Лада кросс цвета: Официальный сайт LADA

Содержание

➤ Лада веста кросс - какой выбрать цвет машины

Производитель предлагает на выбор десять различных цветов машины. С девятью из них многие уже знакомы по универсалу веста кросс, цвета машин одинаковые, но вот десятый оттенок кардинально отличается от остальных – это LadaVestaCross SW оранжевого окраса, который называется Марс. Каждый оттенок имеет свой код, которые представлены в таблице:

КраскаКод
Темно-синяя — Блюз492
Оранжевая — Марс130
Красная — Сердолик195
Серая – Плутон608
Серебристая – Платиновая691
Коричневая — Ангкор246
Серо-бежевая  — Карфаген247
Серо-голубая — Фантом496
Черная676
Белая – Ледниковая221

Для автомобилей лада веста кросс — цвета которых черная жемчужина и ледниковый, не предусмотрена доплата, так как эти оттенки не металлизированные. За все остальные придется доплатить еще 18 тысяч.

Лада веста св кросс 2018 карфаген – описание оттенка

Этот оттенок не только стильный, но и элегантный. За счет особого отлива автомобиль выглядит свежим, современным, необычным, притягивает взгляды. Karfagen является серо-бежевым тоном, его часто называют бежевым металликом, многие уверены, что так и будет записан оттенок в паспорте транспортного средства.
Представители компании утверждают, что при выборе Karfagen отлично подойдет спокойным, уравновешенным людям, которые любят роскошь и красоту.

Производитель называет этот оттенок наиболее светлым и практичным, именно такой автомобиль максимально передает настроение. Естественно, все машины такого тона – металлизированные, за что придется дополнительно заплатить, однако именно этот оттенок требует еще и дополнительной доплаты.
Найти автомобиль можно у официальных дилеров, а подробнее рассмотреть цвет предлагается на фотографиях в сети. Часто возникает вопрос у тех, кто присматривает Ладу Весту цвета карфаген- почему дороже стоит именно этот оттенок? Производитель позиционирует его, как окрас категории люкс, поэтому и приходится немного доплачивать за выбор.

Плюсы и минусы цвета

Лада Веста СВ кросс карфаген будет выглядеть практично и оригинально. Грязь на автомобиле не так сильно бросается в глаза.

Главный минус этого цвета – сложно подобрать краску. Это серебристая эмаль, и она очень капризна при покрасках и подборках. Следует заранее подобрать хорошего мастера и приготовиться к тому, что выбрать подходящего цвета запчасти будет сложно.

Отзывы о цвете – мнения владельцев

«Мне не понятно, почему этот Лада Веста СВ кросс цвет карфаген стоит дороже остальных. Самый обыкновенный, не могу сказать, чтобы он чем-то сильно выделялся. Светлый, не броский. Считаю, что его дороговизна не оправдана» — Никита, г.Москва

«На нем царапины не так сильно видны. Раньше была другая машина темно-синего цвета – даже малейшая царапина от ветки дерева уже отражалась на кузове. Здесь приятно, что маленькие повреждения не бросаются в глаза» — Анатолий, г.Омск.

VestaCross SW в красном цвете – описание

Производитель назвал оттенок в честь природного камня, который отличается красноватым отливом – Serdolic, происхождению этого камня способствует вулканическая деятельность.

Русский народ ассоциировал данный камень с цветом сердца, поэтом был назван сердоликом. Эзотерики уверяют, что именно Serdolic – это камень, который олицетворяет любовь и огонь.

Автомобиль в металлизированном красном цвете говорит об энергичности, динамичности, а яркий дизайн выгодно смотрится на дорогах.

Для красного цвета используют уникальную технологию покраски. Применяются катафорезные грунты высокого качества, что позволяет увеличить адгезию (сцепление поверхностей) эмалированных деталей к металлическим элементам.

Лакокрасочное покрытие стало толще, производитель уверяет, что он сохранит свой первозданный вид не менее, чем на протяжении шести лет.

Преимущества и недостатки Serdolic

Все автомобили АВТОВАЗа всегда имели в цветовом ряде машину красного цвета, так что производитель просто не нарушил уже устоявшиеся традиции, создавая и новое транспортное средство Serdolic. Такой автомобиль не для всех, так как из-за броского цвета кажется вульгарным

Отзывы о цвете Serdolic

«Отлично выглядит на дорогах – я всегда хотела именно красную машину, оттенок Serdolic – это просто воплощение мечты. Стильный дизайн, красиво переливается на солнце, яркая. Мне очень нравится» — Алена, г. Липецк

«На мой взгляд, слишком яркий цвет. Можно было бы сделать его более спокойным, а так даже нервирует. Качество покраски прекрасное, смотрится хорошо, но я все же решил остановить свой выбор на черной жемчужине» — Игорь, г. Екатеринбург

Лада Веста СВ кросс в белом цвете

Недорогие новинки универсалы предлагаются в белом цвете. Ведь он не металлизированный, но достаточно востребованный среди покупателей.
Лада веста кросс универсал белая смотрится шикарно, многие водители предпочитают автомобили такого цвета – они практичные, строгие и солидные, менее мрачные, чем черные.

Насколько хорошо смотрится Лада Веста кросс белого цвета – фото говорят вполне отчетливо.
Производитель назвал этот оттенок ледниковым, официальный сайт характеризует его, как не металлизированный. На фоне белого кузова выгодно смотрятся черные элементы, оттеняются яркие стрелки задних ходовых огней.

Плюсы и минусы Лада Веста кросс белого цвета

У каждого водителя всегда есть свои предпочтения касательно цвета его автомобиля, потому всегда выделяют и положительные, и отрицательные стороны оттенков. Ледниковый многие называют шикарным, он прекрасно гармонирует со вставками и элементами дизайна машины.

Меньше привлекает внимание наличие мелких царапин, солнечные лучи не так сильно нагревают авто в жаркое время года. Подобрать эмаль для ремонта или покраски совсем не сложно, да и доплачивать ничего не придется при покупке авто.
Однако, Лада веста кросс седан белого цвета имеет и несколько минусов. В первую очередь, это необходимость в частой мойке. Особенность белого цвета заключается в том, что он очень быстро пачкается.
Сильно заметна коррозия в случае ее появления. Лада Веста св кросс – белая машина, она сразу потеряет внешний вид, если на месте маленького скола начнет портиться металл.

Отзывы о ледниковом окрасе

«Для меня не понятно зачем покупать белую машину, тем более с нашими погодами, когда постоянно то дождь, то грязь, то слякоть. Сначала рассматривал этот вариант, но потом решил окончательно отказаться от белого автомобиля. Дороже потом на мойку каждый день ездить» — Роман, г. Санкт-Петербург

«Белая машина – это классика. Покраска – на хорошем уровне, цвет – глубокий, насыщенный, меня полностью устроило. Ни разу не пожалела о том, что решила купить именно белую машину. Главное, чтоб не началась коррозия» — Антонина, г. Самара

Лада веста св кросс темно синий блюз – описание

Те, кто уже видел автомобиль в цвете Blues, сравнивают его с глубокой водой, предгрозовым небом. Он такой же спокойный и умиротворяющий, как приятный, легкий блюз.

Для Лада веста кросс, цвет блюз – это среднее между темным и светлым, он выглядит просто, скрывает в себе тысячи оттенков.
При каждой мере освещения меняются его особенности. При создании образа Лада веста св кросс блюз были применены новые эмали, а так же специализированный грунт. Он позволяет надежно защитить машину от адгезии красок и металлов.
Новые лакокрасочные покрытия продержатся долго. Производитель гарантирует шесть лет, с помощью новой технологии удалось сделать коррозию и ржавчину редким появлением.
Показатель средней толщины лакокрасочного покрытия теперь достигает 135 микрон, а это в четыре раза больше, чем на предшествующих версиях. Покрытие стало устойчивее, толще, а внешнее воздействие уже не оказывает такого влияния, как ранее.

Лада веста св кросс синий блюз – плюсы и минусы

Как и все темные цвета, Blues очень капризный в уходе, он требует частого посещения мойки, чем, серебристый или серый автомобиль. Отдельно производитель говорит о том, что для мытья Лада веста кросс блюз, желательно использовать качественную химию, бесконтактную мойку, так как мытье машины вручную может привести к появлению микроцарапин.

Это пожалуй единственный недостаток данной оттенка. Что касается подбора краски и самой процедуры окрашивания – цена на эти услуги будет стандартная.
Оригинальный цвет, который отличается своей глубиной, прекрасно смотрит, хотя его и называют нейтральным.

Отзывы о машинах в цвете Blues

«Очень глубокий оттенок, я долго не мог определиться с цветом. Но когда увидел в живуюBlues, сразу понял, что именно о такой машине я и мечтал. Необычная, и в то же время, не вульгарная, стильная, привлекательная. Великолепный тон!» — Дмитрий, г. Белгород

«Для меня этот цвет немного темноват. На фотографиях в интернете мне он показался таким ярким, нестандартным. А приехала машина темная. Но в целом вполне терпимый оттенок, для тех, кто любит классику – черный серый, синий» — Василий, г. Владивосток

Лада веста св кросс цвет плутон – описание

Главная особенность – это способность краски изменять свой тон. Базовый окрас называют светло-серым, поэтому при плохом свете или когда на улице темно, автомобиль выглядит достаточно монотонным.

Если Лада веста св кросс серый плутон выедет на яркий свет, то оттенок сразу сменится. Он балансирует между темно-коричневым и оранжевым, в зависимости от действия света.

Это удивительно выглядит, производитель для описания краски использовал сравнение с полудрагоценным камнем, который привлекает внимание и притягивает взгляды.

Лада веста св кросс Плутон отличается тем, что это покрытие – хамелеон, и оно постепенно сменяет окрас от золотистого с коричневым отливом до немного синего.

Плюсы и минусы оттенка Phantom

Это покрытие, которое используется лишь некоторыми производителями машин, оно необычно выглядит, и выделяет транспортное средство среди других участников движения.

За счет базового темно-серого цвета, автомобиль нельзя назвать слишком марким, так что даже в дождь или слякоть машина сохранит свою красоту.
Минус – это сложность подборки краски для деталей в случае ремонта, да и обойдется он намного дороже, чем при починке стандартного автомобиля обычного цвета.

Отзывы об оттенке Phantom

«Классно смотрится, особенно на солнце, переливается разными цветами, блестит. Ухаживать не сложно, на мойку езжу не часто, и тем не менее, до сих пор все в восторге от нестандартного дизайна» — Кирилл, г. Новокузнецк

«Пришлось столкнуться с необходимостью подкрасить бампер – краску действительно найти очень сложно, да и стоит она дорого. Пришлось изрядно времени потратить на поиски, но конечно, сам цвет того стоит» — Рустам, г. Москва

LadaVestaCross с серебристым окрасом Platinum

Это металлизированный оттенок, поэтому он прекрасно переливается на солнечных лучах. Меньше пачкается, чем белый цвет, серебряный отлив визуально увеличивает автомобиль, делая его еще более крупным.

Прекрасно подходит, как для мужчин, так и для женщин. С одной стороны – солидно и строго смотрится, с другой – теплый и нежный перелив делает автомобиль восхитительным.

Плюсы и минусы Platinum

Все зависит от вкусов покупателя. Основными плюсами этого цвета является то, что не так сильно заметны небольшие царапины на корпусе, а со временем это достаточно важно.

Кроме того, серебристый цвет достаточно популярен на наших дорогах, следовательно, подобрать краску не сложно, если будет нужно подкрасить деталь или кузов.

Стоимость ремонтных работ – стандартная, мастера берутся за дело по обычным расценкам.
К минусам можно отнести необходимость частого посещения мойки, особенно, после дождя или во время слякоти – все светлые цвета необходимо регулярно мыть. В остальном, цвет прекрасно подходит LadaVestaCross.

Отзывы о LadaVestaCross в серебристом корпусе

«Ничего особенного не могу сказать – стандартная серебряная краска. Зато и цена адекватная. Найти подходящего мастера не составило труда, сразу рядом в автомобильном магазине оказалась и нужная краска. Удобная в эксплуатации, простоя в ремонте». – Максим, г. Курск

«На меня цвет платина произвел прекрасное впечатление. Как только увидела его, сразу поняла, что хочу именно такой автомобиль. Светлый, в любую погоду на нем приятно ехать, переливается корпус очень стильно».

Лада веста кросс, цвет черная жемчужина – описание

Производитель сам описывает этот цвет, отмечая его строгость, солидность. Черные автомобили всегда пользовались спросом, несмотря на времена и моду.

Именно за счет черного отлива, прекрасно смотрятся хромированные молдинги, выполненные в форме икса. Подчеркивают завершенность образа легкосплавные колесные диски.

В таком тоне очень современно выглядит Лада веста кросс, черная жемчужина на фото и в живую просто не может не понравиться.

Плюсы и минусы BlackPearl

Недостаток Лада веста кросс черная жемчужина такой же, как и у всех черных машин – необходимо бережно ухаживать за машиной, часто мыть, избегать царапин – использование традиционной мойки, или самая тонкая ветка уже могут оставить заметный след.

Кроме того, необходимо постоянно избавляться от дорожной пыли и грязи, практически, как и на белых авто.

Владельцы авто так же отмечают, что в таком цвете кузов и пластиковые обвесы у машин сливаются, не подчеркнуты линии корпуса. Не стоит забывать и о том, что черные машины очень сильно греются на солнечных лучах.
Лада веста св кросс черная жемчужина – это не металлизированный цвет, поэтому не понадобится доплачивать за него, да и при ремонте или покраске подборка покрытия не составит никакого труда. Статистика говорит о том, что на машины черного цвета спрос на рынке всегда больше, чем на транспортные средства других оттенков, особенно ярких.

Отзывы о цвете «Черная жемчужина»

«Любая царапинка, даже самая маленькая, бросается в глаза. Съездил на дачу, веткой зацепился тонкой от куста – полоса на весь корпус. НЕ советую этот цвет, лучше доплатить и взять металлик» — Артем. Г. Новгород

«Смотрится в черном цвете, как настоящий джип. Солидно очень выглядит, я полностью доволен. Такой автомобиль действительно подойдет руководителю, имеющему определенный имидж делового человека»

Angkor – новый оттенок Lada Vesta Cross

Многие видео представляют новинку от АВТОВАЗа в коричневом тоне, который носит название Ангкор.

Такому цвету чаще всего отдают предпочтение представители сильного пола, он прекрасно подходит публичным личностям, которые привыкли быть уверенными в себе, мужественными и передовыми. Владельцы LadaVestaCross в коричневом цвете – это чаще всего искренние, трудолюбивые люди.

Плюсы и минусы коричневого оттенка

Единственным минусом этого цвета является то, что некоторые называют его слегка посредственным, скучным, хотя, с другой стороны, он выделяется на дорогах своим нестандартным металлизированным отливом.

Пачкается автомобиль достаточно медленно, на нем не видно грязи и пыли так, как на других машинах. Тон нельзя назвать светлым. То он и не темный – это скорее золотая середина для тех, кто любит нейтральные расцветки.

Отзывы о коричневом цвете LadaVestaCross

«Мне нравится то, что автомобиль не сильно нагревается на солнце, даже в летнее время. Цвет оптимальный – не маркий, не темный и не мрачный. Прекрасно выглядит на дорогах – таких машин не много, так что привлекает внимание» — Сергей, г. Ростов-На-Дону.

«Для меня не понятен этот оттенок – машина должна быть контрастной, яркой или солидной – черной или белой. Но коричневый оттенок для покраски кузова – это на гурмана». – Станислав, г. Пермь

Лада веста св кросс — цвет марс – описание


Это новый оттенок, который производитель подготовил специально для LadaVestaCross.

Теплый, солнечный оранжевый тон, идеально подходит для кроссовера, придает ему оригинальности, выделяет на дорогах среди других участников движения.

Чтобы понять, как выглядит лада веста св кросс марс, реальные фото достаточно посмотреть на просторах сети.

Плюсы и минусы оттенка «Марс»

Минусов у этого цвета практически нет. Он подойдет амбициозным, современным людям, с активной жизненной позицией и четкими целями. Яркий, быстрый, комфортабельный автомобиль Лада веста св кросс марс – это модный выбор.

На покрытии не слишком выделяются царапины, пыль и грязь, а металлизированная краска переливается на солнце.

Отзывы о цвете «Марс»

« Недавно принял решение купить Лада веста св кросс цвет марс – фото понравились, характеристики тоже. Не жалею – цвет действительно яркий, современный, смотрится прекрасно на дорогах, и главное, совсем не маркий!» — Артур, г.Ектеринбург

«Я не считаю, что такой оттенок подойдет для деловых людей. Машина должна быть более сдержанной, хотя для молодежи это вариант прекрасный. Хотя здесь дело вкуса каждого»

Вывод

Все цвета LadaVestaCross особенны по-своему, большая часть оттенков металлизированные, и требуют доплаты. Стоит отметить, что улучшенные компоненты лакокрасочного покрытия и утолщение слоя нанесения позволяет говорить о повышенной прочности. Производитель гарантирует, что минимум шесть лет автомобиль будет выглядеть, как новый.
Среди цветовой гаммы каждый сможет найти для себя LadaVestaCross по своему вкусу. Есть и яркие оттенки, и солидные, классика и даже нестандартный цвет хамелеон.

Видео — LADA Vesta SW Cross : цвет Ангкор (246) — металлик (искусственное освещение)

Видео — LADA Vesta SW Cross : цвет Блюз ( 492)

Видео — Cross универсал LADA Vesta новый цвет и версия Exclusive

Видео — LADA Vesta SW Cross : цвет Платина (691) — металлик

Видео — LADA Vesta SW Cross : цвет Фантом (496) , получивший эффект — хамелеон — металлик

Видео — LADА Vesta седан Cross цвет Плутон (608) — металлик

Видео — LADA Vesta SW Cross : цвет Черная жемчужина (676) — металлик

Видео — В каком цвете LADA Vesta SW кросс выбрать

Карфаген против Марса. Тест-драйв Lada Vesta SW и SW Cross :: Autonews

Стив Маттин не расстается с фотоаппаратом. Даже сейчас, когда мы стоим на площадке высотного парка развлечений SkyPark и глядим на парочку смельчаков, готовящихся сигануть в пропасть на самых больших качелях в мире. Стив наводит камеру, раздается щелчок, тросы расцепляются, пара улетает вниз, а шеф дизайн-центра ВАЗа получает в коллекцию еще несколько ярких эмоциональных кадров.

«Нет желания тоже попробовать?» — подначиваю я Маттина. «Не могу, — отвечает тот. — Недавно я травмировал руку, и физических нагрузок мне сейчас нужно избегать». Руку? Дизайнер? В голове возникает киношная сцена: акции АвтоВАЗа теряют в цене, паника на бирже, брокеры рвут на себе волосы.

Преувеличить ценность работы команды Маттина для завода нельзя — именно он с коллегами создал образ, который не стыдно выводить в топы рынка по причине, отличной от сверхнизкой цены. Как ни крути, а техническая составляющая для тольяттинских машин немного вторична — рынок принял недешевую Vesta потому, что она ему действительно понравилась, и в первую очередь тем, что хороша и оригинальна внешне. И отчасти еще и потому, что своя, а в России это по-прежнему работает.

Но универсал у нас — штука рисковая. Потребность в них есть, а вот культуры использования таких машин в России нет. Сломать старый тренд сможет только действительно выдающаяся машина, которая сможет декларировать отказ от образа утилитарного «сарая». У команды Маттина получилась именно такая: не совсем универсал, совсем не хэтчбек и уж точно не седан. Вазовский SW расшифровывается как Sport Wagon, и это, если хотите, недорогой отечественный Shooting Brake. Причем, спортивно-утилитарному стилю в наших условиях больше отвечает именно исполнение SW Cross с защитным обвесом, контрастной окраской и клиренсом такой величины, которой позавидует большинство компактных кроссоверов.

Новый ярко-оранжевый колер, который разработали специально для версии Cross, называется «Марс», и стандартные универсалы в него не красят. Безальтеративные 17-дюмовые колеса тоже своего, особого стиля, как и двойная труба выхлопа. Черный пластиковый обвес по периметру прикрывает низ бамперов, колесные арки, пороги и нижние части дверей. Но главное — клиренс: под днищем у Cross внушительные 203 мм против и без того немалых 178 мм у седанов и универсалов Vesta. И хорошо, что маркетологи настояли на задних дисковых тормозах, хотя особого смысла в них не было. За большими красивыми дисками барабаны выглядели бы несколько архаично.

На фоне версии Cross стандартная Vesta SW выглядит простовато, и это нормально — именно Cross должен объяснить, наконец, потребителю, что универсал — это круто. Но чистый универсал и сам по себе произведение искусства. Хотя бы потому, что сделан с душой и без особых затрат. Серый «Карфаген» этому кузову подходит идеально — получается сдержанный и интересный образ. Оригинальных кузовных деталей у универсала минимум, а основа и вовсе унифицирована. Настолько, что у него с седаном одинаковая длина, да и задние фонари на заводе в Ижевске берут из одной коробки. Пол и проем багажника не изменились, хотя местами кузов пятидверки пришлось немного усилить из-за отсутствия жесткой панели багажного отсека. Для универсала на заводе освоили 33 новых штампа, и в итоге жесткость кузова не пострадала.

У универсала выше крыша, но это едва ли заметно. И дело не только в скосе заднего стекла. Хитрый Маттин ловко спустил линию крыши вниз сразу за задними дверьми, заодно визуально оторвав ее от кузова черной вставкой. Видимый кусок задней стойки стилисты назвали акульим плавником, и с концепта на серийную машину он пришел без изменений. Vesta SW, особенно в исполнении Cross, вообще мало отличается от концепта, и за такую решительность стилистам и конструкторам ВАЗа можно только поаплодировать.

Приятно и то, что в Тольятти не побоялись точно так же раскрасить салон. Для Cross доступна комбинированная двухцветная отделка, причем не только в цвет кузова, но и любой другой. Помимо цветных накладок и яркой прострочки в салоне появились симпатичные накладки с объемным рисунком, причем вазовцы предлагают выбор из нескольких вариантов. В тон отделке интерьера оформлены и приборы, причем их подсветка теперь работает всегда при включении зажигания.

Выгоду более высокой крыши первыми почувствуют задние пассажиры. Мало того, что Vesta изначально давала возможность вольготно сидеть за водителем ростом 180 см, сзади в универсале не придется пригибаться и более рослым клиентам, хотя речь вроде бы о скромных добавочных 25 миллиметрах. В спинке заднего дивана теперь есть подлокотник, а на тыльной стороне переднего бокса-подлокотника (тоже новинка) нашлись клавиши подогрева задних мест и мощный USB-порт для зарядки гаджета — решения, которые потом перекочуют и на седан.

Универсал вообще принес семейству много полезного. Например, органайзер, ворсовую отделку и микролифт перчаточного ящика — отсека, который раньше просто грубо выпадал на колени. Камера заднего вида фирменной медиасистемы теперь умеет поворачивать парковочную разметку вслед за вращениями руля. На крыше появился плавник с полным набором антенн, изменился уплотнитель капота, лючок бензобака теперь с пружинным механизмом и центральным запиранием. Звуки поворотников стали благороднее. Наконец, именно универсал первым получил привычную и понятную кнопку открывания багажника на пятой двери, пусть даже и вместо салонной.

Отсек за дверью багажника вовсе не рекордный — по официальным данным, от пола до сдвижной шторки те же 480 VDA-литров, что и в седане. Да и те можно насчитать лишь с учетом всех дополнительных отсеков и ниш. Но мерить багажники условными мешками картошки и холодильниками перестали даже в Тольятти — вместо огромного трюма Vesta предлагает хорошо организованное пространство и набор фирменных аксессуаров, за которые хочется доплатить прямо в салоне дилера.

Полдюжины крючков, две лампы и 12-вольтовая розетка, а также закрывающаяся ниша в правой колесной арке, органайзер с полочкой для мелочей, сеточкой и нишей для баллона омывателя с ремешком на липучке — в левой. Восемь точек крепления багажных сеток, а самих сеток — две: напольная и вертикальная за спинками сиденья. Наконец, здесь двухуровневый пол.

На верхнем этаже две съемных панели, под которыми два пенопластовых органайзера — все взаимозаменяемые. Ниже — еще один фальшпол, под которым пристроена полноразмерная запаска и — сюрприз — еще один вместительный органайзер. Все 480 л объема нарезаны, сервированы и поданы в лучшем виде. Спинка сидений складывается по частям по стандартной схеме вровень с верхним фальшполом, хотя и под небольшим углом. В пределе багажник вмещает чуть больше 1350 л, и пресловутые мешки картошки тут представить уже тяжело. Речь, скорее идет о лыжах, велосипедах и другом спортивном инвентаре.

Список всех цветов весты - разберемся в них

Цвета машин люди выбирают не просто так. Если автомобиль нравится человеку, он выбрал свой любимый цвет, то уже можно сказать о том кто он: сангвинник или халерик. А это уже психологический портрет. Лада Веста имеет 9 основных цветов и по 1-2 уникальному цвету в каждом кузове. Для седана это цвета лайм, для кросса Марс. Для универсала sw это Карфаген.

Для расширения палитры Лада Веста были доработаны до девяти возможных вариантов краски. Это наиболее топовые оттенки среди седанов. Для универсала Vesta SW Cross цвета представлены чуть широким спектром. Оттенкам присущи определенные характеристики. Читайте статью и будете знать все о них!

Осуществляя перевозки, доставляя владельца из точки А до точки В, или просто становясь символом состоятельности, машина – нужна людям в 2018 г.

Нет в мире аналогов транспортного средства, столь распространенного и популярного.А особой популярностью среди бывшего СССР пользуется модельный ряд АвтоВАЗа – Лада.

Практичные, надежные, приспособленные к реалиям российских дорог, машины АвтоВАЗа, последнее время, обладают стильным дизайном, модным оформлением.

Особенности покраски

Внешний вид автомобиля — первое, на что обращают внимание. Нет ничего хуже, неудачно подобранного оттенка, или некачественно выполненной покраски. Цвета кузова Лада Веста — металлик (за исключением белого), для получения результата обязательно соблюдение этапов и технологии покраски авто. Важно соблюдение стилистического единства в общем облике. Лада Веста ее цветовая гамма подобрана так, чтобы окраска кузова больше чем обычно подчеркивала линии силуэта автомобиля, создавала эффектное впечатление от внешнего вида.

Цвета для Лада Веста и коды к ним

Палитра всевозможных оттенков широка, для удобства каждой из вновь разработанных красок присваивается код.
У Весты на выбор разработаны цвета:
Белый «Ледниковый» (221)
Красный «Сердолик» (195)
Коричневый «Ангкор» (246)
Темно-синий «Блюз» (492)
Темно-зеленый «Криптон» (372)
Серо-голубой «Фантом» (496)
Серый «Плутон» (608)
Черный «Черная жемчужина» (676)
Серебристый «Платина» (691)
Каждому присущи свои предпочтения во всех сферах жизни, а краска автомобиля исключительно дело вкуса.
Представленные варианты обладают уникальными чертами.

Ангкор имеет код 246, с виду коричневый

Ангкор, или коричневый металлик – популярный часто выбираемый цвет седана. Этот оттенок молочного шоколада идеально сочетается с городской обстановкой, гармонично разбавляя серость жилых массивов. Цвет не маркий, радует глаз в самую грязную погоду, удачно скрывая пыль, мелкие недостатки. Принадлежит к категории классических окрасок, которые ненавязчиво, уверенно завоевали рынок. Практичная и универсальная, коричневая Лада Веста подойдет мужчинам и женщинам, становясь свидетельством делового характера владельца.

Ледниковый имеет код 221, с виду белый

Белая Лада Веста – самый популярный вариант, поскольку краска не металлик, кроме плюсов, на редкость стоит не дорого. Строгий арктический оттенок подчеркивает линии силуэта, а черные элементы кузова максимально выделяются на фоне машины. Ярким фрагментом выглядят задние фары — придает общему виду эдакую изюминку. Довольно капризен в обращении, в плане сколов — на белом, четко видны малейшие недочеты, грязь, следы дождя. Но надо сказать белый окрас практичнее черного, черная Веста марается быстро — такой цвет называют: «Умри с тряпкой». Под лучами солнечного света белый седан Lada Vesta искрится, как чистый снег, лаконично подтверждая название — Ледниковый. Белый цвет характеризует стиль Спорт!

Сердолик, с виду красный, имеет код 195

Красный остается цветом любви, страсти, огня. Алый автомобиль, свидетельствует о ярком, живом темпераменте владельца, будь то мужчина или женщина. Веста огненного оттенка символизирует энергичность, динамику, развитие, бешеный жизненный темп. Стильное авто органично вливается в любую обстановку, привлекая внимание — радуя глаз сочностью краски.

Криптон под кодом 372

Новинкой 2017 года для Весты стал темно-зеленый оттенок, названный Криптон. Этот приглушенный цвет оригинален, при разном освещении выглядит совершенно по-разному. На заснеженных дорогах автомобиль приобретает более яркий зеленый оттенок, в то время на асфальте проявляется сходство с серыми и черными тонами. Темно-зеленая Лада передает рабочее настроение, спокойную уверенность владельца — психология.

Цвет Блюз имеет код 492, с виду синий

Темно-синяя, как предгрозовое небо, Лада Веста воплощает непримиримый, властный характер стихии. Оттенок морской глубины заставляет чувствовать частицей вечного забега, рисуя в воображении бесконечную ленту дороги, что мягким шелестом стелется под колеса. Преодолевая километр за километром, автомобиль делится с владельцем энергией, передавая настроение музыкального стиля, давшего название этому глубокому синему оттенку.

Фантом – 496 код

Переменчивость, динамичность, активность – черты, позволяющие успевать за стремительным жизненным потоком, черты, присущие Лада Веста в серо-голубом цвете. автомобиль, настоящий хамелеон, способен видоизменяться в зависимости от обстановки. Строгий, лаконичный в городских условиях, мягкий, живой, как природа вокруг бездорожья. Ограненный драгоценный камень, окрас переливается от синеватого до оттенка неба на рассвете, вызывая желание непрерывно любоваться автомобилем.

Плутон – 608 код

Темно-серая Лада наводит о мысли о постоянстве, стабильности. Представителей этого окраса автомобиля много, что дарит впечатление надежности и уверенности — завтра новый день, новая пища. Данный оттенок наименее маркий — важно для любого владельца. Самым неожиданным становится, что в графитовом тоне сильно заметны очертания «икс» — образных линий на боковых дверцах машины. Несмотря на обыденность, Веста, окрашенная в Плутон, удивляет единством стиля.

Черная жемчужина, 676 код, с виду черная

Название цвета говорит за себя. Черная Веста — смокинг, нарядная, праздничная, элегантная, утонченная. Представитель светского общества, автомобиль сияет лоском настоящего эстета. Свидетельствует о солидности и властном характере владельца. Но черная окраска требователен в обращении, поскольку на черном становятся заметны пыль, грязь — прочие недочеты. Несмотря на нюанс, 676 код часто становится выбором большинства.

Платина, 691 код, с виду серый

Классический окрас, как ни странно, похож на металл, от которого получил название. Серебристый металлик подчеркивает линии рельефа в силуэте Весты, придавая образу автомобиля четкость и резкость. Светлый оттенок придает автомобилю легкости и воздушности, создает атмосферу беззаботного настроения и радует глаз владельца и окружающих.

Как определить, какой цвет машины взять

Цвета Lada Vesta (как и любой её модификаций, в частности, SW Cross) призваны стать отображением вкусовых пристрастий владельца. Приобретая автомобиль, владелец старается выбрать самый красивый. Но людей много, мнений еще больше, невозможно однозначно судить, какой из оттенков самый-самый.

Цвета модификации Кросс и Универсал

Цветовая гамма универсала Лада Веста и sw cross окраска которых представлены теми же оттенками, что и у седана, за исключением уникальных. Для SW Cross такими становятся серо-бежевый «Карфаген» (247) и оранжевый «Марс» (130), а для Лада СВ — только Карфаген.

При покупке любой модели стоит учитывать предпочтения, и автомобиль будет ежедневно радовать и устраивать Вас.

Лада Веста цвет ангкор фото и особенности

Новинка от российских конструкторов уже успела поразить автомобильный мир своими тактико-техническими характеристиками, но особенно впечатляет ее внешность. Продукт, намеревающийся завоевать рынок продаж, должен обладать большим ассортиментом покрасок. На сегодняшний день АвтоВАЗ представляет на выбор машины с кузовом десяти разных цветов. Лада Веста ангкор (коричневая) входит в этот перечень.

На заметку!

В скором времени ассортимент оттенков будет расширяться, об этом официально заявляют производители. К тому же они проводят голосование, где потребители сами выберут подходящую краску на транспортное средство.

Lada Vesta ангкор – знак уверенности

На многочисленных видео можно наблюдать машину в такой расцветке. Коричневая Лада Веста хорошо подойдет людям, держащимся на публике уверенно и мужественно. Этот раскрас всегда олицетворяет надежду на лучшее будущее и не дает опускать руки даже тогда, когда судьба тебе не улыбается. Окружение будет чувствовать вашу искренность и трудолюбие, если выберете коричневый металлик. Фото Лада Веста цвета ангкор представлены ниже.

Цветовая палитра отечественного седана

Оттенки кузова машины играют значительную роль в полноценном впечатлении, рождаемом при взоре на объект. Один будет непременно сливаться с окружением, но с индивидуальным акцентом, другой же станет лидером на дороге, привлекающим большое внимание. Все цвета Лада Веста, предлагаемые сегодня дилерами, таковы:

  • красный Сердолик с кодом краски в каталоге 195;
  • Блюз в синих тонах — код краски 492;
  • серый оттенок Плутон — код 608;
  • черный жемчуг для респектабельных людей – характеризуется заводским номером 676;
  • серо-голубой раскрас Фантом — 496;
  • Криптон в темно-зеленом, с заводским № цвета 372;
  • коричневый под названием Ангкор — 246;
  • серебристая Платина — 691;
  • Лайм, отличающийся своей специфичностью — 366. Покупается в комплекте Люкс;
  • Белый — 221.

Чтобы сделать правильный выбор цветовой гаммы, следует ориентироваться на личностное восприятие, ведь именно вам эксплуатировать продукт долгое время, а не окружающим. К тому же в перечне нет оттенков, которые явно не нравятся людям.

Цвет ангкор отзывы

Для меня особую роль не играет цветовая палитра. Мне уютно в Лада Веста и черной, и зеленой. По поводу коричневого оттенка могу сказать, что он притягивает и успокаивает.

Виктор, Самара

Пока что мало вижу новинки на дорогах. Видимо, еще не доверяют ВАЗу. Вживую и на фото Лада Веста смотрится приятно, в основном благодаря успешному экстерьеру. Шоколадный ангкор – чисто мужской цвет для вдумчивых и уверенных.

Борис, Пермь

Фото кузова цвета ангкор приятно воспринимаются. Однако я бы не стал останавливаться на этом цвете, мне ближе синий и зеленый, а коричневый на Лада Веста навевает тоску, по-моему.

Игорь, Ростов-на-Дону

Кроссовер smart, который породнится с будущими Volvo через платформу Geely: новое фото

Полноценная премьера нового электрического паркетника пройдет уже через пару месяцев. Предполагается, что базовый кросс будет иметь задний привод.

Перевести свои модели на электротягу марка smart решила еще в 2018-м, а год спустя концерн Daimler перестал владеть ею единолично: было создано совместное предприятие с китайским холдингом Geely. Развитием бренда занимаются в основном китайцы, они отвечают за проектирование и продвижение, в Поднебесной же наладят производство будущих машин. Ну а первенцем «новой волны» станет, конечно, кроссовер. Официально паркетник анонсировали в мае, опубликовав несколько эскизов и тизеров, а теперь smart поделился еще одной картинкой. Отметим, это еще не серийная модель, а концепт, причем пока без имени (марка зовет его eSUV). Впрочем, товарный кросс, скорее всего, не будет сильно отличаться от предвестника.

На этот раз машина запечатлена сверху: паркетнику досталась панорамная крыша с «золотым» узором (вроде бы он еще и светится) в «рамке» того же цвета. Другие особенности экстерьера – сделанная в виде единой плашки головная оптика и черные вставки в нижней части задних стоек, которые дают эффект «парящей» крыши. В целом у паркетника более «взрослый» облик, чем у нынешних Смартов. Кстати, если китайцы отвечают за технику, то дизайн разработан немецкой командой.

Новый smart построен на модульной платформе SEA (Sustainable Experience Architecture), разработанной Geely специально для «электричек». На той же «тележке» базируется и первенец нового премиального суббренда Джили – лифтбек Zeekr 001. И она же ляжет в основу некоторых будущих Volvo (шведская марка принадлежит китайцам). По неофициальным данным, у базового паркетника smart будет один электромотор, установленный на задней оси, и батарея емкостью примерно 70 кВт*ч, с которой он сможет проехать 500 км. Правда, «дальнобойность» рассчитана по устаревшему циклу NEDC. О полном приводе зарубежные СМИ пока молчат, но платформой SEA предусмотрено наличие двух электродвигателей. Также самой маркой объявлено, что всем версиям положена мультимедийная система с голосовым управлением.

Мировая премьера кроссовера пройдет на выставке IAA Mobility (туда шоу переедет из Франкфурта), которая откроется в начале сентября. На конвейер китайского завода модель встанет в следующем году, она будет глобальной.

Из России марка smart ушла после того, как ее актуальные ситикары fortwo и forfour окончательно превратились в «зелень». О возвращении на наш рынок пока не слышно. Зато в 2022-году к нам планируют привезти электрический Mini Cooper SE.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Трехфлуорофорный FRET позволяет анализировать тройную белковую ассоциацию в живых клетках растений

Введение

Интеграция различных сигнальных сигналов на клеточном уровне необходима для выживания любого организма. У растений, например, механическое повреждение клеточной стенки вызывает ослабление реакции клеточного роста, в то время как ресурсы перераспределяются для процессов восстановления. С появлением методов микроскопии высокого и сверхвысокого разрешения, открытием локализации белков в нанодоменах, пространственной организации рецепторов и сопутствующих белков (например,грамм. корецепторы) в плазматической мембране (ПМ). Это вызвало новые вопросы, касающиеся, например, степени, в которой составляющие данного сигнального комплекса или нанодомена ограничены им или распадаются при восприятии сигнала.

Хорошо изученным путем у растений является передача сигнала гормона брассиностероида (BR), опосредованная резидентной киназой рецептора PM BRI1 и ее корецептором BAK1. Связывание BR с внеклеточным доменом BRI1 увеличивает его взаимодействие с BAK1 и реорганизацию белков в комплексе (см. Ссылку), что в конечном итоге приводит к ауто- и трансфосфорилированию их доменов Ser / Thr-киназы 1, 2 .Эти резидентные события PM приводят к дифференциальной регуляции BR-чувствительных генов с помощью нуклео-цитоплазматического сигнального каскада 3–6 и активации PM-резидентных протонных насосов P-типа 7,8 .

RLP44, как было описано ранее, играет роль в восприятии целостности клеточной стенки посредством модуляции BRI1 / BAK1-зависимой передачи сигналов 9 и для взаимодействия с BRI1 и BAK1 9,10 . Это предполагает, что RLP44 непосредственно влияет на активность комплекса BRI1 / BAK1 при входе из клеточной стенки в качестве каркасного белка для установления специфического комплекса BRI1 / BAK1 в PM 2 .

Чтобы проверить гипотезу образования тройного комплекса RLP44 / BRI1 / BAK1, нам сначала пришлось установить трехфлуорофорные спектральные FRET и FRET-FLIM с тремя флуорофорами в растительных клетках. FRET - это безызлучательная передача энергии от донора к акцепторному флуорофору за счет диполь-дипольного взаимодействия, которое возможно только на малых расстояниях и зависит от ориентации относительного дипольного момента донорного и акцепторного флуорофоров 11 . FRET проявляется в изменении интенсивности флуоресценции донора и акцептора, но также уменьшает время жизни возбужденного состояния донора из-за дополнительного пути релаксации от донора к акцептору 12 .В отличие от двухфлуорофоров FRET, промежуточный акцепторный флуорофор включен в путь передачи энергии трехфлуорофоров FRET. Поскольку органические красители не могут проникнуть через клеточную стенку растений, наш подход зависит исключительно от генетически кодируемых флуорофоров. Здесь мы в качестве примера выбираем мономерную бирюзу 2 (mTRQ2) в качестве донора, мономерную Венеру (mVEN) в качестве первого акцептора и мономерный красный флуоресцентный белок 1 (mRFP) в качестве второго акцептора.

На основе теоретических расчетов мы экспериментально показали с помощью спектральных FRET и FRET-FLIM на основе интенсивности, что RLP44, BRI1 и BAK1 объединены в тройной комплекс, который, вероятно, образуется в отдельном нанодомене в PM, который пространственно четко отличается от FLS2. / BAK1 комплексный нанодомен.Кроме того, мы предлагаем FRET-FLIM всегда быть лучшим выбором для анализа образования тройных белковых комплексов и оценки относительной близости в растительных клетках.

Результаты

Физико-химические свойства используемых флуорофоров

Выбранные флуорофоры существенно влияют на качество данных FRET. Все наши генетически кодируемые флуорофоры были мономерными, что сводило к минимуму ложноположительные результаты FRET, возникающие в результате агрегации. mTRQ2 использовался в качестве донора, поскольку он имеет множество преимуществ, включая длительное время моноэкспоненциальной флуоресценции (FLT) 13 .Спектральное перекрытие излучения mTRQ2 с поглощением первого акцептора mVEN велико, что дает большое расстояние Ферстера R 0 14–16 . Второй акцептор - это mRFP, который имеет большое спектральное перекрытие с первым акцептором (mVEN). Время созревания флуорофоров также является решающим фактором для эффективности FRET (EFRET) 17,18 . В нашей системе с тремя флуорофорами и mVEN, и mRFP имеют более быстрое время созревания, чем mTRQ2, что обеспечивает благоприятные условия FRET (более подробная информация о флуорофорах представлена ​​в таблице 1 SI).

Расчетные свойства используемой трехфлуорофорной системы FRET

Для определения рабочего диапазона FRET для выбранных флуорофоров были рассчитаны соответствующие расстояния Ферстера (R 0 ) (Таблица 1), а также расстояние, соответствующее 10% КПД FRET (r E = 10% ). Этот последний параметр лучше всего иллюстрирует предел измерения для FRET, который может быть реализован с помощью стандартных измерений FRET-микроскопии. Для комплексного потока энергии в установке с тремя флуорофорами r E = 10%. было рассчитано для пары mTRQ2 / mRFP с добавлением mVEN в качестве промежуточного акцептора.В особенности в случае нанодоменов рецепторных комплексов в ПМ ожидаются более высокие комплексные стехиометрии. Кроме того, в таком двумерном пространстве более вероятны пространственные ситуации, когда донор находится в диапазоне нескольких акцепторов 19 . Поэтому мы также рассчитали, как этот эффект может повлиять на перенос энергии. Согласно спектрам поглощения и излучения используемых флуорофоров (рис. 1а), излучение mTRQ2 показывает значительное спектральное перекрытие со спектрами поглощения как mVEN, так и mRFP (рис.1а). Кроме того, спектр излучения mVEN существенно перекрывается со спектром поглощения mRFP, обеспечивая передачу энергии от mTRQ2 к mVEN, mVEN к mRFP и mTRQ2 к mRFP. R 0 был рассчитан с n = 1,4 и k 2 = 2/3 согласно 20 с использованием спектров и фотофизических данных из исходных публикаций (таблица 2 SI). Полученные расстояния Ферстера R 0 составили 5,7 нм для mTRQ2 / mVEN, 5,2 нм для mVEN / mRFP и 5,1 нм для пары mTRQ2 / mRFP (таблица 1, рис.1б). Очевидно, такая же тенденция наблюдается для r E = 10% , который является максимальным для пары mTRQ2 / mVEN и самым низким для пары mTRQ2 / mRFP (таблица 1, рис. 1b). Кроме того, было вычислено, что FRET не ограничивается последовательной передачей энергии от mTRQ2 через mVEN к mRFP, но также напрямую от mTRQ2 к mRFP (таблица 1, рис. 1c).

Таблица 1:

комбинаций FRET (столбец 1 st ), их расстояния Ферстера (R 0 ) (2 столбца и столбец ) и расстояния флуорофора, которые соответствуют эффективности FRET 10% (r 10% ), рассчитано для линейной конфигурации с одним (3 -й столбец ) или двумя акцепторами (4 -й столбец ) в диапазоне каждого соответствующего донора (см. также таблицу 2 SI).

Рис. 1. Спектроскопические и FRET свойства используемых флуорофоров и размеры анализируемых гибридных белков RLP44-mTRQ2, BAK1-mVEN и BRI1-mRFP.

a , Нормализованные спектры поглощения (пунктирные линии) и излучения (сплошные линии) mTRQ2 (синий), mVEN (желтый) и mRFP (красный). mTRQ2 является донором как для mVEN в качестве акцептора 1, так и для mRFP в качестве акцептора 2; mVEN также является донором mRFP. Заштрихованная область соответствует спектральному перекрытию между испусканием донора и поглощением акцептора, показанным здесь в качестве примера для пары mTRQ2 / mVEN FRET.Лазерные линии для возбуждения mTRQ2 (синий), mVEN (желтый) и mRFP (красный) отмечены как вертикальные линии на их соответствующих положениях длины волны. b , эффективности FRET (E FRET ) для расстояний (r) между донорными и акцепторными флуорофорами для mTRQ2-mVEN (синий), mVEN-mRFP (желтый) и mTRQ2-mRFP (красный). Расстояния Ферстера R 0 на E FRET = 50%, а также расстояния, соответствующие E FRET = 10% (r E = 10% ) для каждой пары, отмечены пунктирными линиями в соответствующих цвет. c , E FRET в зависимости от расстояния r между mTRQ2 и mRFP без (сплошная линия) и с промежуточным mVEN, расположенным либо эквидистантно (пунктирная линия), либо переменно (кружки) между mTRQ2 и mRFP. Для последнего mVEN был помещен в 1000 случайных позиций для каждого расстояния mTRQ2 / mRFP, усредняя полученные значения E FRET . Расстояния r E = 10% отмечены красными линиями. d , Составное изображение цитоплазматических доменов RLP44 (синий), BRI1 (оранжевый) и BAK1 (коричневый), слитых с 15-аминокислотным линкером Gateway ® либо с mTRQ2 (голубой), либо с mVEN (светлый желтый) или mRFP (светло-красный).Структуры цитоплазматических доменов BAK1, BRI1 и флуорофоров показаны как доступные для растворителя поверхностные модели, в то время как модельные структуры цитоплазматического домена RLP44 и трех линкеров Gateway ® (серый цвет) были предсказаны с помощью PEP-FOLD3. и изображали в мультфильмах. Ориентацию киназных доменов BRI1 и BAK1 относительно друг друга рассчитывали согласно молекулярному анализу стыковки в ориентации к PM. 27 Цветные стрелки под структурами показывают расстояния r E = 10% для всех пар FRET и треххромофорного каскада FRET с mVEN, вставленными в случайные положения, рассчитанные для отношения донорного и акцепторного комплексов 1: 1 ( нижние стрелки) и 1: 2 (верхние стрелки).Точные значения для b, c и d перечислены в Таблице 1.

Для больших расстояний между mTRQ2 и mRFP не ожидается прямой FRET. Следовательно, введение промежуточного акцептора mVEN может увеличить динамический диапазон между mTRQ2 и mRFP. Чтобы оценить этот дальнодействующий эффект, мы исследовали, как присутствие mVEN влияет на передачу энергии mRFP в таком каскаде FRET 21 , и рассчитали увеличение для r E = 10% с 8,2 нм до 12,4 нм (рис.1c, таблица 1), что согласуется с увеличением эффективного расстояния FRET, о котором сообщалось ранее 22 . Однако авторы 28 зафиксировали положения флуорофора вдоль спирали ДНК с эквидистантным разделением флуорофоров. Однако в мультимерных белковых комплексах ни геометрия комплекса, ни точное положение прикрепленных флуорофоров обычно неизвестны. Поэтому мы дополнительно рассчитали усредненное значение r E = 10% , когда mVEN вставлен в случайные позиции между mTRQ2 и mRFP.В этом более реалистичном представлении нашей динамической системы завода мы обнаружили немного меньшее увеличение r E = 10% с 8,2 нм до 11,1 нм (рис. 1c, таблица 1). Этого достаточно, чтобы можно было обнаруживать дальнодействующие взаимодействия с помощью нашего подхода FRET с тремя флуорофорами.

В случае более высокой сложной стехиометрии значения r E = 10% увеличиваются еще больше. Из-за так называемого эффекта «антенны» FRET член расстояния в расчете E FRET изменяется на n -1 r 6 , где n - количество идентичных и эквидистантных акцепторов на донора 19 .Кроме того, коэффициент ориентации k 2 , который обычно считается равным 2/3 для свободно вращающихся молекул, увеличивается из-за смещения отбора для множества акцепторов 19 (известного как «избыточный» эффект FRET 23 ), что приводит к увеличение на 0 и, следовательно, на FRET . Следовательно, когда mVEN вставляется в середину или в рандомизированное положение в структуре FRET, даже осторожное предположение о наличии по крайней мере двух акцепторов в диапазоне каждого донора приводит к увеличению r 10% с 12.От 4 до 14,6 нм и от 11,1 до 13,1 нм, соответственно (таблица 1, дополнительная информация).

Таким образом, в зависимости от соотношения донор-акцептор и на основе переменного расположения, передача энергии от mTRQ2 через mVEN к mRFP может происходить на расстояниях до 13,1 нм. Следовательно, дальнодействующие тройные белковые взаимодействия поддаются проверке путем слияния mTRQ2, mVEN и mRFP с интересующими белками.

Структурное моделирование расположения белков, меченных флуорофором, для оценки диапазона FRET

Чтобы оценить, как максимальный динамический диапазон составляет около 13.1 нм относится к размеру интересующих нас белков, мы расположили цитоплазматические домены RLP44, BRI1 и BAK1, слитые с соответствующими флуорофорами, и рассчитанные значения r E = 10% между mTRQ2, mVEN и mRFP в масштабе на графике (Рис. 1d). Поскольку структуры флуорофоров и цитоплазматических доменов BRI1 и BAK1 доступны, создается доступное для растворителя представление поверхности для оценки размеров белков 24–26 . Ориентация киназных доменов BRI1 и BAK1 друг относительно друга была изображена в соответствии с наибольшей вероятностью после молекулярного док-анализа 27 .Структуры цитоплазматического домена RLP44 и линкеров Gateway ® были недоступны и предсказывались с помощью PEP-FOLD3 28 (подробности см. В разделе "Методы"). Скорректированные по стехиометрии значения r E = 10% для всех пар FRET находятся в диапазоне от 8,6 до 9,7 нм (таблица 1) и, следовательно, могут охватывать расстояние между двумя доменами киназы, которые имеют диаметр около 4,8 нм (рис. 1d). ). Что наиболее важно, в то время как RLP44-mTRQ2 и BAK1-mRFP находятся слишком далеко друг от друга для FRET в этом примерном линейном расположении, трехфлуорофорный FRET от RLP44-mTRQ2 через BRI1-mVEN до BAK1-mRFP может преодолевать это расстояние (рис.1e) То же самое ожидается для компоновки RLP44-mTRQ2 / BAK1-mVEN / BRI1-mRFP.

Расчет перекрестного возбуждения и просачивания в спектральных измерениях FRET на основе интенсивности

Подавляющее большинство исследований на животных клетках оценивали FRET с тремя флуорофорами с помощью методов, основанных на интенсивности, в частности, путем количественного сбора спектров с использованием преимущественно органических красители. Поэтому мы решили сначала оценить образование тройного комплекса для выбранных гибридных белков в растительных клетках с помощью этого метода.

Независимо от стехиометрии комплексов, уровни экспрессии слитых с флуорофором белков имеют большое влияние на спектры FRET на основе интенсивности из-за перекрестного возбуждения и просачивания. Это продемонстрировано в смоделированных эмиссионных спектрах на рис. 2, рассчитанных для сложной стехиометрии 1: 1: 1 и линейного расположения mTRQ2, mVEN и mRFP, размещающих mVEN на равном расстоянии от двух других флуорофоров. При таком соотношении флуорофоров, межфлуорофорных расстояниях более 10 нм (без FRET) и длине волны возбуждения 458 нм пик интенсивности около 525 нм был рассчитан на появление из-за перекрестного возбуждения (рис.2а, вверху). При межфлуорофорных расстояниях 7 нм (рис. 2а, в середине) и 5 ​​нм (рис. 2а, внизу) передача энергии от mTRQ2 к mVEN и mRFP стала очевидной в смоделированных спектрах по мере уменьшения относительного пика интенсивности mTRQ2, в то время как пики mVEN и mRFP увеличивались. Теоретическое просачивание и перекрестное возбуждение сильно зависят от донорно-акцепторного соотношения флуорофоров (рис. 2b и дополнительная информация). Важно отметить, что эффекты просачивания и перекрестного возбуждения имеют большее влияние на кажущийся сигнал mVEN, чем сам FRET: уже соотношение 1: 2 для mTRQ2 / mVEN приводит к пику интенсивности флуоресценции около 525 нм, аналогичному тому рассчитано для межфлуорофорного расстояния 7 нм (ср. рис.2а, посередине и рис. 2б, вверху). Тем не менее, различная прогрессия интенсивности mRFP была хорошо заметна (сравните рис. 2a с рис. 2b. Это подчеркивает необходимость тщательной калибровки количеств слитого белка. Следовательно, сквозное просачивание и перекрестное возбуждение всегда количественно выражаются в представленных абсорбциях и спектры излучения, а также в конфокальных изображениях (дополнительная информация)

Рис. 2 Моделирование спектров излучения показывает решающее влияние относительных количеств флуорофоров на спектральный FRET на основе интенсивности в треххромофорном расположении.

a , Моделирование спектров, возникающих в результате возбуждения mTRQ2 с длиной волны 458 нм для стехиометрии mTRQ2, mVEN и mRFP 1: 1: 1 и линейного расположения трех флуорофоров при размещении mVEN на равном расстоянии друг от друга два флуорофора. Спектры излучения mTRQ (синяя область), mVEN (желтая область) и mRFP (красная область) и их объединенный спектр (черная линия) рассчитываются для равных уровней экспрессии флуорофора. Соответствующие каналы детекторов выбросов показаны над графиками.При межфлуорофорных расстояниях более 10 нм FRET незначителен (вверху), но перекрестное возбуждение mVEN (желтая стрелка) очевидно. Для расстояний между флуорофорами 7 нм (в центре) и 5 ​​нм (внизу) FRET снижает интенсивность излучения mTRQ2, в то время как пики интенсивности mVEN примерно при 525 нм и mRFP примерно при 610 нм (красная стрелка) увеличиваются. b , Моделирование спектров как в a , но без учета FRET, рассчитанного для различных соотношений флуорофоров mTRQ2 / mVEN. При увеличении отношения mTRQ2 / mVEN до 1: 2 (вверху), 1: 3 (в центре) и 1: 4 (внизу) пик интенсивности mVEN (желтая стрелка) увеличивается.Таким образом, соотношение mTRQ2 / mVEN 1: 2 ( b , вверху) приводит к аналогичной спектральной форме, чем у эквимолярных флуорофоров, подвергнутых FRET на расстоянии 7 нм ( a , в середине).

Экспериментальное определение перекрестного возбуждения и кровотечения в растительных клетках

Ранее было показано, что BRI1 / BAK1, RLP44 / BRI1 и RLP44 / BAK1 образуют гетеромеры в растительных клетках 9,10,29 . Напротив, локализованный в PM иммунный ответ, опосредующий рецептор Flagellin Sensing 2 (FLS2), не взаимодействует с RLP44 30,31 и был выбран в качестве отрицательного контроля в дальнейших анализах.Для проведения нашего исследования спектры были получены на временно трансформированных клетках эпидермального листа Nicotiana benthamiana . Все слитые белки локализованы в PM (SI рис. 1).

Спектры испускания флуоресценции трех слитых конструкций (RLP44-mTRQ2, FLS2-mVEN и BAK1-mRFP) регистрировали в отдельных экспериментах после возбуждения светом 458 нм, при этом только FLS2-mVEN показывал значительное количество перекрестного возбуждения. (Рис. 3а). Количественная оценка испускания флуоресценции RLP44-mTRQ2 после возбуждения на 458 нм является мерой его уровня белка, проявляя среднюю интенсивность 120 условных единиц (a.ед.) (рис. 3б). Это отражалось в пике эмиссии с интенсивностью 120 а.е. в спектре (рис. 3а). Относительно высокий уровень накопления FLS2-mVEN со средней интенсивностью 200 у.е. после возбуждения на длине волны 514 нм (рис. 3б) вызвал гораздо меньший фоновый сигнал 8 а.е. в спектре после возбуждения светом 458 нм (рис. 3а). Возбуждение BAK1-mRFP светом 561 нм давало среднюю интенсивность 110 а.е. (Рис. 3б), но не привело к появлению четкого пика в спектре излучения после возбуждения светом 458 нм (рис.3а). Таким образом, разные уровни накопления слитых белков привели к одинаковой форме спектров излучения флуоресценции, но с вариациями пиковой интенсивности (SI рис. 2).

Рис. 3. Взаимодействие RLP44 с BAK1 и BRI1 обнаруживается в плазматической мембране клеток эпидермального листа N. benthamiana с помощью спектрального FRET на основе интенсивности.

a , Зависимая от длины волны интенсивность флуоресцентного излучения после облучения клеток светом 458 нм для RLP44-mTRQ2 (синий), FLS2-mVEN (оранжевый) и BAK1-mRFP (красный). b , Интенсивность излучения после облучения клеток светом с разной длиной волны в канале mTRQ2 (слева, 458 нм), канале mVEN (средний, 514 нм) и канале mRFP (справа, 561 нм) 8-битных изображений для RLP44-mTRQ2 (синий), FLS2-mVEN (оранжевый) и BAK1-mRFP (красный) после коррекции спектрального просвечивания. c , Зависимая от длины волны нормализованная флуоресцентная эмиссия для совместной экспрессии RLP44-mTRQ2 с BRI1-mVEN (синий) или с FLS2-mVEN (серый). Для обоих спектров среднее соотношение донор-акцептор составляло около 1: 4 (0.26). Область длины волны, относящаяся к FRET, выделена в увеличенном виде, а появление FRET от RLP44-mTRQ2 до BRI1-mVEN указано острием красной стрелки. Данные представлены как среднее значение (n ≥13). d , Зависимый от количества белка относительный сигнал эмиссии mVEN в спектрах флуоресценции после облучения клеток светом с длиной волны 458 нм. Показаны отношения слитых белков примерно 1: 4 (слева) и 1:10 (справа) для пары RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN (синий) и пары RLP44-TRQ2 / FLS2-mVEN (серый).Значимые изменения [n = 7 (слева), n = 12 (справа)] в двустороннем двухвыборочном t-тесте с p <0,05 отмечены звездочками. e , Зависимая от длины волны нормализованная эмиссия флуоресценции после облучения клеток светом 458 нм только для RLP44-mTRQ2 (синий), RLP44-mTRQ / FLS2-mRFP (черный), RLP44-mTRQ / BAK1-mRFP (оранжевый) и RLP44-mTRQ / BRI1-mRFP (красный). Область длины волны, относящаяся к FRET, выделена в увеличенном виде, а появление FRET отRLP44-mTRQ2 до BAK1-mRFP или BRI1-mRFP указано острием красной стрелки. f , Интенсивность излучения после облучения клеток светом разной длины волны в mTRQ2 (слева), mVEN (средний) и mRFP канал (справа) 8-битных изображений для RLP44-mTRQ2 (синий), RLP44-mTRQ / FLS2-mRFP (черный), RLP44-mTRQ / BAK1-mRFP (оранжевый) и RLP44-mTRQ / BRI1-mRFP (красный). Подробнее см. b . Для статистической оценки см. Методы. Коробчатые диаграммы в b и f представляют измеренные данные со средним значением (здесь эквивалентным медиане) в виде сплошной черной линии внутри прямоугольника, который ограничен +/- стандартным отклонением.Коробчатая диаграмма в d представляет все данные со средним значением в виде сплошной черной линии внутри прямоугольника, ограниченного первым квартилем (25%; нижний предел) и третьим квартилем (75%; верхний предел). Вискеры показывают минимум и максимум измерений, соответственно.

FRET-анализ двойных белок-белковых взаимодействий на основе интенсивности

Сначала мы оценили FRET от mTRQ2 до гибридных белков mVEN. Поскольку наше моделирование показывает, что количество слитых белков имеет большее влияние на форму спектров, чем сам FRET, корректировка относительных уровней белков была обязательной.Следовательно, всегда необходимо было сравнивать спектры с одинаковыми донорно-акцепторными отношениями RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN со спектрами RLP44-mTRQ2 / FLS2-mVEN. С этой целью каждый записанный спектр подвергался спектральному разделению, чтобы определить относительные пропорции mTRQ2 и mVEN (дополнительная информация). Затем информацию о спектральном несмешивании объединяли с соответствующими оценками уровней слитого белка. Для этого каждый канал визуализировали с последовательным возбуждением перед получением спектров (возбуждение только с 458 нм, затем только с 514 нм, наконец, только с 561 нм).

В спектрах с одинаковым соотношением донорных и акцепторных образцов значение интенсивности пика примерно при 525 нм было выше для RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN, чем для образца RLP44-mTRQ2 / FLS2-mVEN (рис. 3c). ). Обобщение результатов спектрального разделения и соотношения донор-акцептор показало, что доля излучения mVEN в спектрах образца RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN значительно отличается от такового для образца RLP44-mTRQ2 / FLS2-mVEN (рис. . 3d). Это также верно для соотношений донор-акцептор примерно 1:10 и 1: 4 (рис.3d). В заключение, FRET от RLP44-mTRQ2 до BRI1-mVEN наблюдали, но только после тщательного сравнения с данными, записанными для контрольной пары без FRET RLP44-mTRQ2 / FLS2-mVEN.

Затем мы проверили, обнаруживается ли передача энергии от mTRQ2 к гибридным белкам mRFP. Для совместного накопления RLP44-mTRQ2 с FLS2-mRFP не было обнаружено значительного увеличения эмиссии около 610 нм по сравнению с контролем только с донором (фиг. 3e). Напротив, совместное накопление RLP44-mTRQ2 с BAK1-mRFP или BRI1-mRFP привело к значительному увеличению эмиссии на длине волны около 610 нм по сравнению с контролем (рис.3д). Соотношение интенсивности флуоресценции между mTRQ2 и mRFP составляло 1: 1 для пары RLP44-mTRQ2 / FLS2-mRFP (рис. 3f), тогда как RLP44-mTRQ2 / BRI1-mRFP и RLP44-mTRQ2 / BAK1-mRFP были 1: 2 и 1: 5, что выше, чем в контроле RLP44-mTRQ2 / FLS2-mRFP (рис. 3f). После поправки на различные количества слитого белка спектрально детектируемый FRET явно происходил от RLP44-mTRQ2 до BAK1-mRFP или BRI1-mRFP, но не от FLS2-mRFP.

FRET-анализ образования тройного белкового комплекса на основе интенсивности

Когда RLP44, BRI1 и BAK1 образуют тройной белковый комплекс, среднее расстояние между RLP44 и BAK1 может изменяться из-за присутствия BRI1.Например, BRI1 может быть расположен между RLP44 и BAK1, увеличивая расстояние между ними. Также может быть уменьшено общее количество пар RLP44 / BAK1, поскольку могут быть сформированы дополнительные пары, такие как RLP44 / BRI1 или BAK1 / BRI1 32 .

Чтобы проверить эту возможность, мы экспрессировали BRI1 с нефлуоресцентной HA-меткой (BRI1-HA) в клетках табака (SI рис. 3). Совместная экспрессия BRI1-HA не изменяла форму спектра RLP44-mTRQ2 (сравните фиг. 4a и фиг. 3a). Как описано выше, совместное накопление RLP44-mTRQ2 с BAK1-mRFP дало пик эмиссии, индуцированный FRET, примерно при 610 нм (рис.4а). Этот пик больше не присутствовал, когда BRI1-HA коэкспрессировался с RLP44-mTRQ2 и BAK1-mRFP (фиг. 4a). Напротив, коэкспрессия RLP44-mTRQ2 / FLS2-mVEN / BRI1-mRFP сохраняла пик интенсивности около 610 нм (SI рис. 4). Таким образом, добавление BRI1-HA увеличивало среднее расстояние между RLP44-mTRQ2 и BAK1-mRFP или приводило к изменениям уровней белка, меченного флуорофором. Поскольку последнее было не так (рис. 4b), наши результаты демонстрируют, что расстояние между RLP44-mTRQ2 и BAK1-mRFP действительно изменилось при совместном накоплении BRI1-HA.Когда вместо BRI1-HA коэкспрессировался BRI1-mVEN, снова появлялся пик эмиссии около 610 нм (фиг. 4c, d). В то же время была обнаружена передача энергии от mVEN к mRFP, поскольку пик излучения mVEN при 525 нм сильно уменьшился в образце RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN / BAK1-mRFP по сравнению с RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN. образец, который не наблюдался в контрольных образцах FLS2 (рис. 4а, в). Хотя влияние перекрестного возбуждения mVEN и последующего FRET непосредственно на mRFP нельзя полностью исключить, этим эффектом можно пренебречь, поскольку для образца RLP44 / FLS2 / FLS2 не наблюдалось передачи энергии от mVEN к mRFP (SI рис.4). Аналогичным образом, анализ различных комбинаций белков существенно не изменил отношения донор-акцептор (фиг. 4d). В заключение, появление пика эмиссии около 610 нм, которое сопровождалось параллельным уменьшением эмиссии около 525 нм, соответствует критериям для треххромофорного FRET от RLP44-mTRQ2 через BRI1-mVEN до BAK1- mRFP. Кроме того, описанный выше перенос энергии также наблюдался при обмене акцепторных флуорофоров (SI рис.4).

Рис. 4 Образование тройного комплекса, состоящего из RLP44, BAK1 и BRI1, но не включающего FLS2, обнаруживается в плазматической мембране эпидермального листа N. benthamiana с помощью спектрального FRET на основе интенсивности.

a , Зависимая от длины волны нормализованная флуоресцентная эмиссия после облучения клеток светом 458 нм для экспрессии только RLP44-mTRQ2 (синий) или совместной экспрессии с BAK1-mRFP (светло-красный) или HA-меченным BRI1 ( BRI1 HA ) и BAK1-mRFP (черный) или BRI1-mVEN (бронзовый) или BRI1-mVEN и BAK1-mRFP (темно-красный).Соответствующая FRET область длин волн выделена в увеличенном разделе. Появление FRET от mTRQ2 до mRFP указано красной стрелкой. b , Интенсивность излучения после облучения клеток светом с разной длиной волны в mTRQ2 (слева, 458 нм), mVEN (средний, 514 нм) и канале mRFP (справа, 561 нм) 8-битных изображений для RLP44- mTRQ2 коэкспрессируется с BRI1 HA (синий), BAK1-mRFP (светло-красный), BRI1 HA и BAK1-mRFP (черный), BRI1-mVEN (желтый) или BRI1-mVEN и BAK1-mRFP (темный красный). c , Зависимое от длины волны нормализованное излучение флуоресценции после облучения клеток светом 458 нм для экспрессии только RLP44-mTRQ (синий) или совместной экспрессии с BRI1-mVEN и BAK1-mRFP (красный) или BAK1-mVEN и BRI1-mRFP (оранжевый) или BRI1-mVEN и FLS2-mRFP (зеленый) или BAK1-mVEN и FLS2-mRFP (голубой) или с FLS2-mRFP (черный). Области длин волн, относящиеся к FRET, выделены в увеличенных частях. Появление FRET от mTRQ2 до mRFP примерно на 610 нм и вызванное FRET уменьшение сигнала mVEN примерно на 525 нм указано красными стрелками.Фоновое излучение ячеек показано серой штриховой линией. d , Коэффициент испускания флуоресценции после облучения клеток светом разной длины волны в канале mTRQ2 (слева), канале mVEN (в центре) и канале mRFP (справа) 8-битных изображений для RLP44-mTRQ2, коэкспрессированного с BRI1 HA и BAK1-mRFP (черный), BRI1-mVEN (желтый) и BRI1-mVEN и BAK1-mRFP (темно-красный). Подробнее см. b . Коробчатые диаграммы в b и d представляют все данные со средним значением (здесь эквивалентным медиане) в виде сплошной черной линии внутри прямоугольника, который ограничен +/- стандартным отклонением.Для статистической оценки см. Методы.

В заключение, наши данные убедительно доказывают, что FRET от mTRQ2 через mVEN к mRFP специфически возникал для комбинаций RLP44 / BRI1 / BAK1 и RLP44 / BAK1 / BRI1, но не для комбинации RLP44 / BAK1 / FLS2. Это указывает на то, что RLP44, BRI1 и BAK1 образуют определенный тройной комплекс и / или расположены в очень непосредственной пространственной близости, в частности, в PM. Успешное установление трехфлуорофорного FRET на основе интенсивности теперь побудило нас проверить, может ли образование комплекса также быть зарегистрировано с помощью FLIM.

Измерение

in vivo Образование тройного комплекса RLP44 / BRI1 / BAK1 с помощью FRET-FLIM

При изучении трехстороннего взаимодействия с помощью спектральных методов, основанных на интенсивности, соотношение между донорными и акцепторными молекулами имеет большое значение, так как спектральное слияние - сквозное и перекрестное возбуждение имитирует потенциал FRET. Напротив, при мониторинге времени жизни флуоресценции (FLT) донора с помощью FLIM такие тщательные и трудоемкие калибровки не требуются. 7,33 . Поэтому мы проверили, можно ли также отслеживать и подтверждать комплексное образование и пространственное расположение RLP44, BRI1 и BAK1, изменяя FLT mTRQ2.

Мы определили средний FLT около 3,99 нс для RLP44-mTRQ2 (рис. 5a), как сообщалось ранее 13,15 . Интересно, что значительное снижение FLT наблюдается при совместном накоплении RLP44-mTRQ2 с BRI1, слитым либо с mVEN (3,54 нс), либо с mRFP (3,60 нс), либо с BAK1-mRFP (3,54 нс), что указывает на FRET от RLP44- mTRQ2 в BRI1-mVEN, BRI1-mRFP или BAK1-mRFP (рис. 5а). Это составляет нижний предел FLT, который ожидается, когда в PM присутствуют только гетеродимеры. В качестве отрицательного контроля коэкспрессия FLS2-mVEN (3.70 нс) или FLS2-mRFP (3,90 нс) с RLP44-mTRQ2 не вызывали значительного снижения FLT mTRQ2 (рис. 5a, b). Совместное накопление FLS-mRFP с RLP44-mTRQ2 и BRI1-mVEN не привело к дальнейшему снижению FLT RLP44-mTRQ2 (3,60 нс) по сравнению с ситуацией, когда FLS2-mRFP отсутствует (рис. 5a). Напротив, присутствие BAK1-mRFP вместе с RLP44-mTRQ2 и BRI1-mVEN привело к значительному дальнейшему снижению FLT RLP44-mTRQ2 до 3,40 нс, сверх вышеуказанных значений для гетеромеров RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN 3.54 нс (рис. 5а). Это можно объяснить только наличием дополнительного пути FRET, который становится возможным, если RLP44, BAK1 и BRI1 образуют тройной комплекс. Когда 10 нМ брассинолида (BL), активного брассиностероида, наносили на клетки, не наблюдалось изменений FLT RLP44-mTRQ2 (фиг. 5c). Ранее было показано, что FRET-FLIM, в принципе, не зависит от концентрации донора 34 . Однако относительное количество акцептора по сравнению с донорными флуорофорами (соотношение донор-акцептор) может влиять на FLT донора 19,21 .Поэтому мы исследовали, влияет ли этот эффект на значения FLT, полученные с использованием различных соотношений флуоресцентных белков. Поскольку только соотношение RLP44-mTRQ2 / FLS2-mRFP и RLP44-mTRQ2 / BAK1-mRFP показало измеримую разницу в RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN / FLS2-mRFP и RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVENR / BAKRFP в расположении трех флуорофоров различия в силе экспрессии слитых белков не были основным фактором, влияющим на FLT RLP44-mTRQ2 (SI рис. 5).

Рис. 5 FRET-FLIM позволяет проводить количественный анализ белок-белкового взаимодействия трех флуорофоров и анализ близости в Н.benthamiana клеток листа.

a , Время жизни флуоресценции (FLT) RLP44-mTRQ2 после импульсного возбуждения клеток светом 440 нм в присутствии указанных слитых белков mVEN и mRFP. b , FLT RLP44-mTRQ2 отдельно или в присутствии FLS2-mVEN. Представление данных как в a. c , относительный FLT RLP44-mTRQ2 отдельно или в присутствии указанных слитых белков без (темно-красный) и с нанесением 10 нМ брассинолида (BL) (светло-красный).Средний FLT RLP44-mTRQ2 в отсутствие BL был установлен на 1.

Коробчатые диаграммы представляют все данные со средним значением в виде сплошной черной линии внутри прямоугольника, ограниченного первым квартилем (25%; нижний предел) и третий квартиль (75%; верхний предел). Усы показывают минимальное и максимальное значение данных, соответственно, которые не определены как выбросы (межквартильный размах в 1,5 раза). Выбросы обозначены черными ромбами. Статистические оценки были выполнены с помощью ANOVA с последующим апостериорным тестом Tukey-Kramer HSD.Черная звездочка указывает на статистически значимые различия (p≤ = 0,005).

Таким образом, мы смогли подтвердить образование тройного комплекса RLP44, BAK1 и BRI1 трехфлуорофором FRET-FLIM в живых клетках растений. Более того, подход FRET-FLIM явно превосходит подход FRET, основанный на интенсивности, поскольку первый легче реализовать и менее подвержен ошибкам.

Обсуждение

Во многих исследованиях, не связанных с растениями, были независимо установлены наборы флуорофоров для изучения бинарных белок-белковых взаимодействий и образования комплексов в клеточном контексте. 35 .Здесь мы представляем подходы FRET и FRET-FLIM на основе трех флуорофоров с использованием генетически кодируемых флуорофоров mTRQ2, mVEN и mRFP в растительных клетках. Использование синего, желтого и красного флуорофоров было предпочтительным применением для исследований FRET с тремя флуорофорами, поскольку оно обеспечивает хороший компромисс между большими расстояниями Ферстера из-за высокого спектрального перекрытия и достаточного спектрального разделения для независимого обнаружения. Сравнительное исследование доступных флуорофоров в нерастительных клетках показало, что mTRQ2, YPet и mCherry являются наиболее многообещающей комбинацией для трехфлуорофоров FRET 35 .Однако YPet еще не адаптирован для использования в растительных клетках. Кроме того, хотя mVEN менее яркий, чем, например, YPet, это мономер 36 . Мы пришли к выводу, что немного более низкая яркость mVEN вызывает меньшее беспокойство, чем потенциальная тенденция других флуорофоров к образованию агрегатов при высоких локальных концентрациях в ограниченных доменах, чего можно ожидать, когда они сливаются с PM-резидентными белками 36,37 . Флуорофоры высокой яркости, такие как Ruby2 или TagRFP, уступают mCherry, что компенсирует их низкую яркость за счет высокой скорости созревания 38 .Однако время созревания mRFP также относительно короткое, что также делает его подходящим акцепторным флуорофором. До сих пор ни одно исследование не могло обойти прямой FRET между донором и акцептором 2 nd для генетически кодируемых флуорофоров 21,38–42 . Следовательно, в FRET на основе интенсивности требуются обширные корректировки перекрестных помех флуорофоров. Хотя органические красители, возможно, обладали лучшими фотофизическими свойствами, их применение в растительных клетках является сложной задачей, поскольку клеточная стенка препятствует маркировке in vivo .Даже в клетках животных различная эффективность мечения органических красителей является сложной задачей для FRET с тремя флуорофорами, поскольку поправка на непосредственно возбужденную флуоресценцию акцептора оказывается проблематичной 34,43,44 .

На данный момент только в одном исследовании была предпринята попытка оценить, какие расстояния между тремя флуорофорами представляют динамический диапазон их набора 22 . Мы считаем, что реалистичная оценка изменчивости и ограничений трехфлуорофорной системы важна для интерпретации данных FRET.Например, общее практическое правило для надежных измерений FRET (ниже 10 нм) может быть неточным или неправильным. Здесь мы рассчитали адаптированные пределы расстояния, принимая во внимание несколько факторов: во-первых, пространственное расположение флуорофоров в установке с тремя флуорофорами и, во-вторых, возможность наличия нескольких акцепторов на донор для более высоких сложных стехиометрий. Действительно, для идеального линейного расположения флуорофоров mTRQ2, mVEN и mRFP измерения FRET могут охватывать расстояния до 13.1 нм. Это означает, что FRET в мембранах может встречаться не только между белками внутри одного и того же комплекса или домена, но также может быть возможен между белками, расположенными в пространственно различных, но соседних доменах (Рис. 6).

Рис. 6 Модель тройных взаимодействий и пространственных расстояний RLP44, BRI1, BAK1 и FLS2 в определенных нанодоменах, расположенных в плазматической мембране растительных клеток, как определено с помощью трех флуорофоров, спектральных FRET на основе интенсивности и FRET-FLIM.

Показаны два различных схематических нанодомена (синие пунктирные квадраты в верхнем углу) в плазматической мембране.Левый нанодомен в увеличении состоит из RLP44-mTRQ2 (синий), BRI1-mVEN (красный) и BAK1-RFP (оранжевый) - для простоты без флуорофоров и без учета масштаба. Образование различных комплексов показано FRET между mTRQ2 и mVEN синим, mVEN и mRFP желтым и mTRQ2 и mRFP красными стрелками. FRET также возможен между гибридными белками комплексов разного состава, если они находятся на расстоянии ≤ 13,1 нм (типичная желтая стрелка). Из-за отсутствия FRET, например, комплекс BAK1-mVEN / FLS2-mRFP (коричневый) должен быть не менее 13.На расстоянии 1 нм от нанодомена, который содержит комплексы, родственные RLP44, и, скорее всего, является частью независимого нанодомена (прямо в увеличении).

Если предположить, что донор расположен между 1 st и 2 st акцептором в тройном комплексе, вероятность передачи энергии от донора через акцептор 1 к акцептору 2 уменьшается по мере того, как расстояние между акцепторами 1 и 2 увеличивается. Такое пространственное расположение следует учитывать при применении измерений FRET на основе интенсивности.Кроме того, в этом контексте также рекомендуется обменять по крайней мере один из флуорофоров между гибридными белками, как это было сделано здесь. Для классического FRET-FLIM на основе доноров различия в пространственной организации могут быть не обнаружены, поскольку нет информации о том, куда передается энергия. В принципе, такая пространственная информация также может быть получена с использованием более сложного подхода FRET-FLIM, когда mVEN используется в качестве донора путем возбуждения другим лазером. В любом случае записи FRET на основе FLIM имеют преимущество более высокой чувствительности, поскольку отношение сигнал / шум в измерениях FRET на основе интенсивности становится хуже после расчёта несмешивания и сенсибилизированного излучения.

Поскольку плазматическая мембрана представляет собой камеру, ограниченную двумя измерениями, плотность белка сравнительно выше, чем в трехмерном случае. В частности, мембранные рецепторы имеют тенденцию образовывать комплексы с более высокой стехиометрией, так что донор может быть окружен несколькими акцепторами, что может увеличить кажущуюся эффективность FRET. Это может маскировать принципиально линейную взаимосвязь между E FRET и аффинными свойствами взаимодействующих слитых белков. Следовательно, нельзя сделать никаких выводов об их сродстве в тройном комплексе, и можно получить лишь ограниченную информацию об абсолютных расстояниях между тремя флуорофорами.

Ранее было неясно, взаимодействует ли RLP44 одновременно с BRI1 и BAK1. В этом исследовании мы применили FRET и FRET-FLIM на основе интенсивности, чтобы доказать, что RLP44 специфически расположен в непосредственной близости (ниже 13,1 нм) как к BRI1, так и к BAK1 in vivo . В радиусе 13,1 нм три белка могут образовывать тримеры и / или располагаться в виде промежуточных комплексов (рис. 6). Применение 10 нМ BL к клеткам не изменило характеристики FRET в пространственном расположении RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN / BAK1-mRFP в PM.Это указывает на то, что нанодомен RLP44 / BAK1 / BRI1 предварительно формируется в PM в отсутствие BL, и ни один из белков, по-видимому, не покидает нанодомен при связывании BL с BRI1 в значительном количестве.

Согласно нашим записям FRET и FRET-FLIM на основе интенсивности, FLS2 не взаимодействует ни с BRI1, ни с RLP44, что согласуется с недавними исследованиями BiFC 30 . Примечательно, что пространственное расстояние между FLS2 и гетеромерами RLP44-BAK1, RLP44-BRI1 и RLP44-BRI1-BAK1 должно быть больше 13.1 нм. Это указывает на то, что FLS2 локализован в нанодоменах, которые пространственно отличаются от тех, которые состоят из RLP44. Принимая во внимание нанометровую точность FRET, наш подход решительно подтверждает предыдущие результаты, достигнутые с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с переменным углом (VAEM), предел физического разрешения которой составляет примерно от 250 до 300 нм 31,33 .

Таким образом, используя пример трех выбранных хромофоров, мы показываем, что FRET и FRET-FLIM на основе трех флуорофоров являются методами анализа взаимодействия и относительной близости различных белков в PM живых растительных клеток.Кроме того, применяя представленные расчеты и экспериментальные подходы, можно различать пространственно различные комплексы и / или нанодомены в ПМ, которые различаются по своему белковому составу.

Хотя эти два подхода дополняют друг друга, мы настоятельно рекомендуем подход FRET-FLIM, а не спектральный FRET на основе интенсивности для анализа тройного взаимодействия белков и анализа близости, поскольку последний особенно уязвим к изменениям в соотношении донор-акцептор.

Методы

Конструирование плазмиды

Последовательность кДНК интересующего гена без стоп-кодона была перенесена в pDONR221-P3P2 (донор) или pDONR221-P1P4 (первый акцептор) или pENTR ™ / D-TOPO ® (второй акцептор ), как описано в руководстве по шлюзу (Life Technologies), с праймерами, перечисленными в таблице 3 SI. Кодирующая последовательность BRI1 и BAK1 была внесена в pENTR-D-TOPO ранее 7,8 . Для генерации BRI1-HA использовали ранее опубликованный праймер 9 для введения CDS BRI1 в pDONR207 и выполняли LR с pGWB14.LR в pB7RWG2 (RFP) 45 и вектор FRET 2in1 pFRETtv-2in1-CC 15 выполняли, как описано ранее 15,46 .

Локализация и исследования FRET-FLIM

Трансформацию N. benthamiana проводили, как описано в 15,47 , без стадии промывки стерильной водой. Для трансформаций множественными конструкциями устанавливали OD 600 , равную 0,1, и смешивали 1: 1: 1 с ингибитором сайленсинга p19. Растения поливали и оставляли при условиях окружающей среды (24 ° C) с крышкой наверху и визуализировали через два дня после трансформации с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа SP8 (CLSM) (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германия) с программным обеспечением LAS AF и SymPhoTime (Picoquant). GmbH, Берлин, Германия) с использованием 63x / 1.20 иммерсионный объектив 47,48 . Данные были получены из измерений нижнего эпидермиса, избегая замыкающих клеток и устьиц, по крайней мере с двумя биологическими повторностями, содержащими в среднем 20 точек данных и 11 точек данных для контрольных mTRQ2 - mRFP. Локализация и количественная оценка были выполнены с минимальным трехкратным средним значением для mTRQ2, mVEN и mRFP с аргоновым лазером, установленным на 2%, и возбуждениями 458 нм 40%, 514 нм 20% и 594 нм или 561 нм 30% и детектированием излучения. с 465-505 нм 400% на HyD, 525-565 нм 400% на SMD HyD и 605-650 нм 300% на SMD HyD соответственно.

FLIM-измерения были выполнены с помощью импульсного лазера 440 нм (LDH-PC-470, Picoquant GmbH, Берлин, Германия) с частотой повторения 40 МГц при пониженной скорости сканирования, что дает разрешение изображения 256 × 256 пикселей. время выдержки ~ 20 мкс. Максимальная скорость счета была установлена ​​~ 2000 гц. Измерения были остановлены, когда в самом ярком пикселе было зарегистрировано 500 фотонов. Были включены только измерения с равномерным распределением интенсивности в PM. Соответствующее излучение детектировали с помощью HyD SMD от 455 до 505 нм путем коррелированного по времени счета одиночных фотонов с использованием модуля PicoHarp 300 или модуля TimeHarp 260 (PicoQuant GmbH, Берлин, Германия).Расчет FLT был выполнен с помощью итеративной реконволюции, то есть функция отклика прибора была свернута с экспоненциальными тестовыми функциями, чтобы минимизировать ошибку относительно исходных гистограмм TCSPC в итерационном процессе. В то время как образцы только для доноров были снабжены функциями моноэкспоненциального распада, передача энергии флуорофорам в других образцах привела к дополнительным скоростям распада. Эти гистограммы требовали биэкспоненциальных функций подгонки, из которых время жизни флуоресценции определялось путем взвешенного усреднения по интенсивности.Для измерений fastFLIM была увеличена максимальная скорость счета.

Получение λ-сумм (спектров)

Экспрессия соответствующих флуорофоров проверялась через уровень флуоресценции до получения λ-сумм. Для λ-сумм использовали как последовательное возбуждение, так и одновременное возбуждение, как указано в разделе «Результаты», и среднее значение по меньшей мере 6 областей интереса PM с различными уровнями экспрессии по меньшей мере двух биологических повторов. В микроскопе Leica SP8 использовалось возбуждение при 458 нм 80% с SMD HyD ~ 250%, измерение 460-625 нм с Δ7.Разрешение 5 нм и 256 × 256 пикселей, время задержки пикселя ~ 20 мкс и трехкратное накопление линий. В Zeiss LSM880 (Carl Zeiss AG, Оберкохен, Германия) использовалось возбуждение при 485 нм с 30%, NF458, 800 В детекторов эри-сканирования, измерения 460-650 нм или 560-650 нм с Δ4,5 нм и 256 нм. Разрешение × 256 пикселей, скорость 2, цифровое усиление установлено на 2, точечное отверстие установлено на 14,25 единиц Эйри и трехкратное накопление линий. Если общая экспрессия была очень высокой, то вместо этого для всех измеренных образцов брали среднее значение дневной линии.

Белковые структуры и размеры

Внутриклеточный домен BRI1 (5LPW) и BAK1 (3TL8), а также стволы флуорофоров были экспортированы из базы данных по белкам (PDB). В качестве зрителя была выбрана Jmol: программа просмотра химических структур в 3D с открытым исходным кодом для Java 49 с доступным для растворителя изображением и измененными цветами белков. Вторичная структура линкеров и внутриклеточный домен RLP44 была предсказана с помощью предсказания PEP-FOLD 3.5 28 , de-novo , со стандартными настройками и всегда использовалась модель №1 (из 10).Аминокислотные последовательности представляли собой HPTFLYKVGQLLGTS для донора-линкера, NPAFLYKVVSRLGTS для акцепторного линкера, KGGRADPAFLYKVVIS для второго акцепторного линкера и CLWLRITEKKIVEEEGKISQSMPDY для RLP44 Cyto . Размер внутриклеточных доменов рассчитывали по известному расстоянию вторичной структуры альфа-цилиндра, которое составляет 5,4 Å от поворота к повороту и внутренний диаметр 4 Å.

Статистика

За одним исключением, каждое измерение проводилось как минимум в трех биологических повторностях.Каждая биологическая копия, в свою очередь, включала не менее 3 индивидуальных записей. За исключением, были выполнены 2 биологические повторы, каждая из которых содержала 3 индивидуальных записи. Изображения и графики были созданы с помощью Microsoft Excel v1809, SAS JMP 14 или MATLAB 50 , также с использованием этих программ для расчета среднего значения, стандартной ошибки (SE) и стандартного отклонения (SD). Для проверки однородности дисперсии использовался критерий Левена (p <0,05), а статистическая значимость для непараметрических распределений была рассчитана с помощью двустороннего теста Краскела-Уоллиса для всех пар с последующей апостериорной коррекцией Steel-Dwass . с использованием SAS JMP версии 14.0,0 51 . Для небольшого количества образцов на рис. 3d был выбран t-критерий для двух выборок 52 .

Дополнительные примечания

Теоретические основы

Эффективность FRET ( E ) между донорным (D) и акцепторным (A) флуорофором определяется выражением с r в качестве расстояния между донором и акцептором и R 0 в качестве расстояния для передачи энергии 50% (расстояние Фёрстера): с k 2 как фактор ориентации диполя, n как показатель преломления среды, QY D как квантовый выход донора и Дж как спектральное перекрытие между излучением донора и акцептором абсорбция: с ε A как молярный коэффициент затухания акцептора на длине волны пикового поглощения, λ как длина волны в нм, f D и f A как нормированный спектры излучения донора и поглощения акцептора соответственно.

Как видно из уравнения (2), фактор ориентации диполя k 2 имеет сильное влияние на расчетный R 0 и, следовательно, E :

Здесь ω, - угол между вектором электрического поля D в точке A и ориентацией диполя поглощения A, а θ - угол между эмиссионным диполем D и вектором разделения DA (Lakowicz 2006 ).

Чтобы стандартное предположение k 2 = 2/3 было истинным, вращательная диффузия флуорофора должна быть быстрее, чем время жизни флуоресценции (FLT) D (Müller et al.2013; Hink et al. 2002). Однако это может быть неверно для генетически кодируемых флуоресцентных белков, используемых в исследованиях FRET по нескольким причинам: (i) цилиндр флуорофора большой и имеет время корреляции вращения около 20-30 нс, тогда как FLT находится в диапазоне 1–4 нс (Vogel et al., 2012). (ii) Флуорофоры прикреплены к интересующим белкам с помощью гибкого линкера (Chen et al. 2013; van Rosmalen et al. 2017; George and Heringa 2002; Chen et al. 2013). В предыдущих исследованиях предполагалось, что длина линкера из 15 аминокислот обеспечивает свободное вращение флуорофора, даже если это не совсем так (Ujlaky-Nagy et al.2018; Szöllosi et al. 2006; Shrestha et al. 201). Но поскольку лучших вариантов нет, используется стандартное предположение. Это вносит ошибку из-за разной ориентации флуорофора. Hink et al. (2002) предложили использовать k 2 = 0,476, что является значением фактора ориентации для жесткого рандомизированного ансамбля пар D-A (Steinberg 1971). Это эффективно уменьшает расчетное расстояние Ферстера. Это не исключает возможности специфически существующих отклонений из-за фиксированного расположения белков, например.g., предотвращая FRET или другие пространственные устройства. Важно помнить, что эффективность FRET не соответствует фиксированным реальным расстояниям (Müller et al.2013): наличие FRET всегда означает, что они находятся в непосредственной близости, но насколько точно близко, редко можно точно определить, особенно в визуализации живых клеток. Расстояние r , доступное с помощью измерений FRET, в среднем составляет 0,5 R 0 r ≤ 1,5 R 0 (Gadella 2009; Müller et al.2013). Большинство пар FRET имеют расстояние Ферстера от 4 до 7 нс (Bajar et al., 2016; Mastop et al., 2017). Как показывает практика, FRET ограничен расстояниями менее 10 нм. Отсутствие FRET не обязательно означает, что интересующие белки не находятся в непосредственной близости или не взаимодействуют, например, из-за неблагоприятных положений прикрепления флуорофора. Трехфлуорофор FRET-FLIM, в свою очередь, имеет те же ограничения.

Расчеты для каскадов FRET

Мы определяем каскадную линейную треххромофорную систему FRET где 3 - флуорофор с наиболее красным смещением.Когда 2 действует как донор, спектральное перекрытие спектра излучения 2 со спектром поглощения 1 незначительно. Следовательно, эффективность FRET для пути 2 → 3 может быть рассчитана с помощью (1) следующим образом:

Когда 1 действует как донор, возможны два пути:

Энергия может следовать по любому пути, поэтому возможность передачи энергии для 1 → 2 уменьшается из-за возможности передачи энергии для 1 → 3 и наоборот. Это уменьшение можно выразить через квантовый выход флуорофора, используя следующие уравнения Liu & Lu (2002).Для 1 → 2:

R 0 в степени 6 содержит QY в качестве мультипликатора (см. (2)), поэтому потерянная доля QY может быть реализована в R 0 следующим образом: с и как расстояние Ферстера 1 → 2, когда 3 присутствует или отсутствует, соответственно.

Это скорректированное расстояние Ферстера теперь заменяет числитель в (1):

Объединение и упрощение (6) и (7):

Аналогичный результат может быть получен для 1 → 3:

Общая эффективность FRET для вышеуказанного каскада 1 → 2 → 3 FRET теперь может быть оценена с использованием (5), (9) и (10):

В случае переполненной системы, такой как планарная биологическая мембрана, вероятность взаимодействия одного донора с несколькими акцепторами намного выше, изменяя (1) на: с n a в качестве количества акцепторов на донора, также известного как антенный эффект (Bunt et al., 2017). Более того, эффект избытка FRET изменяет среднее значение k 2 из-за смещения выбора (Bunt et al., 2017; Koushik et al., 2009), что, в свою очередь, влияет на рабочее значение R 0 . Используя эту адаптацию для нескольких акцепторов, теперь можно рассчитать общую эффективность FRET, следуя приведенным выше уравнениям, приводящим к (11). Однако это по существу смешивает двумерный подход с очень упрощенным предположением о линейном расположении флуорофора.Более того, даже линейный каскадный подход FRET не учитывает, например, расположение 2 - 1 - 3. На самом деле все будет намного сложнее, включая сложные геометрические схемы флуорофоров, позволяющие множество возможных путей передачи энергии, которые не будут легко решены. без проведения обширного численного моделирования. Однако этот набор уравнений и полученные результаты показывают, как третий флуорофор изменяет рабочие параметры FRET и насколько важно учитывать реальную биологическую ситуацию - в этом примере анализ белковых комплексов (обычно плотно упакованных) в плазматической мембране. , который представляет большой общий интерес в сообществе медико-биологических наук.Хотя эти теоретические соображения могут быть только упрощенными приближениями, они убедительно показывают, что тесты взаимодействия FRET могут при определенных условиях охватывать гораздо большие расстояния, чем обычно ожидается, что делает этот метод жизнеспособным для гораздо более широкого диапазона анализов.

Перекрестные помехи во время визуализации

Перекрестные помехи в виде спектрального просвечивания (bt) и перекрестного возбуждения (ce) присутствовали для наших флуорофоров. Чтобы учесть это, bt и ce были оценены по нормализованным спектрам поглощения и излучения и количественно определены путем визуализации одного флуорофора, экспрессирующего Н.benthamiana растений.

Возбуждение при 458 нм приводит к относительному поглощению 91% для mTRQ2 и перекрестному возбуждению 8% для mVEN и 3% для mRFP (фиг. 1A пурпурный, вертикальная линия). Возбуждение при 514 нм для mVEN дало относительное поглощение 99% и перекрестное возбуждение mRFP 20% (зеленая линия на рис. 1A). mRFP возбуждали 561 нм с относительным поглощением 61% (фиг. 1А оранжевая линия). Просачивание спектра присутствовало от mTRQ2 к mVEN и от mVEN к mRFP: при обнаружении mVEN с полосой пропускания от 525 до 565 нм 35% сигнала исходит от mTRQ2 (SI рис.2, таблица 2 SI). Обнаружение mRFP между 605 и 650 нм включало 6% эмиссии mVEN (SI рис. 2, SI таблица 2). При количественной оценке FI, а также молекулярной яркости флуорофора, настройки обнаружения, такие как усиление детектора и мощность лазера, влияют на величину просвечивания и перекрестных помех. Таким образом, мы рассчитали коэффициенты на основе визуализации образцов с одной меткой при последовательном возбуждении (таблица 2). Измеренные bt и ce от mTRQ2 до желтого и красного каналов были выше расчетных, поскольку для возбуждения mTRQ2 использовались более высокие настройки лазера.Измеренная ce от mVEN до красного канала была в том же порядке, что и рассчитанная. Поскольку молекулярная яркость mVEN относительно высока (таблица SI 1), отношение bt к красному каналу было выше расчетного (таблица 2 SI), даже при уменьшенной мощности лазера для 514 нм по сравнению с линиями 458 нм и 561 нм ( см. Материалы и методы).

Дополнительные таблицы

SI Таблица 1 Параметры флуорофоров в этом исследовании

Квантовый выход (QY), молярный коэффициент ослабления (ε) при максимуме поглощения, яркость как продукт QY · ε, полупериод созревания при 37 ° C в E .coli (t 50 ), фотостабильность как полупериод обесцвечивания при лазерном сканирующем освещении с 80 мкВт (t ½ ), стабильность pH (pK a ) и пропорция мономерного состояния. Для сравнения: EGFP имеет яркость 33,6 мМ −1 см −1 , время полупериода отбеливания 159,7 с и pK a 6,0.

SI Таблица 2 Коэффициенты спектрального просвечивания (bt) и перекрестного возбуждения (ce)

Коэффициенты bt и ce со стандартной ошибкой (SE) для соответствующих лазерных линий были измерены на изображениях, когда был выражен только соответствующий флуорофор (D : A1: A2) и дополнительно рассчитывается на основе нормированных спектров.

SI Таблица 3

Список праймеров

Дополнительные рисунки

SI Рисунок 1

RLP44-mTRQ2, BRI1-mVEN и BAK1-mRFP экспрессируются вместе в клетках эпидермального листа N. benthamiana .

Типичные конфокальные изображения интенсивности флуоресценции в канале mTRQ2, канале mVEN и канале mRFP показаны в качестве примера для комбинации RLP44-mTRQ2, BRI1-mVEN и BAK1-mRFP через два дня после временного преобразования N. benthamiana листовые клетки.Слева показаны длины волн возбуждения и относительные интенсивности лазерного излучения. Синий канал для обнаружения RLP44-mTRQ составлял 465-505 нм, желтый канал для обнаружения BRI1-mVEN составлял 525-565 нм и красный канал для обнаружения mRFP составлял 605-650 нм. Масштабная линейка представляет 20 мкм. В общем, перед получением спектров или интенсивностей флуоресценции экспрессию каждой конструкции слияния определяли путем последовательного возбуждения, что означает, что одновременно включалась одна лазерная линия.

SI Рис. 2

Измерения интенсивности, зависящие от длины волны, выявляют различные уровни экспрессии слитого белка для разных областей плазматической мембраны в временно трансформированных клетках эпидермального листа N. benthamiana.

Зависимая от длины волны необработанная интенсивность 13 различных представляющих интерес областей, каждая, в плазматической мембране клеток листа N. benthamiana после возбуждения светом 458 нм, изображена для одного RLP44-mTRQ2 ( a ), RLP44-mTRQ2 + FLS2-mRFP ( b ) и пара RLP44-mTRQ2 + FLS2-mRFP ( c ).

SI. Фиг.3.

BRI1HA экспрессируется в временно трансформированных клетках листа N. benthamiana.

Вестерн-блоттинг (слева) и общий белок на переносящей мембране, окрашенный Ponceau S (справа) экстрактов листьев N. benthamiana , приготовленных через два дня после трансформации плазмидой ингибитора сайленсинга p19 (контроль) или p19 и плазмида, кодирующая BRI1 HA . BRI1 HA был обнаружен с помощью антитела HA. Маркеры размера белка показаны слева.

SI Рис. 4

FLS2 не мешает взаимодействиям, связанным с RLP44 (продолжение на Рис. 4).

Зависимое от длины волны нормализованное флуоресцентное излучение после облучения клеток листьев N. benthamiana светом 485 нм для совместной экспрессии RLP44-mTRQ2 с BRI1 HA (синий) или с BAK1-mRFP (красный) или FLS2 -mVEN и FLS2-mRFP (оранжевый) или FLS2-mVEN и BRI1-mRFP4 (черный). Соответствующая FRET область длин волн выделена в увеличенном разделе. Появление FRET от mTRQ2 до mRFP обозначено красной стрелкой.

SI Рис. 5

Общее соотношение доноров и акцепторов существенно не различается в схемах слияния белков в анализе FRET-FLIM.

Коэффициенты испускания флуоресценции для пар слитых белков mTRQ2 / mVEN ( a ), пар слитых белков mTRQ2 / mRFP ( b ) и пар слитых белков mVEN / mRFP ( c ). Точки данных были разбросаны влево-вправо ( черных точек, ) и объединены с информацией о прямоугольной диаграмме, что позволяет допускать выбросы. Отношения для mTRQ2 / mVEN, mTRQ2 / mRFP и mVEN / mRFP были проверены на наличие значительных различий с помощью двустороннего теста Краскела-Уоллиса для всех пар с последующей апостериорной коррекцией Steel-Dwass .Звездочкой отмечена значительная разница (p <0,05) в соотношении донор-акцептор, которое представляло собой соотношение mTRQ2 / mRFP в RLP44-mRFP4 / BRI1-mVEN / BAK1-mRFP и RLP44-mTRQ2 / BRI1-mVEN / Устройства FLS2-mRFP. Коробчатые диаграммы представляют все данные со средним значением в виде сплошной линии внутри прямоугольника, ограниченного первым квартилем (25%; нижний предел) и третьим квартилем (75%; верхний предел). Усы показывают минимальное и максимальное значение данных, соответственно, которые не определены как выбросы (1.В 5 раз больше межквартильного размаха). Выбросы обозначены черными ромбами.

Свойства обычных тропических пород древесины для грифа струнных инструментов | Journal of Wood Science

Анализ микроструктуры древесины

Анатомическая структура древесины формируется во время роста дерева и в основном зависит от условий местности. Как правило, это можно контролировать только путем выращивания лесов. После образования изменить микроструктуру с помощью методов улучшения непросто.Анатомическая структура трех ценных пород дерева имеет общие черты, которые обеспечивают научную основу для поиска лучшей замены древесине грифа.

Все выбранные породы представляют собой диффузно-пористую древесину. Как показано в Таблице 1, индийский палисандр имеет наибольший диаметр сосуда. Три дерева грифа имеют меньшее количество сосудов, чем клен (Таблица 1), и имеют темную смолу в порах (Рис. 2). Эбеновое дерево, индийский палисандр и африканское черное дерево имеют немного более толстые стенки ячеек волокна и меньший диаметр просвета волокна по сравнению с кленом.В таблице 2 и на рис. 3 приведены характеристики лучей из четырех пород древесины. Многоярусные и мелкие лучи наблюдались во всех лесах. У черного дерева была самая высокая средняя высота луча (330,4 мкм), в то время как высота луча клена сильно варьировала (25,8–656,1 мкм). Средняя ширина луча в трех деревянных панелях грифа составляла ~ 25 мкм. Доля лучей черного дерева, индийского палисандра, африканского черного дерева и клена составляла 14, 6, 5 и 7 соответственно, причем наибольшее соотношение наблюдалось в черном дереве. Африканское черное дерево отличалось от других пород, особенно большим количеством лучей на квадратный миллиметр, в то время как у клена было наименьшее количество.Из-за потенциальной корреляции между анатомическими свойствами древесины и ее физическими, механическими и акустическими вибрационными свойствами, анализ анатомических свойств древесины обеспечивает теоретическую основу для выбора древесных материалов в музыкальных инструментах [22, 38, 39].

Таблица 1 Характеристики сосуда и волокна древесины Рис. 2

Поперечные сечения различных пород дерева: a черное дерево; b палисандр индийский; c Черное дерево африканское; d клен.Шкала 200 мкм

Таблица 2 Характеристики лучей древесины Рис. 3

Касательные сечения различных пород дерева: a эбеновое дерево; b палисандр индийский; c Черное дерево африканское; d клен. Шкала 100 мкм

Физико-механические свойства

Различные типы музыкальных инструментов и их компоненты имеют разные требования к плотности древесины. Для деки струнных инструментов, когда плотность древесины находится в диапазоне 0.4–0,5 г / см 3 , его динамический модуль упругости будет больше, значение тангенса угла потерь будет меньше, его эффективность акустической вибрации будет выше, а звук инструмента будет громче и четче [20, 40] . Щиток и нервюры струнных инструментов часто изготавливаются из клена средней плотности с плотностью воздушной сушки 0,69 г / см 3 . Напротив, плотность черного дерева, индийского палисандра и африканского черного дерева, используемых для накладки грифа, намного выше (1,21, 0,81 и 1,36 г / см 3 соответственно).Как правило, древесина, используемая для изготовления грифа, должна иметь плотность более 0,80 г / см 3 для достижения высокой твердости и высокой износостойкости.

Дерево по своей природе гигроскопично, и это свойство изменяется в зависимости от влажности окружающей среды. Поэтому стабильность размеров древесины, используемой в струнных инструментах, очень важна [41]. Влагосодержание древесины также влияет на ее физические, механические и акустические вибрационные характеристики. При очень высоком содержании влаги динамический модуль упругости древесины уменьшается, а ее тангенс угла потерь увеличивается.Это создает внутренние напряжения из-за изменения громкости, что влияет на качество звука инструмента, и эффект звучания становится нестабильным. И наоборот, древесина с лучшей стабильностью размеров приводит к более стабильному общему звуковому эффекту инструмента [42].

Здесь мы измерили объемный коэффициент набухания (VSW), тангенциальный линейный коэффициент набухания (TLSW) и радиальный линейный коэффициент набухания (RLSW) четырех деревянных досок, от состояния сушки в печи до состояния сушки на воздухе и из печи. -сухое до водонасыщенного состояния.Результаты, показанные на рис. 4, предполагают, что четыре типа древесины имеют значительные различия в их антигигроскопической способности. На рис. 4а показана скорость изменения размеров древесины при температуре 20 ± 1 ° C и относительной влажности 65 ± 2%. Значения VSW влагопоглощения черного дерева, индийского палисандра, африканского черного дерева и клена составили 4,64, 4,25, 0,37 и 4,72%; значения TLSW были 2,56, 1,97, 0,16 и 2,7 4%; и значения RLSW составляли 1,81, 1,88, 0,03 и 1,74% соответственно. На рис. 4b показана скорость изменения размеров древесины, когда она насыщена деионизированной водой.Значения водопоглощения по ВМЗ составили 15,12, 12,65, 6,43 и 17,04%; значения TLSW были 8,59, 6,32, 3,22 и 10,41%; и значения RLSW составляли 5,44, 5,14, 2,87 и 5,26% соответственно. Африканское черное дерево имело наименьший коэффициент набухания, что означало, что оно имело наименьшее изменение размеров и максимальную стабильность размеров как в условиях высокой влажности, так и при погружении в воду. Напомним, что плотность африканского черного дерева высока, с толстыми клеточными стенками волокон, небольшими полостями, наименьшим диаметром сосудов и большим количеством камеди в порах.В результате он имеет меньшую емкость для хранения воды. По сравнению с древесиной грифа клен имеет более высокий коэффициент набухания, поэтому его размерная стабильность оставляет желать лучшего.

Рис. 4

Эффективность набухания древесины. RLSW коэффициент радиального линейного набухания, TLSW тангенциальный линейный коэффициент набухания, VSW объемный коэффициент набухания

На рис. и 20 дней, пока древесина не пропитается.Поглощение воды можно оценить как клен> черное дерево> индийский палисандр> африканское черное дерево, и эта тенденция согласуется с коэффициентами набухания древесины, показанными на рис. 4. Клен показал прибавку в весе ~ 105% после замачивания в воде в течение 20 дней, в то время как прирост древесины грифа составлял одну треть или меньше от этого значения. В течение первых 2 дней замачивания водопоглощение клена резко увеличивалось с увеличением времени замачивания. Как упоминалось ранее, клен имеет низкую плотность, а его многочисленные сосуды поперечного сечения способствуют переносу влаги.В результате он быстро впитывал воду. Водопоглощение африканского черного дерева было ниже, что в основном связано с его высокой плотностью, меньшим количеством пор на квадратную площадь и тем фактом, что большинство пор содержат камедь. Коэффициенты набухания из-за влагопоглощения и водопоглощения у древесины грифовой доски ниже, чем у клена.

Рис. 5

Во время процессов защипывания и вибрации струны прикладывают натяжение к шейке струнного инструмента, делая последнюю склонной к деформации изгиба и скручивания.В результате гриф может упасть с шеи. Чем выше статическая прочность на изгиб и жесткость материала грифа, тем лучше способность грифа противостоять деформации изгиба и скручивания [20]. И наоборот, грифы из дерева с меньшими значениями MOR и MOE будут испытывать большую деформацию изгиба. Значения MOE и MOR были самыми высокими для африканского черного дерева (17,9 ГПа и 190,8 МПа соответственно), самыми низкими для индийского палисандра, а значения для черного дерева и клена были аналогичными.

Древесина с более высокой прочностью на изгиб и модулем упругости может улучшить характеристики музыкальных инструментов. Прочность на ударный изгиб черного дерева, индийского палисандра, африканского черного дерева и клена приведена в таблице 3. Это значение было наименьшим для черного дерева, а для африканского черного дерева было больше. Древесина с более низкой ударной вязкостью имеет тенденцию быть хрупкой и уязвимой для хрупких повреждений, что влияет на эстетику инструмента.

Таблица 3 Механические свойства древесины

Поскольку гриф вступает в контакт с вибрирующими струнами и пальцами во время игры, древесина с превосходной износостойкостью может обеспечить точное и последовательное расположение нот на грифе [12].Csanády et al. классифицировал износостойкость (сопротивление истиранию) древесины на три класса [24]: удовлетворительная (150–220 мг / 100 r ), хорошая (80–150 мг / 100 r ) и очень хорошая (<80 мг / 100 r ). Устойчивость к истиранию черного дерева, индийского палисандра, африканского черного дерева и клена составляла 113, 101, 87 и 97 мг / 100 r соответственно. В то время как африканское черное дерево имело лучшую износостойкость, а черное дерево - худшее, все четыре вида древесины попадают в категорию «хороших» в соответствии с приведенной выше классификацией [43].

Древесина, используемая для изготовления грифов, должна иметь соответствующую плотность и твердость, прежде чем можно будет оценить другие показатели эффективности. Когда на инструменте играют, гриф должен эффективно противостоять натяжению струн и сжимающей силе пальцев игрока, сводя к минимуму деформацию и образование ямок на поверхности. Жесткость грифа позволяет изменять основную резонансную частоту деки в небольшом диапазоне. При уменьшении основной резонансной частоты всего на 10 Гц можно заметить разницу между инструментами высшего и второго уровня [13, 44].Грифы, сделанные из очень мягкой древесины, вызывают менее жесткую гриф и пониженную частоту основного резонанса, делая выразительность инструмента слабой и неравномерной. И наоборот, более твердый материал грифа может помочь подавить сдвиг основной резонансной частоты и улучшить амплитуду вибрации деки, так что выразительность инструмента станет более выразительной и однородной. С точки зрения передачи вибрации через гриф, если гриф рассматривается как низкочастотный канал, гриф действует как высокочастотный канал, расширяя общую полосу проводимости грифа.Гриф приклеивается к грифу в основном за счет сжимающего усилия, при котором хорошая проводимость для высокочастотных звуковых волн может быть достигнута только при высокой жесткости. При этом материал шейки должен иметь значительную, но не чрезмерную твердость.

В этом исследовании сравнивалась микроскопическая и макроскопическая твердость четырех видов древесины и обсуждались соответствующие требования к выбору древесины грифа. На рис. 6 представлена ​​диаграмма нанотвердости стенок ячеек. Наноиндентирование проводили как на слое вторичной клеточной стенки S 2 , так и на средней ламелле образцов древесины [34].Твердость клеточной стенки черного дерева, индийского палисандра и африканского черного дерева составляла 0,564, 0,469 и 0,500 ГПа соответственно, а у клена была значительно ниже (0,413 ГПа).

Фиг.6

Твердость древесины при наноиндентировании. Нижняя горизонтальная линия перевернутой буквы Т - минимум; верхняя горизонтальная линия буквы Т максимальная; нижний край большого квадрата представляет 1-й квартиль; верхний край большого квадрата представляет 3-й квартиль; горизонтальная линия внутри большого квадрата представляет собой медианное значение; квадратики - средние значения; знак * за рамкой указывает на отклонение от нормы.

На рис. 7 дополнительно сравнивается твердость на трех различных участках каждой древесины: поперечном, тангенциальном и радиальном.Во всех образцах, за исключением африканского черного дерева, твердость оценивается как поперечное> тангенциальное> радиальное сечение. Таким образом, для накладки грифа в основном используется плоско-распиленная доска. Африканское черное дерево имеет самую высокую твердость - 15,5, 18,7 и 16,5 кН соответственно. На втором месте по твердости находится черное дерево (14,3, 12,2 и 10,5 кН соответственно), а для индийского палисандра эти значения составляют 9,1, 6,6 и 6,8 кН. Значения твердости тангенциального и радиального сечений черного дерева и африканского черного дерева были одинаковыми и составляли около 1.В 5 раз больше, чем у индийского палисандра. Для сравнения, клен имел самую низкую твердость во всех трех сечениях (7,6, 4,7 и 3,4 кН соответственно). Опять же, превосходная твердость трех видов древесины грифа может быть объяснена их высокой плотностью, меньшим количеством отверстий для труб на площади и более крупными волокнистыми стенками. В струнных инструментах клен в основном используется для спинки и реберной доски, которые предъявляют более низкие требования к твердости древесины. В целом древесина, используемая для грифа, должна иметь твердость в поперечном сечении более 9,0 кН и более 6 кН.0 кН в тангенциальном и радиальном сечениях.

Фиг.7

Твердость древесины. E обозначает черное дерево, R индийское розовое дерево, B африканское черное дерево и M клен. Знак * за пределами поля указывает на выброс. Когда ожидаемые данные группы были рассчитаны, выброс был удален

С точки зрения физических и механических свойств, плотность древесины, содержание влаги, гигроскопичность, стабильность размеров, твердость, модуль разрыва и износостойкость являются важными критериями для определения выбор дерева грифа.В этой статье эти характеристики были измерены на трех типах широко используемой древесины грифа и сравнивались с характеристиками клена. Такая информация поможет функциональному усовершенствованию быстрорастущей древесины, чтобы заменить традиционную древесину грифа.

Цвет дерева

Гриф струнных инструментов обычно бывает черного или темно-коричневого цвета в соответствии с традиционными эстетическими требованиями; в то время как дека, задник и нервюры в основном выполнены из ели и клена бежевого или светло-желтого цвета.Цвет сердцевины черного дерева и африканского черного дерева - угольно-черный или темно-коричневый и однородный (рис. 8). Для сравнения, индийский палисандр может выглядеть коричнево-черным, пурпурно-коричневым или темно-пурпурно-красным.

Рис. 8

Фотографии, показывающие внешний вид отдельных видов. a Ebony; b палисандр индийский; c Черное дерево африканское; d клен

По сравнению с субъективным наблюдением человека, цвет образцов древесины можно объективно оценить с помощью колориметрии [20].Здесь цвет поверхности древесины был охарактеризован колориметром и выражен в пространстве цветности ( L * , a * , b * ). L * - это яркость, a * - красно-зеленый индекс и b * - желто-синий индекс [45].

Согласно рис. 9, значение яркости L * традиционной древесины грифа было относительно низким в диапазоне 20–30 (для черного дерева, индийского палисандра и африканского черного дерева - 20,86, 29.17 и 21,89 соответственно). Напротив, значение L * для клена было примерно в три раза выше (69,69). Значения a * для черного дерева, индийского палисандра, африканского черного дерева и клена составили 0,72, 6,27, 1,46 и 5,74 соответственно. Значения b * также были положительными, что указывало на то, что цвета древесины были более желтыми, чем синими. Неудивительно, что у клена было относительно большое значение b * , равное 14,26, тогда как у черного дерева, индийского палисандра и африканского черного дерева было 0.92, 5.58 и 1.28 соответственно.

Рис.9

Колориметрические параметры ( L * (яркость), a * (пара красный / зеленый) и b * (пара желто-синего цвета)) четырех пород древесины

Принимая во внимание измеренные значения L * , a * и b * для черного дерева, индийского палисандра и африканского черного дерева, мы определили, что их подходящие заменители должны иметь значение L * ниже 30 и b. * значение меньше 6.0. Эти критерии полезны для решения, какой потенциальный заменитель (натуральное дерево или после модификации) лучше соответствует цвету трех видов древесины грифа.

BurstBrowser - документация PAM 1.2 документация

Одномолекулярные данные FRET можно изучить в интерактивном режиме с помощью основного рисунка BurstBrowser (вкладка «Общие»). Параметры выбираются с помощью списки на вкладке «Выбор». По умолчанию BurstBrowser отображает зависимость эффективности FRET от стехиометрии.

Основной графический интерфейс BurstBrowser.

Выбор данных

Чтобы применить разрезы к данным, щелкните правой кнопкой мыши параметр, чтобы добавить его в таблицу разрезов. Здесь вы можете установить нижнюю и верхнюю границы для параметр («мин» и «макс»). Чтобы временно отключить обрезку, снимите флажок «активен». Чтобы удалить его полностью, установите флажок «удалить». Вы можете добавить любую комбинацию параметров.

Использование пород

Список видов

Часто бывает полезно отсортировать данные по разным популяциям или видам, которые нужно сравнить по некоторым параметрам.BurstBrowser предлагает удобный способ сделать это на основе иерархии видов / подвидов. Доступ к видам осуществляется с помощью панели «Дерево данных».

По умолчанию BurstBrowser создает один вид под названием «Global Cuts» с двумя подвидами («Subspecies 1/2») в дополнение к верхнему уровню. элемент дерева, показывающий имя файла. Вы можете добавить виды или подвиды, щелкнув правой кнопкой мыши существующий вид и выбрав «Добавить вид», который добавит дополнительный вид на том же уровне. Виды удаляются нажатием кнопки «Удалить виды» и переименовываются в пункте меню «Переименовать виды».

Общая идея видов состоит в том, чтобы сначала применить разрезы к измерению, чтобы отфильтровать нежелательные молекулы (т. Е. Молекулы только-донора и акцептора, события фотообесцвечивания, многомолекулярные события), а затем уточнить выбор с точки зрения видов (например, низкая эффективность FRET, высокая анизотропия и т. д.).

Применяются следующие правила:

  • Вновь созданный подвид наследуется от родительского вида.
  • Вырезы, примененные к родительскому виду, будут автоматически применены ко всем подвидам, то есть:
    • К подвидам будут добавлены новые параметры.
    • Изменения границ перезаписывают границы в подвиде.
  • Удаление параметра из родительского вида приведет к его удалению из всех подвидов.
  • Удаление параметра в подвиде не влияет на родительский
  • Границы среза подвидов не могут выходить за границы родительского вида.
  • По наследству также передается активная собственность .

Большинство функций, которые могут быть применены к пакетному выбору, можно получить, щелкнув правой кнопкой мыши список видов.Кроме того, список видов содержит несколько кнопок в правом верхнем углу для быстрого доступа. Это слева направо ярлыки для добавления видов, удаления видов, переименования видов, экспорта выбранных видов в TauFit , экспорта выбранных видов в PDAFit и включения режима множественного выбора для сравнения наборов данных ( см. множественный выбор).

Ручная резка

Ручная обрезка доступна с помощью символа обрезки или нажатием ctrl + пробел , когда выбран основной график.Это превратит курсор в перекрестие, которое вы можете использовать для перетаскивания прямоугольного выделения на текущем графике. Определенные границы затем будут применены к текущим выбранным видам.

Произвольный вырез области (AR)

Произвольный вырез области доступен, нажав кнопку свободного выбора или нажав пробел . Нарисуйте фигуру на основном графике, окружающую популяцию, которую вы хотите выбрать, и подтвердите выбор, дважды щелкнув график.Если вместо этого вы хотите исключить вид из выбора, щелкните правой кнопкой мыши кнопку Произвольный разрез области и выберите Инвертировать произвольный разрез области .

Произвольные сокращения области нельзя изменить после того, как они были определены. В таблице для резки они будут обозначены аббревиатурой AR: *, за которой следует пара параметров, для которой они были определены. Поля * min и max не действуют для разрезов AR .Как и все сокращения, если они применяются к родительскому виду, они будут автоматически применены к соответствующему дочернему виду.

Хранение отрубов

Если у вас есть набор разрезов, которые вы обычно применяете к своим данным (например, для выбора молекул только-доноров или для удаления артефактов обесцвечивания…), вы можете сохранить состояние разреза и применить его к вновь загруженным данным. Щелкните правой кнопкой мыши на столе для резки , выберите Сохранить в базе данных резки и укажите имя для состояния резки (например, Donly ).Сохраняйте имя простым, так как оно будет преобразовано в допустимое имя переменной MATLAB, то есть все пробелы и специальные символы будут удалены.

После того, как вы определили вырез, он будет показан во всплывающем меню базы данных вырезок. Чтобы использовать определенное состояние разреза, вы можете либо применить его к текущему виду, используя ведро с краской, которое перезапишет любые существующие разрезы с теми же параметрами в текущем выбранном виде, либо добавить новый вид с сохраненными разрезами, используя плюс символ.

Чтобы удалить состояние вырезания из базы данных, щелкните правой кнопкой мыши всплывающее меню и выберите Удалить вырезание из базы данных .Чтобы показать, какие вырезы определены в определенном сохраненном состоянии выреза, щелкните Отображаемый выбранный выруб из базы данных в меню , вызываемом правой кнопкой мыши. Это покажет окно с информацией о вырезке, а также распечатает ее в командной строке.

Примечание

Произвольные разрезы области не сохраняются в базе данных разрезов и просто игнорируются при сохранении состояния разреза.

Синхронизация разрезов

При выполнении серии измерений вы можете применить одинаковые разрезы к нескольким файлам.Когда загружено несколько файлов, вы можете синхронизировать состояния вырезания между файлами, щелкнув правой кнопкой мыши Таблица вырезания и выбрав Применить текущие разрезы ко всем загруженным файлам . Разрезы выбранного в данный момент вида будут применены ко всем остальным загруженным файлам. Если файл содержит разновидности с тем же именем, соответствующие сокращения будут перезаписаны / расширены. Если в файле нет одноименного вида, для этого файла будет создан новый вид.

Настройка участков

Панель выбора параметров отображения.

Функциональные возможности построения графиков и представления данных

BurstBrowser можно изменять множеством способов.

Номера интервалов для двумерных гистограмм можно изменять независимо для измерений x и y. Эти настройки глобально влияют на гистограммы на вкладках «Общие» и «Время жизни». Кроме того, можно отобразить логарифм параметра x или y, установив флажки logX или logY.

Тип графика для двумерных гистограмм можно выбрать между Image , Contour , Scatter и Hex .См. Раздел ниже для получения более подробной информации о типах сюжетов.

Цветовая карта может быть выбрана из ряда стандартных цветовых карт MATLAB (струйная, горячая, кость, серая, параула и т. Д.). Кроме того, доступен вариант цветовой карты струи (jetvar), которая начинается с белого, а затем проходит через цветовую палитру струи. Все цветовые карты могут быть инвертированы , установив флажок.

Чтобы построить линии сетки поверх данных, установите флажок Построить сетку поверх данных .

Чтобы сделать второстепенные популяции более заметными, поддерживается построение логарифма частотной информации двумерных гистограмм. Этот параметр применяется только к двумерным данным, но не влияет на одномерные гистограммы.

При выборе Отображать среднее значение в 1D гистограммах среднее значение и стандартное отклонение соответствующего параметра будут показаны на графиках гистограмм параметров.

Включите Сохранить файл при экспорте фигуры , чтобы автоматически запускать диалог сохранения при закрытии фигуры экспорта.

Параметры Line позволяют устанавливать собственные цвета для линий (например, статические / динамические линии FRET, графики Перрина, гауссовские соответствия). Щелкните цветное поле и выберите цвет в диалоговом окне, чтобы изменить цвета линий.

Другие параметры относятся к другим функциям BurstBrowser и объясняются в соответствующих сеансах.

Типы участков

Различные типы графиков, поддерживаемые BurstBrowser. Сверху слева направо внизу: изображение, контур, точечная диаграмма и шестнадцатеричный график.

Изображение:
Стандартный график изображения. Может использоваться с цветом по параметру. Параметр Plot Offset [%] позволяет скрыть все интервалы ниже заданного процента от максимального значения.
Контур:
Контурная диаграмма, интерполирующая данные с разбивкой по ячейкам. Можно дополнительно настроить, указав , количество уровней контура и смещение контура . Смещение контура игнорирует все данные ниже заданного порога, создавая более четкие графики, но потенциально скрывая незначительные популяции.Поэтому для первоначального анализа данных рекомендуется использовать график изображения или установить нулевое смещение контура. Контурные линии можно отключить, сняв флажок Построить контурные линии .
разброс:
Точечная диаграмма, показывающая каждую точку данных. Можно настроить, указав цвет маркера и размер маркера . Может использоваться с цветом по параметру.
шестнадцатеричный:
На этом графике используется шестиугольное разбиение для представления двумерного распределения параметров.Гексагональное бинирование является более подходящим шаблоном для круглой совокупности и, таким образом, может лучше представить распределение. Построение графика основано на hexscatter.m, свободно доступном при обмене файлами MATLAB.
Оценка плотности ядра (сглаживание)

Вместо необработанных данных можно построить сглаженные данные на основе оценки плотности ядра по Гауссу, проверив Построить оценку плотности ядра (сглаживание) . Это может упростить обнаружение популяций, если доступно небольшое количество данных.Для оценки плотности ядра важным параметром является ширина гауссовых ядер. Мы применяем метод, описанный в [Botev2010], для автоматического определения подходящей пропускной способности ядра из данных, используя скрипт, свободно доступный в MATLAB File Exchange. Оценка плотности ядра работает только с графиками Image и Contour . Для графиков Scatter и Hex сглаживание применяется только к одномерным гистограммам.

Пример оценки плотности ядра (слева: необработанные данные, справа: оценка плотности ядра)

Цветовая диаграмма по третьему параметру

Иногда бывает полезно исследовать три параметра одновременно.Вы можете присвоить цветовой код третьему параметру на двумерном графике, используя последний столбец в таблице параметров резки (значок цветовой шкалы , значок ).

Использование третьего параметра для цветовой кодировки графика E-S с использованием донорной анизотропии. Слева направо: обычное масштабирование интенсивности, с цветовой кодировкой без и с масштабированием интенсивности и с использованием диаграммы рассеяния. Высокая эффективность FRET показывает более высокие значения анизотропии донора из-за более короткого времени жизни донора.

Цветовое кодирование поддерживается для графиков Image и Scatter .Масштабирование регулируется в соответствии с пределами обрезки параметра цветовой кодировки. Используйте гистограмму параметров в правом верхнем углу, чтобы настроить пределы. При использовании графика изображения гистограмма параметров для параметра цветового кодирования в правом верхнем углу будет показывать распределение среднего по пикселям и, таким образом, будет отличаться от гистограммы по пакетам того же параметра. Для диаграмм рассеяния показано истинное пакетное распределение, поскольку для цветового кодирования не требуется усреднение. Таким образом, при использовании графика изображения рекомендуется установить состояние обрезки параметра цветового кодирования как неактивное, чтобы избежать удаления точек данных при настройке пределов вырезания.

Вы можете комбинировать информацию о цветовой кодировке и интенсивности, установив флажок Intensity scaling for color coding . Кроме того, вы можете сделать ярче масштабирование интенсивности, используя опцию Ярче цветовой карты . Цветовое кодирование несовместимо с множественным выбором.

Для получения точной эффективности FRET требуется ряд поправочных коэффициентов. Перекрестные помехи, прямое возбуждение и коэффициент \ (\ gamma \) могут быть определены непосредственно из измерения, если используется PIE.

Все поправочные коэффициенты вводятся в таблицу поправок , которая находится на вкладке Поправки / FCS .

Панель исправлений.

При первой загрузке последние использованные поправки автоматически заносятся в таблицу поправок. Фоновые скорости счета определяются из указанного измерения рассеяния. Если вы хотите, чтобы исправления применялись автоматически при загрузке, установите флажок Автоматически применять исправления по умолчанию / сохраненные при загрузке файла в разделе Параметры-> Параметры обработки данных .

Изменение параметров

Любой параметр можно редактировать в таблице коррекций , но изменения будут применены только после нажатия кнопки Применить коррекции . Кнопка Применить исправления станет красной, чтобы указать, что изменения были выполнены, но еще не подтверждены.

Фактор \ (\ beta \) - учитывает различную эффективность возбуждения донорного и акцепторного флуорофора, что приводит к отклонению значения стехиометрии молекул с двойной меткой от теоретического значения \ (0.5 \). При правильно выбранном \ (\ beta \) -факторе стехиометрия в точности равна \ (0,5 \) для видов с двойной меткой. Коррекцию значения стехиометрии по коэффициенту \ (\ beta \) можно переключить с помощью соответствующего флажка.

Примечание

Коррекция стехиометрии с использованием коэффициента \ (\ beta \) рекомендуется, если исследуются различные стехиометрии взаимодействия. \ (\ beta \) - исправленные стехиометрии позволяют напрямую вывести стехиометрии взаимодействия, т.е. \ (S = 0,5 \) соответствует стехиометрии 1: 1, а \ (S = 0.25 \) или \ (S = 0,75 \) соответствуют стехиометрии 1: 3 или 3: 1 донорно-акцепторных флуорофоров соответственно.

Определение поправочных коэффициентов

Перекрестные помехи и прямое возбуждение

Для автоматического определения поправочных коэффициентов перекрестных помех и прямого возбуждения из популяций только доноров и акцепторов, нажмите кнопку Fit ct / de . Популяции, состоящие только из доноров и акцепторов, будут выбраны на основе стехиометрических (необработанных) пороговых значений, указанных в параметрах Опции-> Параметры обработки данных .Чтобы изолировать только акцепторную популяцию, дополнительно может быть установлен минимальный порог для коэффициента близости (то есть нескорректированной эффективности FRET). Чтобы определить правильные значения для пороговых значений, проверьте стехиометрию (необработанную) по сравнению с отношением близости .

Логарифмический график исходной стехиометрии в зависимости от отношения близости для выбора пороговых значений для популяций только доноров (черный) и только акцепторов (красный). Только донор выбирается, если требуется S> 0,95. Только для акцептора выбирается S <0.22 и коэффициент близости> 0,4. Без коэффициента близости популяция только акцепторов была бы загрязнена молекулами от мостика между только акцепторами и популяцией с низкой эффективностью FRET.

Гистограммы отношения близости популяции только доноров и необработанной стехиометрии популяций только акцепторов будут соответствовать одной функции Гаусса для определения центрального значения. Результат отображается на вкладке Поправки , которой автоматически назначается приоритет.{A-only}} \ end {align} \ end {align} \]

Пример определения поправочных коэффициентов перекрестных помех и прямого возбуждения.

Когда параметры перекрестных помех или прямого возбуждения изменяются после автоматического определения, соответствия графиков на вкладке Corrections будут соответственно скорректированы. Используйте это, чтобы судить, согласуются ли выбранные вами значения с данными (т. Е. Были ли значения определены на основе отдельных измерений красителя).

\ (\ gamma \) - коэффициент

\ (\ gamma \) - фактор корректирует различную эффективность обнаружения и квантовые выходы донорного и акцепторного флуорофора.Его можно определить на основе данных двумя способами: либо используя зависимость эффективности FRET и стехиометрии, либо используя информацию о времени жизни флуоресценции донорного флуорофора.

Скорректированное значение стехиометрии не должно зависеть от наблюдаемой эффективности FRET, т.е. если фактор \ (\ gamma \) выбран правильно, то распределение сигнала флуоресценции по двум каналам обнаружения не влияет на стехиометрию. Этот факт может быть использован для определения \ (\ gamma \) - фактора из измерения нескольких видов FRET.Для \ (\ gamma = 1 \) получается линейная зависимость между обратной стехиометрией и эффективностью FRET [Lee2005]. Подгоночные параметры линейной подгонки \ (\ frac {1} {S} = \ Omega + \ Sigma \ cdot E \) связаны с \ (\ gamma \) - фактором и \ (\ beta \) - фактором ( с учетом различной эффективности возбуждения, см. поправочные коэффициенты):

\ [\ gamma = \ frac {\ Omega-1} {\ Omega + \ Sigma-1} \]

\ [\ beta = \ Omega + \ Sigma-1 \]

Определение коэффициента \ (\ gamma \) этим методом осуществляется двумя способами. Fit \ (\ gamma \) Коэффициент использует пакетный график зависимости \ (1 / S \) от \ (E \) для \ (\ gamma = 1 \) для выполнения линейной аппроксимации с использованием соответствует функции MATLAB. Чтобы уменьшить влияние экстремальных выбросов, которые возникают при малых значениях стехиометрии при выполнении обратной задачи, применяется робастная аппроксимация методом наименьшей абсолютной невязки (LAR). Результат подгонки показан на нижнем левом графике на вкладке Corrections .

В качестве альтернативы, коэффициент \ (\ gamma \) может быть рассчитан напрямую без подбора, если определены центральные точки двух разных видов FRET на графике E-S. Щелкните правой кнопкой мыши на кнопке Fit \ (\ gamma \) factor и выберите Определить \ (\ gamma \) фактор вручную , чтобы превратить курсор мыши в перекрестие, которое можно использовать для выбора центров двух разных видов FRET последовательно на графике ES, показанном на нижнем левом графике вкладки Corrections .

Самый надежный способ определить коэффициент \ (\ gamma \) - это определить значения E-S для \ (\ gamma = 1 \) для различных популяций с помощью модуля подгонки по Гауссу.После определения вы можете рассчитать коэффициент \ (\ gamma \), нажав кнопку Calculate \ (\ gamma \) factor и введя значения в таблицу. При желании можно указать неопределенность для E и S (\ (\ sigma E \) и \ (\ sigma S \)), которая будет использоваться для оценки ошибки в определенных \ (\ gamma \) - и \ ( \ beta \) - коэффициенты. Обратите внимание, что неопределенность E и S не определяется стандартным отклонением, полученным при подборе. Более подходящей оценкой неопределенности была бы стандартная ошибка среднего значения, заданного как \ (SEM = \ sigma / \ sqrt {N} \), где \ (N \) - количество точек данных, т.е.е. всплески, используемые для посадки.

Если доступна информация о времени жизни флуоресценции донора, вы можете определить \ (\ gamma \), даже если доступна только одна популяция FRET, пока измеряемая система является статической, т.е. не показывает динамики FRET (например, молекула ДНК ). Нажатие на Fit \ (\ gamma \) фактор от времени жизни минимизирует отклонение частиц FRET от теоретической статической линии FRET, определяемой временем жизни только донора, радиусом Ферстера и наблюдаемой длиной линкера.В программе подгонки используется надежная подгонка методом бисквадрата. Результат отображается на нижнем левом графике вкладки Corrections . Для получения дополнительной информации о зависимости между эффективностью FRET и временем жизни флуоресценции донора см. Соответствующий раздел на статической линии FRET.

Примечание

\ (\ gamma \) - фактор также можно определить, проверив график E - \ (\ tau_D \) и вручную изменив \ (\ gamma \), пока популяция не попадет на статическую линию FRET.Это рекомендуется, если автоматическая подгонка не дает удовлетворительных результатов.

Во всех случаях для автоматического определения используются выбранные в настоящий момент пакеты. Убедитесь, что выбраны только молекулы с двойной меткой. Если нет единого измерения с несколькими видами FRET, вы можете объединить отдельные измерения разных видов FRET, используя функцию нескольких графиков, чтобы построить их одновременно. Автоматическое определение будет использовать текущие выбранные пакеты и объединить выбор по нескольким файлам.

Определение \ (\ gamma \) - фактора. (Слева) Подгонка 1 / S по сравнению с E. (В центре) Ручной выбор центральных точек популяции. (Справа) Использование времени жизни флуоресценции донорского флуорофора.

Синхронизация поправочных коэффициентов

Чтобы синхронизировать поправочные коэффициенты между всеми загруженными файлами, щелкните правой кнопкой мыши кнопку Применить исправления и выберите Заменить исправления всех файлов текущим . Это перезапишет параметры исправления всех других файлов текущим.

Множественный выбор

Кнопка MultiSelection в правом верхнем углу Списка видов переключает режим множественного выбора. Вверху: множественный выбор отключен, внизу: множественный выбор включен. При включении режима множественного выбора отображается кнопка «Мультиплот», а кнопки, связанные с отдельными видами, скрываются.

Режим множественного выбора активируется нажатием кнопки MultiSelection в списке видов (см. Список видов), что позволяет одновременно выбирать несколько видов из списка видов .Кнопка становится красной, когда MultiSelection отключена, и зеленой, когда она включена. Это отключит все параметры, связанные со списком Species List , которые относятся к отдельным файлам. Множественный выбор работает между разными файлами.

При одновременном выборе нескольких видов будут наложены все выбранные наборы данных. Множественный выбор работает со всеми функциями для определения поправочных коэффициентов. В то время как двухмерный график покажет только суперпозицию всех выбранных видов, граничные распределения будут отображать гистограммы для отдельных видов.При использовании графика Scatter виды на двумерном графике дополнительно будут обозначены цветом.

По умолчанию выбранные виды нормированы по площади. Это гарантирует, что все виды будут видны, даже если есть большие различия в количестве всплесков для каждого вида. В качестве альтернативы гистограммы можно нормализовать до максимального значения, нажав правой кнопкой мыши кнопку MultiSelection и выбрав Нормализовать до… -> максимум . Вы можете отключить нормализацию, щелкнув правой кнопкой мыши на поле Multiselection и сняв отметку Нормализовать совокупности .Отображение суммы всех выбранных популяций можно переключить в том же , щелкнув правой кнопкой мыши меню , отменив выбор опции Показать сумму всех популяций .

Множественная выборка с использованием Image График наложит популяции на двумерный график, но покажет отдельные популяции в маргинальных распределениях. График Scatter показывает разные популяции с использованием разных цветов. Функциональность Multiplot присвоила популяциям цветовую кодировку.

Кнопка Multiplot позволяет отображать до трех видов одновременно с использованием отдельного цвета для каждого вида (синий, красный и зеленый в указанном порядке). Он появляется в правом верхнем углу списка Species List , когда активирован режим MultiSelection . Если выбрано более трех видов, будут использоваться первые три. Доступны два режима окраски, которые можно изменить в Options-> Display Options . В режиме по умолчанию для отображения различных видов используются каналы RGB.Возникновение кодируется интенсивностью цвета для каждого цветового канала, начиная с белого. В этом режиме области с высокой интенсивностью перекрывающихся видов будут черными. В качестве альтернативы RGB, реализован режим «от черного к белому», который начинается с черного цвета для низкой интенсивности, переходящего в белый при высокой интенсивности.

Мультиплот для двух видов с использованием режима белого к черному (слева) и режима черного к белому (справа).

Подсказка

Если необходимо визуализировать более трех видов одновременно, лучше всего использовать график Scatter вместе с множественной выборкой.

Сравнение отдельных параметров

Наиболее распространенный случай анализа нескольких наборов данных - сравнение гистограмм эффективности FRET отдельных измерений. Это доступно, щелкнув меню Сравнить на панели инструментов. Выберите Сравнить гистограммы FRET загруженных файлов , чтобы создать единый график со всеми гистограммами эффективности FRET, используя последний выбранный вид соответствующих файлов. Если необходимо сравнить другой параметр, выберите вместо него Сравнить текущий параметр загруженных файлов .Это будет использовать текущий выбранный параметр для оси x , то есть в левом списке выбора параметров.

Чтобы сравнить параметры разных видов из одного измерения (или между измерениями), установите флажок Multiselect и выберите виды для сравнения. Сравнить -> Сравнить текущий параметр выбранных видов снова будет использовать текущий выбранный параметр оси x .

При сравнении гистограмм эффективности FRET, например.грамм. из временного ряда можно также отобразить диаграмму водопада, включив диаграмму Сделать водопад при сравнении гистограмм FRET на вкладке Параметры -> Обработка данных .

Информация о времени жизни флуоресценции является важным параметром при импульсном анализе. Это позволяет идентифицировать фотофизические артефакты, такие как тушение, и, вместе с информацией об анизотропии, может быть учтена свобода вращения флуорофора. Кроме того, он служит параметром для определения конформационной динамики на временной шкале всплеска. BurstBrowser дает обзор наиболее важных графиков, связанных со сроком службы, в PIE-MFD на вкладке Lifetime . Эти графики следует тщательно проверять на предмет всех измерений PIE-MFD.

Вкладка Lifetime , на которой показаны все важные графики, связанные с продолжительностью жизни.

Настройки для фитингов на вкладке Срок службы , находящейся на вкладке Фитинг .

В дополнение к обзору, представленному на вкладке Lifetime -> All , вкладка Individual позволяет просматривать графики, связанные со сроком службы, по отдельности, используя более крупный график с дополнительными предельными распределениями.Используйте список в правом верхнем углу, чтобы изменить текущий график. Все подгонки также могут быть выполнены на участке Individual .

E по сравнению с \ (\ tau_ {D (A)} \)

Верхний левый график показывает зависимость эффективности FRET от времени жизни флуоресценции донора (в присутствии акцептора, \ (\ tau_ {D (A)} \)). Теоретически зависимость между эффективностью FRET является линейной и определяется так называемой «статической линией FRET»:

\ [E = 1- \ frac {\ tau_ {D (A)}} {\ tau_ {D, 0}} \]

где \ (\ tau_ {D, 0} \) - время жизни донора в отсутствие акцептора.На практике график отклоняется от теоретической линии, потому что красители прикрепляются к линкерам, что приводит к быстрым колебаниям (~ 100 нс) расстояния донор-акцептор даже для статических образцов, которые усредняются по шкале времени всплеска (~ мс). Поскольку подбор времени жизни выполняется только на затухании флуоресценции донора, состояния с низкой эффективностью FRET вносят больше фотонов в распад, и, таким образом, определенное время жизни смещено в сторону больших времен жизни. Этот эффект приводит к небольшому искривлению теоретической статической линии FRET, которое зависит от радиуса Ферстера и кажущейся длины линкера, т.е.е. величина колебаний расстояния. Кажущуюся длину линкера можно определить из анализа TCSPC статического образца FRET путем подбора распределения расстояний, и обычно она составляет порядка 5-6 ангстрем.

Эквивалентно конформационная динамика во время всплесков приведет к смешению состояний. Хотя эффективность FRET усредняется на основе времени, в течение которого молекула находится в состояниях, время жизни флуоресценции снова смещается из-за яркости частиц и, таким образом, смещается в сторону низкой эффективности FRET, состояния с длительным временем жизни флуоресценции.В отсутствие динамики линкера динамические линии FRET между двумя состояниями (1 и 2) с различной эффективностью FRET задаются следующим образом:

\ [E = 1- \ frac {\ tau_1 \ tau_2} {\ tau_ {D, 0} \ left (\ tau_1 + \ tau_2- \ left <\ tau \ right> _f \ right)} \]

Здесь \ (\ left <\ tau \ right> _f \) - время жизни, взвешенное по интенсивности, как определено пакетной аппроксимацией. Обратите внимание, что не существует аналитического выражения для статических или динамических линий FRET, когда необходимо учитывать динамику линкера.

Чтобы правильно учесть динамику линкера, статические и динамические строки FRET в BurstBrowser моделируются, как описано в дополнительной информации к [Kalinin2010], с учетом динамики линкера.Однако, в отличие от того, что описано в [Kalinin2010], в BurstBrowser не выполняется аппроксимация полиномом третьего порядка; вместо этого рассчитанные линии используются напрямую без промежуточного шага аппроксимации, поскольку моделирование выполняется быстро.

Построение статической линии FRET

Статическая линия FRET является функцией времени жизни только донора, радиуса Ферстера и кажущейся длины линкера. Его можно построить, нажав кнопку Построить статическую линию FRET , и он обновляется при изменении любого из связанных параметров.

Использование динамической строки FRET

Пример статической и динамической линий FRET. Динамические линии FRET нанесены между двумя состояниями (черный) и дополнительно для гипотетического промежуточного состояния (красный и зеленый).

Щелкните строку Dynamic FRET , чтобы определить динамическую строку FRET. Это превратит курсор в перекрестие, что позволит вам определить два состояния, принадлежащих динамической линии FRET, щелкнув соответствующий график. Вы можете построить до трех динамических линий FRET вместе.Добавьте больше динамических линий FRET, щелкнув правой кнопкой мыши график вместо , щелкнув левой кнопкой мыши .

В качестве альтернативы можно щелкнуть правой кнопкой мыши кнопку и выбрать Определить состояния , чтобы вручную определить два состояния по их соответствующему времени жизни. Выберите, какую строку вы хотите определить, максимум до трех строк. Удалите отдельные линии , щелкните правой кнопкой мыши кнопку Dynamic FRET line и выберите Remove Plot , чтобы указать номер линии, которую вы хотите удалить.Цвета линий соответствуют настройкам на вкладке Options . Динамические строки FRET не будут обновляться при изменении связанных параметров.

Подсказка

Используйте подансамбль TCSPC и биэкспоненциальную подгонку времени жизни, чтобы определить времена жизни флуоресценции двух состояний, если динамика быстрая.

Получение времени жизни только донора и только акцептора

Время жизни только доноров и акцепторов можно извлечь из субпопуляций только доноров и акцепторов эксперимента.Это дает внутреннюю ссылку для статической линии FRET и устраняет необходимость определения срока службы только донора по эталонному образцу.

Время жизни только для донора и акцептора может быть определено двумя основными способами: из пакетного распределения времени жизни или из анализа подансамбля TCSPC.

Первый автоматизирован в BurstBrowser. Просто нажмите кнопку Получить время жизни красителя из данных на вкладке Fitting (подраздел Графики срока службы ).Это автоматически выберет популяции, состоящие только из доноров и акцепторов, и определит среднее время жизни в импульсном режиме с помощью гауссовой подгонки. Подгонку можно проверить на вкладке Corrections на двух верхних графиках (те же графики, которые ранее использовались для проверки качества посадки перекрестных помех и прямого возбуждения). Значения времени жизни только для донора и акцептора будут обновлены автоматически.

Пример аппроксимации распределений времени жизни только доноров и акцепторов.

Анализ суб-ансамбля

TCSPC может быть выполнен вручную на выбранных популяциях доноров и акцепторов, как описано в соответствующем разделе.Определенное время жизни можно вручную ввести в поля редактирования.

Анизотропия и время жизни

Измеренная стационарная анизотропия зависит от времени жизни флуоресценции. Поскольку сама анизотропия затухает, более короткое время жизни флуоресценции приведет к более высокой средней анизотропии, чем большое время жизни флуоресценции при одинаковом времени корреляции вращения. Зависимость между анизотропией и временем жизни определяется уравнением Перрина, предполагающим одно экспоненциальное время жизни и спад анизотропии:

\ [r \ left (\ tau \ right) = \ frac {r_0} {1+ \ frac {\ tau} {\ rho}} \]

Здесь \ (r_0 \) - фундаментальная анизотропия флуорофора, а \ (\ rho \) - время корреляции вращения.

Пример графиков Перрена.

Вы можете добавить линии Перрина к графикам анизотропии, чтобы различать виды на основе времени их корреляции вращения. Нажмите кнопку Fit Anisotropy , чтобы подогнать линии Перрина к распределению \ (r- \ tau \). Определенные времена корреляции вращения будут показаны над графиками. Вы можете вручную добавить линии Перрина, нажав кнопку Ручная линия Перрина и выбрав популяцию на графике. Добавьте еще до двух линий Перрина, повторив предыдущий шаг, но щелкнув правой кнопкой мыши график.Линии Perrin будут использовать указанные значения \ (r_0 \) для соответствующих цветов. Сбросьте любые текущие соответствия Perrin, нажав кнопку Fit Anisotropy или определив новую первичную линию Perrin с помощью кнопки Manual Perrin line .

Подгонка времени жизни / анизотропии по суб-ансамблю TCSPC

Вы можете выполнить суб-ансамблевый (или пакетно-селективный) анализ TCSPC для вида, выбрав его в списке видов в правом нижнем углу вкладки Selection , щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав Отправить выбранные виды в TauFit .Кроме того, вы можете щелкнуть небольшой символ затухания флуоресценции в верхней части списка видов . Это возможно только в том случае, если Multiselect отключен, так как вы можете отправлять только отдельные виды на TauFit . Это откроет экземпляр TauFit с совокупными данными всех выбранных пакетов. Вы можете использовать весь набор инструментов TauFit , как описано в руководстве TauFit. 2 \), как описано в соответствующем разделе руководства TauFit.

BurstBrowser позволяет подобрать любую комбинацию параметров на графике General , используя модель смеси Гаусса с максимум 4 компонентами, используя либо оценку максимального правдоподобия (MLE), либо минимизируя квадратичную ошибку (LSQ). Выберите метод подгонки в нижнем раскрывающемся меню и количество используемых распределений Гаусса в верхнем раскрывающемся меню (в настоящее время доступно до 4 видов). Установка флажка Выбрать начальные точки вручную позволит вам вручную указать начальные точки для алгоритма подбора, щелкнув график.{-1} \ left (x- \ mu_i \ right) \ right] \]

Параметрами модели соответствия являются дробные вклады каждого вида, центральные точки в измерениях X и Y Среднее (X) и Среднее (Y) , а также соответствующие ширины распределений \ ( \ sigma (XX) \) и \ (\ sigma (YY) \) и ковариация между параметрами COV (XY) .

Пользовательский интерфейс подбора гауссовой смеси для MLE (слева) и LSQ (справа).

Пример результата подбора гауссовой смеси.

Примечание

Эллипсы для отдельных популяций представляют собой изолинии распределений. Вы можете указать высоту изолинии, используя высоту изолинии для отображения по Гауссу. Варианты от 0 до 1. Цвета для совокупностей задаются цветом Line Colors .

Подсказка

Чтобы легко экспортировать результат подгонки, щелкните правой кнопкой мыши таблицу и выберите Копировать результат подгонки в буфер обмена , чтобы перенести данные в электронную таблицу.

Фитинг MLE

Подгонка гауссовых распределений с использованием оценки максимального правдоподобия реализуется с помощью функции fitgmdist MATLAB. Алгоритм работает с необработанными данными и, таким образом, не зависит от используемого биннинга для 2D графика. Подгонка MLE не позволяет фиксировать параметры или ограничения через нижнюю и верхнюю границы. Подгонка MLE дополнительно возвращает информацию о сходимости (0, если подгонка не сходилась, 1 в противном случае), отрицательный логарифм вероятности на найденном минимуме ( -logL ) и критерий байесовской информации ( BIC ), определяемый как :

\ [BIC = -2 \ ln \ mathcal {L} + \ ln (n) k \]

Здесь \ (\ mathcal {L} \) - вероятность модели, \ (n \) - количество точек данных, а \ (k \) - количество параметров свободной подгонки.Используйте BIC , чтобы решить, сколько распределений необходимо для описания данных; модель с наименьшим значением для BIC должна быть предпочтительнее. См. Страницу в Википедии для получения дополнительной информации о BIC .

Фитинг LSQ

Процедура аппроксимации методом наименьших квадратов минимизирует квадратичную ошибку между данными и моделью с помощью функции lsqcurvefit MATLAB. Вы можете зафиксировать параметры ( F ) и установить их нижнюю и верхнюю границы ( LB и UB ) в таблице параметров подгонки.2 _ {\ mathbf {red}} \).

1D параметр подходит

Подборы по одному параметру с использованием описанных выше методов можно выполнить, просто выбрав один и тот же параметр для координат x и y.

В FCSFit дополнительно реализована подгонка гистограмм эффективности FRET с настраиваемыми функциями модели.

Определение породы из результата подбора

Полученный результат подгонки можно использовать для сортировки всплесков по видам. Пакеты, принадлежащие определенной ячейке на 2D-графике, будут назначены различным подходящим видам на основе относительных вкладов подходящих видов.Доступ к этой функции можно получить, если щелкнуть правой кнопкой мыши в таблице результатов подгонки и выбрать Определить виды из подгонки . Новый выбор будет добавлен в список видов , охватывающий все выбранные пакеты, используемые для подгонки.

Выбор пакета определяется по результату подгонки. Вид 1 был определен на основе подобранного компонента со средними значениями для эффективности FRET = 0,61 и стехиометрии = 0,69.

Название родительского вида содержит параметры, использованные для подбора.Имена подвидов содержат центральные значения соответствующих параметров, которые использовались для определения вида.

Подсказка

Эта функция в принципе может использоваться для удаления «фоновых» видов из анализа. Однако отнесение «фонового» сигнала должно быть обосновано контрольными измерениями. Если, например, используемый буфер содержит флуоресцентные загрязнения, импульсный анализ только для буфера может идентифицировать фон.

Последовательно FCS

Пакетная FCS может выявить различия во времени диффузии и, следовательно, взаимодействия или конформационную динамику в субмиллисекундной шкале времени.При вычислении корреляционных функций на временных масштабах, аналогичных длине записанного сигнала, как в случае пакетной FCS, необходимо учитывать артефакты дискретизации. Другими словами, длительные задержки, например на шкале времени диффузии реже отбираются импульсные временные следы, чем короткие временные лагы. Для заданного запаздывания \ (\ tau \) и длительности всплеска \ (T \) отсчет времени запаздывания можно производить только для фотонов, обнаруженных в диапазоне \ (\ left [0, T- \ tau \ right] \). На практике индивидуальные корреляционные функции рассчитываются для каждого вносящего вклад пакета и затем усредняются, принимая во внимание неравномерность выборки:

\ [G _ {\ mathbf {bw}} \ left (\ tau \ right) = \ frac {\ sum_ {k} n_k (\ Delta t = \ tau) \ sum_ {k} \ left (T_k- \ tau \ right )} {\ sum_ {k} n_k (t \ leq T_k- \ tau) \ sum_ {k} n_k (t \ geq \ tau)} \]

Здесь суммы идут по количеству всплесков \ (k \), \ (n_k (\ Delta t = \ tau) \) - это количество пар фотонов во всплеске \ (k \) с запаздыванием по времени \ (\ tau \), \ (T_k \) - длительность всплеска, а \ (n_k (t \ leq T_k- \ tau) \) и \ (n_k (t \ geq \ tau) \) - количество фотонов в интервале \ ([0, T_k- \ tau] \) и \ ([\ tau, 0] \).

Пакетная FCS может обнаруживать конформационную динамику во временных масштабах быстрее, чем диффузия. Однако время диффузии, определяемое пакетной FCS, сильно зависит от выбранных параметров поиска пакета, то есть более высокие пороги счета фотонов прервут пакет раньше, что приведет к более короткой длительности пакета. Этот эффект можно уменьшить, добавив временное окно вокруг всплесков, что позволяет более точно определять диффузионную часть кривой FCS. Другой эффект выбора пакета состоит в том, что из результатов измерений выбираются области с высокой скоростью счета для корреляции, что приводит к уменьшению флуктуаций и, таким образом, к более низким амплитудам FCS, поскольку средняя интенсивность завышена.Кроме того, поскольку выбираются коррелирующие области, функция корреляции обычно не уменьшается до 0 при больших временных задержках, что требует учета значительного смещения в функции модели.

На рисунке ниже показано влияние выбранного временного окна на форму и амплитуду полученных пакетных кривых FCS. Большее временное окно приводит к более высоким амплитудам корреляционной функции. Пакетная кривая FCS недооценивает время диффузии, которое асимптотически увеличивается с увеличением временного окна.Очевидно, что максимальная задержка также зависит от выбранного временного окна. Поскольку временное окно добавляется как к началу, так и к концу пакетов, максимальное время задержки будет примерно в два раза больше размера временного окна.

См. [Laurence2007] для получения дополнительной информации о пакетной FCS.

Пакетная корреляция с увеличением временного окна, ненормализованная (слева) и нормализованная к подобранному количеству частиц (справа). Для всех кривых было вычтено смещение.

При добавлении временного окна возможно, что события соседних одиночных молекул попадают в область вокруг соответствующего всплеска, что приводит к загрязнению видоразборной корреляционной функции.Если другое событие одиночной молекулы, которое было обнаружено при поиске пачки, попадает во временное окно вокруг участвующей пачки, эта пачка не включается в функцию корреляции. Это гарантирует, что полученная корреляционная функция специфична для выбранных видов. Однако вклад загрязняющего сигнала, который не был обнаружен как всплеск, не будет отфильтрован.

Примечание

Как правило, для пакетной FCS рекомендуется использовать пороги низкой интенсивности для пакетного поиска, чтобы детектировать как можно большую часть сигнала флуоресценции отдельных молекул, сглаживая границы пакетной корреляционной функции.Кроме того, если необходимо провести видоспецифический анализ FCS, концентрацию следует выбирать достаточно низкой, чтобы оставалось достаточно времени между отдельными событиями.

Использование пакетного модуля FCS

Пакетный графический интерфейс FCS на вкладке Corrections / FCS.

Для выполнения пакетного анализа FCS BurstBrowser предварительно определяет комбинации каналов PIE, а именно: каналы DD для флуоресценции донора после возбуждения донора, DA для флуоресценции акцептора после возбуждения донора, AA для флуоресценции акцептора после акцепторное возбуждение и DX = DD + DA , т.е.е. все фотоны после возбуждения донора. Каналы параллельной и перпендикулярной поляризации обозначены цифрами (1 - параллельный, 2 - перпендикулярный), таким образом, DX1 = DD1 + DA1 . Если номер не указан, канал объединяет обе поляризации, например DD = DD1 + DD2 .

Анализ

FRET-FCCS требует автокорреляции и взаимной корреляции сигналов донора и FRET, то есть в терминах каналов PIE корреляционные функции для DD1 x DD2 , DA1 x DA2 и DD x DA .Обратите внимание, что для автокорреляции каналы с разной поляризацией должны быть взаимно коррелированы, чтобы избежать артефактов детектора, таких как мертвое время или постимпульс. С другой стороны, для взаимной корреляции каналы поляризации должны быть объединены, то есть (DD1 + DA2) x (DD2 + DA2) , чтобы гарантировать использование всей информации о фотонах. Другими соответствующими кривыми FCS для анализа FRET-FCCS являются автокорреляция сигнала акцептора после возбуждения акцептора AA1 x AA2 , а также автокорреляция общего сигнала после возбуждения зеленым DX1 x DX2 , который не будет чувствителен к FRET динамика.

Выбор этих функций корреляции по умолчанию может быть установлен , щелкнув правой кнопкой мыши таблицу и выбрав FRET FCCS selection . Точно так же выбор в таблице можно сбросить, нажав Сбросить . Делитель крупнозернистый: разрешение прихода фотонов по времени; его функции описаны в этом разделе.

Нажмите кнопку Correlate , чтобы выполнить пакетную FCS без какого-либо временного окна, и кнопку Correlate with time window для корреляции с временным окном.Временное окно указывается в единицах 1 мс. Выбранное временное окно будет добавлено до и после пакета, в результате общая длина трассы сигнала будет в два раза больше временного окна. Временное окно может быть включено только в том случае, если для пакетного анализа была выбрана опция Сохранить общий поток фотонов . См. Раздел пакетного поиска в руководстве PAM для получения более подробной информации. 2} {4 \ tau_D} \]

Чтобы получить доступ к этой функции, щелкните правой кнопкой мыши кнопку Корреляция с временным окном и выберите Подобрать пакетное время распространения .Функциональность доступна только при использовании временных окон вокруг пакета

.

Примеры пакетных корреляционных функций и подгонок. Длина временного окна 10 мс.

Пример анализа коэффициента импульсной диффузии. Показано измерение двух молекул ДНК с идентичной структурой, но разным положением метки, показывающее разную эффективность FRET, но идентичные распределения коэффициента диффузии (показан логарифм коэффициента диффузии).

Примечание

Выберите достаточно большое временное окно (> 5 мс), чтобы гарантировать, что коэффициент диффузии не будет завышен из-за алгоритма пакетного поиска.

Использование модуля filter-FCS

FCS с фильтром - это расширение корреляционной спектроскопии времени жизни флуоресценции (FLCS), расширяющее теорию за счет включения других параметров в дополнение к времени жизни флуоресценции, которые доступны в MFD, например анизотропия флуоресценции и информация о цвете (то есть эффективность FRET). См. Соответствующий раздел в руководстве PAM .

Пример фильтрованного анализа FCS. (A) Сложенные гистограммы микровремени измерения смеси (слева) и видов с высокой и низкой эффективностью FRET (синий и красный).Гистограммы микровремени доноров и FRET-сенсибилизированных акцепторов складываются, чтобы использовать информацию о цвете при создании фильтра. (B) Соответствующие статистические фильтры. (C) Результирующие функции авто- и взаимной корреляции видов.

Чтобы разрешить динамику в субнаносекундном диапазоне, fFCS требует взаимной корреляции между двумя детекторами, чтобы избежать мертвого времени и других электронных артефактов. Таким образом, fFCS реализуется только для установок, использующих два канала обнаружения на цвет, либо разделенных по поляризации, либо с использованием светоделителя 50:50.На двух независимых каналах обнаружения создаются отдельные фильтры, которые взаимно коррелируются при вычислении корреляционных функций.

Функциональность

Filtered-FCS интегрирована в BurstBrowser , что позволяет использовать подмножества пакетов для определения фильтров для чистых видов.

Панель опций Filtered-FCS

Модуль отфильтрованной FCS требует определения родительского вида в Списке видов как минимум с двумя дочерними видами, представляющими разные подмножества родительских видов. BurstBrowser затем будет обрабатывать родительский вид как общее измерение , которое будет описано как суперпозиция подвидов.

Функциональность модуля filter-FCS будет продемонстрирована с использованием набора данных, показанного на следующем рисунке. При измерении наблюдаются быстрые флуктуации между состояниями низкой и высокой эффективности FRET на шкале времени \ (\ mu s \), на что указывает отклонение от статической линии FRET.

The E vs.График \ (\ tau_ {D (A)} \) указывает на быструю динамику в субмиллисекундной шкале времени.

Для выполнения анализа FCS с фильтром мы определяем два подвида, представляющие состояния с низкой и высокой эффективностью FRET с использованием пороговых значений \ (E <0,35 \) и \ (E> 0,75 \), соответственно ( видов 1 и видов 2 ). Щелкните Plot Microtimes , чтобы построить микровремени родительских видов (черный) и видов 1 (зеленый) и видов 2 (синий).Нажмите кнопку Calculate Filters , чтобы определить фильтры для двух видов. Вы можете проверить фильтры для параллельных и перпендикулярных каналов на графиках в нижней части окна. На вкладке «Реконструкция » проверьте измеренный (черный) образец микровремени и образец микровремени, восстановленный из разложения (красный), чтобы оценить качество сгенерированных фильтров. Ищите хорошее согласие между двумя шаблонами. Если две модели не согласуются друг с другом, обычно вид, который присутствует в общем измерении, не учитывается ни одним из определенных видов (например,грамм. без фоновых / рассеянных видов).

Пример анализа fFCS данных на предыдущем рисунке. Голубые виды: E <0,35, зеленые виды: E> 0,75.

Наконец, нажмите Do fFCS , чтобы выполнить корреляционный анализ. Результат fFCS будет отображен на вкладке fFCS results . Он не будет сохранен автоматически. Чтобы сохранить результат, нажмите кнопку Сохранить результат , чтобы сохранить две функции автокорреляции и две функции взаимной корреляции в папке .Bur файл.

Результат примерного анализа fFCS.

Есть несколько вариантов анализа fFCS.

Режим fFCS позволяет выбрать один из следующих подходов:

последовательно:
В этом режиме будут использоваться только фотоны, принадлежащие выбранным пакетам, что идентично выполнению пакетного анализа FCS без добавления временного окна.
пакетно с временным окном:
Это добавит временное окно вокруг выбранных пакетов, идентично выполнению пакетного анализа FCS с добавлением временного окна.Он будет использовать временное окно, указанное в подмодуле FCS. Поскольку добавление временного окна добавит больше фонового сигнала, рекомендуется включить диаграмму рассеяния, чтобы учесть фоновый вклад. Требуется файл .aps для измерения, созданный при установке флажка «Сохранить общий поток фотонов» при выполнении пакетного анализа.
непрерывный поток фотонов (только с донором):
Эта опция будет использовать общее измерение для анализа отфильтрованной FCS.Как следствие, необходимо учитывать все виды, присутствующие в измерениях. Используйте вариант без включения только донорных частиц только для образцов, которые не содержат или содержат незначительное количество молекул только-донора. Если присутствуют молекулы только-донора, использование опции … с только-донора определит микровремени на основе измерения всплеска с использованием порога стехиометрии и включит его в анализ. Поскольку анализ фильтрованной FCS не выполняется на канале эмиссии акцептора после возбуждения акцептора ( AA ), нет необходимости учитывать только акцепторные молекулы.Требуется файл .aps , созданный при установке флажка «Сохранить общий поток фотонов» при выполнении пакетного анализа. Поскольку большая часть сигнала будет исходить от фона, требуется включение диаграммы рассеяния как вида.

Параметр Включить рассеивание добавляет сохраненный узор рассеяния / фона в качестве третьего вида. Включите эту опцию при использовании общего измерения или при включении большого временного окна вокруг всплесков.

Проверка Включите канал FRET для совмещения микровременной гистограммы канала FRET с донорским каналом.Это увеличивает статистику за счет включения индуцированных FRET акцепторных фотонов, особенно если присутствуют частицы с очень высоким FRET.

Для устранения шумовых микровременных паттернов, вызванных низкой статистикой, например если для определения вида можно использовать только несколько пакетов, можно увеличить ширину бина TCSPC , как показано на следующем рисунке. Уменьшенное разрешение микровремени используется только для расчета фильтра и никаким другим образом не влияет на данные.

Пример увеличения ширины бункера для работы с зашумленными микровременными шаблонами.

Использование синтетических шаблонов микровремени

Другой способ иметь дело со статистикой для шаблонов микровремени или включать внешние шаблоны микровремени - это подогнать затухание флуоресценции с помощью TauFit и экспортировать подобранный образец микровремени. Обратите внимание, что необходимо использовать модель подгонки анизотропии для создания синтетических микровременных структур как для параллельного, так и для перпендикулярного затухания. Использование канала FRET не поддерживается синтетическими микровременными паттернами, поскольку в настоящее время не существует подходящей модели для одновременного распада донора и акцептора.

Генерация синтетической микровременной модели в TauFit с использованием модели подгонки анизотропии.

Чтобы загрузить файлы .mi , щелкните всплывающее меню вида и выберите Загрузить синтетический образец… . Использование синтетических паттернов повышает качество фильтров за счет уменьшения шума.

Пример использования синтетических шаблонов микровремени для создания фильтров для анализа fFCS.

Кроме того, если чистые частицы доступны в отдельных измерениях, вы можете использовать модуль отфильтрованной FCS в PAM , чтобы экспортировать их как .mi файлов, которые можно загрузить в BurstBrowser .

Анализ временного окна

Динамическое взаимное преобразование между несколькими состояниями эффективности FRET на временной шкале субдиффузии приведет к усреднению наблюдаемой эффективности FRET в зависимости от времени наблюдения. Щелкните правой кнопкой мыши вид и выберите Анализ временного окна . Это построит гистограмму эффективности FRET для временных окон от 0,5 до 3 мс с интервалами 0,5 мс. Укажите минимальное количество фотонов на временное окно, чтобы исключить временные окна с низким количеством фотонов и, таким образом, уменьшить дробовой шум на гистограммах.

Пример определения динамики с использованием анализа временного окна. Две отдельные популяции в малых временных окнах усредняются в более длинных временных окнах.

Анализ дисперсии пакетов

Учитывая, что распределение FRET шире, чем ожидаемое распределение дробового шума, можно использовать анализ дисперсии пакетов (BVA), чтобы различать несколько статических компонентов или несколько состояний взаимного преобразования. Щелкните правой кнопкой мыши вид и выберите Burst Variance Analysis .Это построит график наблюдаемого и ожидаемого стандартного отклонения отношения близости для каждого пакета и соответствующего доверительного интервала (CI) против выбранной оси X. Каждый всплеск будет сегментирован на последовательные окна с заданным количеством фотонов. Стандартное отклонение объединяется с использованием ширины 0,05 по оси X. Задайте порог количества пакетов на ячейку, чтобы увеличить статистическую мощность, исключив ячейки с небольшим количеством пакетов. CI рассматривает выборочное распределение стандартных отклонений, ожидаемых для количества фотонных окон, с использованием подхода Монте-Карло.Укажите номер выборки (т. Е. Количество симуляций), чтобы получить биномиальное распределение стандартных отклонений (например, 100 для действительного ДИ или 1 для быстрого расчета). Укажите CI \ (\ alpha \), чтобы отрегулировать верхний хвост CI (т. Е. Низкое значение \ (\ alpha \) для более высокого доверительного интервала и высокое значение \ (\ alpha \) для более низкого доверительного интервала). Выберите либо коэффициент близости, либо эффективность FRET в качестве оси X (примечание: для эффективности FRET ожидаемое стандартное отклонение имеет овальную форму).

Пример определения динамики с использованием пакетного дисперсионного анализа.Значения стандартного отклонения, сгруппированные вокруг ожидаемого стандартного отклонения, указывают на статический FRET (левая панель), тогда как пакеты со значениями стандартного отклонения, значительно превышающими доверительный интервал, указывают динамику внутри пакета (правая панель).

Работа с большими наборами данных

BurstBrowser предлагает функциональные возможности для одновременной работы с несколькими файлами, например синхронизацию поправочных коэффициентов и состояний резки. Кроме того, многие функции экспорта работают с множественным выбором.

Чтобы загрузить несколько измерений из одной папки, выберите File -> Load New Burst Data (ярлык ctrl + N ) и выберите измерения для загрузки. Добавьте файлы пакетной передачи к текущим загруженным файлам, выбрав File -> Add Burst data . Чтобы легко загрузить сразу несколько измерений, используйте меню File -> Load New Burst Files from Subfolders . Будет произведен поиск во всех подпапках выбранной папки и будут загружены все найденные файлы .bur .

Чтобы отслеживать принадлежащие друг другу файлы, вы можете сгруппировать их в базу данных. На вкладке База данных выберите Добавить файлы в базу данных , чтобы добавить новые файлы в текущую базу данных. Используйте Добавить загруженные файлы в базу данных , чтобы добавить все загруженные файлы в текущую базу данных. Создать базу данных из папки имеет ту же функциональность, что и опция загрузки пакетных файлов из подпапок. Отдельные файлы можно удалить из базы данных, выбрав их в списке и используя ключ del .Чтобы загрузить выборку файлов из базы данных, используйте , введите . Базы данных могут быть сохранены как файлов .bdb и перезагружены позже. Кроме того, BurstBrowser запоминает последнюю использованную базу данных, поэтому вы можете немедленно продолжить работу с последним набором данных.

Кроме того, BurstBrowser отслеживает последние 20 загруженных файлов в истории файлов . Используйте , введите для загрузки выбранных файлов из истории файлов и del для удаления файлов.

Сохранение состояния анализа

Сохраните изменения для всех загруженных в данный момент файлов, выбрав меню Файл -> Сохранить состояние анализа (ярлык ctrl + S ). Это сохранит состояние резки и исправления / параметры. Однако любые подходящие линии на графиках срока службы, графиках коррекции или состоянии анализа отфильтрованной FCS не будут запоминаться.

Подсказка

Чтобы избежать потери данных, установите флажок Запрашивать сохранение при закрытии программы на вкладке Параметры .Вам будет предложено сохранить состояние анализа при закрытии BurstBrowser . Выберите Отменить , чтобы закрыть программу без сохранения изменений, и Отменить , чтобы прервать процесс закрытия и продолжить анализ.

Ведение записей

BurstBrowser предлагает внутренний блокнот Notepad , который можно использовать для хранения временных заметок. Откройте его, используя меню Блокнот или ярлык ctrl + T . Заметки сохраняются в текущем выбранном профиле PAM и хранятся между сеансами.Вы можете сохранить содержимое текущего блокнота как файл .txt , щелкнув правой кнопкой мыши текст и выбрав Сохранить содержимое .

Как читать схемы аккордов

В этом уроке игры на гитаре мы научимся читать схемы аккордов. Диаграммы аккордов - это графики, которые говорят вам, где положить пальцы на гриф, чтобы взять определенный аккорд. Часто диаграммы аккордов можно увидеть в верхней части музыкальной таблицы или по всей таблице.Иногда они помещаются туда на случай, если вы не знаете аккорд, но иногда человек, который написал песню, хочет, чтобы эта конкретная форма была воспроизведена для этого аккорда.

Аккордовая диаграмма состоит из шести вертикальных линий, обозначающих струны гитары, и нескольких горизонтальных линий, обозначающих лады. Крайняя левая строка представляет нижнюю E, а крайняя правая строка представляет собой высокую E. Иногда вы увидите диаграммы с простыми черными точками, которые указывают, куда вы должны положить пальцы, а иногда вы увидите черные точки с числами в них.Эти числа представляют номер пальца, которым вы должны пользоваться, играя эти ноты.

Узнайте, как считать пальцы для гитары здесь!

Есть еще пара символов диаграммы аккордов, о которых вам следует знать. Если вы видите прямоугольный блок в верхней части диаграммы, это просто гайка гитары. Если вы не видите гайку, вы, вероятно, увидите число слева от диаграммы, которое указывает, на каком ладу вы должны быть. X над одной из струн означает, что вы должны отключить звук или просто не играть на этой струне.Если вы видите черную точку или просто кружок над одной из струн, это означает, что вы должны играть на этой струне открытой. Толстые черные линии или дуги, проходящие над несколькими строками, представляют полосы. Если вы видите такую ​​толстую черную линию, вы, вероятно, играете тактовый аккорд.

Узнайте, как пронумеровать гриф здесь!

Теперь, когда вы знаете, что означают все символы на диаграмме аккордов, давайте попробуем несколько примеров. Начните с открытого аккорда соль мажор. Если вы посмотрите на схему этого аккорда, вы увидите точки на 3-м ладу 6-й струны, 2-м ладу 5-й струны и 3-м ладу 1-й струны.Все остальные струны будут иметь точки или кружки над ними, чтобы указать, что вы должны играть на них открытыми.

Попробуйте такт соль мажор. В этом примере вы увидите толстую черную линию или дугу на всех шести струнах. Это полоска с вашим 1-м пальцем. Скорее всего, вы увидите цифру 3 слева от диаграммы, указывающую на то, что вам следует разместить такт на 3-м ладу. На этой диаграмме было бы еще три точки. Точки представляют ваш 3-й палец на 5-м ладу 5-й струны, 4-й палец на 5-м ладу 4-й струны и 2-й палец на 4-м ладу 3-й струны.Опять же, на некоторых диаграммах могут быть номера пальцев на точках, а на некоторых - нет.

Поначалу чтение диаграмм аккордов может происходить медленно, но если вы будете придерживаться этого правила, вы сразу же начнете узнавать определенные диаграммы аккордов. Возьмите музыку, которая вам нравится, или поищите ее в Интернете. Посмотрите, сможете ли вы прочитать схемы аккордов и, возможно, даже выучить новые аккорды в процессе.

После того, как вы закончите этот урок игры на гитаре, вы, возможно, захотите узнать больше о теории игры на гитаре и прочитать гитарные ноты!

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Не беспокойся о себе

Чего бы это ни стоило ... никогда не поздно, а в моем случае - слишком рано, быть тем, кем хочешь быть.

Нет ограничений по времени. Начните, когда захотите. Вы можете измениться или остаться прежним. В этом нет никаких правил. Мы можем сделать лучшее или худшее из этого. Надеюсь, ты извлечешь из этого максимум пользы. Надеюсь, вы видите то, что вас пугает. Я надеюсь, вы чувствуете то, чего никогда раньше не чувствовали. Надеюсь, вы встретите людей, у которых другая точка зрения. Я надеюсь, что вы живете жизнью, которой гордитесь, а если нет, я надеюсь, что у вас хватит смелости начать все сначала.

~ Ф. Скотт Фицджеральд

Квилтинг

Это последний из красных и желтых шестидюймовых квадратов.Их разрезали {и бережно хранили} так давно, что я не могу вспомнить причину. Так что блок песочных часов Суджаты от руки из Cultural Fusion Quilts казался отличным способом быстро использовать их ... и снова попытаться восстановить тайник детских одеял.

Мой старый дисковый нож больше не удерживает лезвие прочно. Гайка и болт откручиваются с каждым движением. Пора покупать новый. Между тем, мои очень острые ножницы Kai отлично подходят для вырезания диагональных линий. {Конечно, блоки будут выровнены позже вращающимися инструментами.}

С моей обычной беззаботностью я вырезал их все, прежде чем определить, сколько действительно нужно. И их было слишком много для одеяла первого года жизни. На самом деле, на секунды хватит, но я готов к новой раскладке. На этот раз все песочные часы указывают в одном направлении.


Я уже упоминал, что начал складывать плиты в мешок для отходов в дополнение к веревкам? Вот откуда взялись апельсины, а также остатки прошлогодней рубашки алоха. Не знаю, как мне это нравится, но, по крайней мере, они были доступны, несмотря на то, что когда я начинал, они были «неправильного» размера.И мне не пришлось искать еще одну сумку или коробку для их хранения.

Затенение между оранжевым и красным не очень хорошее, но мне нравится, как оранжевый передний план сливается с желтым фоном. Всегда есть что открыть для себя, работая с записками.

Поскольку блоки были сшиты пару недель назад, пришивание верха шло намного быстрее, но для этого требовалась граница. Я свел себя с ума, вытаскивая почти все синих из заначки. Эти ...

и эти.

Я хотел полюбить морковь из-за кусочков апельсина.Вы можете видеть, что я положил горизонтально и вертикально, но, похоже, ни один из них не работал. И я люблю сине-черную клетку, но она конфликтует с полосой, которая будет переплетом. {Это слишком хорошая возможность, чтобы упустить возможность использовать его для привязки, и именно здесь пришла идея синей рамки.}

В конце концов, как ни странно, я выбрал самый темный синий цвет. Это почти репродукция широкой полосы. Не знаю, почему это работает, но это действительно так.

Готовое лоскутное переплетение и готово.

Красно-желтое лоскутное одеяло Improv Hourglass

Оранжевая ткань была куплена для другого одеяла, которое еще не началось, поэтому я использую его здесь.Конечно, для спинки этого не хватило, поэтому несколько оставшихся песочных часов и полосок по краям заполнить.

Спинка лоскутного одеяла Improv Hourglass

Переплет выглядит великолепно. Я люблю полосатый переплет и часто покупаю случайные полосы, которые затем тают в моем тайнике. Какая радость осознавать, что этот так хорошо работает с блоками.

Деталь одеяла Improv Hourglass

Окончательный вид передней и задней части одеяла.

Сложенное одеяло из песочных часов Improv

Теперь оно в тайнике с одеялами и ждет старшего брата, которому нужно немного внимания.

Quilt Specifics

Размер: 57 x 57 дюймов

Дизайн: Improv Hourglass

Ватин: Mountain Mist Cream Rose, хлопок

Нить: многожелтая хлопковая нить Gutermann

Квилтинг: параллельные линии для ходьбы

Приблизительный метр : 6 ярдов

Чтение


Я с нетерпением ждал возможности прочитать вторую из серии «Путников» Бекки Чемберс. Замкнутая и общая орбита начинается с переноса системы искусственного интеллекта Лавлейс на человеческое тело. Пеппер, человек, сбежавший с фабрики, где девушки с генной инженерией перерабатывают мусор, приглашает ее к себе домой и пытается помочь ей вписаться в эту новую реальность. Роман исследует разум, автономию и цель.

Я на собственном горьком опыте выучил время, читая новые серии. Чтение их подряд обычно приводит к выгоранию. Теперь считаю дни до следующего.

Наслаждайся днем, Аня .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *