Лада гранта серебристая: LADA Granta седан — Официальный сайт LADA

Содержание

LADA Granta Cross – Обзор модели, фото – Первый Лада Центр, Краснодар.

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Classic (21941-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система

• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Comfort (21941-A1-X31)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка

• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Comfort (21947-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)

• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Comfort (21947-A1-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал

• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Luxe (21947-A2-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом

• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Luxe (21947-A2-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX

• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света

• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

Как узнать цвет автомобиля

У наших клиентов, желающих приобрести окрашенные детали для автомобилей Лада, часто возникает вопрос: как узнать точное наименование цвета? К примеру, у Лады Гранта существует 4 оттенка черного цвета.

Итак, для выяснения точного наименования цвета автомобиля Лада понадобится сервисная книжка автомобиля или гарантийный талон.

В свидетельство о регистрации смотреть не нужно, там МРЭО указывает цвет на свой вкус.

Наименование цвета кузова автомобилей Лада состоит из 3 цифр и названия цвета.

В сервисной книжке это выглядит так:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В гарантийном талоне вот так:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Название цвета после его цифрового обозначения может отличаться от заводского наименования цвета. К примеру, может быть указан цвет "691 серебристый". Заводское наименование этого цвета "691 Платина". Таким образом, при заказе деталей в цвет кузова вам нужно ориентироваться именно на цифровой код цвета.

Для автомобилей Датсун (Datsun) обозначение цветов отличается, на настоящий момент таблица соответствия цветов такова:

Наименование цвета АвтоВАЗ Наименование цвета Datsun
240 Белое Облако C04 или C04G (белый)
413 Ледяной C03 или C03G (серо-голубой)
610 Рислинг C02 или C02G (серебристый металлик)
672 Пантера C05 или C05G (черный)
790 Кориандр C01 или C01G (коричневый)

Если у вас нет гарантийного талона или сервисной книжки на автомобиль, определить цвет возможно по дате выдачи паспорта транспортного средства (согласно плана покраски АвтоВАЗ).

Для определения цвета по дате выдачи паспорта транспортного средства надо перейти по ссылке http://avtosreda.ru/colorplans/2016/03.php , выбрать год и месяц выдачи ПТС, в таблице плана покраски выбрать модель автомобиля, и подобрать цвет. План покраски действителен только для автомобилей, собранных в г. Тольятти. По автомобилям, собранным в Ижевске, рекомендуем обращаться в систему обратной связи АвтоВАЗ.

Если у вас дубликат ПТС или цвет автомобиля не подобрать по плану покраски, вы можете задать вопрос о цвете автомобиля через систему обратной связи ПАО "АвтоВАЗ", указав VIN-номер автомобиля. Чтобы задать вопрос, перейдите по ссылке https://www.lada.ru/feedback/message.html

 

Лада гранта серо синий цвет

С момента приема заказов на Ладу Гранта, для нее предлагалось пять вариантов окраски кузова. Цвета носят собственные названия: «Потвейн», «Белое облако», «Рислинг», «Космос» и «Гранта».

Позже стали доступны дополнительные цвета, включая «Желый-такси», «Аэлита», «Ледниковый», «Серый базальт», «Ледяной», «Персей» и «Платина», а черный цвет «Космос» переименовали в «Пантера». Общее число вариантов окраски составляет 12 цветов.

* в настоящее время не все цвета доступны для заказа
** цвета на представленных ниже изображениях могут несколько отличаться от реальных

1. Лада Гранта цвета Портвейн (темно-красная / бордовая)

2. Лада Гранта цвета Желтый-такси (желтая)

3. Лада Гранта цвета Аэлита

4. Лада Гранта цвета Ледниковый

5. Лада Гранта цвета Белое облако (серебристая)

6. Лада Гранта цвета Серый базальт

7. Лада Гранта цвета Ледяной

8. Лада Гранта цвета Персей (синяя)

9. Лада Гранта цвета Рислинг (серая)

10. Лада Гранта цвета Пантера (ранее Космос) (черная)

11. Lada Granta цвета Гранта (темно-синяя)

12. Лада Гранта цвета Платина

Примеры вариантов окраски Лады Гранта на компьютерных изображениях седана.

— Цвет Белое облако

— Цвет Пантера (ранее Космос)

* в настоящее время не все цвета доступны для заказа
** цвета на представленных выше изображениях могут несколько отличаться от реальных

Ответы (4)

Какой конкретно цвет интересует?

Цвет под название "аэлита" имеет номер краски — 218
Белое облако — 240
Цвет Гранта — так и называется — код — 682
Цвет под названием Калина (он же красный) — 104
Космос (он же черный с неким оттенком) — 665
Ледниковый (очень красивый цвет) — 221
Ледяной — 413
Пантера (в общих чертах черный цвет) — 672
Персей — 429
Платина — 691

Большинство автомобилистов даже не предполагают, какие бывают цвета Лады Гранты Лифтбек для окрашивания кузова. Производители предлагают более 10 оттенков, мы же рассмотрим наиболее популярные и трендовые.

Общее описание цветов. Какие бывают

Цвета новой Лады Гранты Лифтбек:

Помимо указанных цветов кузова Лады Гранты Лифтбек, различают также следующие оттенки: «Платина», «Ледниковый», «Ледяной», «Магма», «Черная жемчужина».

Сердолик. Эмоциональный цвет

Краткое описание

Группа: Красная Гранта Лифтбек.

Достоинства
  • яркость;
  • насыщенность;
  • игра тонов под лучами солнца.

Недостатки
  • маркость;
  • очень заметны повреждения лакокрасочного покрытия, дефекты кузовных элементов.
Отзывы о цвете

Василий: выбирал между сердоликом и ледниковым, оба хороши и прекрасны. Несмотря на маркость, купил в цвете сердолик.

Белое облако. Самый популярный, классический цвет

Краткое описание цвета «Белое облако» Гранты Лифтбек

Тип: автоэмаль, солид.

Способ нанесения: одно- и двухслойный.

Достоинства
  • стойкость к лучам ультрафиолета;
  • сохранение естественного цвета на протяжении длительного периода.

Недостатки
  • маркость;
  • отображение изъянов, деформаций кузова.
Отзывы о цвете

Константин: на момент приобретения машины в салоне расцветки «Белое облако» не оказалось, другой оттенок не захотел. Охотно согласился подождать две недели, пока доставят новую партию.

Голубая планета. Энергия скорости

Краткое описание цвета «Голубая планета» Гранты Лифтбек

Тип: автоэмаль, перламутр, металлик.

Способ нанесения: однослойный.

Достоинства
  • переливается под лучами солнца;
  • длительное сохранение естественного цвета.

Недостатки
  • недостаточная видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Владимир: машина в таком оттенке смотрится просто шикарно. Пожалуй, одна из самых лучших цветовых гамм.

Рислинг. Серебристая эмаль

Краткое описание

Тип: автоэмаль, перламутр.

Цветовая группа: металлик.

Достоинства
  • естественность оттенка;
  • придание объема автомобилю.

Недостатки
  • ограниченная видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Александр: смотрится модель очень даже хорошо, особенно под лучами солнца, игра оттенков поразительная.

Борнео. Глубина морской волны

Краткое описание

Тип: автоэмаль, перламутр, солид, металлик.

Достоинства
  • естественность оттенка;
  • длительное сохранение глубины оттенка.

Недостатки
  • ограниченная видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Владислав: долго искал модель именно в этом окрасе. Лада просто великолепна. Мои рекомендации автомобилистам.

Пантера. Строгий цвет

Краткое описание

Тип: автоэмаль, солид, акрил.

Цветовая группа: черный.

Достоинства
  • сохранение глубины оттенка на протяжении длительного времени;
  • тонкость и выразительность боковых линий кузова.

Недостатки
  • видимость машины в темное время суток ограничена.
Отзывы о цвете

Сергей: строгий цвет Гранта Лифтбек «к лицу», мне он очень нравится.Идеальное сочетание с моим костюмом.

Кориандр. Практичный и удивительно нарядный

Лада Гранта Лифтбек — цвет «Кориандр»

Тип: автоэмаль, металлик.

Цветовая группа: коричневый.

Достоинства
  • контрастность под лучами ультрафиолета;
  • глубина оттенка.

Недостатки
  • подчеркивание изъянов, дефектов кузова, легкое повреждения лакокрасочного покрытия.
Отзывы о цвете

Виктор: до покупки Лифтбек была Приора с такой цветовой гаммой. С целью сохранения естественности оттенка планирую покрыть несколькими слоями лака.

Angkor (коричневый)

Описание цвета Гранта Лифтбек «Оранжевы»

Тип: металлик, акрил.

Цветовая группа: зеленый, коричневый.

Достоинства
  • хорошо скрывает неровности, дефекты на кузове;
  • длительный естественный оттенок.

Недостатки
  • ограничена видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Кирилл: долго искал модель Гранты с оттенком Angkor, так как на нем не видны мелкие сколы, царапины, повреждение лакокрасочного покрытия. Как бы хорошо не водил, а скол дело случая.

Вывод

Лидеры рейтинга: «Белое облако» и «Рислинг». Именно эти оттенки считают безопасными, с наименьшим показателем аварийности на дороге.

Тон Гранты Лифтбек «Черная жемчужина» устарел, исключен из общего перечня. Хотя в начале 2015 года был довольно популярный. Предзаказ в салонах был на полгода вперед.

Оттенок «Магма» Гранты Лифтбек часто путают с «Кориандром», так как они имеют сильное сходство, особенно на дальнем расстоянии. В список не вошел цвет «Платина» Гранта Лифтбек, так как он вышел из моды.

Что получила и чего лишилась «Лада Гранта» после обновления?

«Лада Гранта» — один из самых продаваемых автомобилей на отечественном рынке, но дизайн модели выбивается из новой корпоративной стилистики. А ещё у АвтоВАЗа есть более дорогое семейство «Лада Калина», автомобили которого продаются неважно. Что делать в такой ситуации? Как ни странно, нашёлся способ убить сразу двух зайцев: отправить имя с двадцатилетней историей на покой, причесать все четыре кузова (седан, лифтбек, хэтчбек и универсал) под одну гребёнку в актуальном дизайне и назвать все версии «Грантами». В общем, рестайлинг не стал пустой формальностью и принёс немало изменений.

Внешний вид

Естественно, первый и самый заметный пункт в списке новшеств — дизайн. Общая для всех вариантов кузова черта — новая передняя часть в «икс-стиле», причём под списание пошли многие старые кузовные элементы: крылья, бампер, решётка радиатора, фары, капот. Указатели поворота, как и раньше, у машин в младших комплектациях находятся в крыльях, а в «люксовых» версиях — в зеркалах заднего вида.

Бампер обзавёлся хромированными элементами, проходящими, как у «Икс-рея», над противотуманными фарами. На решётке красуется огромная обновлённая ладья эмблемы. Основным блок-фарам досталась модная чёрная подложка, которая раньше была характерна только для «Калины». Секций три: габаритный огонь, указатель поворота и объединённый отражатель под лампу Н4 для ближнего и дальнего света.

Капот по-прежнему размещается между крыльями, а не лежит на них, как у «Весты», но изменилась общая геометрия передней части. Если раньше для «Гранты» был характерен короткий капот и покатая решётка радиатора, то теперь последняя стоит более вертикально, а капот, соответственно, стал длиннее, заодно сделав более стремительным облик машины в целом. К тому же там больше нет форсунок стеклоомывателя, которые переехали на «жабо», поближе к «дворникам». Двери, крыша и задние крылья остались нетронутыми, ибо менять их дорого.

А вот перемены в задней части неравные. Бывшие «калиновские» кузова явно обделили. У них лишь исчезла выштамповка под фирменный значок на двери багажника, на месте которой теперь красуется размашистая надпись «LADA». Лифтбеку повезло чуть больше: он кроме этого разжился другим бампером с изменившейся формой чёрной вставки в нижней части, видимо, призванной немного визуально облегчить вид сзади. На фоне этого реформа кормы седана выглядит пиром на весь мир — здесь кроме бампера ещё и полностью новая крышка багажника довольно затейливого дизайна, на которую переселили и номерной знак. Все версии кузова получили электрическую кнопку на крышке или двери багажника.

В салоне

Первое, на что обращаешь внимание в салоне — это сиденья. Сперва замечаешь тканевую обивку с рисунком в стиле «Весты Кросс», когда усядешься, понимаешь, что изменились и профиль самого сиденья, и форма подголовника. Пока трудно сказать, насколько удобнее стало водителю, и стало ли: нужно поездить по разным дорогам и в разных режимах, чтобы сделать окончательные выводы.

А вот вернувшаяся из небытия регулировка сиденья по высоте — однозначное благо. К тому же сделана она по-человечески, достаточно покачать рычагом. Подпрыгивать, как в «Логане» первого поколения, не нужно. Жаль было, что её в своё время отобрали у «Калины,» но спасибо, что вернули. Ещё бы боковые подушки безопасности получить. Эх, мечты, мечты... Но, увы, их забрали Datsun on-DO и mi-DO и делиться не хотят.

Перед глазами знакомый по ушедшим «Калине» и «Приоре» руль с новой эмблемой, за ним — комбинация приборов с прежней компоновкой (спидометр и тахометр с дисплеем между ними), но новая в деталях. Шкалы — с оранжевым ободком, белой подсветкой и радиальной оцифровкой. Дисплей в тон, к тому же, наконец-то, с инверсией (светятся только цифры). Компоновка данных также поменялась.

Передняя панель взята у «Калины» (причём ещё до рестайлинга она уже успела занять своё место в топовых комплектациях «Гранты») и изменена в деталях: у панели управления климатом новое обрамление в исполнении с климатической системой (которой также поделилась бывшая «Калина»), щеголяющее серебристой вставкой в тон рулю, облицовка центральных дефлекторов обзавелась рельефным «иксом», а у накладок над «бардачком» и монтажным блоком слева от руля новый рисунок. Ручки управления «автоматом» и роботизированной коробкой остались прежними, а вот рычагом для «механики» поделилась «Веста». И на сладкое самое главное: новый «ручник»! Да, теперь у трамвайно-диванных экспертов отобрали повод для дискуссий, ведь именно из-за этого «Гранта» и «Калина» не могли считаться автомобилями!

Техническая «начинка»

По технике изменений не так много, но это не умаляет их значимости. Например, исчез страшный ночной кошмар владельцев, пугающий сильнее, чем Фредди Крюгер, Джейсон Вурхиз и логотип телекомпании «ВИД» — история под названием «при обрыве ремня ГРМ, заклинивании роликов или помпы клапаны встретятся с поршнями». Не встретятся. Отныне и восьмиклапанные, и шестнадцатиклапанные двигатели объёмом 1,6 литра комплектуются новыми поршнями со специальными выемками, которые не дадут случиться крупным неприятностям.

В механической трансмиссии — главная пара с передаточным отношением 3,9 вместо 3,7, вторую передачу также сделали немного «короче», приблизив её к первой, облегчив жизнь синхронизаторам и обеспечив более плавный разгон. Автомат обошёлся без перемен, а вот «робота», похоже, довольно успешно учат ездить. Теперь он умеет «ползти» при отпущенной педали тормоза на манер классической гидромеханики, имеет спортивный и зимний режимы. Первый, как несложно догадаться, предусматривает улучшенное быстродействие, возможно, немного в ущерб комфорту, а второй даёт возможность тронуться со второй передачи, чтобы избежать пробуксовок на скользком покрытии.

Что в минусе?

Всё вроде замечательно. Думаете, где-то есть подвох? Не бывает ничего идеального? Правильно думаете. Серьёзных потерь нет, но всё же кое-что при обновлении исчезло вместе с именем «Калина». Не зря она стоила немного дороже...

Во-первых, это фары. Хороший свет является залогом комфорта и безопасности передвижения в ночное время и в условиях недостаточной видимости, и у «Калины» он был, без преувеличения, великолепным, одним из лучших в классе (где большинство машин раза в полтора дороже), не в последнюю очередь благодаря раздельным отражателям для ближнего и дальнего света под лампы Н7 и Н1. «Гранта» всегда уступала по этому показателю, и обновлённая модель тоже не дотянется до «Калины».

Во-вторых, наполнение комплектаций. Каким именем семейство назвали, от той машины комплектации и взяли. А это значит, что теперь только в «люксе» можно получить климат-контроль, центральный замок с дистанционным управлением, регулировку передних ремней безопасности по высоте, уплотнители по низу дверей, пластиковую облицовку порогов. Более того, если захочется управлять замками дистанционно и поставить стороннюю охранную систему, просто так вы этого не сделаете, потому что полный набор концевиков дверей тоже есть где? Правильно, только в топовой версии. Для остальных извольте докупить все, кроме водительского. Иначе говоря, формату «сел-поехал» теперь соответствует только самая дорогая модификация.

В-третьих, дизайн. Конечно, обновлённое семейство весьма симпатично, да и к освежённой корме седана меньше претензий. Но многих расстраивает то, что ВАЗ лишается самобытности моделей.

В целом, рестайлинг семейства «Лада Гранта», определённо, удался. Машины приятны на вид, соответствуют корпоративному дизайну, приобрели полезные доработки. Отмеченные минусы особо не мешали продажам «Гранты», а теперь, с подмогой в виде ещё двух типов кузова, она наверняка надолго захватит первое место на российском рынке. Тем более цены на автомобили выросли несильно, а на некоторые версии даже снизились.

ГОТОВЫЕ АВТОЭМАЛИ LADA

Код краски Образец цвета Название краски Цвет В продаже
102 Абрикос Серебристо-светло оранжевый Купить
602 Авантюрин Серебристо-чёрный Купить
204 Айсберг Белая двухслойная Купить
243 Акапулько Ярко-жёлтый Купить
460 Аквамарин Серебристый сине-зелёный Купить
503 Аккорд Серебристо-коричневый Купить
309 Аллигатор Оливково-зелёный Купить
1018 Алмазное серебро (ИЖ) Серебристый Купить
205 Альпийский снег Белый металлик Купить
660 Альтаир Серебристый светло-серый Купить
355 Амазонка Ярко-зелёный Купить
145 Аметист Серебристый фиолетовый Купить
371 Амулет Серебристо-тёмно-зелёный Купить
425 Андриатика Голубой Купить
125 Антарес Тёмно-вишнёвый Купить
277 Антилопа Серебристо-бежевый Купить
286 Апатия Серебристый оранжевый Купить
305 Аспарагус Серебристо-зелёный Купить
490 Астероид Тёмно-сине-зелёный Купить
440 Атлантика Светло-синий Купить
1158 Аустер (GM) Светло-серый Купить
421 Афалина Серебристо-зелёно-голубой Купить
218 Аэлита Бежевый Купить
645 Базальт Серо-чёрный Купить
107 Баклажан Тёмно-фиолетовый Купить
420 Балтика Тёмно-сине-зелёный Купить
353 Бальзам Зелёный Купить
273 Бархан Бежевый Купить
235 Бежевый Бежевый Купить
240 Белое облако Белый Купить
201 Белый Белый Купить
302 Бергамот Серебристо-зелёный Купить
633 Борнео Серебристо-тёмно серый Купить
451 Боровница Серебристо-серо-синий Купить
480 Бриз Зелёно-голубой Купить
262 Бронзовый век Бежево-коричневый Купить
117 Бургундия Красный металлик Купить
388 Вавилон Металлик серо-бежевый Купить
464 Валентина Серо-фиолетовый Купить
310 Валюта Серо-зелёный Купить
191 Венера Тёмно-красный Купить
655 Викинг Тёмно-серый Купить
129 Виктория Серебристый ярко-красный Купить
132 Вишнёвый сад Тёмно-серебристо-красный Купить
127 Вишня Тёмно-бордовый Купить
313 Водолей Серо-зелёный Купить
488 Галактика Тёмно-фиолетовый Купить
423 Гейзер Серо-голубой Купить
481 Голубой Голубой Купить
180 Гранат Тёмно-бордовый Купить
682 Гранта Серо-синий Купить
150 Дефиле Серебристо-серо-коричневый Купить
285 Джем Оранжево-коричневый Купить
424 Дипломат Синий Купить
502 Дыня Серебристо-жёлтый Купить
321 Дюшес Серебристо-молочно-зелёный Купить
203 Жасмин Бело-жёлтый Купить
200 Жёлтый-такси Ярко-жёлтый Купить
230 Жемчуг Серебристо-бело-молочный Купить
627 Жимолость Серо-синий Купить
307 Защитный Зелёный Купить
257 Звёздная Пыль Бежево-сиреневый Купить
307 Зелёный сад Тёмно-зелёный Купить
963 Зелёный Зелёный Купить
1012 Зелёный Авокадо (ИЖ) Тёмно-зелёный Купить
1901 Золотая звезда (GM) Бежево-золотистый Купить
331 Золотой лист Золотистый тёмно-зелёный Купить
245 Золотая Нива Серебристо-жёлто-зелёный Купить
109 Золотисто-бежевый (ИЖ) Золотисто-бежевый Купить
347 Золото Инков Золотистый тёмно-зелёный Купить
311 Игуана Серебристо-ярко-зелёный Купить
515 Изабелла Тёмно-филетовый Купить
385 Изумруд Серебристо-зелёный Купить
441 Индиго Тёмно-синий Купить
406 Ирис Фиолетовый Купить
128 Искра Красный Купить
113 Каберне Тёмно-вишнёвый Купить
358 Кайман Тёмно-зелёный Купить
104 Калина Ярко-красный Купить
190 Калифорнийский Мак Золотисто-красный Купить
453 Капри Тёмно-сине-зелёный Купить
212 Капучино Светлый серо-бежевый Купить
101 Кардинал Ярко-красный Купить
118 Кармен Красный Купить
630 Кварц Тёмно-серый Купить
352 Кедр Серо-зелёный Купить
381 Кентавр Тёмно-зелёный Купить
322 Колумбийская зелень Золотисто-оливковый Купить
116 Коралл Серебристый тёмно-красный Купить
790 Кориандр Золотисто-коричневый Купить
798 Корица Коричневый Купить
370 Корсика Серебристый болотно-зелёный Купить
665 Космос Чёрный Купить
1017 Красный перец (ИЖ) Серебристо-вишнёвый Купить
1013 Красный Порту (ИЖ) Вишнёвый Купить
281 Кристалл Светло-серый Купить
171 Кубок Красный Купить
435 Ла-манш Серебристо-фиолетовый Купить
675 Лаванда Серебристо-коричневый Купить
487 Лагуна Серебристо-синий Купить
411 Ладога Серебристо-голубой Купить
445 Лазурит Фиолетово-синий Купить
498 Лазурно-синий Серебристый тёмно-синий Купить
489 Лазурь Синий Купить
560 Ламинария Зелёный Купить
221 Ледниковый Белый Купить
413 Ледяной Голубой Купить
495 Лунный Свет Светло-голубой Купить
410 Магеллан Тёмно-синий Купить
133 Магия Серебристо-ярко-фиолетовый Купить
119 Магма Оранжевый Купить
120 Майя Серебристый тёмно-бордовый Купить
121 Мальборо Красный металлик Купить
428 Медео Голубой Купить
234 Медовый Желто-золотой Купить

Как узнать цвет краски автомобиля!?

Код ВАЗ Наименование Пример. вид Описание
102 Абрикос   серебристо-светло оранжевый
602 Авантюрин   Серебристо-черный
425 Адриатика   Светло-синий
204 Айсберг   Белая-двухслойная
105 Акапулько   Ярко-жёлтый
460 Аквамарин   Лазурно-серый
460 Аквамарин люкс   Лазурно-серый
503 Аккорд   Серебристо-коричневый
1018 Алмазное серебро   (ИЖ) Серебристый
660 Альтаир   Cеребристый светло-серый
145 Аметист   Серебристо-фиолетовый
371 Амулет   Серебристо-темно-зеленый
425 Андриатика   Голубой
125 Антарес   Темно-вишневый
б/к Антика   Светло-золотистый
277 Антилопа   Серебристо-розовый металлик
277 Антилопа люкс   Серебристо-жёлтый металлик
286 Апатия   Серебристо-оранжевый
305 Аспарагус   Перламутр.-светло-зелёный
490 Астеройд   Темно-сине-зеленый
440 Атлантика   Светло-синий
1158 Аустер   (GM) светло-серый
421 Афалина   Серебристо-зелено-голубой
218 Аэлита   Бледно-жёлтый
107 Баклажан   Темно-фиолетовый
420 Балтика   Темно-сине-зеленый
353 Бальзам   Зелёный
645 Бальзат   Серо-чёрный
393 Бамбук зелёный   Фисташковый
273 Бархан   Бежевый
592 Баролло   медный
235 Бежевый   Бежевый
240 Белое облако   белый
201 Белый   белый
302 Бергамот   Серебристо-Зелёный
451 Боровница   Серебристо-серо-синий
480 Бриз   зелено-голубой
262 Бронзовый век   Бежево-коричневый
464 Валентина   Серо-фиолетовый
310 Валюта   Серо-зелёный
655 Викинг   Темно-серый
129 Виктория   Серебристо-ярко-красный
127 Вишня   Темно-бордовый
132 Вишнёвый сад   Темно-серебристо-красный
313 Водолей   Серо-зелёный
488 Галактика   Темно-фиолетовый
423 Гейзер   Сего-голубой
481 Голубой   голубой
180 Гранат   Темно-бордовый
682 Гранта   Тёмно-лазурный
903 Дельфин   Тёмно-серый
150 Дефиле   Серебристо-серо-коричневый
285 Джем   Оранжево-коричневый
502 Дыня   Серебристо-желтый
321 Дюшес   Серебристо-молочно-зелёный
203 Жасмин   бело-жёлтый
1035 Жёлтая   Жёлтая
230 Жемчуг   Серебристо-бело-молочный
627 Жимолость   Тёмно-серая
307 Защитный   Зелёный
257 Звёздная пыль   Бежево-сиреневый
307 Зелёный сад   Тёмно-зелёный
963 Зелёный   Зелёный
1012 Зелёный авокадо   (ИЖ) Тёмно-зелёный
245 Золотая нива   серебристо-желто-зеленый
331 Золотой лист   золотистый темно-зеленый
347 Золото Инков   золотистый темно-зеленый
901 Золотая звезда   (GM) бежево-золотистый
109 Золотисто-бежевый   (ИЖ) Золотисто-бежевый
311 Игуана   Серебристо-ярко-зеленый
515 Изабелла   Темно-филетовый
385 Изумруд   Серебристо-зеленый
441 Индиго   Тёмно-синий
406 Ирис   Фиолетовый
128 Искра   Красный
358 Кайман   Тёмно-зелёный
104 Калина   Ярко-красный
450 Калипсо   Синий
190 Калифорнийский мак   Золотисто-красный
453 Капри   Темно-сине-зеленый
212 Капучино   Светло-серо-бежевый
101 Кардинал   Ярко-красный
118 Кармен   Красный
630 Кварц   Темно-серый
352 Кедр   Серо-зелёный
381 Кентавр   Темно-зеленый
322 Колумбийская зелень   Золотисто-оливковый
116 Коралл   серебристый темно-красный
798 Корица   коричневый
370 Корсика   серебристый болотно-зеленый
665 Космос   черный
1017 Красный перец   (ИЖ) серебристо-вишневый
1013 Красный порту   (ИЖ) вишневый
281 Кристалл   Светло-серый
675 Лаванда   Серебристо-коричневый
487 Лагуна   Серебристо-синий
805 Ладен   Серебристо-серо-зелёный
411 Ладога   Серебристо-голубой
445 Лазурит   Фиолетово-синий
498 Лазурно-синий   Серебристо-тёмно-синий
435 Ла-Манш   Серебристо-фиолетовый
221 Ледниковый   Белый
413 Ледяной   Светлое серебро
495 Лунный свет   Светло-голубой
410 Магеллан   Тёмно-синий
133 Магия   Серебристо-ярко-фиолетовый
120 Майя   Серебристо-светло-бордовый
428 Медео   Голубой
234 Медовый   Желто-золотой
317 Меридиан   зеленый
217 Миндаль   Серебристо-бежево-розовый
280 Мираж   Серебристый-желто-зеленый
606 Млечный путь   Серебристо-серо-графитовый
626 Мокрый асфальт   Серебристо-стальной
403 Монте карло   Ярко-синий
325 Морская пучина   Тёмно-зелёный
458 Мулен руж   Ярко-фиолетовый
377 Мурена   Сине-зеленый
426 Мускари   Тёмно-фиолетовый
620 Мускат   Серебристо-серо-золотистый
223 Нарцисс   Жёртый
507 Наутилус   Тёмно-синий
239 Невада   Серебристо-серо-коричневый
628 Нептун   Серебристо-темно-серо-синий
368 Несси   Тёмно-зелёный
270 Нефертити   Серебристый-бежевый
383 Ниагара   Серебристо-серо-голубоватый
449 Океан   Темно-синий
345 Оливин   Золотисто-зелёный
340 Оливковый   Жёлто-зелёный
521 Олимпик   Ярко-синий
419 Опал   Серебристо-голубоватый
643 Орхидея   Серебристо-бежевый
308 Осока   Зелено-голубой
172 Паннакота   Светло-золотистый
387 Папирус   Серебристо-серо-коричневый
152 Паприка   Серебристо-красно-оранжевый
429 Персей   Тёмно-синий-металлик
404 Петергоф   Серо-зелёный
795 Пиран   Красно-коричневый
691 Платина   Платиновый
615 Полюс мира   Серо-коричневый
192 Портвейн   Тёмно-вишнёвый
902 Посейдон   Темно-синий
222 Премьер   Ярко-жёлтый
605 Престиж   Серебристо-тёмно-синий
107 Престиж блю   синий с голубоватым оттенком
279 Приз   Серебристо-бежевый
448 Рапсодия   Серебристо-ярко-синий
412 Регата   Серебристо-темно-синий
121 Реклама   Ярко-красный
499 Ривьера   Сине-фиолетовый
610 Рислинг   Серебристо-бледно-серый
391 Робин Гуд   Чёрный с зелёными крапинами
182 Романс   Тёмно красный
904 Рубин   Красный
442 Садко   Тёмно-голубой
670 Сандал   Бежево-красный
446 Сапфир   Серебристый сине-фиолетовый
215 Сафари   Светло-бежевый
301 Серебряная ива   Серебристый-зеленовато-серый
242 Серый бальзат   Серо-бежевый
447 Синяя полночь   Тёмно-фиолетовый
483 Сириус   Серо-синий
478 Слива   Серебристо-ярко-синий
690 Снежная королева   Серебристый
650 Совиньон   Серебристо-серо-зелёный
791 Солярис   Тёмно-коричневый
360 Сочи   Серебристо-серо-зеленоватый
399 Табак   серебристый коричнево-зеленый
206 Талая вода   Светло-серый
631 Тополиный пух   Светло-серый
906 Торнадо   Красный
100 Триумф   Серебристо-красный
708 Туманное утро   Серо-синий с зелёным отливом
115 Феерия   (GM) ярко-красный
416 Фея   Серебристо-сиреневый
105 Франкония   Темно-вишнево-малиновый
430 Фрегат   Цвет морской волны
363 Цунами   Темно-бирюзовый
408 Чароит   Серебристый темно-фиолетовый
162 Черешня   Тёмно-алый
482 Черника   Темно-синий
601 Чёрный   Чёрный
762 Чёрная пантера   Чёрный
513 Чёрный жемчуг   Серебристо-светло-коричневый
651 Чёрный трюфель   Чёрный
635 Чёрный шоколад   Темно-коричнево-чёрный
415 Электрон   Тёмно-серый
290 Южный крест   Серо-бежевый
473 Юпитер   Серебристо-голубоватый
202 Ярко-белый   Ярко-белый
140 Яшма   Темно-вишневый

Лада гранта серебристо темно серый

При выборе автомобиля большую роль играет его цвет, и очень не просто выбрать окрас своего будущего друга по образцам, представленным в автосалоне. Именно для того, чтобы оценить Лада Гранта в определенном цвете и создана эта страница. Здесь представлены все возможные расцветки, сфотографированные реальными владельцами с разных ракурсов и при различном освещении.

Большинство автомобилистов даже не предполагают, какие бывают цвета Лады Гранты Лифтбек для окрашивания кузова. Производители предлагают более 10 оттенков, мы же рассмотрим наиболее популярные и трендовые.

Общее описание цветов. Какие бывают

Цвета новой Лады Гранты Лифтбек:

Помимо указанных цветов кузова Лады Гранты Лифтбек, различают также следующие оттенки: «Платина», «Ледниковый», «Ледяной», «Магма», «Черная жемчужина».

Сердолик. Эмоциональный цвет

Краткое описание

Группа: Красная Гранта Лифтбек.

Достоинства
  • яркость;
  • насыщенность;
  • игра тонов под лучами солнца.

Недостатки
  • маркость;
  • очень заметны повреждения лакокрасочного покрытия, дефекты кузовных элементов.
Отзывы о цвете

Василий: выбирал между сердоликом и ледниковым, оба хороши и прекрасны. Несмотря на маркость, купил в цвете сердолик.

Белое облако. Самый популярный, классический цвет

Краткое описание цвета «Белое облако» Гранты Лифтбек

Тип: автоэмаль, солид.

Способ нанесения: одно- и двухслойный.

Достоинства
  • стойкость к лучам ультрафиолета;
  • сохранение естественного цвета на протяжении длительного периода.

Недостатки
  • маркость;
  • отображение изъянов, деформаций кузова.
Отзывы о цвете

Константин: на момент приобретения машины в салоне расцветки «Белое облако» не оказалось, другой оттенок не захотел. Охотно согласился подождать две недели, пока доставят новую партию.

Голубая планета. Энергия скорости

Краткое описание цвета «Голубая планета» Гранты Лифтбек

Тип: автоэмаль, перламутр, металлик.

Способ нанесения: однослойный.

Достоинства
  • переливается под лучами солнца;
  • длительное сохранение естественного цвета.

Недостатки
  • недостаточная видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Владимир: машина в таком оттенке смотрится просто шикарно. Пожалуй, одна из самых лучших цветовых гамм.

Рислинг. Серебристая эмаль

Краткое описание

Тип: автоэмаль, перламутр.

Цветовая группа: металлик.

Достоинства
  • естественность оттенка;
  • придание объема автомобилю.

Недостатки
  • ограниченная видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Александр: смотрится модель очень даже хорошо, особенно под лучами солнца, игра оттенков поразительная.

Борнео. Глубина морской волны

Краткое описание

Тип: автоэмаль, перламутр, солид, металлик.

Достоинства
  • естественность оттенка;
  • длительное сохранение глубины оттенка.

Недостатки
  • ограниченная видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Владислав: долго искал модель именно в этом окрасе. Лада просто великолепна. Мои рекомендации автомобилистам.

Пантера. Строгий цвет

Краткое описание

Тип: автоэмаль, солид, акрил.

Цветовая группа: черный.

Достоинства
  • сохранение глубины оттенка на протяжении длительного времени;
  • тонкость и выразительность боковых линий кузова.

Недостатки
  • видимость машины в темное время суток ограничена.
Отзывы о цвете

Сергей: строгий цвет Гранта Лифтбек «к лицу», мне он очень нравится.Идеальное сочетание с моим костюмом.

Кориандр. Практичный и удивительно нарядный

Лада Гранта Лифтбек — цвет «Кориандр»

Тип: автоэмаль, металлик.

Цветовая группа: коричневый.

Достоинства
  • контрастность под лучами ультрафиолета;
  • глубина оттенка.

Недостатки
  • подчеркивание изъянов, дефектов кузова, легкое повреждения лакокрасочного покрытия.
Отзывы о цвете

Виктор: до покупки Лифтбек была Приора с такой цветовой гаммой. С целью сохранения естественности оттенка планирую покрыть несколькими слоями лака.

Angkor (коричневый)

Описание цвета Гранта Лифтбек «Оранжевы»

Тип: металлик, акрил.

Цветовая группа: зеленый, коричневый.

Достоинства
  • хорошо скрывает неровности, дефекты на кузове;
  • длительный естественный оттенок.

Недостатки
  • ограничена видимость машины в темное время суток.
Отзывы о цвете

Кирилл: долго искал модель Гранты с оттенком Angkor, так как на нем не видны мелкие сколы, царапины, повреждение лакокрасочного покрытия. Как бы хорошо не водил, а скол дело случая.

Вывод

Лидеры рейтинга: «Белое облако» и «Рислинг». Именно эти оттенки считают безопасными, с наименьшим показателем аварийности на дороге.

Тон Гранты Лифтбек «Черная жемчужина» устарел, исключен из общего перечня. Хотя в начале 2015 года был довольно популярный. Предзаказ в салонах был на полгода вперед.

Оттенок «Магма» Гранты Лифтбек часто путают с «Кориандром», так как они имеют сильное сходство, особенно на дальнем расстоянии. В список не вошел цвет «Платина» Гранта Лифтбек, так как он вышел из моды.

Сегодня объявили цены и дату начала продаж обновленной Lada Granta. Вместе с этим рассекретили цветовую гамму новинки. Палитра новой Гранты состоит из семи цветов, среди которых есть новый красный окрас «Сердолик», пришедший на смену оранжевого перламутрового «Апельсин».

  • Красный «Сердолик» (код 195) — эмоциональный цвет, влюбляющий в себя, и выделяющий автомобиль в потоке.
  • Белый «Белое облако» (код 240) — самый популярный, классический цвет, который органично сочетается с хромированными и черными элементами кузова.
  • Ярко-синий «Голубая планета» (код 418) — отлично подходит любому типу кузова. В этом оттенке – и энергия скорости, и уверенность надежного авто.
  • Серебристый «Рислинг» (код 610) — серебристая эмаль, символизирующая металл, из которого сделан автомобиль – сталь и алюминий.
  • Серебристо-темно-серый «Борнео» (код 633) — глубина морской волны. Далекое марево дождливого неба… В этом цвете – воплощение стихии, сильной, но спокойной.
  • Черный «Пантера» (код 672) — строгий цвет, выигрывающий и от гармонии с линиями кузова, и от контраста со светотехникой и серебристыми элементами.
  • Золотисто-коричневый «Кориандр» (код 790) — практичный и удивительно нарядный. Цвет, способный добавить яркости и вкуса… как и восточная пряность, в честь которой он назван.

Ключевые слова: цвета лада гранта

Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter..

Похожие материалы
Информация

Посетители, находящиеся в группе Гости, не могут оставлять комментарии к данной публикации.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Датчик с генетическим кодированием на основе

FRET для мониторинга серебра Ионы

Абстракт

Серебро обычно используется в перевязке ран, фотографии, здоровье средства ухода, лаборатории, аптека, биомедицинские устройства и несколько промышленные цели. Ионы серебра (Ag + ) являются более токсичными загрязнителями. широко разбросаны в открытой среде естественными процессами и рассредоточены в почве, воздухе и водоемах. Ag + связывается с металлотионеин, макроглобулины и альбумины, которые могут изменение различных ферментативных метаболических путей.Чтобы проанализировать поглощение и метаболизм ионов серебра in vitro, а также в клетках, создан ряд высокоаффинных наносенсоров на основе флуоресценции. с использованием периплазматического белка CusF , входящего в состав CusCFBA комплекс оттока, который участвует в обеспечении устойчивости к ионы меди и серебра в Escherichia coli . Этот наносенсор был построен путем объединения двух флуоресцентных белки (донор и акцептор) на N- и C-концах связывающего серебро белка ( CusF ) соответственно.SenSil (WT) с константа связывания ( K d ) 5,171 мкМ оказался более эффективным, чем его мутантные варианты (h46D и F71W). Этот наносенсор позволяет контролировать уровень ионов серебра в режиме реального времени у прокариот и эукариот без нарушения работы клеток или тканей.

1. Введение

Разное металлы оказывают прямое или косвенное воздействие на живые организмы. Они необходимы как важное питательное вещество в очень низких концентрациях. для различных физиологических и биохимических функций в организме.Высокая доза этих тяжелых металлов может быть вредной и вызывать побочные эффекты на здоровье человека. Токсичность металлов - серьезная угроза для окружающей среды а также для живых организмов. Различные металлы, такие как свинец, мышьяк, никель, серебро и медь вызывают бред и могут вызывать хронические заболевания. токсичность для человека. 1 Благодаря универсальности использование серебра в биомедицинских приложениях, токсичность серебра стала серьезная проблема. Серебро - белый блестящий переходный металл, имеющий незначительная токсичность для человека. 2 За счет нескольких антропогенной деятельности, свободные ионы серебра присутствуют в организме человека тело в незначительных концентрациях из-за вдыхания загрязнителей окружающей среды но не имеют следов металлов в организме человека. Преднамеренное использование серебра в медицинских устройствах, стоматологических, антибактериальных и противогрибковых средства, косметика, средства по уходу за ранами и ожогами увеличивают потенциальное воздействие ионов серебра. 3 В последнее время, использование серебра вызвало опасения по поводу аспектов безопасности и потенциала риски воздействия биологически активных ионов Ag + в окружающая среда и человеческое тело. 4 В настоящее время, серебро в сочетании с сульфадиазином обеспечивает более широкий спектр противомикробных агенты. 10 Серебристый металлик и неорганический соединения серебра ионизируются в водной среде и высвобождаются биологически. активные ионы Ag + . Эти активные ионы Ag + конкурируют с кинетикой гидратов воды и легко связываются и осаждаются с органическими и неорганическими катионами, которые увеличивают острую токсичность серебра. Текущие исследования показывают, что менее 10% токсичности серебра происходит при проглатывании человеком, 5 , но это сильно варьируется в зависимости от возраста, состояния здоровья, состояния питания и диетический состав.Лица, уязвимые для длительного воздействия серебра подвержены аллергическим реакциям, раздражению дыхательных путей тракта и сине-серого окрашивания кожи (аргирия). Проведенных исследований у пациентов с тяжелым аргирием указывают на то, что количество поглощенного серебра человеческим телом низка, но 18% ее остается в теле, что вызывает изменение цвета тканей. 6

В настоящее время опасность отравления при приеме серебра с пищей и питьем вода низкая. Но прямое вдыхание паров / пыли серебра, лекарственного использование и профессиональное воздействие вызывают абсорбцию ионов Ag + через желудочно-кишечный тракт и эти частицы серебра накапливаются в костях, почках, печени и тканях кожи. 7 Благодаря антимикробным свойствам серебро также используется в качестве серебряно-медных фильтров в процессе очистки воды вместо хлора в больницах и ожоговых поликлиниках. Промышленные рабочие у которых длительное воздействие свободных ионов серебра показали повышенное концентрации в волосах, крови, моче и кале. 8,9 Из-за их взаимодействия с различными биологическими молекулами, межклеточные белки и инактивация сульфгидрильной группы ферментов, Ионы Ag + могут оказывать цитопатогенное действие на клетки и ткани, такие как фибробласты десен человека, кератиноциты и эндотелиальные клетки. 10,11 Клинические и экспериментальные исследования указывают на то, что что длительное воздействие ионов металлического серебра или ионизируемого серебра соединения могут вызывать токсичность для костей, почек, канцерогенность, бесплодие и нарушение роста плода. 12 Традиционные методы количественного определения ионов Ag + включают атомно-абсорбционная спектрометрия, 13 индуктивно масс-спектрометрия со связанной плазмой, 14 и ионоселективный электрод. 15 Однако дорогое оборудование, инвазивный характер, меньшая избирательность и чувствительность ограничивает применение этих традиционных методов. 16,17 Таким образом, создавая быстрый и простой альтернативный метод обнаружения ионов Ag + в реальном времени очень желательно. Диапазон биосенсоры на основе флуоресценции были разработаны для мониторинга серебра ионы в реальных образцах. A C – Ag + –C на основе структуры флуоресцентный биосенсор был разработан Li et al. (2019) 18 для обнаружения ионов Ag + в реальные образцы озерной воды и сыворотки крови человека. Они использовали структуру C – Ag + –C с усилением сигнала с помощью Exo III-ассистируемый процесс двойной рециркуляции для синтеза биосенсора.Устимова и др. (2018) 19 разработал Förster хемосенсор на основе резонансного переноса энергии (FRET) для логометрических обнаружение ионов металлов, включая ионы серебра. Этот датчик имеет корону с бисстириловым красителем, в котором оксокраун-эфир (донор) переносит энергия азадитиакраун эфира (акцептор). Хотя такие датчики для измерения ионов серебра есть на практике, но аналитические проблемы стандартизации, воспроизводимости, пробоподготовки и анализа сделать их более громоздкими в использовании.Органические красители, используемые в биосенсорах уязвимы для метаболической деградации. Из-за этих деградаций у них наименьшая фотостабильность. Эти красители снизили квантовую доходность и показал небольшой сдвиг Стокса. 20 Вкл. напротив, мы использовали различные мутантные варианты зеленого флуоресцентного белок в качестве замены этих токсичных красителей, чтобы ограничить их недостатки. Генетически кодируемый наносенсор на основе флуоресценции является эффективным устройство для количественного определения уровня метаболитов у прокариот и эукариоты неинвазивно.Однако генетически закодированный FRET датчик не был разработан для мониторинга ионов серебра в клетке. уровень в реальном времени. Поэтому мы создали линейку флуоресцентных ламп. генетически кодируемые биосенсоры для количественного определения ионов Ag + в клетках. Наше исследование показывает, что этот аналитический метод имеет большой потенциал и возможность контролировать поток ионов Ag + в настоящее время.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Генерация Наносенсора

CusF была используется для создания генетически закодированного FRET на основе наносенсор для контроля ионов серебра.Для разработки наносенсоров FRET, Использовали флуорофоры ECFP (донор) и Венеры (акцептор), которые являются самая многообещающая флуоресцентная пара среди различных вариантов флуоресцентные белки. 21 Сигнальные пептиды были удалены, нуклеотидная последовательность гена Cus F была введена между ECFP (донор) и Венерой (акцептор) последовательности генов для конструирования SenSil, и эта последовательность была далее перемещаются в различные векторы экспрессии. Линейная диаграмма показывает положение сайтов рестрикции в конструкции наносенсора (А, Б).В близость изменения в спектрах излучения обоих флуорофорных белков в связанном и несвязанном состояниях лиганда показаны на C. Эффективность FRET во многом зависит от ориентация диполя, расстояние близости между донором и акцептором флуорофоры (10–100 Å) и интенсивности излучения перекрываются между донорными и акцепторными флуорофорными белками.

(A) Строительство Генетически кодируемый датчик на основе FRET для ионы серебра. (B) Кристаллическая структура CusF. (C) Энергия иллюстрация передачи при отсутствии (слева) и наличии (справа) лиганд Ag + .

2.2. Экспрессия и очистка сенсора Белок

Сенсорную плазмиду трансформировали и экспрессировали. в Escherichia coli ( E. coli ) BL21 (штамм Codon Plus). Химерный белок (SenSil) был успешно очищен Ni-NTA агарозой на основе His-tag. смоляной аффинной хроматографии и подтверждено SDS-PAGE. Это очищенное белок был использован для исследования белка наносенсора in vitro.

2.3. Спектры излучения SenSil

спектральный анализ показал сдвиг в спектре излучения флуоресцентных белки в отсутствие и в присутствии ионов серебра.В отсутствие серебра не происходит изменений в спектре излучения. Сдвиг в спектр наблюдали при добавлении различных концентраций (1 и 5 мкМ) ионов серебра (). Спектральный профиль излучения ECFP (донор) и Венера (акцептор) показывает соответствующее изменение интенсивности излучения с добавлением ионов серебра. При увеличении концентрации ионов серебра основные конформационные изменения происходят в белке CusF что приближает два флуорофора достаточно близко, чтобы передать максимум энергия от ECFP до Венеры.Таким образом, интенсивность излучения ЭКФП снижается. и впоследствии интенсивность излучения Венеры увеличивается. 22 Связывание ионов серебра с периплазматическим связывающий белок (PBP) вносит конформационные изменения, которые привели к чтобы пары флуорофоров находились в непосредственной близости <10 нм, и, в конечном итоге, выполняет требования FRET.

Спектральный анализ наносенсора на основе FRET. Спектр излучения регистрировали после возбуждения сенсорного белка при 420 нм и регистрация излучения в диапазоне от 450 до 600 нм как в отсутствие и наличие ионов серебра.

2.4. Проверка стабильности pH SenSil

Очищенный наносенсорный белок был охарактеризован in vitro в различных буферные системы при различных значениях pH от 5,0 до 8,0. Среди использование различных буферных систем, построенный наносенсор показал максимальная стабильность в 3- N -морфолинопропане буфер сульфоновой кислоты (MOPS), поскольку наблюдались наименьшие изменения в соотношении с этим буфером (A). Для дальнейшего анализа сенсорный белок разводили в буфер MOPS.Чтобы оценить pH-стабильность SenSil, FRET соотношение регистрировали в физиологическом диапазоне pH (5,0–8,0). Добавление 1 мкМ иона Ag + к очищенному белку привело к существенным изменениям в соотношении FRET вплоть до pH 6,0, что позволяет предположить чувствительность сенсорного белка в кислотном диапазоне, при этом нет значительное изменение произошло в соотношении FRET выше pH 7,0, подтверждая стабильность наносенсора в щелочном диапазоне pH (B). Стабильность генетически кодируемого наносенсора в цитозольной и внутриклеточной pH делает его более совместимым для мониторинга ионов серебра в живых системы.

Анализ стабильности буфера SenSil. (A) Коэффициент интенсивности выбросов регистрировали в MOPS, фосфатно-солевом буфере (PBS) и Tris – Cl буфер с различными диапазонами значений pH. Датчик оказался стабильна в 20 мМ буфере MOPS, так как было отмечено наименьшее изменение соотношения FRET. наблюдается с этим буфером. (B) Стабильность наносенсора была проанализирована. в буфере MOPS в физиологическом диапазоне pH (от 5,0 до 8,0) в отсутствие и наличие 1 мкМ ионов серебра. Данные - это средства трех независимых повторяется ( n = 3).Вертикальные полосы обозначают стандарт ошибка.

2.5. Специфичность и влияние ионов металлов

Анализ специфичности in vitro SenSil проводился с использованием микропланшета. читатель, взяв серебро, марганец, железо, медь и никель в разные концентрации 100, 200 и 500 нМ, а также 1, 5 и 10 мкМ каждая. Значительное изменение соотношения FRET наблюдалось при добавлении концентрации ионов серебра 10 мкМ по сравнению с контролем (без серебра) (A). Влияние биологических ионов металлов (Na + , K + , Ca 2+ и Mg 2+ ) на специфичность белок наносенсора также наблюдали путем регистрации соотношения FRET (540/485 нм) после смешивания 180 мкл разбавленного белка с 20 мкл физиологической концентрации этих биологических ионов металлов.Нет значительные изменения наблюдались в соотношении FRET с этими металлами. ионы, что показывает эффективность SenSil по отношению к ионам серебра (B). Наносенсоры на основе FRET откройте окно для PBP. Эти наносенсоры являются наиболее подходящими кандидаты на домен, чувствительный к лиганду, которые связываются со специфическими подложки. 23 Шарнирно-изгибное движение эти белки ответственны за основные конформационные изменения. Эти шарнирные движения трансформируются в ратиометрические изменения излучения интенсивности двух флуорофоров.Другие молекулы не показали любое значительное изменение отношения FRET, предполагающее, что датчик специфичен для ионов серебра.

Анализ специфичности SenSil in vitro. (А) Специфика сенсорный белок был подтвержден путем измерения отношения FRET в присутствии ионов различных металлов (Ag + , Mn 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ и Ni 2+ ). (B) Эффект существенного ионы металлов, такие как NaCl, KCl, CaCl 2 и MgCl 2 , на эффективность наносенсора, который не влияет на специфика SenSil.Данные представляют собой средства трех независимых реплик. ( n = 3). Вертикальные полосы указывают стандартную ошибку.

2.6. Кривая насыщенности и близость Варианты SenSil

Кривая насыщения SenSil была рассчитана путем проведения измерения FRET с концентрациями ионов серебра в диапазоне 0,1–9 мкМ. В ответ на ион Ag + a была получена сигмовидная кривая насыщения, которая первоначально представляет максимальное изменение отношения интенсивностей эмиссии с 0,678 до 1.068 до концентрации ионов Ag + 7 мкМ и далее насыщать при 7–9 мкМ (). Определен диапазон сродства вариантов наносенсора. путем расчета константы связывания ( K d ). Все показания были сняты в трех экземплярах с использованием считывающего устройства для микропланшетов. и SenSil связывается с ионом Ag + со сродством 5,171 мкМ. Для расширения физиологического диапазона SenSil, a набор вариантов сенсора был создан путем введения точечных мутаций с использованием сайт-направленного мутагенеза в связывающем мотиве белка.Два аффинных мутанта (h46D и F71W) были сформированы путем замены аминокислотные остатки. 24 Родство очищенный химерный сенсорный белок к различным концентрациям серебро определяли с помощью микропланшетного ридера. Данные показывают, что мутанты h46D и F71W имеют низкое сродство к серебру по сравнению с к сенсору дикого типа (WT) (Таблица 1). Расчетные значения K d вариантов h46D и F71W оказались 5,799 и 5,914 мкМ, соответственно. На основании значений константы сродства SenSil (WT) имеет наименьшее значение K d ; Таким образом, наносенсор WT был выбран и признан наиболее эффективным инструментом для исследования динамического потока ионов Ag + на клеточном уровне в как прокариоты, так и эукариоты.

In vitro лиганд-зависимая эмиссия FRET изменение WT и мутанта сенсоры в присутствии различных концентраций ионов серебра. Близость мутанты h46D и F71W были созданы и сравнены с сенсором WT. белок. Данные представляют собой средние значения трех независимых повторов ( n = 3). Вертикальные полосы указывают стандартную ошибку.

Таблица 1

Константы сродства привязки и динамическое Диапазон SenSil-WT и его варианты соответствия a

Название сенсора b последовательности K d (мкМ) (± SD d ) динамический диапазон c (мкМ)
Sensil дикий тип 5.171 (± 0,003) 1,679–7,198
Sensil-36 h46D 5,799 (± 0,001) 2,039–6,879
Sensil-71 F71W 5,914 (± 0,001) 2,232–7,249

2.7. Мониторинг SenSil в бактериях и дрожжах

Для определения функции SenSil в клеточной системе, сенсор экспрессировался в цитозоле бактериальных клеток. Подвеска из выраженных E.coli BL21 (DE3) бактериальные клетки тестировали на наличие и отсутствие ионов серебра. Накопление и измерение метаболитов также проводились ранее. с использованием генетически кодируемого сенсора на основе FRET у прокариот. 25 При добавлении 5 мкМ серебра изменяется в соотношении FRET происходят значительно. Никаких существенных изменений в Отношение FRET наблюдалось в отсутствие ионов серебра. Коэффициент FRET суспензии клеток отчетливо увеличивалось с серебром через 5 мин. и насыщение при 55 мин ().Бактериальные клетки, содержащие pRSET-ECFP_ CusF _Venus, выращивали для экспрессии сенсорного белка и получали изображения. это показало успешное применение наносенсора.

На основе ячеек анализ наносенсора. Изменения соотношения FRET в бактериальной клетки, содержащие SenSil, регистрировали в ответ на 5 мкМ серебра в зависимости от времени. Данные представляют собой средства трех независимых реплик. ( n = 3). Вертикальные полосы указывают стандартную ошибку.

Для визуализации живых клеток SenSil в реальном времени в дрожжевая клетка, конструкция трансформировался в Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) BY4742. Для экспрессии сенсорного белка в дрожжах клетки выращивали на синтетической питательной среде определенного (SD) в течение 3–5 дней в присутствии 2% сахарозы и 3% галактозы в качестве источника углерода и индуктор соответственно. Визуализация живых клеток S. cerevisiae / URA3 штамма BY4742 показала экспрессию SenSil в цитозоле клетки и большей части клетки оставшаяся неокрашенной указывает на большую площадь вакуоли. Дрожжевые клетки затем инкубировали с 5 мкМ Ag + и изменение соотношение интенсивностей излучения контролировали в течение 10 мин с помощью LAS-AF. программное обеспечение конфокального микроскопа.Экспрессирующие дрожжевые клетки показали изменение интенсивности флуоресценции ECFP и Венеры (А). Ратиометрические изображения дрожжевой клетки также были получены при записи графика, указывает изменения в ячейке (B). Флуоресцентный наносенсор ответил к изменяющемуся уровню серебра, что позволяет характеризовать поглощения серебра с субклеточным разрешением. Ранее Fehr et al. 26 успешно охарактеризовали живые визуализация клеток с использованием наносенсоров на основе FRET для отслеживания потока мальтозы дрожжевые клетки (FLIPmal).

Количественная оценка динамического изменения скорости потока в реальном времени поглощения Ag + дрожжевыми клетками. (A) График показывает изменение в соотношение FRET в цитозоле дрожжевых клеток в присутствии 5 мкМ Ag + вместе с ратиометрическими изменениями в одном клетка. Изменение соотношения FRET указывает на импорт и привязку Ионы Ag + с SenSil. (B) Конфокальные изображения, показывающие цитозольный экспрессия SenSil в присутствии ионов Ag + в дрожжах ( С.cerevisiae ).

2.8. Мониторинг SenSil в клетках млекопитающих

Клетки эмбриональной почки человека (HEK-293T) использовали в качестве экспериментальной эукариотическая система для характеристики серебряного наносенсора. SenSil временно трансфицировали в клетки млекопитающих HEK-293T и конфокальная визуализация клеток выполнялась через 2–3 дня. трансфекции для лучшей экспрессии сенсора с помощью Leica микроскоп, полученный в разных каналах (B). За потоком ионов серебра следили. неинвазивно в эукариотической системе.С добавлением серебра ионов, изменение отношения FRET не наблюдалось. Интенсивность излучения Венеры увеличился, а ECFP уменьшился в зависимости от времени. манера. Изменение отношения интенсивностей излучения регистрировалось в интервал 0–10 мин, который постоянно увеличивался с увеличением добавление 5 мкМ ионов серебра (А). Этот датчик имеет отличный потенциал для применяться для мониторинга ионов серебра в эукариотических организмах в режиме реального времени. клетки, не разрушая клетки. Ранее сообщалось что генетически закодированные наносенсоры на основе FRET обладают большой пропускной способностью для обнаружения и мониторинга метаболитов, таких как ионы металлов, в клетках и субклеточные компоненты клетки млекопитающего, как показано в случае внутриклеточные колебания вторичного мессенджера цАМФ. 27

Визуализация SenSil в клеточной линии HEK-293T в реальном времени. (А) НЕК-293Т клетки также трансфицировали SenSil и интенсивность эмиссии изменения коэффициентов зафиксированы за определенный период. График указывает изменение соотношения Венера / ECFP за 10 мин. (B) Конфокальные изображения, показывающие экспрессия SenSil в присутствии Ag + в HEK-293T клеточная линия. (C) Исследования жизнеспособности клеток ионов серебра на HEK-293T. Жизнеспособность клеток HEK-293T, обработанных увеличивающимися концентрациями ионов Ag + (0.01–20 мкМ) с использованием 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) анализ. Процент жизнеспособности клеток рассчитывали относительно к необработанным контрольным клеткам.

2.9. Цитотоксические исследования

Токсичность ионы серебра плохо документированы, но несколько недавних случаев цитотоксичности in vitro исследования показывают, что ионы Ag + обладают способностью реагировать с сульфгидрильными группами, другими белковыми остатками и ферментами, которые связаны с клеточными мембранами, что приводит к денатурации, структурным повреждение и дисфункция митохондрий. 28 Культивированные клетки, подвергшиеся воздействию ионов серебра, показали измененную форму клеток. и показали признаки окислительного стресса и повышенного перекисного окисления липидов. 29 Таким образом, цитотоксичность ионов серебра не может игнорировать. Чтобы определить цитотоксичность ионов серебра in vivo, исследования жизнеспособности клеток. Исследования клеточной токсичности были проводится в диапазоне концентраций серебра 0–20 мкМ ионы. Выяснилось, что обработка Ag + не показывает значительная токсичность для клеток HEK-293T в исследуемой концентрации диапазон для 24-часовой выдержки (C).Результат определения жизнеспособности клеток показал, что лечение серебра становится токсичным при более высоких концентрациях (> 10 мкМ), но в диапазоне обнаружения наносенсора нетоксичен для клеток.

4. Методы и методология

4.1. Проектирование кассеты Construct

A был подготовлен присоединением донорного флуорофора (ECFP) и акцептора флуорофор (Венера) в векторе pRSET-B (Invitrogen, США). Грунтовки содержащие сайты рестрикции Bam HI на 5 ' end и Kpn I сайтов на 3 'конце вместе с фланкирующие основания распознавающих последовательностей использовали для усиление ECFP.Аналогичная стратегия использовалась для амплификации Венеры с использованием Kpn I и Hind III сайты ферментов на 5'- и 3'-концах соответственно. Последовательность и кристаллическая структура белка CusF (связывающая серебро домен) были получены из Национального центра биотехнологии Информационная база данных (NCBI) и банк данных по белкам. Сигнальные пептиды из 23 аминокислот от N-конца белка, связывающего серебро были идентифицированы с помощью сервера Signal P4.1 (CBS, Дания).Последовательности гена CusF амплифицировали из геномной ДНК E. coli Dh20β с рестрикцией участков кпн я на обоих концах. Конструкция наносенсора был разработан путем вставки амплифицированного гена CusF между ECFP и Венерой и верность конструкции pRSET-B-ECFP_ CusF _Venus была подтверждена полноразмерным секвенированием (рисунок S1). Затем эти последовательности были перенесены к вектору pYES-DEST52 (Invitrogen, США) через шлюз клонирования технологии с использованием фермента LR клоназы II в соответствии с рекомендациями производителя инструкции. S. cerevisiae / штамм URA3 BY4742 был выбран в качестве эукариотического хозяина и трансформирован с помощью pYES-DEST-ECFP_ CusF _Venus последовательность. Штамм S. cerevisiae поддерживали на дрожжевом экстракте. пептон-декстроза (YEPD) агаровой среды и выращивание в жидкой среде YEPD при 30 ° C с аэрацией в шейкере. Конструкция была дальше клонировано в ограничении Bam HI и Hind III сайтов в эукариотическом векторе экспрессии pcDNA3.1 (-) (Invitrogen, USA) для экспрессии сенсорного белка в клетках HEK-293T.

4.2. Экспрессия и очистка сенсора Белок

Плазмида pRSET-B-ECFP_ CusF _Venus был трансформирован в кодон E. coli BL21 Плюс компетентные клетки методом теплового шока. Для выражения наносенсора, белковые клетки выращивали в Luria – Bertani (LB) среда при 20 ° C и 150 об / мин путем добавления 100 мкг / мл ампициллина. в течение 22 ч, пока ОП не достигнет 0,4–0,6. Клетки были дополнительно индуцированы на 0,5 мМ IPTG и позволяли расти еще 20 ч в темноте.После 20 ч клетки собирали с помощью охлаждаемой центрифуги (Thermo Scientific, США) при 4500 об / мин в течение 30 мин и осадок клеток ресуспендировали. в 20 мМ Трис-Cl (pH 7,8). Лизис клеток проводился с помощью ультразвука. (Sonics, США) 5–6 мин с паузами 15 с. Бесклеточный лизат был получен центрифугированием при 4500 об / мин в течение 20 мин. Супернатант переносили на смолу Ni-NTA (Qiagen, Германия) и выдерживали при 4 ° C на качалке в течение 1 ч для связывания His-tagged сенсорный белок к смоле.Сенсорный белок очищали с помощью His-связывания. аффинная хроматография (Qiagen, Германия). Промывка колонки была выполняется с использованием ледяного промывочного буфера (20 мМ Tris – Cl, pH 8,0, 10 мМ имидазол), и сенсорный белок элюировали элюцией буфер (20 мМ Tris – Cl, pH 7,8, 300 мМ имидазол). Очищенный белок был назван Sensor for Silver (SenSil) и хранился при 4 ° C. на ночь, чтобы обеспечить необходимое время для правильного складывания после очистки процесс.

4.3. Исследование SenSil

in vitro 4.3.1. Спектральный анализ излучения SenSil

Флуоресценция анализ спектра излучения очищенного сенсора белка осуществляли с помощью считывающего устройства для микропланшетов-монохроматора (Synergy h2, BioTek, США) с добавлением и без добавления ионов серебра. Возбуждение проводился при 420 нм, а интенсивность эмиссии флуоресценции был зарегистрирован между 460 и 600 нм.

4.3.2. Тестирование Стабильность pH SenSil

Кинетика наносенсора изначально проводился в различных буферные системы, то есть 20 мМ PBS, забуференный трис физиологический раствор (TBS) и MOPS с изменяющимся значением pH.Чувствительность сенсорного белка был протестирован с этими буферами в широком диапазоне значений pH. В выделенный сенсорный белок разводили в 20 раз, используя соответствующие буферы. В другом исследовании стабильность сенсорного белка была протестировано с буфером MOPS в диапазоне pH 5,0–8,0 с добавление серебра и отсутствие серебра. Логометрический изменение отслеживали с помощью считывающего устройства для микропланшетов с использованием возбуждения фильтр 420/20 нм и комплект эмиссионных фильтров для ECFP и Venus было отрегулировано до 485/20 и 540/20 нм соответственно.

4.3.3. Специфичность и действие других биологических Ионы металлов

Для определения специфичности SenSil, различные ионы металлов. Коэффициент FRET был записан после добавления 20 мкл металлов Cu 2+ , Ag + , Ni + , Mn 2+ и Fe 2+ в шести различных концентрациях, то есть 100, 200 и 500 нМ и 1, 5 и 10 мкМ. Потенциал влияние биологически значимых ионов металлов, таких как Ca 2+ , Mg 2+ , Na + и K + , на обнаружение также была исследована специфичность наносенсора.Изменение в Соотношение интенсивностей флуоресценции контролировали после добавления 1 мкМ ионы серебра.

4.3.4. Кривая насыщенности и Affinity Mutants

Проверено сродство наносенсора. измеряя FRET ответы на возрастающие концентрации Ag + , и константа сродства ( K d ) была рассчитана аппроксимируя кривую на изотерме привязки

, где S - насыщение, [ L ] - концентрация лиганда, r - концентрация лиганда. передаточное число, r апо - передаточное число при отсутствии лиганда, а r sat - соотношение при насыщение лигандом определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7.Чтобы увеличить физиологическое обнаружение, диапазон датчика серебра, точечные мутации были введены для развития аффинных мутантов датчик с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange. С использованием Получены данные из кристаллической структуры CusF , 2 двух аффинных мутантов. Мутанты были созданы путем замены аминокислотных остатков в связывающем карман связывающего белка CusF и гистидин был заменен аспарагиновой кислотой (h46D) в положении 36 и фенилаланином 71 был заменен на триптофан (F71W) (Рисунок S2).Для дальнейшего анализа эти мутанты по аффинности были экспрессированы и очищен как датчик WT.

4.4. В реальном времени Мониторинг серебра в бактериях и дрожжи

Эксперименты на клетках были выполнены на основе работы Soleja et al. 30 и Капер и другие. 31 Монохромный считыватель микропланшетов был использован для количественной оценки изменений соотношения FRET от E. coli BL21 Codon Plus (DE3), экспрессирующие SenSil. Клетки выращивали на среде LB в течение 3 суток при 20 ° С. ° C в темноте.Суспензия бактериальных клеток (180 мкл) был объединен с 20 мкл 5 мкМ ионов Ag + и распределено в трех экземплярах в каждую лунку микропланшета. Датчик ответ на излучение флуоресценции в виде сигнала FRET был сообщается с регулярными интервалами в 5 минут, всего 65 минут. Конфокальный микроскоп (Leica, Wetzlar, Германия) с конфокальной головкой TCS-SPE, объектив 63 × с числовой апертурой 1,53 и сопряженная камера использовался для проверки выражения и получения изображений SenSil после фиксации экспрессированных бактериальных клеток медицинским клеем на предметном стекле.

Сенсорный белок был экспрессирован в дрожжи, и конструкция была перенесена в дрожжевую экспрессию вектор pYES-DEST52, содержащий промотор GAL1, с использованием шлюза технология. S. cerevisiae / URA3 штамм BY4247 использовали и поддерживали на среде SD с добавлением с 2% сахарозы и 3% галактозы при 30 ° C в условиях аэрации на роторный шейкер-инкубатор на 3–5 дней. Визуализация выраженных дрожжевых клеток выполняли с помощью конфокального микроскопа (Leica DMRE) оснащен конфокальной головкой TCS-SPE (Leica, Wetzlar, Германия).В дрожжевые клетки фиксировали на предметных стеклах с помощью медицинского клея. и покрыт покровным стеклом, покрытым поли-L-лизином. Измерять поток ионов серебра в дрожжевые клетки, соотношение интенсивностей эмиссии изменение регистрировали с помощью программного обеспечения LAS-AF (Leica, Wetzlar, Германия) с возбуждением 420/20 нм и двумя фильтрами излучения, то есть 485/20 нм для донорского ECFP и 540/20 нм для акцепторной Венеры. Изменение в соотношение интенсивностей флуоресценции контролировали в течение 10 мин после добавления 5 мкМ ионов Ag + .Выбран интересующий регион для расчета изменения коэффициента интенсивности в реальном времени.

4.5. Мониторинг SenSil в ячейках HEK-293T

Для мониторинга поток ионов серебра в клетки млекопитающих, конструкция был перемещен в вектор экспрессии млекопитающих pcDNA3.1 (-). Клетки HEK-293T культивировали при 37 ° C на Dulbecco’s модифицированная среда Орла (DMEM, Sigma, США) с 10% плода теленка сыворотка, 50 мкг / мл ампициллина и 5% CO 2 . Эти клетки были помещены в 6-луночные культуральные планшеты и трансфицированы pcDNA-ECFP_ CusF _Venus с использованием реагента для трансфекции липофектамина.Для экспрессия наносенсора, клетки выращивали в течение 2 дней. FRET отношение изображений клеток HEK-293T было выполнено через 2 дня трансфекции. с помощью конфокального микроскопа (TCS-SPE, Leica, Германия) с числовой апертурой 1,53, 63-кратный масляный иммерсионный объектив и охлаждаемая камера с зарядовой связью.

4.6. Исследования клеточных культур и цитотоксичности

Культуру клеток HEK-293T поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS и 1% коктейль антибиотик-антимикотик (пенициллин, стрептомицин и амфотерицин-B) в увлажненной камере CO 2 (5% CO 2 , 37 ° C).Стандартный МТТ Анализ был использован для оценки уровня токсичности ионов серебра. Вкратце, клетки (9000–10 000 клеток / лунку) высевали в 96-луночный пластина для культивирования. Клетки инкубировали в инкубаторе CO 2 . в течение 24 часов при 37 ° C. После 80% слияния старые медиа были удаляли, и клетки обрабатывали увеличивающимися концентрациями ионов серебра (0–10 мкМ) в течение 12 ч. Эксперимент был повторяется в трех экземплярах. После инкубации клетки промывали и далее инкубировали в течение 4–5 ч со 100 мкл неполного Среда DMEM и 10 мкл раствора МТТ (взятого из исходного раствора 5 мг / мл) при 37 ° C в инкубаторе CO 2 .Надосадочные среды клеток заменяли 150–200 мкл диметилсульфоксида. для растворения оставшихся черных нечетких кристаллов (формазана) на рокер-шейкер. Формазан растворяется и приобретает пурпурно-синий цвет. После 30 мин. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при длиной волны 570 нм с использованием микропланшетного ридера ELISA (Bio-Rad). Ну наконец то, была определена жизнеспособность клеток и построен график. против концентраций ионов серебра.

Спектральная фокусировка широкополосной электролюминесценции серебра в наноскопических FRET-светодиодах

  • 1

    Непийко, С.A. et al. Излучение света кластерными пленками Ag при возбуждении током проводимости. Ann. Phys . 9 , 125–131 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 2

    Borzjak, P.G. et al. Neue Erscheinungen in sehr dünnen Metallschichten. Phys. Стат. Sol . 8 , 55–58 (1965).

    Артикул Google Scholar

  • 3

    Ламбе, Дж.и другие. Излучение света при неупругом электронном туннелировании. Phys. Rev. Lett . 37, , 923 (1976).

    CAS Статья Google Scholar

  • 4

    Gonzalez, J. I. et al. Квантово-механический электролюминесцентный источник света на основе одного нанокластера золота при комнатной температуре. Phys. Rev. Lett . 93 , 147402 (2004).

    Артикул Google Scholar

  • 5

    Ли Т.H. et al. Одномолекулярная оптоэлектроника. В соотв. Chem. Res . 38 , 534–541 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 6

    Kern, J. et al. Оптические антенны с электрическим приводом. Nat. Фотон . 9 , 582–586 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 7

    Nilius, N. et al. Фотонная эмиссионная спектроскопия отдельных кластеров серебра на оксидной основе в сканирующем туннельном микроскопе. Phys. Rev. Lett . 84 , 3994 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8

    Berndt, R. et al. Неупругое туннельное возбуждение индуцированных иглой плазмонных мод на поверхности благородных металлов. Phys. Rev. Lett . 67 , 3796–3799 (1991).

    CAS Статья Google Scholar

  • 9

    Chen, C. et al. Визуализация золотого правила Ферми посредством визуализации светового излучения цепочек атомов серебра. Наука 325 , 981–985 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 10

    Мак, К. Ф. и др. Атомно тонкий MoS2: новый прямозонный полупроводник. Phys. Rev. Lett . 105 , 136805 (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 11

    Mueller, T. et al. Эффективное узкополосное излучение света от одиночного p – n-диода из углеродных нанотрубок. Nat. Нанотехнологии. 5 , 27–31 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 12

    Klein, D. L. et al. Одноэлектронный транзистор из нанокристалла селенида кадмия. Nature 389 , 699–701 (1997).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13

    Schneider, N. L. et al. Оптический зонд уменьшения квантового дробового шума при одноатомном контакте. Phys. Rev. Lett . 105 , 026601 (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 14

    Coe, S. et al. Электролюминесценция одиночных монослоев нанокристаллов в молекулярно-органических устройствах. Nature 420 , 800–803 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 15

    Achermann, M. et al. Накачка с переносом энергии полупроводниковых нанокристаллов с использованием эпитаксиальной квантовой ямы. Nature 429 , 642–646 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 16

    Castellanos-Gomez, A. et al. Детерминированный перенос двухмерных материалов методом сухой вязкоупругой штамповки. 2D Материал . 1 , 011002 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 17

    Баугер, Б. В. Х. и др. Оптоэлектронные устройства на основе электрически перестраиваемых p − n-диодов в однослойном дихалькогениде. Nat. Нанотех . 9 , 262–267 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18

    Росс, Дж. С. и др. Электроперестраиваемые экситонные светодиоды на основе однослойных p − n-переходов WSe2. Nat. Нанотех . 9 , 268–272 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 19

    Сундарам Р. С. и др. Электролюминесценция в однослойном MoS2. Nano Lett . 13 , 1416–1421 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 20

    Silly, F. et al. Автокорреляция по времени в излучении фотонов с металлической поверхности, индуцированном сканирующим туннельным микроскопом. Заявл. Phys. Lett . 77 , 3648 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 21

    Барнс, У. Л. Флуоресценция вблизи границ раздела: роль плотности фотонных мод. J. Mod. Опция . 45 , 661–699 (1998).

    CAS Статья Google Scholar

  • 22

    Чижик А.И. и др. Передача энергии под действием металлов для наноскопии живых клеток. Nat. Фотон . 8 , 124–127 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 23

    Дрексхаге, К. Х. Влияние диэлектрической границы раздела на время затухания флуоресценции. Дж. Люмин . 1 , 693–701 (1970).

    Артикул Google Scholar

  • 24

    Swathi, R. S. et al. Дальнодействующий резонансный перенос энергии от молекулы красителя к графену имеет зависимость (расстояние) (- 4). J. Chem. Phys . 130 , 086101 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 25

    Prins, F. et al. Уменьшение диэлектрического экранирования и улучшенная передача энергии в однослойном и малослойном MoS2. Nano Lett . 14 , 6087–6091 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 26

    Raja, A. et al. Передача энергии от квантовых точек к графену и MoS2: роль поглощения и экранирования в двумерных материалах. Nano Lett . 16 , 2328–2333 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 27

    Poellmann, C.и другие. Резонансные внутренние квантовые переходы и фемтосекундный радиационный распад экситонов в монослое WSe2. Nat. Материал . 14 , 889–893 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 28

    Черников А.А. и др. Энергия связи экситона и неводородный ряд Ридберга в монослое WS2. Phys. Rev. Lett . 113 , 076802 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 29

    Li, Y.и другие. Измерение оптической диэлектрической функции однослойных дихалькогенидов переходных металлов: MoS2, MoSe2, WS2 и WSe2. Phys. Ред. B 90 , 205422 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 30

    Plechinger, G. et al. Контроль двухосной деформации однослойного молибденита с помощью локального теплового расширения подложки. 2D Материал . 2 , 015006 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 31

    Чаудхури, Д.и другие. К субдифракционной просвечивающей микроскопии диффузных материалов с использованием маяков белого света с наночастицами серебра. Nano Lett . 9 , 952–956 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 32

    Bao, W. et al. Визуализация наноразмерных свойств экситонной релаксации неупорядоченных краев и границ зерен в монослое дисульфида молибдена. Nat. Коммуна . 6 , 7993 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • Высокочувствительные гомогенные иммуноанализы на основе построения серебряных треугольных нанопластин-квантовых точек Система FRET

    Усовершенствованный синтез STNP был методом опосредованного семенами роста в соответствии с нашим предыдущим методом 19 .Во-первых, соли серебра восстанавливали сильным восстановителем для получения затравочных частиц. После этого частицы затравки серебра немедленно облучали натриевой лампой (70 Вт) в течение 2 часов. Вкратце, треугольные нанопластинки с пиком поглощения плазмона при 613 нм были синтезированы с использованием цитратной кислоты в качестве поверхностного лиганда 19,21 . На рисунке S1 в вспомогательной информации схематически показан процесс роста очень однородных и неоднородных STNP. Высокооднородные STNP (см. FESEM на рис.2) были подготовлены дополнительным контролем ОН -. Как показано на рисунке S2 в вспомогательной информации, малое увеличение FESEM и узкое распределение размеров STNP хорошо подтверждают высокое качество и высокую однородность подготовленных STNP. Без добавления OH - полученные STNP имеют неоднородную морфологию, размер и широкое распределение по размерам (см. FESEM на рисунке S3), что подтверждается расширением полной ширины на полувысоте (fwhm) спектра поглощения плазмонного резонанса. (Рисунок S3 во вспомогательной информации).Очевидно, что значение fwhm может быть уменьшено с 117 нм до 83 нм после введения OH -. Это связано с тем, что введение OH - могло равномерно подавить скорость генерации ионов серебра в сумме 19 . Мы действительно наблюдали, что окисление наночастиц серебра, очевидно, сдерживалось введением OH -. Хотя световое облучение ускоряет процесс окисления небольших наночастиц серебра из-за повышения температуры, ионы OH -, по-видимому, эффективно подавляют побочный эффект.Следовательно, введение OH - может ингибировать окисление наночастиц серебра и замедлить скорость генерации ионов серебра, что благоприятно для кинетического контроля роста 19,21 . Как показано на рис. 2, длина стороны треугольных нанопластин составляет около 70 нм. В нашем случае настроенные по размеру красные КТ (λ em = 612 нм) были выбраны в качестве донора для HIA, потому что они хорошо совпадают с полосой поглощения локализованного плазмонного резонанса STNP.

    Рис. 2: FE-SEM изображение STNP, полученное с помощью нашего метода, а также нормализованный спектр поглощения STNP и спектр PL квантовых точек.

    Масштабная линейка составляет 200 нм.

    Поскольку QD и STNP были закрыты отрицательно заряженными лигандами 3-меркаптопропионовой кислоты и лимонной кислоты, соответственно, таким образом, когда QD и STNP были смешаны вместе в одном сосуде, они не могли объединиться друг с другом из-за электростатического отталкивания. сила. Следовательно, ФЛ квантовых точек будет оставаться постоянной. Как показано на рис. 3 и 4а, когда объем СТНЧ, добавленных в раствор КТ, был увеличен с 5 до 10, 20, 40 мкл и выше, интенсивность ФЛ КТ почти осталась постоянной.Однако, когда модифицированные этилендиамином STNP были добавлены в раствор QD, QD могли легко объединиться с STNP через мостиковую связь этилендиамина из-за электростатического взаимодействия. Следовательно, фотолюминесценция квантовых точек будет эффективно подавляться STNP за счет безызлучательного процесса FRET. Цифровые фотографии раствора КТ до и после добавления модифицированных этилендиамином СТНЧ при возбуждении ультрафиолетовой лампой показаны на Рисунке S4 в дополнительной информации.Невооруженным глазом можно наблюдать, что флуоресценция КТ резко гасится после введения модифицированных этилендиамином СТНЧ. Как показано на рис. 3 и 4b, когда объем модифицированных этилендиамином СТНЧ, добавленных в раствор КТ, был увеличен с 5 до 10, 20, 40 мкл и выше, интенсивность ФЛ КТ резко снизилась, и гашение приблизилось к насыщению до тех пор, пока объем СТНП достигал около 160 мкл.

    Рис. 3

    Схема механизма гашения на основе FRET от КТ до модифицированных этилендиамином СТНЧ.

    Рисунок 4

    Изменение интенсивности ФЛ на пике эмиссии КТ после добавления различных объемов STNP ( a ) и STNP, модифицированных этилендиамином ( b ). Объем STNP увеличен с 5 до 10, 20, 40, 80 и 160 мкл. Концентрация квантовых точек была зафиксирована на уровне 14 нМ. На вставке - соответствующая эволюция спектров ФЛ КТ.

    Эффективность FRET можно оценить как Ф FRET = 1 - I DA / I D , предполагая, что другие механизмы гашения, такие как реабсорбция, незначительны, где I DA и I D представляют собой интенсивность флуоресценции донора FRET с присутствием и без акцептора FRET, соответственно 1,3 .Согласно спектрам ФЛ, показанным на рис. 4б, эффективность FRET могла достигать 98% для КТ в точке насыщения тушения. Такая высокая эффективность FRET демонстрирует синергетический эффект благодаря свойствам настоящей конструкции. 3 . Во-первых, STNP имеют большую площадь поверхности и отсутствие кривизны, что может усилить участки тушения и повысить эффективность тушения. Во-вторых, СТНП имеют большой коэффициент экстинкции. Коэффициент экстинкции СТНЧ составляет около 10 12 M −1 см −1 (подробности см. Во вспомогательной информации), что примерно на 2–3 порядка величины выше, чем у наночастиц золота и даже на 7–8 на порядки выше, чем у флуоресцентных красителей.В-третьих, спектры STNP и QD идеально перекрываются благодаря рациональной перестройке спектров наших специально разработанных доноров QD и акцепторов STNP. Очевидно, что чем больше перекрываются спектры между донором и акцептором, тем выше будет эффективность FRET. Наконец, поглощение СТНЧ при возбуждении донора, например, 400 нм для квантовых точек, невелико, что максимально устранит неблагоприятное влияние эффекта FRET. Поскольку тушение PL QD коррелирует с дозировкой STNP, мы могли бы выполнить HIA на основе тушения флуоресценции QD, когда высокоэффективные и надежные QD функционировали как индикаторный агент обнаружения.

    В данной работе был выбран вирус гепатита В для проведения ОВЗ на основе наноплатформы QDs-STNPs FRET. Схематический путь HIA HBsAg представлен на рис. 1. STNP, иммобилизованные с HBsAb1 на поверхности, используются в качестве акцепторов FRET. С другой стороны, излучающие красный цвет КТ (λ em = 612 нм), иммобилизованные HBsAb2 посредством ковалентного связывания (рисунок S5 в вспомогательной информации), используются в качестве доноров FRET. Добавление аналита HBsAg к раствору HIA запускало иммунные реакции, индуцированные сэндвич-конструкцией, что приводило к коррелированным с концентрацией Ag процессам FRET.Перед тестом на обнаружение сначала смешивали STNP-Ab1 и QD-Ab2 в гомогенном растворе. Когда аналит Ag был добавлен в раствор, сэндвич-структура STNPs-Ab1 / Ag / QDs-Ab2 будет формироваться из-за иммунных реакций, и FRET от QD до STNP будет происходить спонтанно.

    Как показано на вставке к фиг. 5 и цифровой фотографии набора КТ на фиг. 6, тушение ФЛ демонстрирует развивающийся процесс FRET по сравнению с с увеличением концентрации HBsAg.Кривые обнаружения были получены путем вычитания интенсивности ФЛ контрольного образца QDs-Ab2 без Ag и сэндвич-структур STNPs-Ab1 / Ag / QDs-Ab2 с Ag. На рис. 5а, б представлены спектры ФЛ системы HIA с различными концентрациями антигенов, когда дозовая концентрация QDs-Ab2 составляла 7 нМ и 0,35 нМ соответственно. Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции монотонно увеличивалась с постепенным увеличением концентрации Ag до 160 нг / мл -1 для более высокой концентрации QD и 8.1 нг мл -1 для более низкой концентрации КТ соответственно. Следовательно, диапазон обнаружения HBsAg может достигать 160 нг / мл -1 для этого HIA. После линейной аппроксимации линейная калибровочная кривая может быть получена как Y = 86,0671X - 148,2 (5 ≤ X ≤ 40 нг мл −1 , R = 0,997) для более высоких доз HBsAg и Y = 1088,7X - 93,96 (0,3 ≤ X ≤ 2,7 нг / мл ( -1 , R = 0,999) для обнаружения HBsAg с более низкой дозировкой соответственно. Предел обнаружения (LOD) был определен как самая низкая концентрация обнаруженного образца, которая дает положительное значение вычитания интенсивности PL между контрольным и обнаруженным образцом 1,22 .Из рис. 5b отчетливо видно, что вычтенная интенсивность PL все еще оставалась положительной, даже когда концентрации HBsAg были всего лишь примерно 300 пг / мл -1 для HIA, когда подавалась более низкая дозированная концентрация. Таким образом, LOD этого HIA может достигать всего 300 пг / мл -1 . В результате мы можем выполнять чрезвычайно точное обнаружение в относительно широком диапазоне концентраций и требования к высокочувствительному обнаружению (например, 300 пг / мл -1 ~ 160 нг / мл -1 ).Здесь LOD в 27,7 раз ниже, чем предыдущий результат при использовании золотых наностержней (GNR) в качестве акцептора FRET (8,3 нг / мл -1 ) 1 , что связано с более высокой эффективностью FRET, как обсуждалось выше. Соответствующие параметры STNP и GNR показаны в таблице S1; сравнение объясняет причину более высокой эффективности FRET и более низкого LOD обнаружения антигена при использовании STNP. Одним словом, нельзя игнорировать две причины: во-первых, STNP имеют большую площадь поверхности и отсутствие кривизны, что может усиливать участки тушения и повышать эффективность FRET.Во-вторых, СТНЧ имеют больший коэффициент экстинкции по сравнению с наночастицами золота. Теоретически, когда концентрация аналита Ag превышает насыщенную концентрацию меченого Ab, например, 320 нг / мл -1 для HBsAg в иммуноанализе с более высокой концентрацией Ag и 24,3 нг / мл -1 для HBsAg в иммуноанализе с более низкой концентрацией Ag , ответа на иммуноферментный анализ быть не должно. Фактически, кривая обнаружения немного снизилась. Это связано с тем, что добавление детектированного HBsAg к набору заменило сэндвич-Ag ​​и привело к восстановлению флуоресценции квантовых точек (рис.7).

    Рисунок 5

    Определение антигена на основе FRET с предоставленной концентрацией QDs-Ab 7 нМ ( a ) и 0,35 нМ ( b ). Связь между вычтенной интенсивностью PL (I 0 -I) QDs-HBsAb в присутствии STNPs-Ab1 и обнаруженным HBsAg с различными концентрациями. На вставке - соответствующее изменение спектров ФЛ квантовых точек.

    Рисунок 6

    Цифровая фотография набора КТ до ( a ) и после ( b ) обнаружения антигена на основе FRET при возбуждении ультрафиолетовой лампой.Слева направо концентрация обнаруженного антигена увеличивается от 0 до 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 и 320 нг / мл. Каждая концентрация антигена определяется статистикой пяти параллельных образцов.

    Рисунок 7

    Схема механизма восстановления флуоресценции, вызванного перенасыщенным детектируемым Ag.

    Специфичность иммунного обнаружения в основном зависит от иммунореактивности меченых моноклональных антител. Чтобы доказать высокую обнаруженную специфичность нашей ОВЗ на основе FRET, мы также выполнили некоторую неспецифическую диагностику.Для подтверждения специфичности был проведен контрольный тест с применением 1% раствора BSA в качестве образца аналита. Поскольку как структура, так и морфологические свойства HBeAg и HBsAg подобны друг другу, необходимо обнаруживать HBeAg для дальнейшего подтверждения специфичности HIA. Результаты показаны на фиг. 8, на которой интенсивность флуоресценции нормализована к значению обнаружения HBsAg с учетом специфичности HBsAg за 100%. Когда конъюгаты QDs-HBsAb используются для обнаружения неспецифического связывания HBeAg, может наблюдаться низкая интенсивность флуоресценции.Этот феномен означает, что имелось 8,6% неспецифического связывания HBeAg. Точно так же, когда конъюгаты QDs-HBsAb используются для обнаружения неспецифического связывания образца BSA, при тех же условиях обнаружения наблюдается только небольшой сигнал PL. Это явление означает, что неспецифичность в отношении молекул BSA составляет лишь 5,6%. Очевидно, что HIA с использованием конъюгатов QDs-HBsAb очень специфичен для обнаружения HBsAg, поскольку специфичность превышает 90%. В результате наша HIA, основанная на наноплатформе FRET QDs to STNPs, заслуживает доверия и осуществима.

    Рисунок 8

    Специфичность экспериментов по неспецифическому связыванию BSA (1%) и HBeAg с использованием гомогенного иммунного детектирования на основе FRET с учетом специфичности HBsAg за 100%.

    Использование стабильно экспрессируемого биосенсора FRET для определения эффективности противораковых препаратов

    Abstract

    Многие противораковые препараты предназначены для уничтожения раковых клеток путем индукции апоптоза. Однако анализы активности, используемые для измерения биологической активности этих продуктов, обычно представляют собой анализы жизнеспособности клеток, которые не делают различий между гибелью клеток и ингибированием роста.Здесь мы описываем клеточный биосенсор с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), предназначенный для измерения биологической активности противораковых препаратов, вызывающих апоптоз. Биосенсор содержит голубой флуоресцентный белок (CFP), связанный с желтым флуоресцентным белком (YFP) через специфические последовательности расщепления каспазы 3 и каспазы 8. При активации каспазы, как и в случае индукции апоптоза, линкер отщепляется, уничтожая клеточный сигнал FRET. Этот анализ точно отражает механизм действия противораковых лекарств в уничтожении раковых клеток и, следовательно, может функционировать как тест на эффективность различных противораковых лекарств.Мы строго продемонстрировали это, охарактеризовав класс белков, нацеленных на рецепторы смерти. Одноэтапный анализ, по-видимому, превосходит другие анализы, основанные на апоптозе, благодаря своей простоте, удобству и надежности.

    Образец цитирования: Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) Использование стабильно выраженного биосенсора FRET для определения эффективности противораковых препаратов. PLoS ONE 9 (9): e107010. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0107010

    Редактор: Вей Сюй, Университет Висконсина - Мэдисон, Соединенные Штаты Америки

    Поступила: 28 апреля 2014 г .; Одобрена: 10 августа 2014 г .; Опубликовано: 4 сентября 2014 г.

    Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, изменять, строить или иным образом использовать в любых законных целях. Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

    Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все данные включены в документ.

    Финансирование: Эта работа была поддержана Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Центром оценки и исследований лекарственных средств, Фондом инициативы «Критический путь»; и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Центр оценки и исследований лекарственных средств, Фонд Инициативы по медицинскому противодействию. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Эффективность - это мера активности лекарственного средства с точки зрения концентрации или количества, необходимого для достижения определенного биологического эффекта [1]. Следовательно, анализ активности должен быть разработан таким образом, чтобы максимально полно отразить механизмы действия лекарственного средства. Для онкогенных лекарств, которые предназначены для уничтожения раковых клеток, анализ активности может быть мерой цитотоксичности лекарства в отношении раковых клеток.Исторически многие химиотерапевтические агенты были идентифицированы путем высокопроизводительного скрининга библиотек соединений с использованием анализов жизнеспособности клеток с МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) или другими родственными красителями [2], [3]. Этот формат анализа получил широкое распространение в качестве теста на эффективность при разработке лекарств от рака. Однако анализы жизнеспособности клеток не могут различить эффекты гибели клеток и остановки роста, что оставляет оговорку в оценке истинной биоактивности противоракового препарата.Поскольку цель терапии рака - убить раковые клетки, очень важно оценить способность лекарства вызывать гибель раковых клеток. Форма гибели клеток, наиболее часто связанная с лечением рака, как in vivo, и in vitro, - это апоптоз или запрограммированная гибель клеток.

    Отличительным признаком апоптоза является активация протеаз каспаз, приводящая к расщеплению структурных белков и образованию апоптотических телец [4]. Существует два различных пути, а именно внутренний и внешний, которые приводят к активации каспазы в ответ на лекарственное лечение.Классические химиотерапевтические препараты, такие как этопозид, компактин, фторурацил (5-ФУ), таксол и камптотецин, вызывают активацию каспазы 3 р53-зависимым образом [5] - [7], что часто связано с митохондриальными изменениями. Напротив, новый класс белков, нацеленных на рецепторы смерти, экспрессируемые на поверхности клетки, находится в стадии разработки [8] - [11]. Эти белки включают варианты рекомбинантного фактора некроза опухоли человека (TNF), связанный с TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), и агонистические антитела к рецепторам смерти.TRAIL связывается с рецептором смерти 4 и / или 5 (DR4 / 5) и впоследствии индуцирует сборку индуцирующего смерть сигнального комплекса (DISC), содержащего адаптерный белок, ассоциированный с Fas белок с доменом смерти (FADD) и прокаспазу 8. Внутри В DISC, прокаспаза 8 активируется путем саморасщепления и высвобождается в цитозоль, где активирует каспазу 3. В некоторых типах клеток апоптотическая передача сигналов дополнительно усиливается через митохондрии в результате транслокации каспазы 8 опосредованное расщепление Bid (белок взаимодействующего домена Bh4).Таким образом, эффективность противоракового лекарства можно оценить, измерив величину активности каспазы в обработанных клетках. Одним из подходов к измерению активности каспаз было использование флуоресцентных зондов, содержащих субстраты каспаз, показывающих изменения интенсивности флуоресценции при активации каспазы [12] - [16]. В качестве альтернативы активные каспазы можно обнаружить с помощью иммуноблот-анализа с использованием антител, специфичных к расщепленной форме отдельного фермента [14], [17] - [19]. Однако эти анализы могут быть связаны с большой вариабельностью из-за сложных операционных процедур.В этом исследовании мы разработали клеточный FRET-анализ для проверки эффективности продуктов рака. Зонд FRET содержит последовательности распознавания как для каспазы 3, так и для каспазы 8, и было обнаружено, что он чувствителен к лекарствам от рака, которые действуют внутренними или внешними путями. В частности, со стабильно экспрессируемым зондом FRET, ответ, вызванный лекарством, непосредственно отслеживается на обработанных клетках без дополнительных этапов обработки. Более того, анализ FRET выявляет клетки, подвергающиеся апоптозу, с заметной чувствительностью и экспериментальной простотой, что делает его многообещающим анализом эффективности для оценки противораковых препаратов.

    Материалы и методы

    Клеточные линии и реагенты

    Линия клеток рака молочной железы человека

    MDA-MB-231 была приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния). Плазмида pCMV6-AC для экспрессии слитого белка (552 аминокислоты), содержащего полноразмерный голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), связанные через последовательность распознавания каспазы, была приобретена у OriGene (Rockville, MD). Линкер между CFP и YFP содержит шестнадцать аминокислот, GSGDEVDGGIETDGSG, которые могут расщепляться активированной каспазой 3 при G ↓ DEVD или каспазой 8 при G ↓ IETD, где ↓ указывает сайт разрезания протеазы.Кодирующую последовательность кДНК (1656 пар оснований) для слитого белка CFP-линкер-YFP клонировали в вектор pCMV6-AC по сайтам рестрикции Sgf I и Mlu I, и правильность конструкции проверяли путем нуклеотидного секвенирования. Плазмиду трансфицировали в клетки MB231 с использованием реагента Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA). Трансфицированные клетки отбирали против неомицина (G418) в концентрации 1 мг / мл (Corning Cellgro, Manassas, VA). Клоны, устойчивые к G418, отбирали с использованием цилиндров для клонирования (Millipore, Temecula, CA) и тестировали на интенсивность флуоресценции и уровни экспрессии белка.Стабильный клон с наивысшими уровнями экспрессии зонда CFP-линкер-YFP, обозначенный как MB231_CFP-YFP, использовали в следующих анализах. Клетки поддерживали в среде DMEM / F-12 50/50 с добавлением 5% FBS, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 0,4 мг / мл сульфата G418. Родительские клетки MB231 культивировали в той же среде без добавления сульфата G418. И рекомбинантный человеческий TRAIL (rhTRAIL, № по каталогу 375-TEC), и агонистическое моноклональное антитело (№ по каталогу MAB631), специфичное к рецептору смерти 5, были приобретены в R&D systems (Миннеаполис, Миннесота).RhTRAIL существует как гомотример, где каждый мономер состоит из аминокислот 114–281 нативного внеклеточного домена TRAIL человека. Стауроспорин был приобретен в ApexBio (Бостон, Массачусетс). Камптотецин и этопозид были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури). 5-ФУ был приобретен у Enzo Life Sciences (Фармингдейл, Нью-Йорк). Компактин был приобретен в Санта-Круз (Даллас, Техас). Таксол был приобретен у Calbiochem (Ла Хойя, Калифорния).

    Анализ жизнеспособности клеток

    Жизнеспособность клеток определяли с помощью колориметрического анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ), как описано ранее [20].Вкратце, 1,0–2,0 × 10 4 клеток высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета. Затем клетки обрабатывали цитотоксическим агентом. После обработки лекарственным средством среду для культивирования клеток аспирировали, затем в каждую лунку добавляли МТТ (2 мг / мл в буфере PBS) и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. Затем супернатант аспирировали и нерастворимый формазан растворяли в ДМСО. Поглощение при окрашивании формазаном измеряли при 562 нм с использованием микропланшетного ридера SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния).Относительную OD 562 для каждой лунки наносили на график в зависимости от логарифмического значения концентрации цитотоксического агента в молях. Значения EC 50 были определены путем подгонки кривой доза-реакция к уравнению 1, Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 + 10∧ ((LogEC 50 -X) * HillSlope)), с использованием GraphPad Prism программное обеспечение. X - это логарифм молярной концентрации цитотоксического агента, а Y - измеренное значение абсорбции. Каждая точка данных была повторена в трех экземплярах.

    Проточная цитометрия

    3.0 × 10 5 клеток культивировали в каждой лунке 6-луночного планшета. Клетки обрабатывали TRAIL или антителом против DR5. Затем клетки собирали, окрашивали аннексином-V-APC (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) и йодидом пропидия (PI, Сент-Луис, Миссури) и анализировали с использованием проточного цитометра BD Accuri C6 (BD, Franklin Lakes, NJ) [ 21].

    Иммуноблот-анализ

    Вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [19]. Вкратце, клетки лизировали с использованием буфера RIPA [0,5 М трис-HCl (pH 7.4), 1,5 М NaCl, 2,5% дезоксихолевой кислоты, 10% NP-40, 10 мМ ЭДТА и коктейль ингибиторов протеазы] (EMD Millipore, Дармштадт, Германия). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием и определяли общее количество белка с помощью анализа BCA (Pierce, Rockford, IL). Равное количество белка (30 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием NuPAGE 4–12% градиентных гелей Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) и переносили на PVDF-мембраны. Антитела, специфичные к CFP и YFP, были от Covance (Gaithersburg, MD), антитела, специфичные к каспазе 8 и каспазе 3, были от Cell Signaling (Danvers, MA), а антитела, специфичные к актину, были от Santa Cruz (Dallas, TX).В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой антимышиные, антикроличьи или козьи антитела IgG. Обнаружение иммуноблота визуализировали с помощью Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) и системы камеры LAS-4000 CCD (Fujifilm, Эдисон, Нью-Джерси).

    Анализ цитотоксичности FRET на основе клеток

    1,8–5,4 × 10 4 Клетки MB231_CFP-YFP культивировали в каждой лунке черного 96-луночного микропланшета. После того как клетки выращивали в течение ночи, среду для культивирования клеток аспирировали и буфер PBS, содержащий цитотоксический агент (TRAIL, антитело против DR5 или стауроспорин), добавляли к прикрепленным клеткам на указанные временные точки.Из-за необходимости более длительного периода инкубации для обработки камптотецином клетки обрабатывали средой DMEM, содержащей цитотоксическое лекарственное средство, в течение 48 часов перед заменой среды буфером PBS и продолжением инкубации в течение дополнительных 24 часов. Эту процедуру также проводили для этопозида, компактина, 5-ФУ и таксола. После лекарственной обработки сигнал FRET каждого образца определяли с использованием флуоресцентного планшет-ридера FluoDia T70 (PTI, Эдисон, Нью-Джерси). Обработанные клетки возбуждали с помощью фильтра возбуждения 425 ± 10 нм.Для определения FRET после вычитания фона были рассчитаны коэффициенты испускания YFP (фильтр 530 ± 5 нм) и CFP (фильтр 486 ± 5 нм). Значения FRET были нормализованы и нанесены на график в зависимости от логарифмического значения концентрации цитотоксического агента в молях с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Значения EC 50 были определены путем подбора нелинейной кривой к уравнению 2, Y = 100 / (1 + 10∧ ((LogEC 50 -X) * Hill Slope)). X - это логарифм молярной концентрации цитотоксического агента, а Y - нормализованное значение FRET.Каждую точку данных повторяли в трех экземплярах для одного эксперимента, и каждый эксперимент повторяли независимо, по крайней мере, дважды.

    Биохимическая характеристика зонда FRET

    Чтобы охарактеризовать экспрессию зонда CFP-линкер-YFP, экспрессированный белок выделяли с использованием антитела против CFP / YFP. Вкратце, 1,2 × 10 6 клеток MB231_CFP-YFP собирали и лизировали в 1 мл буфера для иммунопреципитации для лизиса Пирса. 25 мкл антитела против CFP / YFP, конъюгированного с сефарозой (Abcam, Cambridge, MA), вращали с лизатом клеток без остатков в течение 3 часов при 4 ° C.После промывания буфером для лизиса связанный зонд CFP-линкер-YFP FRET элюировали 50 мМ Трис-буфером (pH 8,5), содержащим 1 М NaCl. Сразу после элюирования белок разбавляли трис-буфером до конечной концентрации NaCl 300 мМ. Чистоту белка визуализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим, а также с помощью анализа иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных для CFP и YFP (описанных выше).

    Для in vitro анализов FRET иммуноочищенный зонд CFP-линкер-YFP FRET инкубировали с активной каспазой 3, каспазой 8 или каспазой 2 (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота) в течение 3 часов при 25 ° C в Буфер PBS, содержащий 1 мМ DTT, с использованием черных 96-луночных микропланшетов.В качестве контроля к некоторым реакциям также был добавлен Z-VAD. FRET измеряли, как описано выше.

    Конфокальная микроскопия

    1,5 × 10 4 Клетки MB231_CFP-YFP культивировали на 4-луночных системах боросиликатного покровного стекла (Nunc, Rochester, NY) за один день до эксперимента. Клетки обрабатывали различными концентрациями TRAIL (0-25 нг / мл) в течение 2,5 ч перед визуализацией. Клетки получали с помощью линзы объектива 63x и системы конфокального микроскопа с вращающимся диском Zeiss Cell Observer (Торнвуд, Нью-Йорк) с камерой окружающей среды PECON.Эффективность FRET определялась путем регистрации сенсибилизированного излучения [22], [23]. Лазерные линии возбуждения с длиной волны 458, 514 и 458 нм использовались для донорных каналов CFP, акцепторных YFP и FRET соответственно. Эмиссионный фильтр для CFP составлял 485/30, тогда как эмиссионный фильтр для YFP и FRET был 535/30. Дихроичный светоделитель для конфокальной сканирующей головки Yokogawa был RIFT 457/514/647 нм. После получения поправочных коэффициентов для отдельно выраженных CFP и YFP изображения клеток были получены для ячеек MB231_CFP-YFP через каналы CFP, YFP и FRET идентичным образом.Наборы данных из 9 изображений были сохранены в формате zvi для будущего количественного анализа. Программное обеспечение Zeiss Axiovision (версия 4.8.2) использовалось для измерения FRET сенсибилизированного излучения. Эффективность FRET была рассчитана на основе системы с тремя фильтрами, которая нормирована относительно интенсивностей доноров и акцепторов, что позволяет рассчитывать перекрестные помехи и проверять истинный сигнал FRET [24], [25]. Величина эффективности FRET рассчитывалась по формуле Ся [24]. Для каждого эксперимента были получены три случайно выбранных изображения.По этим изображениям была рассчитана эффективность FRET. От двух до трех областей интереса (ROI) были помещены для соответствующей ячейки, и от десяти до пятнадцати областей интереса были подвергнуты FRET-анализу.

    Результаты

    Создание клеточного биосенсора FRET

    клеток рака молочной железы человека MB231 стабильно трансфицировали экспрессионной плазмидой, кодирующей слитый белок CFP-линкер-YFP (MB231_CFP-YFP), где CFP действует как донор, а YFP как акцептор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).Линкер содержит последовательности распознавания как каспазы 3, так и каспазы 8, DEVD и IETD соответственно, которые, как ожидается, будут чувствительны к лекарствам, функционирующим через либо внутренними, либо внешними путями апоптоза. После активации каспазы после лечения лекарственным средством линкер, соединяющий CFP и YFP, будет расщеплен и впоследствии приведет к потере клеточного сигнала FRET. Эта методология позволяет использовать мощный биосенсор FRET, служащий маркером апоптоза (рис. 1А). Клеточная линия MB231 была выбрана в качестве клеточного субстрата, поскольку было показано, что она полностью чувствительна к целому ряду цитотоксических агентов, что подразумевает функциональную целостность аппарата апоптоза [3], [18].Ожидается, что такая клеточная платформа будет полезна для анализа эффективности различных противораковых препаратов.

    Рис. 1. Клеточный биосенсор FRET.

    (A) Схематическое изображение анализа FRET. Зонд FRET, CFP-линкер-YFP, экспрессируется как гибридный белок, содержащий CFP и YFP, связанные через пептидную последовательность из 16 аминокислот: GSGDEVDGGIETDGSG. Линкерная область содержит последовательности распознавания каспазы 3 (DEVD) и каспазы 8 (IETD), которые могут избирательно расщепляться соответствующими ферментами при индукции внутренних и / или внешних путей апоптоза.(B) Иммуноблот-анализ зонда CFP-линкер-YFP FRET, стабильно экспрессируемого в клетках MB231. (C) Клетки, экспрессирующие зонд CFP-линкер-YFP FRET, продуцировали значительный и стабильный сигнал FRET, клетки инкубировали в буфере PBS в течение 0-24 часов. (D) Зонд CFP-линкер-YFP FRET очищали иммуноочисткой из клеточного лизата MB231_CFP-YFP и визуализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (вверху) или с помощью анализа иммуноблоттинга (внизу). (E) Изменения FRET отслеживали, когда 100 нМ очищенного белка CFP-линкер-YFP инкубировали со 100 нМ рекомбинантной активной каспазой 3 (C3), каспазой 8 (C8) или каспазой 2 (C2) в течение 3 часов.Значения p определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g001

    Сначала мы подтвердили экспрессию зонда CFP-линкер-YFP FRET с помощью анализа иммуноблоттинга, используя первичное антитело, которое распознает CFP и YFP. Сильная полоса, специфичная для интактного белка CFP-линкер-YFP (ожидаемая молекулярная масса 55 кДа), наблюдалась в лизате клеток MB231_CFP-YFP, но не в родительских клетках (рис. 1В). Затем мы определили, могут ли ячейки MB231_CFP-YFP обеспечивать приемлемый сигнал FRET.Чтобы исключить вывод из компонентов среды, среду для культивирования клеток аспирировали из клеток MB231_CFP-YFP, прикрепленных к 96-луночным микропланшетам. Буфер PBS был добавлен в каждую лунку, и сигнал FRET был рассчитан, взяв соотношение между эмиссией флуоресценции акцептора (530 ± 5 нм) и эмиссией флуоресценции донора (486 ± 5 нм), когда образцы возбуждали при 425 ± 10 нм с использованием флуоресценции. планшетный ридер. Действительно, в этих условиях для клеток MB231_CFP-YFP был обнаружен значительный сигнал FRET (рис. 1C).Примечательно, что зонд FRET оказался стабильным в клетках, погруженных в буфер PBS, на срок до 24 часов (рис. 1C). В качестве контроля параллельно анализировали нетрансфицированные родительские клетки MB231, которые не давали какого-либо значимого сигнала флуоресценции выше фонового шума при возбуждении на длине волны 425 ± 10 нм.

    Иммунопреципитацию зонда CFP-линкер-YFP FRET проводили для подтверждения его селективности в отношении расщепления каспазой 3 и каспазой 8. Зонд CFP-линкер-YFP FRET очищали от клеточного лизата с использованием антитела против CFP / YFP, конъюгированного с шариками сефарозы.Связанный зонд FRET элюировали трис-буфером, содержащим 1 М NaCl. Изолированный зонд FRET был охарактеризован с помощью SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим (рис. 1D, вверху) и иммуноблот-анализом (рис. 1D, внизу). Для оценки специфичности каспазы очищенный зонд FRET инкубировали с рекомбинантными формами активной каспазы 3, каспазы 8 или каспазы 2. Изменения FRET отслеживали (рис. 1 E). Как и ожидалось, расщепление зонда FRET было специфичным для каспазы 3 и каспазы 8 и приводило к выраженному снижению сигнала FRET.Соответственно, расщепление зонда FRET полностью прекратилось, когда реакционную смесь инкубировали с ингибитором панкаспазы (Z-VAD). Напротив, при инкубации зонда CFP-линкер-YFP FRET с каспазой 2 практически не было обнаружено расщепление зонда FRET.

    Аттестация биосенсора FRET для использования в тестировании активности для лечения рака, направленного на рецепторы смерти

    С помощью стабильно трансфицированного зонда FRET мы сначала проверили его пригодность для измерения эффективности класса белков, которые индуцируют апоптоз, воздействуя на рецепторы смерти (DR).К ним относятся рекомбинантный человеческий TNF-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), и агонистические антитела к DR5, которые находятся в стадии разработки в многочисленных клинических испытаниях для лечения рака. Эти продукты действуют через DR4 и / или DR5, экспрессируемые на поверхности клеток-мишеней. После активации внутриклеточный домен смерти способствует сборке прокаспазы 8/10 и адапторного белка FADD в индуцирующий смерть сигнальный комплекс (DISC), что приводит к последовательной активации каспазы 8 и каспазы 3.Таким образом, эти агенты служат отличными зондами для тестирования сконструированного биосенсора FRET. Как ранее было показано для родительских клеток MB231 [18], клетки MB231_CFP-YFP сохраняли аналогичную чувствительность к TRAIL и антителам против DR5. Это было впервые продемонстрировано анализами жизнеспособности клеток на основе МТТ, когда клетки обрабатывали возрастающими концентрациями TRAIL или антитела против DR5. Аналогичная кривая доза-ответ и значение EC 50 были получены как для клеток parental_MB231, так и для клеток MB231_CFP-YFP при обработке TRAIL или антителом против DR5 (фиг. 2A и таблица 1).При анализе индукции апоптоза обе клеточные линии показали аналогичное дозозависимое увеличение апоптозных клеток после обработки TRAIL или антителом против DR5 (рис. 2В). Эти данные показывают, что трансфекция биосенсора FRET не влияла на клеточный ответ на терапию, направленную на DR. Стабильная линия клеток MB231_CFP-YFP, по-видимому, сохраняет интактный аппарат апоптоза, что поддерживает ее использование в качестве клеточного субстрата для тестирования цитотоксичности противораковых препаратов.

    Рисунок 2. Клетки MB231_CFP-YFP сохраняют чувствительность к TRAIL и антителам против DR5.

    (A) Родительские клетки MB231 (закрашенные черным) и MB231_CFP-YFP (открытые прозрачные) обрабатывали TRAIL (0–100 нг / мл) в течение 2,5 ч или антителами против DR5 (0–200 мкг / мл) в течение 20 часов. ч при указанных концентрациях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-анализа. (B) Клетки обрабатывали, как в A, и анализировали на апоптоз проточной цитометрией после окрашивания аннексином-V-APC и йодидом пропидия (PI). p-значения были определены с использованием t-критерия Стьюдента. Значения EC 50 были определены с использованием аппроксимации нелинейной кривой, как описано в разделе «Материалы и методы».Для каждого значения EC 50 95% доверительные интервалы, отражающие статистическую точность, представлены в таблице 1.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g002

    Затем мы оценили расщепление зонда FRET в ответ на лечение TRAIL или антителом против DR5. С этой целью клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали TRAIL и антителом против DR5. Иммуноблот-анализ выявил корреляцию между активацией каспазы и расщеплением зонда CFP-линкер-YFP FRET при всех уровнях доз (рис. 3A и 3B).

    Рисунок 3. Расщепление зонда FRET указывает на активацию каспазы.

    Клетки обрабатывали (A) 0–300 нг / мл TRAIL в течение 2,5 часов или (B) 0–50 мкг / мл антитела против DR5 в течение 20 часов. Полученные клетки анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител, специфичных к каспазе 3 (C3), каспазе 8 (C8) и CFP / YFP.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g003

    Для измерения FRET клетки MB231_CFP-YFP культивировали в 96-луночных планшетах в течение ночи в среде DMEM.Среду для культивирования клеток удаляли и буфер PBS, содержащий различные концентрации TRAIL или антитела против DR5, добавляли к прикрепленным клеткам на 2,5 часа и 20 часов соответственно. В указанные моменты времени сигналы FRET измеряли непосредственно на отдельных образцах с настройкой возбуждения 425 ± 10 нм и настройкой излучения 530 ± 5 нм для YFP и 486 ± 5 нм для CFP с использованием флуоресцентного ридера для планшетов. Дозозависимое снижение FRET было идентифицировано с увеличением концентрации TRAIL и антител против DR5 (фиг. 4A и 4B).Значения FRET были нормализованы и нанесены на график в зависимости от логарифмического значения TRAIL и концентрации антител против DR5 в молях с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (рис. 4A и 4B), что дает значения EC 50 после подгонки нелинейной кривой к уравнению 2 (таблица 1). Примечательно, что анализ FRET дал значения EC 50 , которые согласуются со значениями из обычных анализов (MTT, проточная цитометрия и анализ иммуноблоттинга). В совокупности эти данные подтверждают использование клеточного анализа FRET для анализа биологической активности терапии, нацеленной на DR.Конфокальная микроскопия также использовалась для оценки изменения клеточного FRET, когда клетки MB231_CFP-YFP обрабатывались TRAIL (рис. 4C). Выраженный сдвиг от эмиссии акцептора YFP (желтый) к эмиссии донора CFP (голубой) можно наблюдать для клеток, обработанных увеличивающейся концентрацией TRAIL с настройкой возбуждения = 458 нм.

    Рис. 4. Клеточный биосенсор FRET обеспечивает поддающийся количественной оценке ответ на лечение рака, нацеленного на рецепторы смерти.

    Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали (A) 0–300 нг / мл TRAIL для 2.5 часов и (B) 0–100 мкг / мл антитела против DR5 в течение 20 часов. FRET был рассчитан и представлен в виде гистограмм в левой части панели. Значения EC 50 определяли путем аппроксимации нелинейной кривой к нормализованным значениям FRET, нанесенным на график в зависимости от логарифмических значений TRAIL и концентрации антител против DR5 в молях (правая часть панели). (C) Изображения конфокальной микроскопии, показывающие изменения FRET в клетках MB231_CFP-YFP, обработанных 0-25 нг / мл TRAIL в течение 2,5 часов. Выраженный сдвиг от эмиссии акцептора YFP (желтый) к эмиссии донора CFP (голубой) можно наблюдать для клеток, обработанных увеличивающейся концентрацией TRAIL, с настройкой возбуждения = 458 нм.Статистический анализ проводился как на рис. 1 и 2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g004

    Применение клеточного FRET-анализа для оценки биологической активности химиотерапевтических средств против рака

    Мы спросили, может ли сконструированный зонд FRET быть адаптирован для анализа низкомолекулярных лекарств, которые функционируют посредством модуляции внутренних сигнальных путей апоптоза. К этой категории относятся многие классические химиотерапевтические препараты. Сначала мы протестировали стауроспорин и камптотецин, так как оба они, как известно, являются мощными индукторами апоптоза в различных типах клеток [7], [26].С этой целью клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали стауроспорином или камптотецином. Дозозависимое снижение FRET наблюдалось с увеличением концентрации каждого отдельного агента (рис. 5А). Аппроксимация нелинейной кривой дала значения EC 50 , которые, в частности, сопоставимы со значениями, полученными с помощью МТТ-анализа (рисунок 5B, таблица 1). Мы расширили исследование, включив в него несколько других химиотерапевтических препаратов, включая этопозид, компактин, 5-ФУ и таксол. Эти препараты действуют через генотоксический и цитоскелетный стресс и приводят к последующему подавлению роста и / или апоптотической гибели клеток, в зависимости от условий эксперимента и целевых клеток [5] - [7].Соответственно, наблюдаемые изменения сигнала FRET были идентифицированы, когда клетки MB231_CFP-YFP обрабатывались каждым химиотерапевтическим агентом (рис. 5C). Однако их способность индуцировать апоптоз, зависящий от каспазы 3/8, оказалась намного ниже, чем у TRAIL или антител против DR5, что требует как высокой концентрации (100 мкг / мл), так и более длительных периодов инкубации (72 часа) по сравнению с эффективностью. TRAIL (EC50 ∼0,05–0,08 нМ) и анти-DR5 (EC50 ∼0,24–0,80 нМ). Эти данные демонстрируют способность клеточного зонда FRET количественно определять активность, индуцирующую апоптоз, как биологических, так и химиотерапевтических агентов.Путем точной настройки экспериментальных условий тесты FRET можно использовать для прямого сравнения биологической активности различных противораковых препаратов in vitro.

    Рисунок 5. FRET-анализ биоактивности химиотерапевтических агентов.

    (A) Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали 0–100 мкг / мл стауроспорина в течение 20 часов и 0–1,7 мкг / мл камптотецина в течение 72 часов. Дозозависимые изменения сигналов FRET определяли, как показано на рис. 4. (B) МТТ-анализ использовали для оценки жизнеспособности клеток в ответ на обработку клеток parental_MB231 (закрашено черным цветом) и MB231_CFP-YFP (открытое прозрачное) 0-25 мкг. / мл стауроспорина в течение 20 ч и 0–7.7 мкг / мл камптотецина в течение 72 ч соответственно. (C) Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали химиотерапевтическими агентами (100 мкг / мл) в течение 72 часов. Измерение и анализ FRET выполняли, как на рис. 4. Статистический анализ выполняли, как на рис. 1 и 2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g005

    Обсуждение

    Мы разработали клеточный биосенсор FRET для измерения активности препаратов, вызывающих апоптоз. Наш анализ FRET, по-видимому, превосходит другие обычно используемые анализы апоптоза, учитывая его простоту, стабильность, удобство и надежность.Мы ожидаем, что с учетом этих преимуществ стабильно экспрессируемый зонд FRET может быть адаптирован для использования в будущих исследованиях по открытию и разработке соответствующих лекарств.

    Целью лечения рака является уничтожение раковых клеток. Следовательно, анализ активности должен быть разработан таким образом, чтобы отразить механизм действия лекарственного средства, то есть индуцировать апоптоз или другие формы гибели клеток. Апоптоз - распространенная форма гибели клеток, связанная с лечением рака как in vitro, , так и in vivo . Для обнаружения и измерения апоптоза доступно несколько методов, включая проточную цитометрию, микроскопию, иммуноблоттинг и анализы на основе каспазных субстратов [14], [27] - [29].Эти методологии являются мощными исследовательскими инструментами при изучении апоптоза, но каждый метод связан с присущими ему ограничениями, включая, помимо прочего, невозможность оптимизации с высокой пропускной способностью, изменчивость, связанную с проницаемостью клеток материалов, необходимых для сигнала считывания, требованием клетки лизис и высокий фоновый шум [17]. Из-за этих ограничений все еще существует потребность в стандартном и надежном анализе апоптоза. Хотя несколько групп сообщили о клеточной экспрессии слитого белка на основе GFP, который может действовать как субстрат каспазы и обнаруживать изменения в клеточном FRET при индукции апоптоза, методы обнаружения в этих случаях в первую очередь полагались на конфокальную микроскопию и проточную цитометрию [15], [15] [ 30] - [33].Предоставляя ценную информацию, эта рабочая процедура не идеальна для надежного и высокопроизводительного анализа активности. Примечательно, что есть редкие сообщения, в которых используется формат планшетов с пропускной способностью [34], [35]. Наш клеточный FRET-анализ позволяет беспрецедентно определять активность каспазы 3 и каспазы 8 в формате микропланшета с использованием линии клеток рака груди человека. Эта комбинация каспаз позволяет охарактеризовать любой агент, который может индуцировать апоптоз внутренним или внешним путем, или обоими способами.Кроме того, наша методология была специально адаптирована для устранения фоновой автофлуоресценции, связанной со средой для культивирования клеток; это помогает достичь улучшенного отношения сигнал / шум и позволяет избежать сильного вычитания фона, что может усложнить вычисления FRET. Кроме того, наша работа строго сосредоточена на пригодности описанного анализа для функционирования в качестве теста на эффективность сложных белковых препаратов, нацеленных на рецепторы смерти, в то время как другие работы в основном сосредоточены на открытии низкомолекулярных лекарств.

    Одно из ограничений нашего анализа связано с доступностью молекулярных мишеней в клетках MDA-MB-231 для конкретной молекулы лекарства. Например, известно, что клетки MDA-MB-231 обладают недостаточной экспрессией рецептора Her2, что делает анализ непригодным для оценки моноклональных антител против HER2, одобренных для использования при лечении рака груди. Этот недостаток, однако, можно легко устранить либо путем экспрессии зонда CFP-YFP FRET в HER2-положительной линии клеток, либо путем трансфекции HER2 в линию клеток MB231_CFP-YFP.В принципе, стабильные клетки MB231_CFP-YFP могут служить в качестве матрицы, которая может быть сконструирована для экспрессии молекулярной мишени (мишеней) для конкретного лекарственного средства. Кроме того, зонд CFP-YFP FRET может быть включен в другие линии раковых клеток для тестирования соответствующих интересующих лекарств. Следует также отметить, что описанный зонд FRET не подходит для лекарств, которые убивают раковые клетки посредством независимых от каспаз механизмов, или лекарств, убивающих клетки посредством активации каспаз, отличных от каспазы 3 или 8, таких как апоптоз или некроптоз, опосредованный каспазой 2.Тем не менее, анализ FRET, описанный в этой работе, позволяет осуществлять одноэтапное обнаружение и измерение апоптоза для обработанных клеток, что делает его привлекательным подходом к быстрому и надежному анализу эффективности противораковых препаратов или лекарств-кандидатов, которые вызывают каспазозависимый апоптоз. Важно отметить, что платформа на основе FRET также позволяет различать препараты, вызывающие гибель клеток, и препараты, вызывающие ингибирование роста, что, в свою очередь, может определять выбор комбинированной терапии для лучшего результата лечения рака.

    Благодарности

    Мы благодарим докторов наук. Эми Розенберг и Серж Бокаж за критическое прочтение рукописи. Отказ от ответственности: комментарии и обсуждения в этой статье основаны на наших экспериментальных данных и обзоре соответствующих научных публикаций. Они не обязательно отражают официальную точку зрения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в отношении анализов активности для использования при оценке онкологических лекарственных препаратов.

    Вклад авторов

    Эксперимент задумал и спроектировал: БЖ.Проведены эксперименты: WB XD KT SP. Проанализированы данные: WB XD KT LR. Участвовал в написании рукописи: BZ WB XD LR.

    Ссылки

    1. 1. Waldman SA (2002) Предсказывает ли потенция клиническую эффективность? Иллюстрация через антигистаминную модель. Ann Allergy Asthma Immunol 89: 7–11 S1081-1206 (10) 61904-7 [pii]; 10.1016 / S1081-1206 (10) 61904-7 [doi].
    2. 2. Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ и др. (1988) Возможность скрининга лекарств с панелями линий опухолевых клеток человека с использованием анализа тетразолия в микрокультурах.Cancer Res 48: 589–601.
    3. 3. Shoemaker RH (2006) Скрининг противоопухолевых препаратов линии опухолевых клеток человека NCI60. Nat Rev Cancer 6: 813–823 nrc1951 [pii]; 10.1038 / nrc1951 [doi].
    4. 4. Кремер Дж., Галлуцци Л., Ванденабил П., Абрамс Дж., Алнемри Е.С. и др. (2009) Классификация клеточной смерти: рекомендации Номенклатурного комитета по клеточной смерти 2009. Cell Death Differ 16: 3–11 cdd2008150 [pii]; 10.1038 / cdd.2008.150 [doi].
    5. 5. Хагг М., Бивен К., Уэно Т., Ридлендер Л., Бьорклунд П. и др.(2002) Новый тест с высокой пропускной способностью для скрининга проапоптотических препаратов. Инвестируйте новые лекарства 20: 253–259.
    6. 6. Ли Y, Yu J, DU D, Fu S, Chen Y и др. (2013) Участие посттранскрипционной регуляции FOXO1 с помощью HuR в 5-FU-индуцированном апоптозе в клетках рака молочной железы. Oncol Lett 6: 156–160 10.3892 / ol.2013.1352 [doi]; ol-06-01-0156 [pii].
    7. 7. Степчинска А., Лаубер К., Энгельс И.Х., Янссен О., Кабелиц Д. и др. (2001) Стауроспорин и обычные противоопухолевые препараты вызывают перекрывающиеся, но разные пути апоптоза и активации каспаз.Онкоген 20: 1193–1202 10.1038 / sj.onc.1204221 [doi].
    8. 8. Абдулгани Дж., Эль-Дейри В.С. (2010) Передача сигналов рецептора TRAIL и терапия. Мнение эксперта Ther Targets 14: 1091–1108 10.1517 / 14728222.2010.519701.
    9. 9. Zhou L, Wang W, Dicker DT, Humphreys RC, El-Deiry WS (2011) Прогнозирование проапоптотического противоракового терапевтического ответа in vivo на основе визуализации клеточной смерти и взаимодействия лиганд-рецептор смерти TRAIL. Cancer Biol Ther 12 335–348: 17174.
    10. 10.Walczak H (2013) Системы рецептор-лиганд смерти при раке, гибели клеток и воспалении. Колд-Спринг-Харб Perspect Biol 5: a008698 5/5 / a008698; 10.1101 / cshperspect.a008698.
    11. 11. Джонстон Р.В., Фрю А.Дж., Смит М.Дж. (2008) Путь апоптоза TRAIL в возникновении, прогрессировании и терапии рака. Nat Rev Cancer 8: 782–798, nrc2465; 10.1038 / nrc2465.
    12. 12. Smith GS, Voyer-Grant JA, Harauz G (2012) Мониторинг активности расщепленной каспазы-3 и апоптоза иммортализованных олигодендроглиальных клеток с использованием визуализации живых клеток и расщепляемых субстратов флуорогенного красителя после индуцированной калием деполяризации мембраны.J Vis Exp. 3422 [pii]; 10,3791 / 3422 [doi].
    13. 13. Prasuhn DE, Feltz A, Blanco-Canosa JB, Susumu K, Stewart MH, et al. (2010) Пептидные биосенсоры на квантовых точках для мониторинга протеолиза каспазы 3 и ионов кальция. ACS Nano 4: 5487–5497 10.1021 / nn1016132 [doi].
    14. 14. Kaufmann SH, Kottke TJ, Martins LM, Henzing AJ, Earnshaw WC (2001) Анализ активации каспаз во время апоптоза. Curr Protoc Cell Biol Глава 18: Единица. 10.1002 / 0471143030.cb1802s11 [doi].
    15. 15. Wu X, Simone J, Hewgill D, Siegel R, Lipsky PE, et al. (2006) Измерение активности двух каспаз одновременно в живых клетках с помощью нового двойного флуоресцентного индикаторного зонда FRET. Cytometry A 69: 477–486 10.1002 / cyto.a.20300 [doi].
    16. 16. Wang ZQ, Liao J, Diwu Z (2005) N-DEVD-N’-морфолинкарбонил-родамин 110: новые флуорогенные субстраты каспазы-3 для клеточного анализа апоптоза. Bioorg Med Chem Lett 15: 2335–2338 S0960-894X (05) 00274-X [pii]; 10.1016 / j.bmcl.2005.02.081 [doi].
    17. 17. Brunelle JK, Zhang B (2010) Анализы апоптоза для количественной оценки биоактивности противораковых лекарственных препаратов. Обновление Drug Resist 13: 172–179 S1368-7646 (10) 00039-7 [pii]; 10.1016 / j.drup.2010.09.001 [doi].
    18. 18. Zhang Y, Zhang B (2008) TRAIL-резистентность клеток рака молочной железы связана с конститутивным эндоцитозом рецепторов смерти 4 и 5. Mol Cancer Res 6: 1861–1871 6/12/1861 [pii]; 10.1158 / 1541-7786.MCR -08-0313 [doi].
    19. 19. Zhang Y, Rivera Rosado LA, Moon SY, Zhang B (2009) Подавление D4-GDI ингибирует рост и инвазивное поведение в клетках MDA-MB-231 за счет активации Rac-зависимой передачи сигналов p38 и JNK. J Biol Chem 284: 12956-12965 M807845200 [pii]; 10.1074 / jbc.M807845200 [doi].
    20. 20. Zhang B, Zhang Y, Dagher MC, Shacter E (2005) Ингибитор диссоциации Rho GDP защищает раковые клетки от апоптоза, вызванного лекарствами. Cancer Res 65: 6054–6062 65/14/6054 [pii]; 10.1158 / 0008-5472.CAN-05-0175 [doi].
    21. 21. Мастерс А., Харрисон П. (2013) Подсчет тромбоцитов с помощью проточного цитометра BD Accuri C6. Тромбоциты. 10.3109 / 09537104.2013.801947 [doi].
    22. 22. van RJ, Langeslag M, Jalink K (2004) Корректировка конфокального сбора для оптимизации отображения резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью сенсибилизированного излучения. Biophys J 86: 2517–2529 S0006-3495 (04) 74307-6 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (04) 74307-6 [doi].
    23. 23. Клегг Р.М. (1996) Флуоресцентный резонансный перенос энергии.В: X.F.Wang, B.Herman, редакторы. Флуоресцентная спектроскопия и микроскопия. 179–252.
    24. 24. Xia Z, Liu Y (2001) Надежное и глобальное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием флуоресцентных микроскопов. Biophys J 81: 2395-2402 S0006-3495 (01) 75886-9 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (01) 75886-9 [doi].
    25. 25. Gordon GW, Berry G, Liang XH, Levine B, Herman B (1998) Количественные измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии с использованием флуоресцентной микроскопии.Biophys J 74: 2702–2713 S0006-3495 (98) 77976-7 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (98) 77976-7 [doi].
    26. 26. Nieves-Neira W, Pommier Y (1999) Апоптотический ответ на камптотецин и 7-гидроксистауроспорин (UCN-01) в 8 клеточных линиях рака груди человека из NCI Anticancer Drug Screen: многофакторные взаимосвязи с топоизомеразой I, протеинкиназой C, Bcl- 2, p53, MDM-2 и каспазные пути. Int J Cancer 82: 396–404 10.1002 / (SICI) 1097-0215 ​​(199

      ) 82: 3 <396 :: AID-IJC13> 3.0.CO; 2-Z [pii].

    27. 27. Демченко А.П. (2012) Изменение клеточных мембран при апоптозе: детекция флуоресценции. Опыт Онкол 34: 263–268. 3559 [pii].
    28. 28. Muppidi J, Porter M, Siegel RM (2004) Измерение апоптоза и других форм гибели клеток. Curr Protoc Immunol Глава 3: Блок. 10.1002 / 0471142735.im0317s59 [doi].
    29. 29. Крыско Д.В., Ванден Берге Т., Д’Херде К., Ванденабеле П. (2008) Апоптоз и некроз: обнаружение, различение и фагоцитоз.Методы 44: 205–221 S1046-2023 (08) 00002-9 [pii]; 10.1016 / j.ymeth.2007.12.001 [doi].
    30. 30. He L, Wu X, Meylan F, Olson DP, Simone J и др. (2004) Мониторинг активности каспаз в живых клетках с помощью флуоресцентных белков и проточной цитометрии. Am J Pathol 164: 1901–1913 S0002-9440 (10) 63751-0 [pii]; 10.1016 / S0002-9440 (10) 63751-0 [doi].
    31. 31. Kawai H, Suzuki T, Kobayashi T., Sakurai H, Ohata H, et al .. (2005) Одновременное обнаружение в реальном времени активации инициатора и эффекторной каспазы с помощью анализа переноса энергии двойного флуоресцентного резонанса.J Pharmacol Sci 97: 361–368. JST.JSTAGE / jphs / FP0040592 [pii].
    32. 32. Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC (2001) Применение метода флуоресцентного резонансного переноса энергии для изучения динамики активации каспазы-3 во время УФ-индуцированного апоптоза в живых клетках HeLa. Biochem Biophys Res Commun 283: 1054-1060 10.1006 / bbrc.2001.4896 [doi]; S0006-291X (01) 94896-X [pii].
    33. 33. Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC (2003) Измерение динамики активации каспазы-8 в одной живой клетке HeLa во время апоптоза, индуцированного TNFalpha.Biochem Biophys Res. Commun. 304: 217–222. S0006291X0300559X [pii].
    34. 34. Jones J, Heim R, Hare E, Stack J, Pollok BA (2000) Разработка и применение внутриклеточного анализа каспазы GFP-FRET для скрининга лекарств. J Biomol Screen 5: 307–318.
    35. 35. Zhu X, Fu A, Luo KQ (2012) Анализ апоптоза эндотелиальных клеток на основе высокопроизводительного флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и его применение для скрининга агентов, разрушающих сосуды. Biochem Biophys Res Commun 418: 641–646 S0006-291X (12) 00100-3 [pii]; 10.1016 / j.bbrc.2012.01.066 [doi].

    (PDF) Резонансный перенос энергии Форстера (FRET) с донорно-акцепторной системой, адсорбированной на серебряных или золотых наноостровках

    с 300 нм (сплошная линия). Перекрытие между флуоресцентным излучением

    и полосой рассеяния подложки с покрытием из серебра

    отличное. Напротив, спектр покрытой золотом подложки

    полностью отстроен от излучения флуорофора.

    22

    Таким образом, серебро представляется лучшим выбором, в то время как золото

    может оказать пагубное влияние на работу соединения 1

    .

    Выводы

    Мы изучили FRET-свойства SAM новой

    ковалентно связанной донорно-акцепторной пары D – A, состоящей из

    двух нафталиновых групп, действующих как доноры, и бензофуразановой группы

    , действующей как акцептор и адсорбированной на Ag и Au

    NIF. Спектроскопия SERS подтвердила его адсорбцию на металле

    даже без какой-либо конкретной функционализации и предоставила

    информацию о природе хемосорбции. Для обоих металлов

    мы наблюдали хорошо разрешенный эффект FRET, характеризуемый

    интенсивным сигналом флуоресценции в зеленой области спектра

    , который был вдвое более интенсивным в случае НИФ Ag

    .Хотя наши тесты не могут помочь дать окончательное объяснение этого результата

    , тем не менее наш АСМ-анализ и спектроскопия экстинкции

    показывают, что ценный вклад в

    флуоресцентного излучения антенны на серебре можно отнести к резонансам рассеяния. , что согласуется с моделью излучающего плазмона

    . В этом кадре мы можем заключить, что

    процесс автоорганизации, используемый для создания металлических нано-структур

    , более благоприятен для путей радиационного распада на

    AgNIF по сравнению с AuNIF.

    Такие находки могут помочь в разработке подходящих металлических подложек

    , которые эффективно преобразуют передачу энергии, которая происходит внутри молекулы

    , в излучение. Перспективным применением

    является разработка флуоресцентных хемосенсоров.

    23

    Например, предварительные испытания показали, что контакт

    SAM соединения 1 на Ag с водными растворами

    , содержащими следы Cu

    2+

    , вызывает чистое и селективное тушение

    Флюоресценция.В этом смысле будущая работа

    будет сосредоточена на разработке SAM новых систем D – A, содержащих

    групп D, поглощающих в видимой области электромагнитного спектра

    , где доступны дешевые источники в виде лазерных диодов.

    Возможность работы с видимыми длинами волн

    также открыла бы путь к использованию распространения поверхностных плазмонов

    на границах раздела серебро / хромофор, что представляет собой мощную

    альтернативу использованию локализованных поверхностных плазмонов для эффективного усиления

    финальной флуоресценции.

    24

    Благодарности

    Финансирование от итальянского FIRB 2004 «Молекулярные соединения

    и гибридные наноструктурированные материалы с резонансными и не

    резонансными оптическими свойствами для фотонных устройств» (номер контракта

    RBNE033KMA) и от PRIN 2007 Подтвержден договор «Металлоорганические плазмонные наноструктуры

    для сенсоров» №1 2007LN873M_002

    .

    Ссылки

    1 А. Андронов и Дж. М. Фреше

    ´

    т, Chem.Commun., 2000, 1701;

    F. V. R. Neuwahl, R. Righini, A. Andronov, P. R. Malenfant и

    J. M. Freche

    ´

    t, J. Phys. Chem. В, 2001, 105, 1307; A. Bar-Haim,

    J. Klafter и R. Kopelman, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119,

    6197; A. W. Freeman, S. C. Koene, P. R. L. Malenfant,

    M. E. Thompson и J. M. Freche

    ´

    t, J. Am. Chem. Soc., 2000,

    ,

    , 122, 12385; В. Бальзани, П. Черони, М. Маэстри, К.Саудан и

    В. Вичинелли, Верх. Curr. Chem., 2003, 288, 159; V. Balzani,

    P. Ceroni, M. Maestri и V. Vicinelli, Curr. Opin. Chem. Биол.,

    2003, 7, 657; D. W. Brousmiche, J. M. Serin, J. M. J. Fre

    ´

    chet,

    G. S. He and R. Kannan, J. Phys. Chem. B, 2004, 108, 8592.

    2 L. Basabe-Desmonts, D. N. Reinhoudt и M. Crego-Calama,

    Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 993; К. Э. Сапсфорд, Л. Берти и

    И.Л. Мединц, Angew. Chem., Int. Ed., 2006, 45, 4562.

    3 A. B. Doust, X. Yang, T. E. Dykstra, K. Koo and G. D. Scholes,

    Appl. Phys. Lett., 2006, 89, 213505.

    4 PL Gentili, M. Mugnai, L. Bussotti, R. Righini, P. Foggi,

    S. Cicchi, G. Ghini, S. Viviani and A. Brandi, J Photochem.

    Photobiol. A: Chem., 2006, 18, 209.

    5 (a) G. Calzaferri, H. Li, Proc. SPIE, 2008,7002,

    700202-1–700202-7; (b) А.З. Руис, Х. Ли и Г.Calzaferri, Angew.

    Chem., Int. Ed., 2006, 45, 5282; (c) Х. Спанггаард, Ф. К. Кребс,

    М. Йоргенсен, Н. Розлосник, Н. Б. Ларсен и О. Хагеманн, Proc.

    SPIE – Int.Soc.Opt.Eng., 2005,5938,59380V; (d) M.Sakomura,

    T. Takagi, H. Nakayama, R. Sawada и M. Fujihira, Colloids

    Surf., A, 2002,198–200 769.

    6 Э. Джорджетти, М. Мунис-Миранда, Г. Маргери, А. Джусти,

    С. Соттини, М. Аллоизио, К. Куниберти и Г. Деллепиане, Лангмюр,

    2006,

    22, 1129 .

    7 J. R. Lakowicz, Anal. Biochem., 2005, 337, 171.

    8 M. P. Kreuzer, R. Quidant, J. P. Salvador, M. P. Marco и

    G. Badenes, Anal. Биоанал. Chem., 2008, 391, 1813.

    9 Н. Т. Ким, З. Розенцвейг, Anal. Chem., 2002, 74, 741624.

    10 WS Rasband, ImageJ, Национальные институты здравоохранения США,

    Bethesda, Мэриленд, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997.

    11 I. Horcas, R. Ferna

    ´

    ndez, JM Go

    ´

    mez-Rodrı

    ´

    guez and J.Colchero,

    Rev. Sci. Instrum., 2007, 78, 13705.

    12 H. Morawitz, M. R. Philpott, Phys. Ред. B: Конденс. Matter

    Mater. Phys., 1974, 10, 4863.

    13 Х. Беккер, С. Э. Бернс, Р. Х. Френд, Phys. Ред. B: Конденс.

    Matter Mater. Phys., 1997, 56, 1893.

    14 J. Zhang, Yi. Fu, J. R. Lakowicz, J. Phys. Chem. C, 2007,

    111 (1), 50.

    15 K. LanceKelly, E. Coronado, Lin Lin Zhao и G.C.Shatz,

    J.Phys. Chem. B, 2003, 107, 668.

    16 H. Heberer, H. Matschiner, J. Prakt. Chem., 1986, 328, 261.

    17 A. M. Schwartzberg, C. D. Grant, A. Wolcott, C. E. Talley,

    T. R. Huser, R. Bogomolni и J. Z. Zhang, J. Phys. Chem. B,

    2004, 108, 19191.

    18 К. Дж. Аддисон и А. Г. Броло, Langmuir, 2006, 22, 8696.

    19 С. К. Гош и Т. Пал, Chem. Rev., 2007, 107, 4797.

    20 A. A. Lazarides, G. C. Schatz, J. Phys. Chem. В, 2000, 104, 460.

    21 KH Su, QH Wei, X. Zhang, JJ Mock, DR Smith и

    S. Schultz, Nano Lett., 2003, 3, 1087.

    22 Y. Chen, K. Munechika and DS Ginger, Nano Lett., 2007,

    7 (3), 690.

    23 M. Arduini, S. Marcuz, M. Montolli, E. Rampazzo, F. Mancin,

    S. Gross, L. Armelao, P. Tecilla and U. Tonellato, Langmuir, 2005,

    21, 9314.

    24 T. Neumann, ML Johansson, D. Kambhampati and W. Knoll,

    Adv. Функц.Матер.

    , 2002, 12, 575.

    Рис. 8 Спектры экстинкции AgNIF с 1 покрытием (пунктирная линия),

    AuNIF с покрытием 1

    (штриховая линия) и флуоресцентное излучение раствора этанола

    из 1 для возбуждения с 300 нм (сплошная линия).

    Это журнал

    c

    Общества владельцев 2009 Phys.Chem.Chem.Phys., 2009, 11, 9798–9803 | 9803

    Противники тайской хунты недовольны планом амнистии заговорщиков

    Эми Савитта Лефевр БАНГКОК (Рейтер) - В соответствии с новой конституцией, которая разрабатывается комитетом, назначенным хунтой Таиланда и призванным защищать страну от «парламентской диктатуры» , организаторы прошлогоднего военного переворота будут пользоваться иммунитетом от судебного преследования.Два человека из 36 членов редакционного комитета, которые отказались назвать свое имя из-за секретности, связанной с новым уставом, сообщили Reuters, что статья об амнистии была принята на прошлой неделе без особых дебатов. Критики хунты говорят, что это положение является одним из нескольких предложенных конституционных изменений, которые вернут часы Таиланда назад в эпоху слабых политических партий до 1997 года, в которых доминировали роялистская и военная элита. Рейтер не видел проект конституции полностью, но ранее сообщалось, что положения, которые также могут вызывать споры, включают предложение избирать сенаторов верхней палаты из числа кандидатов, выбранных бывшими политиками и военными.В проекте предлагается создать совет так называемых «мудрецов» для наблюдения за реформами, одобренными хунтой, и план пропорционального представительства, который повысит вероятность коалиционных правительств и потенциально нейтрализует оппозицию. Нипит Интрасомбат, заместитель лидера консервативной демократической партии, которая является конкурентом партии Пуэа Тай, свергнутой в результате переворота 2014 года, сказал, что лидер хунты и премьер-министр Прают Чан-оха может попытаться продлить свою власть. «За последнюю неделю Прают послал тревожные сигналы, которые показывают, что если Таиланд не будет обеспечен военными, то всеобщие выборы, запланированные на следующий год, могут быть отложены», - сказал Нипит Рейтер.«НЕ МОЖЕТ ВЛАСТИ». Выборы уже отложены с 2015 года, и политические противники хунты обеспокоены тем, что они могут быть отложены снова, если военные захотят. Прайют все больше раздражается на журналистов, которые ставят под сомнение его методы, что побудило Совет по новостному вещанию Таиланда (NBCT) опубликовать заявление, предупреждающее его, что он рискует выглядеть деспотом. Прают отрицает обвинения. «Я не голоден до власти», - сказал он в среду. «Я не диктатор, как многие меня обвиняют.Киат Ситтиаморн, высокопоставленный член Демократической партии, сказал, что некоторые статьи проекта конституции могут быть необходимы для пресечения «злоупотребления властью» неназванными политиками. быть подходящими механизмами сдержек и противовесов ". Но его коллега Нипит сказал, что некоторые политики чувствовали себя исключенными из планов военной реформы. Комитет по разработке конституции, который начал работу в январе, провел ежедневные закрытые заседания в здании парламента в Бангкок, с ограниченными общественными консультациями, несмотря на обещания «народной хартии».«Наша точка зрения не была принята комитетом по разработке конституции», - сказал Нипит. «У этой конституции есть механизм, который не позволяет ее изменять в течение пяти лет, и если она будет плохо написана, возникнет политический тупик». Общественное недовольство хунтой во главе с Праютом растет. Военное положение, которое он ввел незадолго до переворота в мае прошлого года, было отменено поздно вечером в среду. Прают хочет заменить его законом, который поддерживает широкие полномочия армии, включая возможность задерживать людей на срок до семи дней без предъявления обвинений.ПОЛОЖЕНИЕ ОБ АМНИСТИИ СООТВЕТСТВУЕТ КРИЗИСУ 2013 ГОДА Потенциально самым взрывным изменением в проекте хартии является амнистия, касающаяся переворота в мае прошлого года, потому что она перекликается с законопроектом, предложенным в 2013 году правящей тогда партией Пуэа Тай и призванным очистить кого-либо от правонарушений, совершенных во время беспорядков, последовавших за Военный переворот 2006 года. Противники более ранней амнистии заявили, что она была направлена ​​на то, чтобы позволить свергнутому тогда премьер-министру Таксину Чинаватре вернуться в Таиланд из изгнания без необходимости отбывать два года тюрьмы за коррупцию.Сенат отклонил законопроект в ноябре 2013 года, но это не остановило смертоносных протестов, которые длились шесть месяцев и спровоцировали прошлогодний политический кризис. «Этот (2015 г.) проект разработан таким образом, что он станет еще хуже, чем конституции, обнародованные около 30 лет назад, которые позволили неизбранным лицам при поддержке вооруженных сил присоединиться», - сказал Ануттама Аморнвиват, заместитель секретаря. генерал партии Пуэа Тай. Она имела в виду конституцию 1976 года, которая фактически установила гражданскую диктатуру при бескомпромиссном роялисте премьер-министре Танине Крайвичиене.Таиланд пребывает в состоянии почти постоянного беспорядка с 2006 года, когда Таксин был свергнут армией. Его младшая сестра Йинглак была свергнута в результате прошлогоднего переворота.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *