насыщенная функциями.

Эндрю Крок / Roadshow

Стандартных систем безопасности на Chevy Tahoe 2021 года немного, они ограничиваются предупреждением о лобовом столкновении и автоматическим экстренным торможением с обнаружением пешеходов.Роскошный пакет моего тестера за 2490 долларов включает в себя мониторинг слепых зон, помощь в удержании полосы движения, датчики парковки и систему камер объемного обзора высокой четкости, которые, честно говоря, должны входить в стандартную комплектацию чего-то размером с небольшой коттедж. Как ни странно, я не может получить Tahoe RST с адаптивным круиз-контролем — это доступно только в комплектациях Premier и High Country, потому что у GM есть некоторые странные заминки (вероятно, связанные с затратами) по поводу систем помощи на основе радара. Опять же, я удивлен, что лицензированные водители просто получают бесплатный пропуск на пилотирование этой штуки, так что можно подумать, что любая помощь водителю под солнцем станет стандартной.

Учитывая все большие скачки вперед в Chevy Tahoe 2021 года, неудивительно, что это дорогостоящая машина. В то время как базовая цена RST в 61 395 долларов (включая 1295 долларов для пункта назначения) представляет собой премию в 10000 долларов по сравнению с базовой ценой всей линейки, несколько скромных пакетов оборудования увеличивают цену до 70 435 долларов, а хорошо оборудованные модели High Country могут подтолкнуть к минимуму 80 долларов. с. Уф. К счастью, сам дизельный двигатель всего на 995 долларов дороже, чем бензиновый, так что конкретное обновление не приведет к потере денег.

Chevy Tahoe — один из немногих оставшихся внедорожников с кузовом на раме, а два его конкурента с аналогичной структурой, Nissan Armada и Toyota Sequoia, кажутся старше и менее оснащенными, чем предложения GM. Ford Expedition приближается, но у него нет дизеля, и он немного менее отполирован, чем Tahoe. Впечатляет, насколько лучше Chevy Tahoe 2021 года, чем раньше, и добавление недорогого дизельного двигателя предлагает покупателям возможность утолить жажду большого внедорожника, сохраняя при этом возможности, не жертвуя какой-либо из его новообретенных изысков.

Новый Jeep Grand Cherokee на продажу в Сими-Вэлли, Калифорния

Новый Jeep Grand Cherokee на продажу в Сими-Вэлли, Калифорния Сохраненные автомобили

СОХРАНЕННЫЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДСТВА

У вас нет сохраненных машин!

Ищите эту ссылку в избранном:

Сохранив несколько транспортных средств, вы можете просмотреть их здесь в любое время.

Бесплатное техническое обслуживание

Уверенность в защите транспортных средств

Выделенная круглосуточная поддержка владельцев 24/7

VIP-доступ к мероприятиям бренда Jeep

Бесплатное техническое обслуживание

Уверенность в защите транспортных средств

Выделенная поддержка владельцев 24/7

VIP-доступ к мероприятиям бренда Ram

Автомобиль в стадии строительства.Свяжитесь с дилером, чтобы зарезервировать этот автомобиль и обсудить варианты фиксации цен и соответствующие льготы.

Автомобили, помеченные как «Строящиеся», представляют собой опытные образцы, которые еще не находятся на складе дилера или не находятся в пути. Могут быть показаны предварительные компьютерные изображения, которые могут не соответствовать перечисленному транспортному средству.
Рекомендованная производителем розничная цена
для стандартного оборудования плюс перечисленное дополнительное оборудование. Дата доставки автомобиля и другая информация о транспортном средстве, включая цены и льготы, могут изменяться до завершения сборки автомобиля.
Рекомендуемая производителем розничная цена
не включает дополнительные сборы, включая, помимо прочего, любые сборы за доставку, государственные сборы и налоги, сборы за право собственности и регистрацию, сборы за финансирование, регистрацию и обработку, сборы за испытания на выбросы, аксессуары и дополнительные приспособления.

Simi Valley Chrysler Dodge Jeep RAM 34.277950, -118.778030.
Переходная ступица для покрышек
Ngt, черная для винтов из нержавеющей стали mini-z 4X4

Состояние: Использовал: Предмет, который использовался ранее.См. Список продавца для получения полной информации и описания любые недостатки. … Подробнее о состоянии Торговая марка: mini-z

Винтаж (Да / Нет): NA Страна: Япония

Модель: NA Требуемая сборка: NA

Модель Оценка: NA Цвет: NA

Материал: NA Измененный элемент: NA

Тип топлива: NA Тип: NA

Тип двигателя: NA 4WD / 2WD: NA

Реплика: NA Рекомендуемая поверхность: NA

Шкала: NA Описание модификации: NA

MPN: NA Описание комплекта: NA

Тип размера: NA Возрастной уровень: NA

Размер: NA Страна / регион производства: NA

UPC: NA

Оригинальная лампа Osram PVIP и корпус для проектора Epson Home Cinema W15 + — 24 & nbsp Наше поколение Sydney Lee Doll Рождественский подарок Игрушки 2020 Kids, Child New sf.. & nbsp 24 Pack Wash Cloth Набор полотенец 100% хлопок Салфетки для лица Впитывающая кухонная мочалка & nbsp Cal Bears Under Armour White # 1 Sideline Replica Футбол Джерси & nbsp Космическая сумка для красоты NK с 30 предметами Стоимость 285 долларов США. no Barbara Sturm Drop & nbsp AIRKICKER Теплообменник с тепловыми трубками, D10Z2R460L-1, Б / У, ГАРАНТИЯ, ТО ЖЕ ДЕНЬ ДОСТАВКА American Airlines MD-80 N573AA GeminiJets 1: 400 Модель самолета & nbsp HOT 3шт. V4R0 & nbsp Tamiya 1/35 Пластиковая модель German Army Volkswagen Zee & nbsp Seguridad Oído Protección Orejeras Defensores Компактные подвижные электрические вилки и nbsp Детское одеяло Лоскутное одеяло для кроватки Одеяло для малышей LLAMA Настенное носки для детской комнаты Monkey Двусторонняя и накладка на гриф для гитары DC10 V2 Рама 10 дюймов 472 мм Колесная база Углеродное волокно & nbsp Lamb IL-363-703-030 Mh21710 PX7601029 Входной вал водителя & nbsp K-fashion Джонни ненавидит джаз, носящий дважды полосатую блузку с оборками S & nbsp OEM 660i Unifi 35 Запасная лампа для проектора SmartBoard (Osram Inside ) 840046025113 & nbsp E3 Электроформовочная установка Sherri Haab Выпрямитель постоянного тока 12 В для ювелиров Металлическое покрытие & nbsp Щелевая дверь клапана (AMAT) 0040-2352 5 300 мм & nbsp 032 Demi-Luxe Beams Пуловер с французскими рукавами & nbsp TEMCo 30-футовый шнур для генератора холодной погоды Черный NEMA L14-30 125 / 250V 30A UL
Переходная ступица для шин Ngt, черная для винтов из нержавеющей стали mini-z 4X4

Переходная ступица для покрышек Ngt, черная для винтов из нержавеющей стали mini-z 4X4
Игрушки и хобби .

No related posts.

модернизация серийного внедорожника и создание нового поколения

Озвучены сроки выхода на рынок нового поколения Lada 4×4 2024

Новая Lada Niva NG 2024 (рендер)

Все, что известно о новом поколении Лада Нива 4х4

Последние новости о новом двигателе лада 4х4 2017 года — наконец-то!

Советуем прочитать эти статьи:

Новый двигатель для Лады 4х4: технические характеристики

Последние новости о новом двигателе

Список инноваций

Советуем прочитать эти статьи:

Ещё один плюс

Lada 4х4 Vision — концепт новой Нивы 4х4 2018

Дизайн Lada 4х4 Vision

Технические характеристики

Двигатель Lada 4х4 Vision

Серийное производство

Видео Lada 4×4 Vision

Новую Lada 4×4 будут выпускать в Казахстане в России — CARobka.ru

Пётр Прусов, создатель автомобиля ВАЗ-2121 «Нива», главный конструктор Волжского автозавода (1998 — 2003 гг.) («АВТОСТАТ»)

Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Abstract

Введение

Результаты

Создание конструкций

Показатели в анализах активации GPCR

Быстрые кинетические измерения

Заключительные замечания

Методы

Конструирование флуоресцентных слитых белков

Культура клеток и подготовка проб

Широкопольная микроскопия

Конфокальная микроскопия

Благодарности

Вклад авторов

Ссылки

(PDF) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Обзор Mercedes-Benz G550 4×4 Squared: жизнь преувеличена

Информация о модели автомобиля

Mercedes-Benz Spied Testing Hardcore 4×4 Версия G63 AMG 6×6

Обзор первого привода Chevy Tahoe Diesel 2021 года: Range queen

Новый Jeep Grand Cherokee на продажу в Сими-Вэлли, Калифорния

СОХРАНЕННЫЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДСТВА