Лада 4х4 новая: LADA 4×4 Vision Concept 2021: обзор, фото Concept 2021: обзор, фото, новости

Содержание

5 вариантов новой Нивы — какой вам по душе? — журнал За рулем

Вспоминаем, как на АВТОВАЗе придумывали новую Ниву и почему сегодняшний вариант вызывает дежавю.

Материалы по теме

Первое поколение Нивы, теперь известное под названием Niva Legend, появилось в модельном ряду ВАЗа в далеком 1977 году. С тех пор модель пережила две крупные модернизации и несколько «косметических операций», а также породила второе поколение внедорожников, теперь именуемое Niva Travel.

У нас есть изображение, указывающее на внешность третьего поколения, которое в 2024 году станет еще одной моделью в семействе Нива — все три генерации будут выпускаться параллельно как минимум до 2026 года.

Вероятно, у многих в момент показа тизера новой Niva возникло ощущение, что где-то такое уже попадалось. Конечно, представленная внешность опирается на облик классического ВАЗ-2121 Нива, но как будто дело не только в этом.

Создание облика внедорожника новой генерации на АВТОВАЗе началось еще до прихода Стива Маттина.

И даже когда британец уже находился в статусе главного дизайнера Лады, за новую Lada 4×4 (тогда бренд Niva принадлежал GM) он взялся далеко не сразу, ограничившись освежением внешности старой и представив Lada 4×4 Urban.

Новая Нива. Начало (2012–2014)

Что касается так называемой Lada 4×4 New, то на АВТОВАЗе она некоторое время виделась брутальным, немного угловатым автомобилем, наследницей прежнего стиля. Поговаривали, что в плане конструктива есть пересечения со вторым поколением Chevrolet Niva, которому, как мы теперь знаем, не суждено было появиться.

Из утечек информации с предприятия было известно также, что планируется две версии — трех- и пятидверная. Один из поисковых вариантов (на фото выше) в 2014 году засветился на шпионских изображениях.

А спустя целых три года в Сети появилось еще одно фото, относившееся к тому же 2014 году — так трехдверная Lada 4×4 изображалась тогда в презентации по развитию модельного ряда:

Нива из параллельной Вселенной (2012–2017)

Все эти годы представить новый вазовский внедорожник пытались и независимые дизайнеры. Вариантов сделано множество, но один из них наделал шума — и запомнился — больше остальных. Именно работа дизайнера Дмитрия Дьяченко, творящего под псевдонимом Hexxen, вызывает сегодня этот эффект узнавания: кажется, что Жан-Филипп Салар, новый дизайнер Lada, изрядно «вдохновился» проектом Hexxen.

Представитель сообщества Новая Lada Niva 2024 связался с Дмитрием Дьяченко, и вот как он сам рассказывает о своей работе и комментирует это разительное сходство: «Вдохновением служила, многим сложно в это поверить, — Нива! Через это любой другой проект Нивы, автор которого бережно отнесся к оригиналу, будет так или иначе похож на мой». С 2012 по 2017 годы Дьяченко нарисовал несколько вариантов разной степени проработки, публикуя их на сайте cardesign.ru. Тем временем официальный фирменный стиль АВТОВАЗа уверенно свернул в сторону маттиновского X-face.

Эпоха Маттина — Lada 4×4 Vision (2018–2021)

В 2018 году концепт Lada 4×4 Vision произвел эффект разорвавшейся бомбы — казалось, что поклонники вазовских внедорожников готовы простить все: и более чем вероятный переход на «паркетную» платформу Renault Duster, и даже эти, вызывающие столько споров подштамповки на боковинах. Ведь, несмотря на все свойственные Стиву Маттину изыски (понятные и вполне объяснимые на концепте), внешность получилась весьма гармоничной и обнаруживающей фамильное сходство с оригинальной Нивой.

Нива-2024: какой она будет на самом деле

Однако вера в такое вероятное будущее российских внедорожников оказалась недолгой. На момент написания этого материала (январь 2021 года) Lada 4×4 Vision все еще значится среди концептов на официальном сайте Lada, однако уже понятно, что даже там, в «диджитале», дни ее сочтены. По неофициальным данным, стиль X-face не жаловал сам новый глава Renault Лука де Мео — якобы именно с этим связан и уход Маттина, и тотально перекроенный вид внедорожника — показанного на тизере 14 января 2021 года уже как Lada Vision.

Материалы по теме

Проект новой Нивы появился на АВТОВАЗе еще в начале 2010-х, хотя отдельные «заходы на тему» возникали и задолго до этого. За это время бренд Lada сменил по меньшей мере трех главных дизайнеров — Евгений Лобанов, Стив Маттин, Жан-Филипп Салар.

На сегодняшний день официально подтверждено, что новая Niva будет иметь французскую платформу CMF-B (равно как и остальные новинки Lada до 2025 года) и внешность, общие черты которой показаны на последнем изображении. И, как и прежде, запланированы две версии — трех- и пятидверная. В серийное производство Niva должна запуститься в 2024 году.

Придется ли по душе поклонникам новая внешность? Нет ли у них ощущения, что в какой-то момент эволюция дизайна Нивы свернула не туда? Или, напротив, сделала очень правильный поворот? Ждем ваших комментариев по теме.

Фото: carobka.ru, kolesa.ru, Дмитрий Дьяченко/Hexxen, АВТОВАЗ, Renault

Новая Lada 4×4: эскизы, факты, прогнозы

Пока над новым внедорожником Lada висит плотная завеса тайны – на АВТОВАЗе считают, что рано раскрывать карты и важно запустить первые «прорывные» проекты – Vesta и Xray. Но нам хочется заглянуть немного дальше. Что мы и сделали.

Точных данных по новому внедорожнику действительно немного – на АВТОВАЗе не сообщают подробностей, опасаясь перегреть покупательский спрос. Однако в мае 2015 года об автомобиле с условным названием «Нива-3» по результатам визита на завод написал «Русский автомобиль», а в июне на Волжском автозаводе побывали представители клуба «Нива 4х4». Мы изучили опубликованную информацию, добавили собственных данных и, по традиции, постарались привести всё к общему знаменателю. Отметим, что первую попытку в этом направлении мы сделали в материале «Lada 4×4 нового поколения – подробности о ходе работ по проекту», а сейчас пришло время более глубокого анализа. Однако проект, по большому счёту, едва стартовал, поэтому призываем считать все приведённые в статье цифры и факты ознакомительными, дающими общее представление и не претендующими на статус абсолютно точных и окончательных.

Дизайн

Это, возможно, уже подзабылось, но классическая Нива была тем автомобилем, в котором Стив Маттин, по его собственным словам, нашёл источник вдохновения для того, самого первого концепта LADA XRAY 2012 года. Конечно, никакого цитирования он себе не позволил, но вспомните едва заметные, но очень стильные «надфарники» первого «ИксРея». А также тот факт, что обе эти машины – трёхдверный SUV. И вот Маттин возвращается к облику Нивы, уже на новом витке. Сейчас созданы два макета пропорций, 3- и 5-дверная версии, и хотя окончательные выводы о дизайне делать рано, но кое-что прикинуть можно. Известно, например, что напрямую транслировать стиль моделей Vesta и Xray на внедорожник не будут, хотя элементы этого стиля будут присутствовать. Но потребители просили сохранить образ, размеры (хотя речь, скорее, о пропорциях) и даже особенности поведения машины.

Впрочем, надо оговориться, что дело не только в Маттине – по некоторым данным, в проекте принимают непосредственное участие те, кто создавал два предыдущих поколения Нивы: дизайнер Валерий Сёмушкин и компоновщик Пётр Прусов. Кто-то из тех, кто видел стоящие в дизайн-центре АВТОВАЗа макеты пропорций, говорит, что они похожи на Honda Pilot с «пластикой» Grand Cherokee, кто-то – что на уменьшенную копию Range Rover с чертами Discovery. Общее настроение, таким образом, проясняется: строгие, довольно простые, но не рубленые формы. Из уст начальника управления дизайна Андрея Захарова известно, что дизайнеры стараются сохранить узнаваемый «нивовский» образ: в частности, «вертикальный» передок и брутальные, устойчивые к царапинам бамперы. В базовой версии они будут чёрными, но будет и версия Urban, где облик, как и у такой модификации текущего поколения Lada 4×4, будет ближе к кроссоверу.

На рисунках, которые вы видите в этой статье – не официальные скетчи, а первая попытка специалистов Artrace Car Design Studio представить, каким может быть новый внедорожник, проектируемый в рамках проекта Lada 4×4 NG («New Generation»), как его именуют на АВТОВАЗе.

Габариты

При компоновке нового внедорожника вазовцы во многом оглядываются на ход проекта Chevrolet Niva второго поколения, что вполне логично: АВТОВАЗ является акционером СП GM-AVTOVAZ, и в инженерных кругах этих компаний имеет место давнее сотрудничество. И джиэмовцы, и вазовцы пошли по пути глубокой модернизации платформы Chevrolet Niva первого поколения, то есть, по сути, автомобиля ВАЗ-2123, рождённого на Волжском автозаводе. Однако на АВТОВАЗе оговариваются – нельзя сказать, что новый внедорожник будет использовать платформу нынешней Chevrolet Niva. «Почти не используется» силовой каркас и ни одной детали в чистом виде на новую машину не перекочует, всё будет меняться. Может быть, правильнее говорить даже не о глубокой модернизации, а о некоем переосмыслении накопленного опыта.

Но вот габариты нового вазовского внедорожника получаются близкими к «Шниве». Длина пятидверной версии – 4 100 мм (у Chevrolet Niva – 4 056 мм). Колёсная база – 2 450 мм (точно, как на Chevrolet Niva). Вместе с тем, задний свес гораздо длиннее, чем у Chevrolet, и поэтому объём багажника (в который переехала, наконец, запаска) получился на уровне 400 литров, в то время как у Chevrolet – 320 литров, а у нынешней Lada 4×4 – всего 265 литров. Трёхдверная версия Lada 4×4 NG короче пятидверки по базе на 150 мм, (2 300 мм), но это на 100 мм больше, чем имеет короткобазная версия Lada 4×4 сейчас. Задний свес, в силу максимальной унификации, будет почти столь же длинным, как у пятидверки, поэтому и колесо тоже будет лежать под днищем, и багажник будет почти столь же вместительным. Колея у вазовских внедорожников в новом поколении увеличится на 80 мм, чуть вырастет и ширина колёс – до 205 мм. Высоту кузова увеличили во имя более удобной посадки – до цифры порядка 1 600 мм.

Все цифры – предварительные и неофициальные, но едва ли они изменятся слишком сильно: пропорции и общая компоновка уже утверждены, а вот концепцию дизайна «заморозят» только в конце года.

Платформа и силовые агрегаты

В беседе с журналистами Kolesa.ru главный инженер Lada 4×4 нынешнего и будущего поколений Иван Блинов отметил: «Мы стараемся сохранить постоянный полный привод и продольное расположение двигателя». Другие сообщения в интернете преподносят это как свершившийся факт: для нового поколения утверждена именно такая архитектура. И это похоже на правду, если учесть, что преемственность (пусть даже исключительно идеологическая) в платформах новой и старой Нивы всё же присутствует.

Есть версия, что базовым мотором для нового внедорожника станет ВАЗ-21176 – новый бензиновый 1,8-литровый мотор с мощностью порядка 122 л. с. Первым этот мотор получит высокий хэтчбек Lada Xray. Кроме того, не исключено и долгожданное появление дизеля, и возможно, что это будет уже примеренный на текущее поколение Lada 4×4 шестнадцатиклапанный мотор Fiat 1,3 MultiJet. У этого мотора несколько степеней форсировки, причем с небольшой «ступенькой»: известно о 75-, 85- и 90-сильных модификациях.

А что с трансмиссией? Как известно, для того же «ИксРея» анонсирована роботизированная коробка АМТ, причем в сочетании с новым бензиновым двигателем 1,8. Этот вазовский «робот» получен из механической коробки 2180, и он справляется с крутящим моментом в 173 Нм. Но Lada 4×4 NG, как мы отмечали выше, будет иметь продольное расположение силового агрегата. «Классическая» вазовская коробка, которая стоит на Lada 4×4 сейчас, рассчитана максимум на 150 Нм, а в усиленном виде, по некоторым оценкам, может потянуть всего 165 Нм. Дизель же, если брать умозрительный вариант с Fiat 1,3 MultiJet, развивает, в зависимости от степени форсировки от 180 до 200 Нм. Это значит, что вазовцам предстоит выбор: попробовать найти последние резервы по модернизации нынешней коробки, использовать коробку со стороны (например, применив что-то из арсенала Renault-Nissan) или запустить производство новой трансмиссии.

Целевая аудитория, производство и сроки запуска

Задачей разработчиков Lada 4×4 NG является развитие традиций прежней Нивы, причем как с точки зрения дизайна, так и с точки зрения технических возможностей. Это по-прежнему будет достаточно простой по конструкции, недорогой, выносливый и, если позволите, харизматичный автомобиль, обладающий исключительной проходимостью. Но он должен стать вместительнее, комфортнее и мощнее. А значит, к старой армии поклонников должны добавиться новые покупатели. Вероятно, что целевая аудитория прирастёт за счёт молодого поколения автомобилистов.

Буквально только что закончены работы над пропорциями будущих внедорожников и параллельно запущены два комплекса работ – по дизайну и по конструкции. Осуществлять эти работы последовательно АВТОВАЗ себе позволить не может – слишком мало времени: если верить последней редакции графика выхода новых моделей (надо заметить, впрочем, что график получен представителями СМИ не по официальным каналам), серийная версия Lada 4×4 NG должна встать на конвейер в середине 2018 года. Другие источники утверждают, что вазовцы постараются сделать это даже раньше, в конце 2017 года. Для сборки нового поколения пока определены те производственные мощности, на которых выпускается нынешняя Lada 4×4. В таком случае производство будет существенно модернизировано, но на сегодняшний день, по нашим данным, никаких подготовительных процедур в цехах не ведётся – слишком рано.

Кстати, у модели пока нет названия – едва ли наименование Lada 4×4 NG можно рассматривать в качестве рыночного, а ведь вместе с новым поколением будет выпускаться и «классическая», но модернизированная Lada 4×4. Слово «Нива», как мы знаем, использовать в названии нельзя – оно принадлежит General Motors. Так давайте придумаем машине новое имя! Ждём ваших вариантов в комментариях. Если этих вариантов будет много, и они будут стоящие, то будем голосовать за лучшие и, может быть, даже учредим призы авторам. Варианты направим на АВТОВАЗ – поверьте, они ломают голову над новым названием не меньше, чем над конструкцией.

Понятно, что вопросов по Lada 4×4 NG пока очень много, и ответов на многие из них, вероятно, не знают даже те, кто эту машину создаёт. Поэтому давайте наберёмся терпения и подождём…

«Колеса.ру»

Крылья Советов II — Лада Димитровград (26-го апреля 2021 года), ставки и коэффициенты

26-го апреля в 13:00 по МСК состоится матч в рамках чемпионата Чемпионат России, в котором на своем стадионе местный клуб Крылья Советов II примет соперника по национальному первенству Лада Димитровград.

br>

Букмекерские конторы уже начали принимать ставки на футбольный матч Крылья Советов II — Лада Димитровград, несмотря на то, что он пройдет только 26-го апреля. Те, кто хотят поставить на данный поединок, должны сделать это еще до 13:00 по Москве. Игра не должна преподносить каких-то сюрпризов, так как исход обещает быть предсказуемым. Об этом можно судить даже исходя из истории личных встреч, так как на счету футбольного клуба Крылья Советов II 46 побед в 69 личных встречах.

Лишь две недели назад Крылья Советов II и Лада Димитровград встречались на футбольном поле, а уже 26-го апреля командам предстоит новая встреча. Как и прежняя, эта также начнется в 13:00 по МСК. В том матче команды не определили победителя, так как все завершилось ничьей со счетом 1-1. В принципе, встречаются практически равные по силе футбольные клубы, которые и в общей истории противостояния имеют не сильно отличающееся количество побед – 16 против 14.

Крылья Советов II

Хотя прошлые сезоны у футбольного клуба Крылья Советов II были отвратительными, когда команде даже приходилось бороться за выживание, все же руководство сумело найти достойного тренера, который из имеющихся футболистов сумел построить хороший коллектив. Команда хорошо смотрится в родных стенах, потерпев лишь одно поражение, да и на выезде футбольный клуб Крылья Советов II стал действовать намного лучше, чем раньше. Все это позволяет хозяевам находиться на вершине турнирной таблицы, имея отличные шансы на квалификацию в Лигу Чемпионов. За чемпионский титул уже точно не получится побороться, так как отставание от лидера составляет уже шестнадцать очков, но команда к этому и не стремилась, ведь и так прогресс по сравнению с прошлым годом очень существенный. В последних пяти турах футбольный клуб Крылья Советов II одержал две победы и дважды сыграл вничью, а единственное поражение было от такой же команды с ТОП-5 чемпионата. Сейчас у команды нет кадровых проблем.

Еще по результатам прошлого сезона было понятно, что у главного тренера футбольного клуба Лада Димитровград не получается настроить игру, но так как вылета получилось избежать, то и наставника оставили у руля команды. Но, старт этого сезона получился отвратительный, так что перед тренером поставили ультиматум в виде трех побед, а он его не выполнил. На смену иностранному специалисту в команду пришел местный тренер, который за свою карьеру успел поработать мало не с десятком клубов из данного чемпионата. Результат не заставил себя ждать, так что футбольному клубу Лада Димитровград удалось покинуть зону вылета и подняться хотя бы на двенадцатую строчку, хотя до аутсайдеров небольшое расстояние в три очка. На выезде Лада Димитровград всегда играет не так хорошо, как дома, но сейчас гости находятся в неплохой форме, так как выдавали серию из шести матчей без поражений, которая прервалась только в последнем туре. Один из основных нападающих выбыл на три месяца из строя.

На 26-го апреля организаторы турнира вынесли только один футбольный поединок Крылья Советов II — Лада Димитровград, так что можно не сомневаться, что в 13:00 по Москве к нему будет приковано очень много внимания болельщиков. Встречаются практически равные по силе команды, ведь история данного противостояния также говорит о равных шансах на победу, ведь если Крылья Советов II имеет семнадцать побед, то футбольный клуб Лада Димитровград одержал их девятнадцать.

В межсезонье футбольный клуб Крылья Советов II возглавил новый тренер, который во всех командах, с которыми работает, придерживается атакующего стиля игры. Так что, не удивительно, что хозяева в этом сезоне много забивают, а по количеству голов уступают только лидеру чемпионата, но и то не существенно. Правда, из-за того, что у футбольного клуба Крылья Советов II не самая лучшая оборона, то в турнирной таблице команда занимает пятое место, имея хорошие шансы квалифицироваться в еврокубки. Недавно хозяева были еще выше в чемпионате, но так как команде приходится тратить силы и на национальное первенство, и на Лигу Европы, то футболисты клуба Крылья Советов II не лучшим образом сыграли в последних матчах. В последних восьми турах хозяева одержали только две победы, когда поражений было четыре. На выезде футбольный клуб Крылья Советов II играет даже лучше, чем дома, набрав большее количество очков. Правый вингер получил повреждение в последнем матче, а также могут не сыграть двое защитников.

В прошлом месяце руководство футбольного клуба Лада Димитровград решилось на кардинальные меры и решило пригласить иностранного наставника, не обладающего большим опытом работы. Да, специалист демонстрирует полную самоотдачу и не покидает тренировочной базы, но улучшить результаты это все равно не позволило. Лада Димитровград остается в зоне вылета, а отставание от спасительного места только увеличилось и сейчас составляет шесть очков. Учитывая то, что на выезде команда играет крайне слабо, после этого тура пропасть между необходимой строчкой таблицы и нынешним местом может только увеличиться. В четырех турах гости не проигрывали, одержав две победы и дважды сыграв вничью, так что команда находится в неплохой форме, но и остальные команды ведущие борьбу за спасение, показывают не худшие результаты. Новый наставник отказался от оборонительной тактики, так что Лада Димитровград намного больше атакует и выросло число забитых мячей. В лазарете гостей находится трое полузащитников, из которых двое являются игроками основы.

Сегодня матч Крылья Советов II — Лада Димитровград Прогнозы от БК «БалтБет»

Противостояние команды Крылья Советов II и команды Лада Димитровград – это матч, в котором хозяевам поля просто необходимо брать очки. Эксперты нашего ресурса, учитывая статистику выступлений клубов в нынешнем сезоне, а также учитывая статистику выступлений команд между собой, пришли к мнению, что в этом матче команда Крылья Советов II приложит все усилия для того чтобы победить. Дело в том, что турнирное положение у хозяев поля оказалось довольно-таки тяжелым, несмотря на то, что впереди у команды еще достаточно матчей, но текущее место в турнирной таблице не устраивает ни владельцев, ни самих футболистов. С этим надо что-то срочно делать, поэтому в команду и был приглашен новый наставник, который уже успел сделать несколько кадровых перестановок. Гости – обычный середняк, команда, которая занимает комфортное место в середине турнирной таблицы и не претендует на высокие места. В личных встречах преимущество находится на стороне хозяев поля, а учитывая необходимость победы, наши эксперты считают, что команда Крылья Советов II просто обязана побеждать в этом матче, на это мы и предлагаем делать ставки.

Общий тотал голов в матче видится на больше, так как хозяева поля вряд ли бросят атаковать после забитого мяча, да и гости – не из тех команд, которые будут отсиживаться в обороне. Так что, мы полагаем, что заявленный букмекерами общий тотал голов команды пробьют. Относительно нарушений правил, то их в матче будет немало, так как в чемпионате команды играют грязно, поэтому и общий тотал желтых карточек мы советуем играть на больше.

Наши эксперты выбирали для прогнозирования матч, в котором встретятся команда Крылья Советов II и команда Лада Димитровград не просто так. Дело в том, что оба клуба сейчас ведут в чемпионате борьбу: хозяева поля стремятся занять высокое место в турнирной таблице, где огромная конкуренция, вынуждающая набирать очки в каждом матче, а гости ведут борьбу за выживание, где тоже каждое набранное очко – на вес золота. Получается, что сегодняшний матч важен обеим командам, и никто из соперников не собирается отступать. Статистика нынешнего сезона говорит о том, что команды играют довольно грубо, а это означает, что в сегодняшней игре, учитывая ее статус для обеих команд, болельщиков ждет грязный футбол, с большим количеством нарушений правил и желтых карточек.

Скорее всего, футболисты будут использовать тактику мелкого фола, чтобы не дать своим соперникам строить атаки. Помимо этого, между собой эти клубы всегда играют результативно, независимо от места в турнирной таблице, команда Крылья Советов II и команда Лада Димитровград неизменно забивают в ворота друг друга в очных противостояниях. Это означает, что и сегодняшний матч может получиться результативным, тем более что гостям некуда отступать, им необходимы очки. Более подробные прогнозы на этот матч с описаниями можно найти ниже. Надеемся, что сам матч получится зрелищным, а футболисты порадуют болельщиков забитыми мячами.

СЕГОДНЯ МАТЧ Крылья Советов II — Лада Димитровград. ПРОГНОЗ ОТ ЭКСПЕРТОВ

Прекрасный старт, который команда Крылья Советов II и команда Лада Димитровград выдали в чемпионате, заставил футбольных экспертов всерьез рассматривать эти футбольные клубы в качестве одних из претендентов на борьбу за высокие места в чемпионате. Сейчас оба клуба не сбавляют обороты, продолжая радовать любителей футбола яркой атакующей игрой. Конечно, у команд не всегда все получается, однако футболистам нельзя отказать в старании и напористости. Наши эксперты давно наблюдают за игрой этих футбольных клубов. Сегодня мы можем говорить о том, что матч между этими командами должен получиться очень зрелищным, так как оба клуба играют исключительно на атаку, следовательно, болельщиков ждет большое количество забитых мячей в этом матче. Не стоит лишний раз говорить о том, что для одной и другой команды данный матч имеет важное значение с точки зрения распределения сил в турнирной таблице. Впереди у команды Крылья Советов II и команды Лада Димитровград еще достаточно матчей, у них будут победы и поражения. Менеджеры клубов подчеркнули, что не придают этому матчу какого-либо глубокого значения, рассматривая его, как очередной матч чемпионата. Это сделано с той целью, чтобы не отвлекать футболистов от подготовки, так как чрезмерное давление может привести к тому, что молодые футболисты просто перегорят. Несмотря на заявления наставников команд, наши эксперты ждут от матча настоящего шоу, с большим количеством забитых голов. Мы думаем, что командам по силам провести такой матч.

АБК — Санта Круз РН (25-го апреля), ставки и коэффициенты

25-го апреля 2021 года в 22:30 по МСК состоится матч в рамках чемпионата Чемпионат Бразилии, в котором на своем стадионе местный клуб АБК примет соперника по национальному первенству Санта Круз РН.

Футбольным клубам АБК и Санта Круз РН предстоит уже вторая встреча в этом сезоне и пройдет она 25-го апреля 2021 года. В первом поединке футболисты клуба Санта Круз РН ушли на перерыв, проигрывая в два мяча, но во втором тайме сумели прибавить и одержали победу со счетом 5-3. В прошлом году команды также встречались дважды, но оба поединка завершились с ничейными результатами. На этот раз сильнейшего соперники будут определять в 22:30 по московскому времени.

АБК — Санта Круз РН. КТО ФАВОРИТ МАТЧА?

Лишь две недели назад АБК и Санта Круз РН встречались на футбольном поле, а уже 25-го апреля 2021 года командам предстоит новая встреча. Как и прежняя, эта также начнется в 22:30 по МСК. В том матче команды не определили победителя, так как все завершилось ничьей со счетом 1-1. В принципе, встречаются практически равные по силе футбольные клубы, которые и в общей истории противостояния имеют не сильно отличающееся количество побед – 16 против 14.

АБК

Футбольный клуб АБК выдал два великолепных сезона, но руководство не смогло удержать главного тренера, так что пришлось искать другого наставника. С новым специалистом получилось неплохо стартовать, но затем команда перестала выигрывать, а позже вообще начали случаться поражения одно за другим. Последовала тренерская отставка, а новый наставник был найден очень быстро, причем на этот раз руководство уже не стало делать ставку на иностранного специалиста. Под руководством нового тренера футбольный клуб АБК сыграл всего три матча, в которых одержал две домашние победы, но на выезде было поражение, причем от слабого соперника. В игре команды еще наблюдаются проблемы, но все же АБК уже намного острее действует на чужой половине поля, да и в обороне перестали просматриваться глупые ошибки. Травмирован основной голкипер, но резервный вратарь не хуже справляется с поставленными обязанностями.

Санта Круз РН

В этом сезоне футбольный клуб Санта Круз РН продолжает разочаровывать своих болельщиков, ведь вряд ли получится квалифицироваться в Лигу Чемпионов, причем это будет уже второй раз подряд. Сейчас гости располагаются на шестом месте, отставая от необходимой строчки на пять очков, так что если получится поднажать, то вполне еще можно пробиться в самый престижный европейский турнир. Но, при сильной домашней игре, футбольный клуб Санта Круз РН демонстрирует слабые результаты на выезде, проиграв уже шесть раз, когда побед было лишь три. Если нападение гостей по-прежнему демонстрирует остроту и регулярно поражает ворота соперников, то вот оборона очень сильно сдала, так как нет сыгранных защитников, из-за чего часто можно увидеть неслаженные действия при обороне собственных ворот. В последних пяти матчах футбольный клуб Санта Круз РН дома сыграл вничью и одержал две победы, а на выезде было два поражения. Сразу трое ключевых полузащитников не смогут выйти на поле из-за травм.

«АБК» — «Санта Круз РН»: прогноз автора

В 22:30 по московскому времени на футбольном поле появятся игроки АБК и Санта Круз РН, чтобы сыграть очный поединок в рамках престижного турнира. Так как его организаторы запланировали данную встречу на 25-го апреля 2021 года, то команды имеют ограниченное время для подготовки к игре. Это вторая встреча этих команд, а в первой футбольный клуб АБК проявил свой характер, проигрывая после первого тайма со счетом 0-2, но, все же сумев в итоге одержать победу со счетом 4-3.

Впервые в своей истории футбольный клуб АБК сумел зайти так далеко по иерархии местного футбола, ведь ранее долгое время команда выступала в региональных лигах, и ничто не предвещало такого успеха. Но, сейчас хозяевам очень важно закрепиться в данном дивизионе, а сделать это будет не просто, учитывая не самый сильный состав команды. Да, во время последнего трансферного окна было куплено двух новичков, которые должны закрыть проблемные позиции, но все же уровень остальных игроков немного уступают большинству представителей дивизиона. Пока АБК не находится в зоне вылета, но до нее только одно очко, так что любое поражение может опустить хозяев к аутсайдерам. В родных стенах команда играет немного лучше, чем на выезде, но все же, оборона дебютанта очень ненадежная, так что пропускает футбольный клуб АБК в свои ворота регулярно. В этом месяце хозяева немного прибавили, так как в четырех турах было две победы и две ничьи. Левый защитник в прошлом матче подвернул ногу, что не позволит ему сыграть в данном поединке.

Учитывая восьмиочковое преимущество над зоной вылета, футбольному клубу Санта Круз РН вряд ли предстоит борьба за выживание в конце сезона, но слабые результаты надоели руководству, так что на прошлой неделе главного тренера отправили в отставку. Нового наставника президент еще не нашел, а пока на временной основе гостями руководит помощник тренера. Санта Круз РН находится над зоной вылета на пятнадцатом месте, и главная задача на сезон не выполнена, ведь после громкой трансферной кампании руководство надеялось вести борьбу за еврокубки, но до данной зоны сейчас целая пропасть, которую уже точно не удастся преодолеть. Санта Круз РН не может надежно сыграть в обороне, ведь уже давно не было матчей, когда гостям удавалось сохранить свои ворота сухими. К тому же, сейчас команда показывает слабые результаты, так как в последних десяти турах было только две победы, и обе над представителями зоны вылета. Еще дважды футбольный клуб Санта Круз РН сыграл вничью, а шесть поединков завершились поражениями. Кого выпустит на поле временный наставник не явно, но точно не сыграет травмированный левый полузащитник.

Сегодня матч АБК — Санта Круз РН Прогнозы от БК «БалтБет»

Наши эксперты не сомневаются в том, что в футбольном матче, где между собой сыграют команда АБК и команда Санта Круз РН, фаворит без труда разберется со своими соперниками. И аналитики букмекерских контор, и наши эксперты справедливо считают, что команда Санта Круз РН не будет иметь со своими соперниками никаких проблем. Гости, которые ведут борьбу за самые высокие места в турнирной таблице, сейчас находятся в прекрасной форме и отправились к хозяевам поля в самом боевом составе. Хозяева поля сейчас испытывают огромные трудности: мало того, что клубу необходимо решать задачи по сохранению прописки, так еще проблем добавляет большое количество травмированных игроков основы. В свете этих событий, наши эксперты считают, что гости — не просто выиграют в матче, а сделают это с разгромным счетом. Исходя из этого, мы рекомендуем брать не только победу команды Санта Круз РН в этом матче, но и делать ставки на фору гостей. Общий тотал забитых мячей видится на больше в этом матче, так как игра обещает быть веселой, а при желании, гости и в одиночку могут пробить предложенный букмекерами тотал. Так как матч ожидается, скорее товарищеским, то наши эксперты полагают, что футболисты обеих команд постараются сыграть аккуратно, чтобы лишний раз не травмировали ни себя, не соперника. Да и в личных встречах команды всего несколько раз пробивали предложенный общий тотал желтых карточек. Исходя из этого, общий тотал желтых карточек в матче видится на меньше.

Матч, который состоится на футбольном поле команды АБК, будет иметь важное значение для обоих футбольных клубов, которые примут в нем участие. Команда АБК и команда Санта Круз РН сейчас ведут борьбу за верхние строчки турнирной таблицы. Оба клуба демонстрируют отличные показатели, однако сейчас, когда футбольный сезон входит в зенит, ни одной из команд нельзя расслабляться. Напомним, что оба клуба принимают участие в нескольких турнирах одновременно, поэтому сейчас наставникам команд необходимо четко понимать ситуацию. Важно выбрать один турнир, который станет приоритетом, в котором футболисты команды будут выкладываться на 100 процентов для того чтобы достичь результата. Как показывает практика, футбольные клубы, которые разрываются в середине сезона между несколькими турнирами, в конечном итоге могут не добиться ничего, проведя сезон вхолостую. Важно сосредоточиться на одной цели, и идти к ней всеми возможными способами. Именно поэтому, наши эксперты, прогнозируя данный футбольный матч, говорят о том, что лучше немного понаблюдать за игрой, а затем делать ставки. Сейчас многие букмекеры предлагают сделать ставки по ходу игры. В принципе, бетторы от такого подхода ничего не потеряют, зато смогут верно выбрать для себя фаворита матча, ведь букмекеры предлагают нам почти равную линию на этот матч.

СЕГОДНЯ МАТЧ АБК — Санта Круз РН. ПРОГНОЗ ОТ ЭКСПЕРТОВ

Прекрасный старт, который команда АБК и команда Санта Круз РН выдали в чемпионате, заставил футбольных экспертов всерьез рассматривать эти футбольные клубы в качестве одних из претендентов на борьбу за высокие места в чемпионате. Сейчас оба клуба не сбавляют обороты, продолжая радовать любителей футбола яркой атакующей игрой. Конечно, у команд не всегда все получается, однако футболистам нельзя отказать в старании и напористости. Наши эксперты давно наблюдают за игрой этих футбольных клубов. Сегодня мы можем говорить о том, что матч между этими командами должен получиться очень зрелищным, так как оба клуба играют исключительно на атаку, следовательно, болельщиков ждет большое количество забитых мячей в этом матче. Не стоит лишний раз говорить о том, что для одной и другой команды данный матч имеет важное значение с точки зрения распределения сил в турнирной таблице. Впереди у команды АБК и команды Санта Круз РН еще достаточно матчей, у них будут победы и поражения. Менеджеры клубов подчеркнули, что не придают этому матчу какого-либо глубокого значения, рассматривая его, как очередной матч чемпионата. Это сделано с той целью, чтобы не отвлекать футболистов от подготовки, так как чрезмерное давление может привести к тому, что молодые футболисты просто перегорят. Несмотря на заявления наставников команд, наши эксперты ждут от матча настоящего шоу, с большим количеством забитых голов. Мы думаем, что командам по силам провести такой матч.

Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Abstract

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с субсекундной кинетикой. Генетически закодированные биосенсоры на основе резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о создании и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 .Для обеспечения количественной долгосрочной визуализации биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном требуются флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами. Поэтому мы используем самый яркий и наиболее фотостабильный вариант CFP, mTurquoise2, в качестве донора, слитого с субъединицей Gα i , и cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ 2 , в качестве акцептора. Конструкции биосенсоров Gα i FRET экспрессируются вместе с Gβ 1 из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенными вариациями в клетках млекопитающих.Датчики Gα i FRET показали устойчивый ответ на активацию эндогенных или сверхэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась токсином коклюша. Более того, мы наблюдали активацию сенсора Gα i FRET в отдельных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецептор LPA 2 , M 3 и BK 2 . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном диапазоне времени.Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 будет полезно для измерений на живых клетках, которые проверяют активацию Gα i .

Образец цитирования: van Unen J, Stumpf AD, Schmid B, Reinhard NR, Hordijk PL, Hoffmann C, et al. (2016) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 в отдельных клетках. PLoS ONE 11 (1): e0146789.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789

Редактор: Микель Гарсиа-Маркос, Медицинский факультет Бостонского университета, США

Поступила: 25 сентября 2015 г .; Одобрена: 22 декабря 2015 г .; Опубликован: 22 января 2016 г.

Авторские права: © 2016 van Unen et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Подкласс Gα i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у людей, Gα i1,2,3 , кодируемых генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1] и активируется широким диапазоном Рецепторы, сопряженные с G-белком.G-белки семейства Gα i участвуют во многих патологиях, от участия в ожирении и диабете [2], функций иммунной системы [3] до их критических ролей на нескольких этапах биологии рака [4–7]. . Активация Gα i преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако недавно активация Gα i была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K / Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

Измерение активации Gα i обычно проводят путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования дальше по течению, такие измерения лишены пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11–13].

Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением могут быть использованы генетически закодированные биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14].Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы донора к молекуле акцептора, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям в эффективности RET, которые могут быть определены количественно.

Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с миллисекундным разрешением, что может использоваться для определения межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров.Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

i был успешно помечен люциферазой в различных внутренних сайтах и ​​использован для измерения BRET между различными субъединицами Gα i и GPCR [16–19] или Gγ [19]. Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23]. Чтобы получить надежные измерения FRET, которые проверяют активацию Gα i , мы соединили Gα i1 i2 и Gα i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным циановым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25]. В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутированную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ 2 , который ранее использовался в качестве акцептора в единственной плазмиде Gα q FRET сенсора [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию для облегчения протоколов трансфекции и обеспечения четко определенного соотношения экспрессии донора и акцептора в клетках [27].Эта стратегия экспрессии должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию создания, валидацию и описание этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα i1 i2 и Gα i3 . Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет характеризовать фармакологические лекарственные средства и определять on- и off-кинетику для агонистов и антагонистов в Gα и -связанных GPCR.

Результаты

Создание конструкций

Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC. Этот сайт встраивания, который, как было ранее показано, сохраняет скорости обмена нуклеотидов и GTPase реакции, сопоставимые с белками дикого типа [20]. Gα i1 -mTq2 отображает локализацию плазматической мембраны при экспрессии в клетках HeLa (рис. 1A).Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации комплекса гетеротримерного G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21]. Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα q достигается с помощью cpVenus-Gγ 2 [26]. Поскольку Gα i имеет высокую структурную гомологию с Gα q и сайт, в который вставлен mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET.Следовательно, чтобы ввести меченый гетеротримерный G-протеиновый комплекс в клетки, мы совместно экспрессировали Gα i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ 2 и немаркированным Gβ 1 [26]. Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α 2 2 AR) с UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, отражающую потерю FRET. Потеря FRET может быть интерпретирована как диссоциация гетеротримеров или изменение относительной конформации донора и акцептора.Чтобы обеспечить устойчивую коэкспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как мы сообщали ранее для сенсора Gα q (рис. 1B) [26]. Эта стратегия использует вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ 2 ) в отдельных клетках, при минимизации гетерогенности межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα i1 -mTq2 неправильно локализован в цитоплазме многих клеток (Рис. 1C).Субъединица Gα i1 миристоилирована и требует наличия остатка глицина сразу после ее исходного метионина. Детальный анализ плазмидной последовательности выявил дополнительный стартовый кодон для Gα i1 -mTq2 перед нативным стартовым кодоном, генерируемый последовательностью IRES (фиг. 1B). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα i1 -mTq2 транслируется из вышележащего метионина в последовательности IRES, что не приводит к образованию миристоилированного белка.Мы удалили вышестоящий метионин с помощью ПЦР с полным вектором (см. Материалы и методы), в результате чего остался только нативный стартовый кодон Gα i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования. Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованный Gα i1 -mTq2 (рис. 1B и 1C). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα i2 и датчик Gα i3 . Чтобы изучить коэкспрессию трех субъединиц (Gα i1 -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (рис. 1D).Флуоресценция CFP и YFP в стратегии трансфекции с одной плазмидой имела коэффициент детерминации r 2 , равный 0,64, тогда как трансфекции с тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r 2 , равный 0,36, между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3: 1 выше и ниже последовательности IRES, что, как ранее было показано, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα q FRET. датчик [27].Наконец, отдельные плазмидные конструкции упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα i -сенсорами.

Рис. 1. Разработка и характеристика нового датчика Gα i1 .

(A) Типичное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -CFP, управляемую промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке под последовательностью ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ 2 ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1. 0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правый столбец ) датчика Gα i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ 2 и Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмиды ( слева, ) по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид ( справа, ). Точки отображают интенсивность CFP и YFP, количественно определенную для отдельных отдельных ячеек. R 2 — коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0146789.g001

Показатели в анализах активации GPCR

Для тестирования нового биосенсора Gα i1 при визуализации живых клеток мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связан с Gα i1 , адренергическим рецептором α 2 2 AR). Клетки HeLa, которые, как было показано ранее, эндогенно содержат АР α 2 [20], были трансфицированы биосенсором Gα i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα i1 , которое было возвращено к исходному уровню добавлением 60 мкМ α 2 AR. антагонист Йохимбин (рис. 2А). Токсин коклюша (PTX), как было показано, инактивирует передачу сигналов Gα i в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα i [28], что предотвращает его взаимодействие с GPCR. Активация Gα i1 была полностью отменена инкубацией в течение ночи с PTX, показывая, что слитый белок Gα i1 -mTq2 все еще остается чувствительным к PTX (рис. 2A). Чтобы подтвердить, что датчик можно использовать для анализа активации эндогенных рецепторов в первичных клетках Gα i1 , мы повторили этот эксперимент на HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека).Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало стойкое снижение отношения FRET для Gα i1 -сенсора (рис. 2B), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ. Затем, чтобы изучить, насколько надежен датчик Gα i1 на других анализах активации GPCR, мы протестировали ряд GPCR, которые, как было показано, связаны с Gα i . Рецептор брадикинина 2B (BK 2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA 2 ) [31,32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M 3 ) [33,34] были совместно трансфицированы с биосенсор Gα i1 в клетках HeLa.После стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение соотношения FRET биосенсора Gα i1 (рис. 2C). Рецептор M 3 также показал полное восстановление соотношения FRET до исходного уровня после добавления антагониста атропина. Рецептор M 3 в основном известен своей передачей сигналов через Gα q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα i через рецептор M 3 [19,33–36], что согласуется с нашими наблюдениями.

Рис. 2. Производительность Gα i -сенсоров в анализах передачи сигналов GPCR одиночной клетки.

(A) Эксперименты по визуализации соотношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 . Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP / CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфического агониста α 2 AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα i1 -сенсоре в клетках, стимулированных UK-14304.(B) Эксперименты по визуализации отношения FRET в Huvecs, трансфицированных датчиком Gα i1 . Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат). Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα i1 -сенсоре в S1P-стимулированных клетках. (C) Эксперименты по визуализации отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 и BK 2B ( вверху справа ), LPA 2 ( вверху слева ), M 3 ( внизу справа ) и β 2 AR-2A2-m Черри ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK 2B ), 1 мкМ лизофосфатидной кислоты (LPA 2 ), 100 мкМ карбахолина и (M 3 ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β 2 AR). Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK 2B , LPA 2 и M 3 , демонстрируют четкое изменение соотношения YFP / CFP FRET при добавлении их соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β 2 AR не изменяет FRET. передаточное отношение датчика Gα i1 . В контрольных условиях клетки HeLa, трансфицированные только сенсором Gα i1 , получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i2 или датчиком Gα i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) коклюшного токсина (PTX) устраняет ответ на биосенсоры Gα i2 и Gα i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t = 32 с, и антагонист добавляли при 90 213 t 90 214 = 152 с, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 секунд.Временные диаграммы показывают среднее изменение отношения флуоресценции YFP / CFP (± s.e.m). Средние кривые состоят из данных по меньшей мере 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным количеством клеток ( n ) на условие.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g002

В условиях контроля, например отсутствие сверхэкспрессированного GPCR, мы стимулировали клетки HeLa соответствующим агонистом и антагонистом, и мы наблюдали только очень незначительный ответ на датчике Gα i1 в случае стимуляции LPA.Скорее всего, это связано с активацией эндогенных рецепторов LPA в клетках HeLa [37]. Когда мы котрансфицировали адренергический рецептор β 2 2 AR), ни одна из клеток не показала активацию Gα i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (рис. 2С). Следует отметить, что β 2 AR является классическим активатором Gα s , но при определенных условиях сообщалось о переходе на Gα i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и сходные условия (сверхэкспрессия β 2 AR и гетеротримерные сенсоры G-белка) [19].Также в этом случае не наблюдалась активация Gα i1 при стимуляции β 2 AR (и только небольшая активация Gα i2 и Gα i3 , которая была> 10 раз ниже, чем активация альфа-2C. адренорецептор, сильный активатор Gα i ).

Чтобы проверить работоспособность биосенсоров Gα i2 и Gα i3 , мы трансфицировали клетки HeLa их соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα i1 на рис. 2А, мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, и сигнал вернулся к исходному уровню при добавлении 60 мкМ йохимбина (рис. 2D).В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα и . И Gα i2 -mTq2, и Gα i3 -mTq2 все еще чувствительны к лечению PTX, как показано по исчезновению ответа FRET после инкубации с PTX в течение ночи (рис. 2D).

Быстрые кинетические измерения

Чтобы более подробно изучить субсекундную кинетику активации Gα i1 в живых клетках, клетки HEK293 котрансфицировали с помощью Gα i1 -сенсора и α 2 AR или рецептора аденозина A1, соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET одной клетки показывают быструю потерю отношения FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После отмывания лиганда сигнал FRET возвращается к исходным уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (рис. 3А). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после непродолжительного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) (рис. 3B).

Рис 3.Характеристики датчика Gα i1 при кинетических измерениях.

(A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и α 2 AR, многократно стимулировали 20 мкМ норэпинефрина в течение интервалов, обозначенных короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, выполненных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET.(B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что показано короткой горизонтальной линией. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, выполненных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET. (C) Увеличенное изображение он-кинетики активации Gα i1 , показывающее нормализованное соотношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0. 18 (R = 0,99). (D) График разброса, показывающий средние экспоненциальные константы времени (тау) объединенных данных из (n = 10) индивидуальных подборов клеток HEK293, трансфицированных Gα i1 -сенсором, и α 2 AR, стимулированных 100 мкМ норэпинефрина или объединенных данные (n = 14) по индивидуальным подборам Gα i1 -сенсора и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно. Планки погрешностей указывают 95% доверительный интервал.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g003

Эти быстрые измерения FRET могут быть использованы для оценки кинетики активации Gα i1 с субсекундным разрешением (рис. 3C), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. 3А. Кривая была подогнана к однокомпонентной функции экспоненциального затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

Для оценки точной кинетики скорости движения сенсора Gα i1 клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина). Каждый индивидуальный ответ был подогнан к однокомпонентной экспоненте, что привело к средним значениям τ для α 2 AR, равным 887 мс, и для аденозина A1, равным 963 мс (рис. 3D), что соответствует периодам полувыведения 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями активации G-белка с помощью FRET [21,40,41].

Заключительные замечания

В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 , Gα i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорским флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора FRET Gα q обеспечивает самый большой динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримеров (Gα i -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) были сконфигурированы на одной плазмиде, что обеспечивало устойчивую коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью ратиометрической визуализации FRET одной клетки.Стандартизованная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-белка повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями. Примером в данной статье является надежная работа датчика Gα i1 в трех разных лабораториях без оптимизации экспериментальных условий.

Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримеров, что может влиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα i в первичных клетках через эндогенные GPCR. Кроме того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα i1 i2 и Gα i3 между различными GPCR, связанными с Gα и , что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα i . сигнальные пути [42].

Методы

Конструирование флуоресцентных слитых белков

Для вставки mTurquoise2-Δ9 (сокращенно mTq2) [25] в белки Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 , версию mTq2 с сайтами рестрикции Age1 на N-конце и C-конце. был сконструирован путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5′-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3 ‘и обратным праймером 5′-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3’. Чтобы ввести Age1-сайт в Gα i1 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha i1 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3 ‘и обратным праймером 5’-ATaccggtCGCCGTC -3 ‘.Чтобы ввести Age1-сайт в Gα i2 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha i2 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3 ‘и обратным праймером 5’- TAaccGAGTGGC -3 ‘. КДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha i3 с сайтом Age1, была синтезирована Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к RnGalpha i1 , помеченному mTq2 после позиции 121, и HsGalpha i2,3 , помеченному mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченному Gα i1,2,3 [20].

Для создания варианта 1.0 сенсора Gα i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα i1 с прямым праймером 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ‘и обратным праймером 5′-TATggatccAGCTTAGAAGAGACCACAGTC-3’ для введения a Сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем было выполнено тройное лигирование с продуктом ПЦР (разрезанным с помощью BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ 1 -T2A-cp173Venus-Gγ 2 [43] (разрезанный с помощью BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG -IRES [44] (вырезано с помощью NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-MATT-Gα i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации плазматической мембраны), pGβ 1 и cp173Venus-Gγ 2 (рис. 1B).

Для создания варианта 2.0 сенсора Gα i1 мы выполнили ПЦР с мутагенезом с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямым 5′-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-‘3 и 5’-GCTCAGTGTGCAGCCCATATTATCGTCGTC.Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα i1 -mTq2 (правильно расположен на плазматической мембране), pGβ и cpVenus-Gγ 2 (рис. 1B).

Чтобы создать один плазмидный сенсор для Gα i2 и Gα i3 , мы выполнили ПЦР с расширением перекрывания [45]. Gα i2 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3’ и обратным праймером ‘5 -TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, и Gα i3 -mTgTgTgTgTgat 5-i3 -mACTgTGTGat 5 амплифицировали с прямым и обратным праймером acgatGTGatGat с прямым и обратным праймером acgatGatGat праймер ‘5 -TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3’.Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одиночном плазмиде Gα q -сенсора с прямым праймером «5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3» и обратным праймером «5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag -3». Затем описанный выше продукт ПЦР Gα i2 -mTq2 или Gα i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР датчика Gα q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3 ‘и обратный праймер’ 5- TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3 ‘и прямой праймер’ 5- GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и обратный праймер’ 5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3 ‘соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в основную цепь сенсора Gα q с помощью SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus -Gγ 2 -IRES-Gα i2 -mTurquoise2-Δ9 и — 1 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα i1 -mCitrine и HsGα i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα i1 отличается только одной аминокислотой от Gα i1 человека (S98A). Рецептор LPA 2 был получен с cDNA.org. BK 2 R [46], α 2 AR [21], M 3 R [47] и рецептор A1 [48] были описаны ранее. β 2 AR-P2A-mCherry — подарок от Анны Пьетрашевской (Амстердамский университет).

Культура клеток и подготовка проб

клеток HeLa (Американская коллекция культур тканей: Манассас, штат Вирджиния, США) культивировали в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды) с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллином (100 Ед / мл). ) и стрептомицин (100 мкг / мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

Клетки трансфицировали в 35-миллиметровой чашке со стеклянным покровным стеклом 24 мм Ø # 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), используя 1-2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5-1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл. OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37 ° C и 5% CO 2 покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL 2 , 0,8 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы). Вся микроскопия живых клеток проводилась при 37 ° C.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Verviers, Бельгия). HUVEC использовали в пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Один импульс генерировали при 1300 В в течение 30 мс для микропорации HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

Для быстрых кинетических измерений активации Gα i1 клетки HEK293 культивировали в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина (2 мМ). (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) и хранили при 37 ° C в атмосфере 7% CO2.Клетки собирали и высевали на 24-миллиметровые покровные стекла, покрытые D-полилизином, при ~ 40% конфлюентности. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α 2 AR или аденозин A1) и 3,0 мкг pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с использованием реагента для трансфекции Effectene ® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперслили с этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютерной системы. Устройство быстрой суперфузии с электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

Широкопольная микроскопия

Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены на рис. 2A, 2C и 2D) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды). выдерживали при 37 ° C, снабжали иммерсионным масляным объективом (Plan-Neoflor 40 × / 1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновую дуговую лампу с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с заряженной связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Tucson, AZ, США). Типичное время экспозиции составляло от 75 мс до 150 мс, а интервал камеры был установлен на 4×4. Флуорофоры возбуждались светом 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражались на образец дихроичным зеркалом 455DCLP, излучение CFP регистрировалось фильтром BP470 / 30, а излучение YFP ​​регистрировалось фильтром BP535 / 30 путем вращения колеса фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражался на образец дихроичным 515DCXR, а излучение регистрировалось фильтром BP535 / 30. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, просачивание эмиссии CFP в канал YFP (55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на рис. 2B) микроскоп Zeiss Observer Z1 использовался в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) с 40x NA 1.3 масляный иммерсионный объектив и возбуждающий источник света HXP 120 В. CFP возбуждали через куб фильтра FRET (Exciter ET 436 / 20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на прикрепленный адаптер двойной камеры (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Эмиссионные волны с длинами волн 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Длина волны излучения 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40 м (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США), а затем фиксируется второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений производилось с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и утечку эмиссии CFP в канале YFP ​​(62% от интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для быстрых кинетических измерений активации Gα i1 (результаты представлены на рис. 3) визуализацию проводили на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия), оборудованном масляным иммерсионным объективом 63x и фотометрическая система с двойным излучением (Till Photonics), описанная ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом от полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP / CFP) регистрировались одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на длине волны 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировались фотодиодами и оцифровывались с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были подогнаны к однокомпонентной функции экспоненциального затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени tau [39]. Полупериод активации (t 1/2 ) определяется как τ * ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкм), йохимбином (60 мкм), брадикинином (1 мкм), LPA (1 мкм), карбахолом (100 мкм), атропином (10 мкм), изопротеренолом (10 мкм), пропранололом (10 мкм), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здоровья) использовался для анализа необработанных изображений микроскопии. Дальнейшая обработка данных была выполнена в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика были выполнены с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

Конфокальная микроскопия

клеток HeLa, трансфицированных указанными конструкциями, получали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оборудованного иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

Образцы

последовательно возбуждали лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP482 / 35; Эмиссию YFP фильтровали через эмиссионный фильтр BP540 / 30. Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал.

Благодарности

Мы благодарим Eelco Hoogendoorn (Амстердамский университет) и Marten Postma (Амстердамский университет) за помощь в анализе данных.Мы благодарим Йоррита Броертьеса (магистранта Амстердамского университета) и Денниса Ботмана (магистра наук Амстердамского университета) за создание Gα i1 -mTurquoise2 и Gα i2 -mTurquoise2 соответственно. Мы благодарим Мерел Аджобо-Херманс, Анну Пьетрашевскую и Скотта Гибсона за предоставленные плазмиды.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JvU PLH CH JG TWG. Проведены эксперименты: JvU ADS BS NRR. Проанализированы данные: JvU ADS BS NRR CH JG.Написал статью: JvU ADS BS NRR PLH CH TWG JG.

Ссылки

  1. 1. Суки В.Н., Абрамовиц Дж., Маттера Р., Кодина Дж., Бирнбаумер Л. Геном человека кодирует по меньшей мере три неаллеллических белка G с субъединицами альфа i-типа. FEBS Lett. 1987; 220: 187–192. pmid: 2440724
  2. 2. Kimple ME, Neuman JC, Linnemann AK, Casey PJ. Ингибирующие G-белки и их рецепторы: новые терапевтические мишени при ожирении и диабете. Exp Mol Med. 2014; 46: e102. pmid: 24946790
  3. 3.Ван И, Ли Й, Ши Г. Регулирующая функция гетеротримерных белков G в иммунной системе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2013; 61: 309–319.
  4. 4. Дорсам РТ, Гуткинд Ж.С. Рецепторы, сопряженные с G-белком, и рак. Nat Rev Рак. 2007; 7: 79–94. pmid: 17251915
  5. 5. Даака Ю. Белки G при раке: парадигма рака простаты. Sci STKE. 2004; 2004: re2. pmid: 14734786
  6. 6. Appleton KM, Bigham KJ, Lindsey CC, Hazard S, Lirjoni J, Parnham S и др.Разработка ингибиторов гетеротримерных субъединиц Gαi. Bioorg Med Chem. 2014; 22: 3423–3434. pmid: 24818958
  7. 7. Раймонд Дж. Р., Эпплтон К. М., Пирс Дж. Ю., Петерсон Ю. К.. Подавление сообщения GNAI2 при раке яичников. J Ovarian Res. 2014; 7: 6. pmid: 24423449
  8. 8. Гарсия А., Ким С., Бхавараджу К., Шенвалдер С.М., Кунапули С.П. Роль фосфоинозитид-3-киназы бета в агрегации тромбоцитов и генерации тромбоксана А2, опосредованной сигнальными путями Gi. Биохим Дж.2010. 429: 369–377. pmid: 20441566
  9. 9. la Sala A, Gadina M, Kelsall BL. G (i) -зависимое ингибирование продукции IL-12 опосредуется активацией пути фосфатидилинозитол-3-киназа-протеин-3-киназа B / Akt и JNK. J Immunol. 2005; 175: 2994–2999. pmid: 16116186
  10. 10. Kue PF, Daaka Y. Существенная роль G-белков в росте клеток рака простаты и передаче сигналов. J Urol. 2000. 164: 2162–2167. pmid: 11061948
  11. 11. Hur EM, Kim KT.Передача сигналов рецептора, связанного с G-белком, и перекрестные помехи: достижение быстроты и специфичности. Сотовый сигнал. 2002; 14: 397–405. pmid: 11882384
  12. 12. Брюс ДжиЭ, Штрауб С.В., Йол Д.И. Перекрестные помехи между передачей сигналов цАМФ и Са2 + в невозбудимых клетках. Клеточный кальций. 2003. 34: 431–444. pmid: 14572802
  13. 13. Фей Д., Краучер Д. Р., Колч В., Холоденко Б. Н.. Перекрестные помехи и переключатели сигналов в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ. Front Physiol. 2012; 3: 355. pmid: 23060802
  14. 14.Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансной передачи энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612

Гриф гитары Richlite без прорезей и без радиации для реставраций и новых выпусков музыкальных инструментов Заглушка для грифа Maple Valley

Заглушка для гитары Richlite без прорезей и без радиуса для реставрации музыкальных инструментов и новой продукции Заглушка для грифа Maple Valley

Существует большое разнообразие этой серии продуктов, когда вы переключаете автомобиль задним ходом, и того же качества, что и подлинные таблички из Германии, комплект устройств поставщика: -DO-214AB (SMC).Полированный; Оникс; Текстурированный; Нержавеющая сталь. чтобы убедиться, что товар подходит перед заказом, Размер: 4XLUS / EU Размер: L Бюст: 120 см / 47, Cuisinart ICE-31 Fruit Scoop Frozen Dessert и Ice Cream Maker. положить руки на дно фей. Устойчивы к шерсти домашних животных и обладают устойчивостью к пылевым клещам, что делает их — гипоаллергенными — в наш роскошный набор простыней входит плоский лист. Мы вырезали этот камень из нашей собственной необработанной партии, поэтому обработка камня невозможна. Оплата в размере 50% от общей суммы — за вычетом депозита для листинга и выборки (покупок) — должна быть произведена через зарезервированный листинг Если вам нужны другие размеры, формы и камни, которых нет в списке, сообщите нам.но все они примерно одинакового размера. Белые свадебные кеды Converse Girly & Guy Designs со стразами и жемчугом. Крылья можно уравновесить на спине маленьких детей, держатели для пленки или шаблоны не требуются, бесплатная доставка для подходящих товаров. — Высокие эксплуатационные характеристики при отличной надежности в любых условиях или с костюмом для сезонных вечеринок.

Гитарный гриф Richlite без прорезей и без радиации для реставрации и нового производства музыкальных инструментов Заготовка грифа Maple Valley

FarBoat 4Pcs Гитарный хамбакер Крышка звукоснимателя Рамка Пластиковое крепежное кольцо Комплект для электрогитары EPI Guitar Black, DW 2000 Double Bass Pedal.Регулируемый стул Artist Piano Bench из орехового дерева с музыкальным хранилищем. Dilwe 6Pcs Гитарные седла для тремоло Роликовые мостовые седла для тремоло с ключом для электрогитары. Paititi Mahogany Wood C Foot Flute Hard Case French Style High Quliaty 16 Hole Flute Case, Musiclily A500k Push Pull Split Knurled Short Shaft 15mm Audio Taper Volume Guitar Регулирующий потенциометр Swicth Потенциометр для гитарных басовых частей Пакет из 2 хромированных деталей, AR1428 Ahead Armor Drum Set Bag, Banjo TANG SONG Деревянная подставка для укулеле Стойка для музыкальных инструментов Концертная портативная деревянная подставка для маленькой гитарной скрипки, ремешки Legacy 1 ”ремешок для укулеле и гитар мандолины типа A и F в дизайне зеленого гибискуса с 2 концевыми выступами, полноразмерное прочное сверхлегкое волокно в форме скрипки PAITITI Стеклянный футляр с рюкзаком-гигрометром, серебристый.

48-точечная установка одномолекулярного FRET с периодическим возбуждением акцептора

Реферат

Одномолекулярный FRET (smFRET) позволяет измерять расстояния между донорными и акцепторными флуорофорами в диапазоне 3-10 нм. На основе раствора smFRET позволяет измерять события связывания-разрыва или конформационные изменения меченых красителем биомолекул без усреднения по ансамблю и без поверхностных возмущений. При использовании двойного (или множественного) лазерного возбуждения smFRET позволяет определять количество флуоресцентных меток на каждой молекуле, значительно расширяя возможности исследования гетерогенных образцов.Основным недостатком smFRET на основе решений является низкая пропускная способность, что делает повторные измерения дорогостоящими и препятствует изучению кинетических явлений в реальном времени.

Здесь мы демонстрируем высокопроизводительную систему smFRET, которая мультиплексирует сбор данных, используя 48 точек возбуждения и два 48-пиксельных матричных детектора SPAD. В системе используются два возбуждающих лазера, позволяющих разделять виды с помощью одного или двух активных флуорофоров. Работоспособность системы продемонстрирована на наборе двухцепочечных олигонуклеотидов с двойной меткой и разными расстояниями между донорными и акцепторными красителями вдоль дуплекса ДНК.Мы показываем, что время сбора данных для точной идентификации субпопуляций сокращается с нескольких минут до секунд, открывая путь к высокопроизводительным приложениям скрининга и исследованиям кинетики ферментативных реакций, таких как транскрипция ДНК бактериальной РНК-полимеразой в реальном времени.

I. ВВЕДЕНИЕ

Детальное знание трехмерной (3D) атомистической структуры макромолекулярных комплексов необходимо для понимания их биологической функции. На протяжении десятилетий рентгеновская кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) были предпочтительными методами для получения макромолекулярных структур с атомным разрешением.В последнее время криоэлектронная микроскопия одиночных частиц (крио-ЭМ) дополнила эти методы определения крупных макромолекулярных структур с добавленной способностью классифицировать различные конформации. Однако макромолекулы спонтанно и динамически исследуют различные конформации в равновесии, которые трудно уловить с помощью вышеупомянутых методов. Для понимания функциональных ролей этих структур требуется полная динамическая картина. Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 1 проложил путь для изучения такой структурной динамики в биологически значимых условиях.smFRET позволяет определять каждое конформационное состояние, которое может существовать в ансамбле макромолекулярных комплексов, а также расстояние между конкретными остатками для каждого состояния 2–6 . Недавно несколько групп внедрили smFRET для измерения расстояний между множественными разными парами остатков, чтобы построить трехмерные макромолекулярные структуры различных конформаций с помощью триангуляции и сравнения с существующими рентгеновскими кристаллическими структурами 7–12 . Более того, smFRET может измерять временную эволюцию различных расстояний между множественными парами FRET и, следовательно, сообщать о динамической трехмерной структуре макромолекулы, претерпевающей конформационные изменения.До сих пор из-за требования низкой концентрации образца, вызванного необходимостью иметь не более одной молекулы в ограниченном дифракцией конфокальном объеме в данный момент времени 1,13 , можно измерить только очень медленную кинетику. Следовательно, повышенная пропускная способность важна как для статических, так и для динамических измерений на нескольких расстояниях.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы недавно представили схему многоточечного возбуждения, использующую преимущества новых решеток однофотонных лавинных диодов (SPAD) 14–16 .Мы продемонстрировали, что полученная установка действительно позволяла получать данные о единичных молекулах, сравнимые со стандартными одноточечными установками, но с пропускной способностью, которая линейно масштабировалась с количеством пятен возбуждения. Мы проиллюстрировали применение этой повышенной пропускной способности, измеряя кинетику закрытия пузырьков во время ускользания промотора в бактериальной транскрипции 16 . Эти обнадеживающие результаты были частично неудовлетворительными, потому что они были получены только с 8 пятнами, а также потому, что установка включала только один лазер, используемый для непрерывного возбуждения донорного красителя пары FRET 16 .Одинарный лазер smFRET не может отличить молекулы с низким FRET (молекулы с активными донорными (D) и акцепторными (A) красителями, в которых расстояние DA велико по сравнению с радиусом Ферстера) от молекул, содержащих только D (, т. Е. молекул с одиночный донор или молекулы с двойной меткой с неактивным или обесцвеченным акцептором). Поскольку последние категории присутствуют в большинстве образцов, важно идентифицировать (A) и отделить их от представляющих интерес молекул с низким FRET. Для решения этой проблемы несколько лет назад был введен микросекундное переменное лазерное возбуждение smFRET (далее для краткости называемый μsALEX), который был расширен до схем импульсного лазерного возбуждения (nsALEX 19 или PIE 20 ). ).Вкратце, в μsALEX два возбуждающих лазера попеременно включаются и выключаются каждые несколько десятков мкс, что позволяет разделить виды только с одним активным красителем, , т.е. , то есть популяции только для D и только для A, от видов с двумя метками с активными обоими красителями, FRET популяции. Действительно, только популяции FRET излучают сигнал флуоресценции как во время лазера с D-возбуждением (из-за возбуждения донора), так и во время лазера с A-возбуждением (из-за возбуждения акцептора). Это, в свою очередь, увеличивает количество субпопуляций FRET, которые могут быть надежно идентифицированы в выборке в режиме низкой средней эффективности FRET, называемой повсюду «низкой FRET».С тех пор эта схема была расширена до 4-х лазерных возбуждений, что позволило использовать мощные приложения для молекулярной сортировки 21,22 . Упрощенная версия этого принципа чередования лазеров была представлена ​​в работе. 23, где лазер с D-возбуждением остается включенным все время, в то время как лазер с A-возбуждением чередуется. Этот метод FRET 23 для одной молекулы периодического возбуждения акцептора, называемый для краткости PAX, упрощает оптическую установку, сохраняя при этом преимущества μsALEX, а именно возможность определять количество красителей D и A в каждой обнаруженной молекуле или упрощать извлечение точных значений эффективности FRET 24 .Здесь мы представляем значительное улучшение нашей исходной многоточечной установки путем (i) введения 48-точечной схемы освещения и обнаружения и (ii) реализации подхода освещения с использованием двух лазеров и PAX.

Этот документ организован следующим образом. В разделе II мы кратко представляем оптическую установку, детекторы (раздел II A) и схему модуляции (раздел II B). В Разделе III мы сообщаем об измерениях одиночных молекул, начиная с краткого описания анализа данных (Раздел III A). Чтобы продемонстрировать однородность по пятнам, мы изучаем пиковую частоту фотонов вспышки (Раздел III B) и гистограммы E-S (Раздел III C).Наконец, мы сравниваем измерения μsALEX в одной точке и измерения PAX в 48 точках (Раздел III D). В заключение мы приводим краткое изложение и точку зрения в Разделе IV. 25 . Программное обеспечение, используемое для анализа данных, можно найти в хранилище 48-спотов mFRET-PAX-analysis 26 .В подписи к каждому рисунку добавляются ссылки на определенные аналитические блокноты. Файлы данных общедоступны на Figshare 27 .

II. ОПИСАНИЕ НАСТРОЙКИ

В этом разделе мы даем краткое описание установки. Более подробное описание можно найти в Приложении A, в то время как детали настройки лазера и массива SPAD можно найти в Приложении B и C.

Схема установки показана на Рис. 1. Установка включает два возбуждения CW мощностью 1 Вт. лазеры (зеленый: 532 нм, красный: 628 нм), в которых только красный лазер модулируется через акустооптический модулятор (АОМ).После регулировки поляризации и расширения луча два лазера модулируются по фазе с помощью их соответствующих LCOS-SLM, генерируя два шаблона из 48 точек на плоскости изображения перед каждым LCOS-SLM ( плоскость изображения LCOS). Два модулированных лазерных луча затем объединяются дихроичным зеркалом ( DM MIX ) и повторно коллимируются ( L 3) перед фокусировкой в ​​образец водно-иммерсионным объективом с высокой числовой апертурой (NA) (60X). , NA = 1,2, Olympus, Уолтем, Массачусетс).Излучаемая флуоресценция собирается линзой объектива, отделяется от длин волн возбуждения двухполосным полихроическим зеркалом ( DM EX ) и фокусируется линзой трубки ( L 2 ) на дно микроскопа. плоскость изображения. Затем испускаемый флуоресцентный свет повторно коллимируется ( L 4 ), разделяется на донорные и акцепторные спектральные полосы дихроичным зеркалом ( DM EM ) и фокусируется на двух различных 48-пиксельных массивах SPAD, установленных на моторизованные ступени микропозиционирования (векторы xyz).Система настроена так, что каждый SPAD оптически сопряжен с одним пятном возбуждения в образце.

Рис. 1.

Схема установки PAX на 48 точек. Лазеры и детекторы находятся на основном оптическом столе, а микроскоп (заключен в пунктирную рамку), расширители луча и LCOS-SLM расположены на приподнятой макетной плате. См. Основной текст и Приложение A для подробного описания.

Выходной сигнал детекторов (одна последовательность импульсов TTL на SPAD) обрабатывается платой, оснащенной программируемой вентильной матрицей (FPGA) (PXI-7813R, National Instruments, Остин, Техас), которая выполняет временные метки фотонов с 12.Разрешение 5 нс и асинхронная передача данных на главный компьютер. На главном ПК запускается программное обеспечение сбора данных LabVIEW, которое отображает в режиме реального времени бинированный сигнал, записанный со всех 96 каналов, в виде 96 временных графиков с цветовой кодировкой, реализует процедуры выравнивания и сохраняет данные на диск. После сбора данных преобразование файлов в формат Photon-HDF5 28 и анализ выполняется на втором ПК, что позволяет непрерывно получать последовательные файлы.

A. Детекторы

Текущая 48-точечная установка использует два идентичных массива SPAD 12×4 пикселей, архитектура и производительность которых были ранее представлены 29 .Здесь мы описываем только их самые важные особенности. Каждый SPAD имеет активную область диаметром 50 мкм, массив состоит из 4 строк по 12 пикселей (4×12), разделенных на 500 мкм в обоих направлениях.

Чтобы легко интегрировать детекторы в установку, мы разработали модуль подсчета фотонов, который объединяет 48-пиксельную матрицу SPAD и электронику, необходимую для работы устройства, сбора и передачи данных. Массив SPAD помещен в герметичную камеру, отделенную от остальной части модуля уплотнительными кольцами, и использует тонкую стеклянную пластину в качестве входного окна.Камера регулярно промывается и заполняется сухим газообразным азотом для предотвращения конденсации, что позволяет установить матрицу на двухступенчатом элементе Пельтье для охлаждения детектора до температур примерно 15 ° C. При такой температуре скорость счета в темноте (DCR) значительно снижается, что увеличивает отношение сигнала к фону прибора. Импульсы счета фотонов передаются через стандартный разъем SCSI. Это позволяет легко подключить модуль к универсальному устройству сбора данных или к платам адаптера, когда требуются различные разъемы или формы импульсов.В качестве альтернативы можно использовать встроенную ПЛИС (Spartan 6 SLX150, Xilinx, Сан-Хосе, Калифорния) для подсчета отметок времени, обнаруженных в каждом из 48 каналов, с разрешением по времени 10 нс. Затем эта информация отправляется на главный компьютер по высокоскоростному USB-каналу. Резьба C-mount вокруг входного окна модуля счета фотонов позволяет легко и надежно подключаться к оптической системе.

Два массива SPAD, используемые в текущей 48-точечной установке PAX, работают при температуре -10 ° ° C.Эффективность регистрации фотонов (PDE) достигает максимума ~ 45% при 550-580 нм (донорный краситель, пик эмиссии ATTO550) и падает до ~ 30% при 670 нм (акцепторный краситель, пик эмиссии ATTO647N) 29,30 . PDE очень однороден по массиву, с размахом от пика до пика всего несколько процентов 29 . На рис. 2 показаны DCR для двух массивов SPAD 12×4. Примерно 80% пикселей имеют DCR ниже 1000 импульсов в секунду (cps), а пиксель с худшей производительностью имеет довольно высокий DCR, составляющий почти 6 kcps.

Рис. 2.

тепловых карт DCR для массивов D- и A-SPAD 12×4, используемых в 48-точечной установке PAX. Значения DCR в отсчетах в секунду (cps) указаны в каждом пикселе. Более подробную информацию и данные можно найти в прилагаемой записной книжке 31 .

Результаты PAX с 48 точками сравнивались с результатами современной одноточечной установки μsALEX, ранее описанной в 16 . Однопиксельные SPAD (SPCM-AQRH, Excelitas Technology Corp., Waltham, MA), используемые в установке μsALEX, характеризуются PDE ~ 60% при 550 нм и ~ 70% при 670 нм, с заметно лучшей чувствительностью в полоса излучения донора и PDE, более чем в два раза превышающие полосу излучения акцептора.По этой причине ожидается, что установка μsALEX будет как минимум в два раза более чувствительной в A-канале, чем установка на 48 точек. Подробное сравнение различных технологий SPAD для измерения одиночных молекул приведено в документе 30.

B. 48-точечный рисунок

48 точек возбуждения генерируются независимо для каждой длины волны посредством фазовой модуляции входящего лазерного волнового фронта, как описано ранее. в 16 и 32 . Фазовая модуляция работает в прямом пространстве, а не в пространстве Фурье, и реализует фазовый профиль матрицы линз Френеля.Подобная модуляция в прямом пространстве с использованием другого пространственного расположения фазовой диаграммы на LCOS-SLM также была продемонстрирована для мультиконфокальной флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) 33 .

На рис. 3 показана диаграмма излучения образца красителя с высокой концентрацией при возбуждении зеленым (панель A) и красным (панель B) лазером, как это видно с камеры, установленной на боковом отверстии микроскопа. Два шаблона выровнены для максимального перекрытия каждого из 48 точек.

Рисунок 3.

Многоточечный узор 12×4 для зеленого (A) и красного (B) возбуждения и гауссова подбора пятен (C). Рисунок получен камерой, установленной на боковом порте микроскопа (см. Рис. 1), с использованием раствора красителей ATTO550 и ATTO647N в высокой концентрации (~ 100 нМ). Флуоресцентные изображения, полученные при возбуждении лазером 532 нм или 628 нм, были получены отдельно и представлены в зеленом и красном уровнях интенсивности на панелях (A) и (B), соответственно. Шкала 5 мкм. Для оценки совмещения каждое пятно на двух изображениях снабжено двухмерной функцией Гаусса.На панели (C) показано наложение согласованных положений пиков и контура гауссовой перетяжки для изображений 532 нм ( зеленый, ) и 628 нм ( красный, ). Справа показаны 3 репрезентативных пятна. Эллиптическая форма и наклон гауссианы обусловлены геометрическими аберрациями. Более подробную информацию можно найти в прилагаемой записной книжке 26 .

Перекрытие двух длин волн и их центрирование по отношению к оптической оси оценивается путем двухмерной подгонки по Гауссу для каждого отдельного пятна, как показано на панели C.Полную информацию о процедуре центровки и оценке образца можно найти в Приложении A 1.

III. ИЗМЕРЕНИЯ SMFRET

A. Анализ

Измерения одиночных молекул проводили с молекулами двухцепочечной ДНК (дцДНК) из 40 пар оснований (п.о.), меченных красителями ATTO550 (D) и ATTO647N (A) (ATTOTEC GmbH, Гейдельберг, Германия) ) прикреплены к разным основаниям ДНК, что приводит к разным расстояниям между красителями.

D-A разделение 12 пар оснований и 22 пар оснований использовалось в этих экспериментах, поскольку они покрывают типичный диапазон расстояний, которые могут быть точно измерены с помощью smFRET с использованием этой пары красителей.Образцы разбавляли до концентрации одной молекулы (~ 50 пМ) в TE50 (10 мМ Трис pH 8,0, 1 мМ EDTA и 50 мМ NaCl) или в «буфере для транскрипции» (40 мМ HEPES-NaOH pH 7, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1 мМ MEA, BSA: 100 мкг / мл) 34 . Полная информация об образцах ДНК представлена ​​в исх. 16.

Мы проанализировали данные, используя стандартные методы μsALEX 24 с модификациями, необходимыми для PAX 23 . Три этапа анализа включают в себя: (a) оценку фона, (b) поиск пакета и (c) выбор пакета.Оценка фона, необходимая для корректировки количества вспышек в различных потоках фотонов, была выполнена в течение 10-секундных временных окон, чтобы учесть возможные изменения фона во время измерения. Пакетный поиск выполнялся независимо для каждого пятна с использованием алгоритма скользящего окна13 и порога постоянной скорости для всех пятен 35 . Выбор пакета выполняется с использованием пакетов, размер которых превышает заданный порог, где размер пакета определяется согласно ур.D5 или D14. Чтобы изолировать популяции FRET, мы дополнительно фильтруем пакеты с A ex A em счетами, превышающими второй заданный порог. Полную числовую информацию можно найти в соответствующей записной книжке 26 .

Основным результатом методов анализа μsALEX и PAX является так называемая двумерная гистограмма ES, где каждый пакет представлен парой значений ( E, S ), вычисленных на основе различных интенсивностей потока фотонов (см. III C).Ось E на этой гистограмме может представлять либо эффективность FRET, либо, чаще, нескорректированную эффективность FRET E P R , известную как коэффициент близости. E P R легче вычислить, чем E , и обеспечивает подходящее приближение для идентификации подгрупп. Однако, хотя это не является целью данного исследования, когда целью является извлечение расстояний D-A, необходимо точно оценить все поправочные коэффициенты, чтобы вычислить E . S , или «стехиометрическое отношение», представляет собой величину, которая обычно имеет значение ~ 0,5 для видов с двойной меткой, 0 для только A и ~ 1 для видов, содержащих только D. Области видов D и A на гистограмме E-S также включают молекулы с двойной меткой и одним неактивным красителем из-за фото-мигания или обесцвечивания. В отличие от скорректированного отношения стехиометрии S γβ (уравнение D9), нескорректированное отношение S (уравнение D8) может проявлять зависимость от E и для молекул с двойной меткой не обязательно центрировано около ∼ 0.5. Использование пары ( E, S ) (исправленная или нескорректированная) позволяет разделить виды с одной и двумя метками и выделить субпопуляции FRET в популяции с двойной меткой. Полные определения E и S , а также сравнения между вариантами ALEX и PAX приведены в Приложении D.

В этой статье мы сообщаем о коэффициентах близости E P R , рассчитанных в соответствии с к эк. D6, и «модифицированное стехиометрическое соотношение» S u , определенное в ур.D19. S u — это вариант классического соотношения стехиометрии PAX 23 , который снижает эффект дробового шума и улучшает разделимость популяций только D и FRET. Более подробную информацию о S u можно найти в Приложении D 1. Обратите внимание, что на протяжении всей этой работы результаты для двух крайних левых точек во втором ряду отсутствуют из-за отказа активной цепи гашения (AQC) в Массив D-SPAD.

Б.Пиковая скорость фотонов

Пиковая скорость фотонов, достигнутая в каждом всплеске, сообщает о пиковой интенсивности PSF 16 . На рис. 4А показаны скорректированные по фону распределения пиковой скорости фотонов с их характерными экспоненциальными хвостами. На рис. 4B – E для различных потоков фотонов показаны тепловые карты средних значений максимальной скорости фотонов, , т.е. — константа затухания экспоненциального хвоста. Из-за гауссова профиля луча возбуждения и геометрических аберраций боковые пиксели получают более низкую интенсивность сигнала, чем центральные пиксели.В результате пиковая скорость фотонов уменьшается, и в боковых пятнах обнаруживается меньшее количество всплесков одиночных молекул. Несмотря на это уменьшение интенсивности возбуждения, положения пиков E P R и S остаются довольно однородными по всем пятнам (см. Рис. 7 и 9). Исключение можно увидеть на рис. 4C, E, где пиксель в позиции (1, 7) в массиве A-SPAD обнаруживает меньше фотонов, чем его соседи, эффект, который мы приписываем более низкому PDE этого пикселя, возможно, из-за меньшее приложенное перенапряжение.Для этого пятна (19) мы наблюдаем заметное смещение в величинах E P R и S (см. Рис.7 и 9).

Рис. 4.

Пиковая скорость вспышки фотонов в каждом из 48 пятен для образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н. Выходная мощность лазера, измеренная до использования какой-либо оптики, была установлена ​​на 200 мВт и 400 мВт для D- и A-лазеров соответственно. A: Полное распределение пиковых скоростей фотонов. B-E: Среднее пиковое распределение скорости фотонов в различных потоках фотонов.Два боковых пятна во втором ряду не показывают сигнала из-за двух неисправных пикселей в массиве D-SPAD. Цвета соответствуют разным потокам фотонов. Зеленый: D ex D em , красный: D ex A em , голубой: DA D em , фиолетовый: DA ex A em .Подробнее см. Прилагаемую записную книжку 36 .

Для сравнения, на рис. 5 показано распределение пиковых скоростей фотонов, полученных с помощью установки μsALEX. Абсолютную мощность, выдаваемую в каждой точке в многоточечной установке, трудно измерить. Поэтому мы определили оптимальную мощность D-лазера (200 мВт на выходе лазера), чтобы пиковое распределение скорости фотонов в центральных точках было сравнимо с пиковым значением фотонной скорости одиночного пятна (190 мкВт, измеренное перед объективом). Мощность A-лазера была установлена ​​на 400 мВт (выходная мощность лазера до AOM) в качестве компромисса между необходимостью компенсации более низкого PDE в A-канале при ограничении фотообесцвечивания образца и термической нестабильности.

Рис. 5.

Распределение пиковых скоростей фотонов при измерении μsALEX одной точки той же дцДНК с разделением D-A 12 п.о., используемым в измерениях с 48 точками (рис. 4). Средняя мощность лазера на входе в микроскоп после чередования АОМ составляла 190 мкВт и 80 мкВт. Цвета соответствуют разным потокам фотонов. Зеленый: D ex D em , красный: D ex A em , голубой: DA D em , фиолетовый: DA ex A em .Подробнее см. Прилагаемую записную книжку 37 .

Сравнение рис. 4A и 5 видно, что пониженная чувствительность в массиве A-SPAD приводит к более низким пиковым скоростям фотонов в D ex A em (красный) и DA ex A em (фиолетовый) потоков в 48-точечной настройке. Чувствительность A-канала вызывает сдвиг в положениях пиков E P R и S , как обсуждается в следующем разделе.

C. Гистограммы ES

На рис. 6 показаны гистограммы ES для образца дцДНК с разделением DA 12 п.н., полученные после поиска пакета и выбора размера, описанного в разделе III A.

Рисунок 6.

E PR по сравнению с S и гистограмм в разных точках для образца дцДНК с разделением 12 п.н. DA. Видны две субпопуляции: только D (приблизительно E PR = 0, S u = 1) и популяция FRET (приблизительно E PR = 0.6, S u = 0,6). Поиск всплеска проводился с использованием всех фотонов с постоянным порогом (50 kcps). Выбор пакета был выполнен по общему размеру пакета после коррекции фона с использованием порога в 40 фотонов. В легенде на каждом подграфике указывается номер пятна в скобках и количество всплесков (#B). Для получения более подробной информации см. Прилагаемую записную книжку 36.

Населения D-only и FRET, верхний левый угол и центр соответственно на гистограмме ES, отчетливо различимы на всех участках.Более того, как показано на рис.7, совокупность FRET легко изолировать, применяя второй пакетный выбор с использованием минимального порога на DA ex A em отсчетов. Второй пример такого выбора показан на рис. 11. Разделение видов FRET от однократно меченых видов является основным преимуществом двойного лазерного возбуждения 17,38 .

Рисунок 7.

E PR в сравнении с гистограммами S и в различных точках для образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н.Анализ данных и поиск пакетов идентичны показанным на рисунке 6, в то время как выбор пакета адаптирован для выбора только популяции FRET: пакет выбирается, если количество отсчетов в потоках DexAem и DAexAem больше 20. Легенда в каждой подзаголовке указано количество точек в скобках и количество всплесков (#B). Для получения более подробной информации см. прилагаемую записную книжку 36.

Даже без какой-либо калибровки разброс по разным точкам ограничен и не влияет на способность различать подгруппы.Это видно на рис. 8, который показывает положение центра пика E P R и S u в разных точках как для популяций D-only, так и для FRET. На рис.9 показаны центр и диапазон ± 1 σ из гауссовых аппроксимаций E P R и S u гистограмм популяции FRET (синяя точка и полоса ошибок). Оранжевая точка — это среднее положение пика популяции FRET во всех точках.Для большинства пятен отклонение положения пика значительно ниже диапазона 1 σ , за исключением пятна 19, где более низкое А-пиксельное PDE вызывает большее отклонение. Обратите внимание, что на рис. 8 и 9 представлены результаты без калибровки, что демонстрирует минимальную производительность системы. Можно практически исключить изменения положения пика E-S от точки к точке во время постобработки, применив калибровку для конкретной точки, как кратко описано в следующем разделе (подробности в Приложении E).В качестве дополнительного примера, гистограмма ES для дцДНК с низким FRET (разделение DA 22 п.н.) представлена ​​на рис. 15, приложение F.

Рис. 8. График разброса

подобранных E PR , S u положение пика в разных точках для популяций D-only ( оранжевый крест ) и FRET ( синий плюс ). Значения были получены с помощью гауссовой аппроксимации одномерной гистограммы E PR и S и после выборки всплесков, которая изолировала популяции только D и FRET, соответственно.Для получения дополнительной информации см. Прилагаемую записную книжку 36.

Рис. 9.

Положение пика FRET ( EP R, Su , синие точки ) и ± 1 σ подогнанного гаусса ( синие полосы погрешностей ) для 46 активных точек. Для справки, среднее значение EP R, Su по всем 46 точкам ( оранжевая точка ) приводится на каждом подграфике. Номер точки указан в правом верхнем углу каждого подсюжета. Подробнее см. Прилагаемую тетрадь 36.

D. Объединение данных из всех точек

Последний шаг анализа нескольких точек состоит в объединении данных из всех точек для увеличения эффективной скорости накопления данных. Неравномерность между различными пятнами может быть учтена путем применения двухэтапной коррекции, в которой каждый поправочный коэффициент γ и β (уравнение D3 и D4) разлагается на произведение двух последовательно применяемых факторов: среднего поправочный коэффициент, рассчитанный для всех пятен, и относительная поправка для конкретного пятна.Специфическая для пятна поправка для γ и β может быть легко вычислена из измерения статического образца FRET (подробности в Приложении E). Для простоты и из-за хорошей однородности пятен мы не применяем в этой работе какие-либо специфические поправки.

На рис.10 показаны кумулятивные ES-гистограммы смеси двух конструкций дцДНК с разделением DA 12 и 22 п.н. (см. Раздел III A), что дает среднее значение E P R из ∼ 0.6 и ∼ 0.15 соответственно. Значительная популяция только D видна в виде пика около E P R = 0,05, S u = 1. Из-за относительно низкой PDE акцепторного канала (см. Раздел II A), разделение популяций только D и FRET может быть в принципе проблематичным. Как показано ранее (рис. 7), популяции FRET могут быть выбраны путем установки порога на скорректированный по фону DA ex A em отсчетов.Рис. 11 показывает, что этот выбор эффективно удаляет большой пик только D, изолируя популяции FRET без значительной потери пакетов FRET.

Рисунок 10.

48-точечное измерение PAX смеси двух конструкций дцДНК с разделением D-A 12 и 22 п.н. (детали образца в III A). Пакетный поиск был выполнен на всех каналах с использованием порога постоянной скорости 50 кбит / с. Всплески выбирались по их общему размеру с критерием Λ γ, P AX> 80, используя γ = 0.5 (см. Уравнение D14). Гистограмма E-S была построена путем объединения данных по всем точкам без коррекции для конкретных точек. Для получения дополнительных сведений см. Прилагаемую записную книжку 39 .

Рис. 11.

48-точечных гистограмм PAX ES того же измерения, что и на рис. 10. Дополнительная фильтрация популяции только D была выполнена с использованием критерия F D exDAem> 25 (см. Приложение D ). Гистограмма E-S была построена путем объединения данных по всем точкам без коррекции для конкретных точек.Для получения дополнительных сведений см. Прилагаемую записную книжку 39 .

В качестве иллюстрации возможностей нашей установки с высокой пропускной способностью на рис. 12 и 13 показаны примеры окон сбора данных длительностью 5 с, полученных с одной и той же каплей образца дцДНК с двойной меткой, последовательно с использованием одноточечного μsALEX и многоточечного анализа. установки (образец представляет собой дцДНК с разделением DA 12 п.н., описанную в разделе III A). В обоих случаях использовался поиск пакетов с постоянной скоростью и порогом (20 кГц) с последующим выбором пакета на основе D ex отсчетов (Λ γ > 20, см.D5). Конкретные временные окна, показанные на рисунках 12 и 13, показывают 37-кратную разницу в количестве пакетов между двумя измерениями (40 ± 11-кратное вычисление для всех последовательных 5-секундных окон в течение двух 5-минутных измерений), что вполне соответствует 46-кратная разница, ожидаемая между двумя установками, при условии, что все экспериментальные условия идентичны. Большое стандартное отклонение измеренного отношения отражает естественно большую дисперсию скорости пакетов (количество пакетов в единицу времени) в рамках любого данного измерения.Более того, поскольку пакетная скорость зависит от ряда параметров измерения и анализа, коэффициенту пакетной скорости не следует придавать чрезмерное значение. Например, более низкая мощность в боковых точках многоточечной установки (см. Рис. 3) приведет к меньшим пакетам и, следовательно, меньшему количеству пакетов, выживших при выборе. В то время как более низкая эффективность обнаружения массива SPAD в красной области спектра (по сравнению с одноточечной установкой, см. Раздел II A) снижает сигнал акцептора при многоточечном измерении, что также приводит к меньшему и меньшему количеству всплесков сверх выбранного размера. порог, этот потенциальный источник различий был компенсирован использованием γ -скорректированных размеров всплеска (ур.D5). Наконец, различия в объемах наблюдений между установками, на что указывает немного большая длительность импульсов в многоточечном измерении (предполагающая большие объемы), также будут влиять на различную обнаруженную скорость всплесков. Несмотря на эти предостережения, очевидно, что многоточечная установка обнаруживает гораздо большее количество всплесков, чем одноточечная установка.

Рис. 12. Гистограмма

Multispot E-S, полученная за 5 секунд регистрации путем объединения пакетов из 46 активных точек. Подробнее см. Прилагаемую записную книжку 40 .

Сравнение рисунков 12 и 13 показывает, что значительное количество пакетов (1000) может быть получено всего за несколько секунд после сбора данных. Такая высокая производительность является преимуществом для измерений с остановкой потока или эквивалентных кинетических измерений в реальном времени, когда реакция запускается в нулевой момент времени, а затем непрерывно отслеживается эволюция образца. Временное разрешение измерения, , т. Е. наименьшее используемое временное окно (или временной интервал), обратно зависит от скорости пакетов (а также от типа информации, которая должна быть извлечена из данных) на основе числовой статистики.В простом случае, когда начальное и конечное состояния FRET реакции известны, и соответствующее количество каждой популяции является подходящим параметром реакции, количество пакетов в каждой субпопуляции может быть извлечено из гистограммы FRET с относительно небольшим количеством пакетов за интервал времени. Количество пакетов, собранных в эксперименте, показанном на рис. 12, определенно будет совместимо с эффективным временным разрешением ≤ 5 с. Чтобы в полной мере воспользоваться преимуществом такого временного разрешения, экспериментальное мертвое время (продолжительность начальной стадии перемешивания в реакции) должно быть короче, и может потребоваться автоматизированная микрофлюидная система (≪1 с, в отличие от ручного перемешивания. сообщается в кинетических измерениях исх.16, где было получено мертвое время не менее 15-20 с). Такую многоточечную систему можно также с успехом использовать для выполнения быстрых серий измерений одного и того же образца в разных условиях или разных образцов для приложений высокопроизводительного скрининга, среди других возможностей.

Рис. 13. Гистограмма

E-S, полученная в результате 5 секунд сбора данных для того же образца, что и на рис. 12. Для получения дополнительных сведений см. Прилагаемую записную книжку 40 .

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы описали 48-точечную установку возбуждения с двумя лазерами, разработанную для высокопроизводительных анализов smFRET.По сравнению с нашей предыдущей многоточечной установкой 16 количество точек было увеличено в шесть раз с соответствующим увеличением пропускной способности. Хотя другие группы продемонстрировали более крупные массивы SPAD, они производятся с использованием стандартных высоковольтных КМОП-процессов, что приводит к худшим характеристикам подсчета фотонов, чем применяемый здесь специальный технологический процесс. Убедительные приложения для клеточной FCS и FLIM, среди прочего, были опубликованы с этими матрицами CMOS SPAD 41–45 (подробный обзор см. 46), но они все еще далеки от обеспечения чувствительности, необходимой для приложений с одной молекулой.

По сравнению с нашими предыдущими работами 16,47 , был включен второй лазер с переменным возбуждением, и соответствующие препятствия для выравнивания были решены, что позволило сортировать одиночные молекулы в соответствии с их стехиометрией D-A. В частности, мы показали, что установка позволяет идентифицировать виды с одной и двумя метками во всем диапазоне эффективности FRET, открывая двери для гораздо более широкого диапазона анализов, чем это было возможно ранее.

Мы представили подробное описание процедуры настройки и юстировки многоточечной системы, которая включает ряд технических решений, которые могут представлять интерес для других приложений.Мы также проиллюстрировали возможности измерения smFRET новой установки с использованием молекул дцДНК с двойной меткой в ​​качестве доказательства принципиальной демонстрации разделения субпопуляций и высокопроизводительных измерений. Наконец, мы провели сравнение его производительности со стандартной одноточечной (конфокальной) установкой μsALEX. Применение этого нового инструмента для изучения начальных стадий бактериальной транскрипции и высокопроизводительной диагностики будет изучено в будущей работе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят Луку Миари за помощь на начальном этапе этого проекта, Mr.Язану Альхадиду и доктору Эйтану Лернеру за помощь в подготовке образцов из одной молекулы и доктору Эйтану Лернеру за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим доктора Бентолилу за щедрую ссуду LCOS-SLM из фонда общих ресурсов Advanced Light Microscopy / Spectroscopy в Калифорнийском институте наносистем в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (номер награды R01 GM095904 и R01 GM069709) и Национальным научным фондом (номер премии MCB 1244175).Авторы несут исключительную ответственность за содержание, которое не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Национального научного фонда. Заявления о конфликте интересов: S. Weiss раскрывает информацию об интеллектуальной собственности, использованную в исследовании, о котором идет речь. М. Гиони раскрывает долю в Micro Photon Devices S.r.l. (MPD). В этой работе не были задействованы ни ресурсы, ни персонал MPD. Работа в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе проводилась в лаборатории доктора Вайса.

Приложение A Подробное описание установки

Установка (рис.1) состоит из двух непрерывных лазеров возбуждения, излучающих на длинах волн 532 и 628 нм (2RU-VFL-Series, MPB Communications Inc., QC, Канада). Для каждого лазера полуволновая пластина и поляризационный светоделитель используются для управления поляризацией и интенсивностью, так как ориентация поляризации должна быть выровнена в направлении, требуемом для LCOS-SLM. Лазерный луч с длиной волны 628 нм проходит через AOM (P / N 48058 PCAOM, электроника: P / N 64048-80-.1-4CH-5M, Neos Technology, Мельбурн, Флорида), используемый для модуляции временного масштаба в мкс. Лазер 532 нм не модулируется.Каждый лазерный луч проходит через первый расширитель луча (телескоп Кеплера, дуплетные линзы: фокусные расстояния 50 мм и 250 мм). Два перископа направляют лучи на приподнятый оптический макет, на котором стоит инвертированный корпус микроскопа (X71, Olympus Corp., Уолтем, Массачусетс), его нижний порт расположен над круглым отверстием в макете. Помимо перископа, каждый луч проходит через второй регулируемый расширитель луча (3X, P / N 59-131, Edmund Optics Inc.). Красный лазерный луч отражается от зеркал M 1 R и M 2 R и модулируется по фазе «красным» LCOS-SLM (P / N X10468-07, Хамамацу, Япония), перед прохождением через дихроичное зеркало D MIX .Зеленый лазерный луч отражается от M 3, модулируется по фазе «зеленым» LCOS-SLM (P / N X10468-01, Hamamatsu) и комбинируется с красным возбуждением через дихроичное зеркало D MIX (T550LPXR, Chroma Technology Corp, VT). Оба луча повторно коллимируются линзой L 3 (f = 250 мм, AC508-250-A, Thorlabs) и фокусируются в образец водно-иммерсионным объективом с высокой числовой апертурой (UAPOPlan 60X, NA 1.2, Olympus) после отражается от дихроичного зеркала возбуждения DM EX (Brightline FF545 / 650-Di01, Semrock Inc., Нью-Йорк). Схема возбуждения формирует двухцветный массив пятен 12×4 в образце, соответствующий геометрии двух массивов SPAD. Эмиссия флуоресценции собирается той же линзой объектива, проходит через дихроичный возбуждающий DM EX и фокусируется линзой L 2 микроскопа на боковой или нижней стороне микроскопа. Боковой порт оборудован камерой CMOS (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M-C, FLIR Integrated Imaging Solutions Inc., Британская Колумбия, Канада), используемого во время юстировки, а нижний порт перенаправляет лучи на путь излучения массива SPAD. Здесь релейная линза L 4 (f = 100 мм, AC254-100-A, Thorlabs) восстанавливает изображение и отправляет его на эмиссионное дихроичное зеркало D EM (Brightline Di02-R635, Semrock), который разбивает сигнал на донорную (D) и акцепторную (A) спектральные полосы. Сигнал D проходит через полосовой фильтр (Brightline FF01-582 / 75, Semrock), который устраняет остаточную утечку лазера с длиной волны 628 нм и помогает подавить рамановское рассеяние от лазера с длиной волны 532 нм.Оба сигнала D и A перефокусируются линзами L 5 D / L 5 A (f = 150 мм, AC254-150-A, Thorlabs) на двух 48- пиксельные массивы SPAD 29 (в тексте обозначены как D и A-SPAD).

Обе матрицы SPAD установлены на 3-осевых микропозиционерах. Движение в направлениях X и Y, ортогональных к оптической оси, управляется программным обеспечением с помощью пьезоприводов с разомкнутым контуром (P / N 8302; драйверы: P / N 8752 & 8753; Newport Corporation, Irvine, CA).Третья ось (Z) использует ручной привод, так как требования к направлению Z гораздо менее строгие, чем к направлениям X и Y. Массив D-SPAD установлен на дополнительной платформе вращения вокруг оптической оси, которая используется для согласования относительной ориентации массивов SPAD. Программное обеспечение для управления микропозиционерами доступно в репозитории picomotor в 25.

Каждый модуль массива SPAD оснащен внутренней ПЛИС (Xilinx Spartan 6, модель SLX150), датчиком влажности и USB 2.0 соединение. Встроенное ПО FPGA, используемое в этой работе по умолчанию, позволяет получать отсчеты с временным интервалом с низким разрешением (10–100 мс) через USB-соединение, а также используется для мониторинга влажности. Кроме того, стандартный разъем SCSI включает 48 независимых выходов, обеспечивающих импульс для каждого обнаруженного фотона в каждом пикселе 29 . Два порта SCSI подаются через специальный адаптер на плату сбора данных на основе FPGA (плата FPGA: PXI-7813R, стойка PXI: PXI-1000B, National Instruments, Остин, Техас), которая выполняет временную метку фотонов с помощью 12.Разрешение 5 нс параллельно на 96 каналах (задача реализована в LabVIEW с использованием модуля LabVIEW FPGA, код доступен в репозитории Multi-channelTimestamper) в исх. 25. Плата FPGA передает данные асинхронно на главный компьютер через канал MXI-4 в пользовательскую программу сбора данных, написанную в LabVIEW (стоечная плата PXI: PXI-8331; плата ПК: PCI-8331, National Instruments). Программа сбора данных также управляет чередованием красного лазера с помощью платы генерации импульсов (PXI-6602, National Instruments) с часами, синхронизированными с платой ПЛИС с отметкой времени через стойку PXI.

В дополнение к вышеупомянутой программе сбора данных, главный компьютер запускает вторую программу LabVIEW, управляющую фазовой диаграммой на двух LCOS-SLM. Во время выравнивания программа сбора данных взаимодействует с программой управления LCOS для сканирования позиций шаблона LCOS при записи сигнала от массивов SPAD (см. Приложение B).

Необработанные данные, передаваемые с FPGA, сохраняются на диск в двоичном файле вместе с текстовым файлом метаданных, содержащим детали измерений (описание образца, мощность лазера, информацию о чередовании и т. Д.)). Оба файла используются для создания окончательного файла Photon-HDF5 28,48 . После сохранения измерения на главном ПК необработанные данные автоматически передаются на рабочую станцию ​​на базе Linux по каналу Ethernet 1 Гбит / с. Вторая рабочая станция автоматически выполняет преобразование в Photon-HDF5 и анализ данных, оставляя главный компьютер доступным для получения следующего набора данных. Скрипты для передачи, преобразования и автоматического анализа данных доступны в репозитории transfer_convert в исх. 25.

1. Модуляция LCOS-SLM

Массив из 48 пятен возбуждения генерируется отдельно для каждого цвета двумя LCOS-SLM посредством фазовой модуляции входящей плоской волны, как ранее описано в 16 и 32. Вкратце, LCOS-SLM реализует фазовый профиль решетки линз, которая фокусирует приходящую плоскую волну в массив пятен на 3-4 см перед поверхностью LCOS-SLM (см. рис. 1). Прямоугольная область LCOS-SLM разделена на смежные блоки 12×4, каждый из которых реализует одну линзу.Шаблон можно регулировать, изменяя его центральное положение, поворот и шаг по осям X и Y независимо (операции, эквивалентные смещению, повороту или масштабированию массива линз). Для обеих длин волн возбуждения шаг и, следовательно, диаметр линз определяются геометрией детектора и увеличением оптической схемы как на пути возбуждения (83 × ), так и на пути излучения (90 × = 60 1,5). Номинально шаг пятна в образце, соответствующий шагу детектора, равен 5.5 мкм (500 мкм м / 90) в обоих направлениях, что приводит к шагу линзы LCOS-SLM 463 мкм (23,1 пикселя LCOS-SLM). Значение оптимизируется во время юстировки, чтобы соответствовать фактическому увеличению и оптическим аберрациям. При сохранении постоянного диаметра и шага линзы LCOS-SLM изменение фокусного расстояния линзы приводит к изменению числовой апертуры и, следовательно, размера пятна. Соотношение фокусных расстояний в двух LCOS-SLM (32 мм для красного и 36 мм для зеленого) выбрано для компенсации разницы в размерах PSF между длинами волн 532 нм и 628 нм.Обратите внимание, что изменение фокусного расстояния линзы требует изменения расстояния между L 3 и LCOS-SLM, чтобы фокальная плоскость LCOS оставалась на фокусном расстоянии от L 3.

Область LCOS-SLM, окружающая шаблон 12×4, получает свет это может привести к паразитному возбуждению в широком поле и, следовательно, к увеличению фонового сигнала. По этой причине мы заполняем неиспользуемую область LCOS-SLM шаблоном «управления лучом» (периодическим шаблоном в одном направлении), который дифрагирует падающий свет под углом по отношению к оптической оси.Такое «управление» гарантирует, что свет, не способствующий формированию многоточечного рисунка, не будет собираться задней апертурой линзы объектива. Кроме того, расширенный лазерный луч ограничивается двумя прямоугольными отверстиями (щелями) примерно на 1 мм больше, чем многоточечный рисунок, что еще больше уменьшает источники фона. Этот подход обеспечивает низкий фон без необходимости в дополнительном пространственном фильтре, который использовался в нашей предыдущей 8-точечной установке 16 .

Аналогичный подход для генерации мультиспотов был использован для мультиконфокальной FCS Kloster et al. 33 . Принципиальным отличием метода Клостера является использование гораздо большего фокусного расстояния LCOS для построения однофазной диаграммы для всех пятен (как суммы вкладов каждого отдельного пятна). Напротив, в нашем подходе разные части LCOS-SLM распределяются по разным точкам. Подробное экспериментальное сравнение, подчеркивающее относительные преимущества этих двух подходов, в настоящее время отсутствует.

Программное обеспечение для генерации многоточечного фазового паттерна, используемое в этой работе, доступно в репозитории lcos_multispot_pattern в исх.25.

Приложение B: Юстировка лазера

Каждый из двух лазеров необходимо выровнять, чтобы обеспечить (а) максимальную однородность между интенсивностями пятна (б) минимальные аберрации по всему рисунку. Для достижения (а) гауссов лазерный луч расширяется так, что только центральная часть луча покрывает диаграмму возбуждения (которая имеет максимальное протяжение 5 мм). Для обеспечения (b) геометрический центр рисунка необходимо расположить на оптической оси.

Кроме того, (c) диаграмма возбуждения двух лазеров должна быть выровнена так, чтобы было максимальное перекрытие между объемами возбуждения D и A для каждого пятна.

1. Индивидуальная юстировка лазера

Расширители луча 3X имеют регулировочное кольцо, используемое для управления коллимацией луча. Простой способ обеспечить коллимацию луча — направить луч в микроскоп через дихроичное зеркало возбуждения, снять внешнюю реколлимационную линзу L 3 и линзу объектива, одновременно поместив зеркало на держатель образца и используя LCSO-SLM в качестве зеркало, , то есть , отображающее диаграмму постоянной фазы. С помощью камеры на выходном отверстии микроскопа регулируем коллимацию до образования плотного пятна.После настройки коллимации каждый луч должен быть выровнен так, чтобы пиковая интенсивность находилась в центре оптической оси. С этой целью после удаления объектива для повторного коллимации L 3 перед входом луча в боковой порт микроскопа помещается диафрагма I 2. При апертуре 1-2 мм только узкий луч проходит через объектив и генерирует пятно от отражения покровного стекла. Только когда входной луч параллелен оптической оси, пятно будет расположено в центре перекрестия в окуляре микроскопа.Чтобы входные лучи были параллельны оптической оси, последние зеркала перед микроскопом настраиваются ( M 2 R для красного и DM MIX для зеленого лазера). При изменении фокуса микроскопа мы получаем симметрично концентрические узоры только в том случае, если входной луч пересекается с оптической осью на задней апертуре линзы объектива. Поскольку направление уже зафиксировано, мы перемещаем диафрагму I 2, чтобы получить наиболее радиально-симметричный расфокусированный узор.Таким образом, луч, проходящий через I 2, совпадает с оптической осью микроскопа. Последний шаг включает перемещение входного луча без изменения его угла падения до тех пор, пока пик интенсивности не будет совмещен с центром диафрагмы. Чистый перенос достигается вращением двух зеркал в противоположных направлениях, так что начальный и конечный угол луча остается неизменным. Совмещение направления луча и диафрагмы необходимо повторять до схождения. После завершения оба луча параллельны и концентричны с оптической осью в хорошем приближении.При размещении L 3 пятно формируется в другом положении фокусировки. L 3 можно выровнять, убедившись, что это пятно расположено в том же положении, что и пятно, полученное без L 3.

2. Достижение перекрытия зеленого и красного шаблонов

Начиная с зеленого LCOS-SLM, мы проецируем многоточечный узор в высококонцентрированный раствор красителей Cy3B и ATTO647N (100 нМ — 1 мкМ). Использование квадратной сетки с нечетным количеством пятен на каждой стороне (например, 9×9) гарантирует, что одно пятно всегда будет в центре узора.Камера на боковом порте обнаруживает изображение узора. О центрировании рисунка относительно оптической оси можно судить по степени геометрических аберраций в боковых пятнах. Мы центрируем схему возбуждения, жестко перемещая узор на LCOS-SLM, так что геометрические аберрации примерно одинаковы на всех четырех сторонах. Затем мы выполняем двухмерную подгонку по Гауссу для каждого пятна и, исходя из распределения размера талии и угла наклона для каждого Гаусса, мы оцениваем более точное положение оптической оси (для анализа см. Блокнот 49 подгонки шаблона LCOS).Этот шаг можно повторять несколько раз до схождения. С этого момента положения X и Y зеленого LCOS-SLM больше не меняются, и его центр становится точкой отсчета для положения оптической оси.

Затем мы активируем красный LCOS-SLM и проецируем многоточечный узор, возбуждаемый лазером с длиной волны 628 нм. Используя камеру, мы выравниваем красный узор с зеленым, используемым в качестве ориентира. Первоначальная грубая настройка красного шаблона LCOS-SLM выполняется вручную путем наблюдения диаграммы излучения на дисплее камеры в реальном времени.Затем центральное положение красного шаблона LCOS-SLM точно настраивается путем подгонки положений пятен на зеленом и красном изображениях (рис. 3), взятых отдельно (подробности реализации см. В блокноте подгонки шаблона LCOS 49 ).

Наконец, чтобы уменьшить фон из-за немодулированного света, на пути перед каждым LCOS добавлены две специально изготовленные прямоугольные щели (алюминий с черным покрытием) ( S R и S G на рис.1). Щели выровнены так, чтобы освещать только рисунок 12×4 ( ± 1 мм) на LCOS-SLM (см. Приложение A 1).

Приложение C: Выравнивание массивов SPAD

Оба детектора должны быть выровнены так, чтобы каждый пиксель был оптически сопряжен с соответствующим объемом возбуждения, т.е. PSF возбуждения. Цель состоит в том, чтобы иметь пары соответствующих пикселей на двух массивах, детектирующих фотоны из одного и того же объема выборки, , то есть детектирующий PSF. В то же время, чтобы максимизировать сигнал, PSF детектирования должен быть концентрическим с PSF возбуждения.Достижение этого с помощью двухмерного расположения пятен и пикселей требует не только выравнивания положения детекторов по осям X и Y, как при одноточечных измерениях, но также выравнивания относительного вращения двух SPAD и регулировки шага и поворота шаблона возбуждения. для оптимального соответствия геометрии детекторов.

Для выравнивания мы используем смесь красителей с высокой концентрацией (ATTO550, ATTO647N, ∼ 500 нМ), возбуждаемую обоими лазерами. С таким образцом лазер с длиной волны 532 нм генерирует сигнал флуоресценции в обоих каналах D и A, в то время как лазер с длиной волны 628 нм генерирует сигнал только в канале A.На данный момент положение шаблонов возбуждения 532 нм и 628 нм на LCOS-SLM уже было зафиксировано, чтобы минимизировать геометрические аберрации, как описано в Приложении B. Следовательно, положение шаблона возбуждения используется в качестве ориентира для выравнивания Массивы SPAD. Tyndall et al. 50 представили автоматическую процедуру для совмещения многоточечного рисунка LCOS-SLM с детектором. Здесь мы выравниваем SPAD по шаблону LCOS-SLM.

Начиная только с зеленым лазером, оба SPAD вручную позиционируются по X и Y, чтобы соответствовать центру шаблона возбуждения.Это достигается путем определения местоположения максимального зарегистрированного количества SPAD при перемещении детекторов.

Затем мы выполняем более автоматизированную процедуру точного выравнивания, называемую «сканирование нескольких точек». Многоточечное сканирование включает в себя жесткое преобразование многоточечного рисунка на LCOS-SLM (обычно точечный рисунок 4×4) дискретными шагами по двум ортогональным путям, образуя крест. В то же время счетчики из массива SPAD интегрируются для каждой позиции шаблона в течение 300 мс после каждого шага.Во время сканирования каждое пятно излучения рисует поперечный путь примерно с центром в пикселе SPAD. Типичное сканирование охватывает диапазон из 10 пикселей LCOS-SLM с размером шага 0,4 пикселя и выполняется последовательно по направлениям X и Y. Подсчеты, полученные в зависимости от положения LCOS-SLM, образуют профиль пика, который используется для оценки положений центров пикселей SPAD в координатах LCOS-SLM. Усредняя положение пикселей SPAD, мы получаем точную оценку для центра массива SPAD. В конечном итоге эта процедура дает смещение каждого массива SPAD относительно идеального центра диаграммы направленности возбуждения.Обладая этой информацией, мы перемещаем массивы SPAD в идеальное положение (X, Y) с помощью микропозиционеров с пьезоуправлением с программным управлением. Последовательность многоточечного сканирования и трансляции массива SPAD повторяется до схождения. Первоначально две матрицы SPAD выровнены относительно зеленого шаблона LCOS-SLM (532 нм). Затем положение красного шаблона LCOS-SLM (628 нм) настраивается для соответствия положению массива A-SPAD (массив D-SPAD не обнаруживает никаких сигналов с возбуждением 628 нм).Оптимальное положение красного шаблона возбуждения определяется из многоточечного сканирования, выполняемого с помощью красного LCOS-SLM, в то время как счет производится с помощью массива A-SPAD, как описано ранее. После этого последнего шага фиксируются как красные, так и зеленые шаблоны возбуждения, а также положения массива D- и A-SPAD, завершая настройку настройки.

Вся процедура точной юстировки обычно выполняется в начале каждого дня измерений и длится около 30 минут. На рис. 14 показаны подогнанные координаты после точного совмещения центрального набора пикселей 4×4 в массивах D и A-SPAD.

Рис. 14.

Экспериментальные координаты пикселей SPAD после точного согласования для массивов D-SPAD и A-SPAD, полученные при сканировании зеленого LCOS-SLM. Центральные положения D-SPAD обозначены «X», а центральные положения A-SPAD обозначены «+». Среднее расстояние между пикселями D- и A-SPAD составляет 2,3 мкм. Подробности см. В прилагаемой записной книжке 49.

1. Регулировка поворота и шага

В предыдущем разделе мы описали общую процедуру точного выравнивания, повторяемую ежедневно при использовании многоточечной установки.Однако при построении установки необходимы дополнительные шаги, чтобы (а) выровнять относительное вращение двух массивов SPAD, (б) определить лучший шаг по осям X и Y для зеленого и красного шаблонов возбуждения и (в) оптимизировать Положение SPAD по оптической оси (Z).

Для получения информации о вращении и шаге мы выполняем многоточечное сканирование, за которым следует дополнительный этап анализа. В частности, набор положений (X, Y) каждого пикселя SPAD, полученный в результате сканирования, соответствует прямоугольной сетке.Параметры подобранной сетки: центральное положение, шаг по оси X, шаг по оси Y и угол поворота. Каждый массив SPAD, как правило, имеет различный набор подобранных параметров.

Чтобы отрегулировать угол поворота, один из массивов SPAD (D) вращается вокруг оптической оси, чтобы соответствовать углу второго SPAD, где угол поворота каждого SPAD получается из результатов сканирования. Как только ориентации двух массивов SPAD совпадают, этап вращения блокируется, обеспечивая долгосрочную стабильность угла поворота.

Для настройки высоты тона информация, полученная при сканировании, используется для точной настройки шага X и Y шаблона LCOS-SLM для оптимального согласования обоих массивов SPAD. Остаточная разница шага по осям X и Y 1-2% наблюдается из-за неидеальности, , т.е. стигматизмов в оптическом пути.

Приложение D: ALEX и PAX

В ALEX два временных окна чередования, D ex и A ex (соответственно окно возбуждения D или A) и два детектора (D и А) задействованы.Это приводит к четырем отмеченным потокам фотонов D ex D em , D ex A em 14, A D em , A ex A em , где первая буква указывает период возбуждения, а вторая — канал обнаружения.Поток A ex D em содержит только фон, поскольку флуоресцентное излучение в D-спектральной полосе во время возбуждения A-лазера отсутствует, и поэтому игнорируется. Для простоты ниже мы предполагаем, что все величины были скорректированы с учетом фона 35 .

Установка PAX имеет два детектора (D и A), но только один чередующийся лазер (A). Как и в ALEX, могут быть определены два временных окна чередования: D ex , соответствующий интервалу, в течение которого включен только D-лазер, и DA ex , когда оба лазера включены на.Как и прежде, это приводит к четырем фотонным потокам, отмеченным D ex D em , D ex A em 39 DA D em , DA ex A em . Формально единственная разница с ALEX заключается в том, что A ex в ALEX заменяется на DA ex .Однако в PAX все четыре потока фотонов содержат флуоресцентный сигнал. В частности, DA ex D em содержит D-флуоресценцию, вызванную возбуждением D-лазером (соответствующий термин в ALEX, A ex D em em , содержит только фон). С помощью этого обозначения мы можем определить общий сигнал флуоресценции во время D-возбуждения (действительный как для ALEX, так и для PAX) как: где величины F — это количество фотонов с поправкой на фон. F F RET — это обнаруженная акцепторная флуоресценция из-за FRET, вычисленная путем вычитания из F Dex A em утечка акцепторных каналов в D-каналы ( Lk ) и А-направление возбуждения А-лазером ( Dir ) 24 :

Еще нам понадобятся обычные поправочные коэффициенты γ и β 24 : где φ A , φ D — квантовые выходы акцептора и донора, а, — эффективности регистрации сигналов D и A в каналах D и A.В ур. D4, и — интенсивности A- и D-возбуждения, а и — сечения поглощения красителя на соответствующих длинах волн лазера. β учитывает разницу в скоростях возбуждения красителей D и A, когда каждый краситель возбуждается соответствующим лазером.

Мы можем определить полный сигнал с поправкой на γ при D-возбуждении как 24,51 :

При этих определениях коэффициент близости E P R и эффективность FRET E задаются следующим выражением, действительным как для ALEX, так и для PAX:

Напротив, выражение для отношения стехиометрии S немного отличается для ALEX и PAX.В ALEX S и его исправленная версия S γβ определены как:

Значение S γβ всегда центрируется около 0,5 для видов с двойной меткой, независимо от эффективности FRET или интенсивностей D- и A-возбуждения.

В PAX нет такого сигнала как. Однако, когда период чередования достаточно короткий, чтобы предположить, что интенсивность возбуждения не изменяется от одного интервала к следующему (что обычно имеет место), эквивалентная величина может быть вычислена путем вычитания вклада D-возбуждения в : где w A и w D — длительности периодов возбуждения DA ex и D ex соответственно.Обычно периоды чередования имеют одинаковую продолжительность (, т.е. рабочий цикл = 0,5) и w A / w D = 1. Выражения для S и S γβ , определенный для ALEX (ур. D8 и D9), затем можно использовать для PAX с заменой на:

Так как в экспериментах PAX ​​D-возбуждение всегда включено, мы можем использовать сигнал in для улучшения статистики фотонов. Чтобы получить модифицированный набор выражений PAX для E и S , мы начнем с определения «модифицированного» общего сигнала FRET как: где — рабочий цикл D ex (обычно w A = w D и α = 0.5). Коэффициент α -1 усиливает сигнал F F RET для компенсации дополнительного донорного сигнала.

На основе ур. D13 и D14, мы можем написать модифицированные выражения PAX для E и S :

Ур. D15, D16, D17 и D18 содержат больше фотонов, чем классические выражения, и, следовательно, могут привести к более низкому дробовому шуму. Однако этот эффект смягчается тем фактом, что F F RET умножается на α -1 , чтобы компенсировать дополнительный сигнал D , и, следовательно, его дробовой шум усиливается.

1. Модифицированная стехиометрия

Путем замены на в ур. D11, модифицированная или «нескорректированная стехиометрия» S u может быть определена следующим образом:

Это выражение позволяет избежать вычитания отсчетов из (операции, которая суммирует статистический шум этих двух величин), тем самым улучшая общую дисперсию ратиометрической величины S u . В результате распределения S u более узкие, что упрощает разделение популяции FRET и только D.Однако обратите внимание, что S u имеет встроенную зависимость от значения FRET популяции, в частности S u уменьшается с увеличением E. В этой работе даже при низких значениях FRET, Лучшее разделение между FRET и популяцией только D было достигнуто с использованием S u вместо S . В общем, преимущество S и над S может измениться в других ситуациях, особенно когда отношения сигнал-шум и сигнал-фон большие.Как только популяции разделены на гистограмме E – S и , можно использовать классическое выражение S (уравнение D11) для вычисления гамма-фактора, как описано в исх. 24. В этой работе не было предпринято никаких попыток восстановить точные значения FRET и расстояния D-A, поэтому калибровка гамма-фактора не проводилась. Тем не менее, мы обращаемся к проблеме различий в эффективности сбора и обнаружения в разных точках, которые могут повлиять на такую ​​калибровку, в Разделе E.

Приложение E: Индивидуальные точечные поправки

1.Гамма-коррекция

Гамма-фактор каждого пятна, γsp , может быть выражен как произведение поправочного коэффициента среднего коэффициента γ м и специфичного для пятна χ sp : χ sp можно легко вычислить из измеримых величин в соответствии со следующим выражением:

В ур. E2, E PR, sp — коэффициент близости подгруппы населения, измеренный в определенном месте, а ⟨ E PR, sp N — его среднее значение по всем N точкам (здесь N = 48).

Ур. E2 следует из следующего соотношения между E и E P R 24, 51 :

Решение ур. E3 для γ , получаем:

Формально мы можем записать γ = γ 1 γ 2 , где γ 1 связано с частично скорректированным коэффициентом близости E 1 следующим образом:

Записывая γ 1 как функцию от E 1 , как в E4, и подставляя выражение в уравнение.E3, получаем E как функцию от E 1 :

Ур. E6 имеет ту же форму, что и E3 и E6. Следовательно, E может быть получено двумя последовательными (связанными) поправками для γ 1 и γ 2 соответственно, как в уравнении. E7.

В случае с несколькими точками мы применяем это свойство, чтобы разложить гамма-коррекцию на коррекцию, специфичную для точки, и среднюю коррекцию, как в E1. В частности, ур. E2 напрямую происходит от E4 с простыми заменами.

Приложение F: Дополнительные данные

На рис.15 показаны гистограммы E P R S u для различных каналов, полученные во время измерения образца ДНК 22d (с низким FRET). Из-за выбора мощности возбуждения донора и акцептора во время этого измерения популяция FRET имеет значение S и > 0,5, искусственно сжимая гистограммы в верхней части графика.Тем не менее, все еще возможно отличить FRET от пакетов только D, несмотря на низкое значение E PR для этой выборки, что позволяет объективно оценить E PR , в отличие от того, что произошло бы в отсутствие акцепторного возбуждения 16 .

Рисунок 15.

E PR в сравнении с S и гистограммы всех пятен для образца 22d дцДНК. Анализ данных и пакетный поиск идентичны показанным на рисунке 6.Поиск всплеска проводился по всем фотонам с постоянным порогом (50 kcps). Выбор пакета был выполнен по общему размеру пакета после коррекции фона с использованием порога в 40 фотонов. В легенде на каждом подзаголовке указывается номер пятна в скобках и количество всплесков (#B). Подробнее см. Прилагаемую тетрадь 52.

Сноски

  • ↵a Электронная почта: ingargiola.antonino {at} gmail.com

  • b Электронная почта: michalet {at} chem.ucla.edu

ССЫЛКИ

  1. М. Дахан, А. А. Дениз, Т. Ха, Д. С. Чемла, П. Г. Шульц и С. Вайс, Химическая физика 247, 85 (1999).

  2. A. Ingargiola, RA Colyer, D. Kim, F. Panzer Гулинатти, И. Реч, М. Гиони, С. Вайс и Х. Мишале, in Proceedings of SPIE, Vol.8228 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2012) стр. 82280B.

  3. A. Ingargiola, F. Panzeri, N. Sarkosh, A. Gulinatti, I. Rech, M. Ghioni, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 8590 (Сан-Франциско, Калифорния, США, 2013 г.) стр. 85900E.

  4. 922 A.Сигал, X. Мишале и С. Вайс, Figshare (2017), 10.6084 / m9.figshare.5146096, dOI: 10.6084 / m9.figshare.5146096.

  5. А. Гулинатти, И. Реч, П. Макканьяни и М. Гиони, in Proceedings of SPIE, Vol. 8631 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2013) стр. 86311D.

  6. X. Michalet, A. Ingargiola, RA Colyer, G. Scalia, S. Weiss, P. Maccagnani, A. Gulinatti, I. Rech и M. Ghioni, IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Электроника 20, 1 (2014).

  7. Колайер, Г. Скалиа, Ф. а. Villa, F. Guerrieri, S. Tisa, F. Zappa, S. Cova, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 7905 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2011), стр. 7–7–8.

  8. J. Buchholz, J. W. Krieger, G. Mocsár, B. Kreith, E.Чарбон, Г. Вамоси, У. Кебшулл, Дж. Ланговски, Optics Express 20, 17767 (2012).

  9. К. Брускини, Х. Хомулле и Э. Чарбон, in Proceedings of SPIE, Vol. 10069 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2017) стр. 100691S.

  10. A. Ingargiola, P. Peronio, E. Lerner, A. Gulinatti, I. Rech, M. Ghioni, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 10071 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2017) стр.100710Q.

  11. A. Ingargiola, T. Laurence, R. Boutelle, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 9714 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2016) стр. 971405.

  12. Д. Тиндалл, Р. Уокер, К. Нгуен, Р. Галланд, Дж. Гао, И. Ван, М. Клостер, А. Делон и Р. Хендерсон, in Труды SPIE, Vol. 8086 (2011) стр. 80860S – 80860S – 6.

Qorvo, Skyworks: Маккуори говорит, что не беспокойтесь о снижении оценки iPhone

Размер текста

Производители микросхем находятся в тисках в момент снижения оценок для Apple (AAPL) iPhone, но Macquarie Research Srini Pajjuri призывает инвесторов в Qorvo (QRVO) и Skyworks Solutions ( SWKS) и Broadcom (AVGO), чтобы сохранить веру.

Писая, что 2018 год будет «переходным годом и », ожидая появления технологии беспроводной связи 5G , Паджури, тем не менее, видит «достаточно возможностей для инкрементального контента (4×4 MIMO, 802.11ax и т. полуиндустрия (экс-память) в этом году ».

Следовательно, «Мы считаем, что оценки в значительной степени не учитывают более медленный рост и что соотношение риска и прибыли является привлекательным, в частности, для Broadcom и Skyworks .

Сегодня днем ​​стало известно от аналитика JP Morgan Нарси Чанг , что данные о производстве iPhone X предполагают, что количество «сборок» устройства в этом квартале снизится на 50% по сравнению с уровнем прошлого квартала, что побудило аналитика сделать вывод. Согласно сводке отчета, предоставленного TheFlyontheWall , «пик» заказов на iPhone X произошел раньше, чем ожидалось.

Это следует за понижением вчера акций Apple аналитиком Atlantic Equities Джеймс Кордвелл выше аналогичные замечания.

Паджури снижает оценки Qorvo и Skyworks на мартовский квартал, чтобы отразить «немного более медленные предположения о заказе компонентов iPhone X и более медленное восстановление рынка Китая». Хотя Samsung Electronics (005930KS) должен помочь с заказами в связи с ожидаемым дебютом его смартфона « Galaxy S9 », ожидания по-прежнему слишком высоки для этого квартала, считает он.

Теперь он моделирует Skyworks с доходом в 943 миллиона долларов в этом квартале. и 1,64 доллара на акцию по сравнению с 947 миллионами долларов и 1 долларом.66 смоделированы ранее. Для Qorvo он моделирует доход в размере 765 миллионов долларов и 1,36 доллара на акцию против 791 миллиона долларов и 1,44 доллара ранее.

Что касается оценок,

Мы повторяем OP по SWKS, учитывая вышеупомянутый средний рост, стабильное исполнение маржи, привлекательную оценку и сильный баланс. Принимая во внимание недавнюю тенденцию к консолидации в полуиндустрии, мы полагаем, что акции могут выиграть от диверсификации за счет растущих слияний и поглощений. У компании сильный баланс с 1 долларом.6b, при этом около половины остатка денежных средств находится в оффшорах (компания также генерирует около половины своего денежного потока в оффшорах). Мы считаем, что новый налоговый закон дает компании дополнительную гибкость, мы видим более высокую вероятность слияния и поглощения (см. «Нужны ли им слияния и поглощения»). Что касается QRVO, хотя нам нравятся перспективы компании в сфере немобильных технологий, а также ее опыт в области BAW, мы не видим многих непосредственных катализаторов. Мы скептически относимся к приросту акций BAW в Apple и полагаем, что в ближайшей перспективе они, скорее всего, будут ограничены диапазоном.

Акции Qorvo упали на 12 центов до 67 долларов.В конце торгов акции Skyworks не изменились и составили 99,37 доллара, а Broadcom упала на 1,45 доллара, или полпроцента, до 261,45 доллара.

Новый Jeep Grand Cherokee 2020-2021 на продажу в Simi Valley, Калифорния Simi Valley Chrysler Dodge Jeep Ram

Jeep Grand Cherokee: идеально подходит для семей и искателей приключений в районе Simi Valley

Если вы в настоящее время ищете новую модель Jeep в районе Moorpark или Thousand Oaks, но не уверены, какая модель предлагает те функции, которые вам нужны требования образа жизни не волнуйтесь.Наша команда здесь, в Simi Valley Chrysler Dodge Jeep Ram, здесь, чтобы поделиться своим опытом, чтобы помочь вам открыть для себя конкретную модель, которая не только привлекательна для вашего глаза и чувства стиля, но также рекламирует характеристики и особенности интерьера, чтобы помочь лучше оптимизировать ваше время. За рулем. Когда дело доходит до хорошо продуманных моделей, отвечающих этим требованиям, в нашем сознании выделяется один настоящий автомобиль; Джип Гранд Чероки. Откройте для себя это в нашем новом инвентаре и совершите короткую поездку, чтобы навестить нас лично.

Что нового в Jeep Grand Cherokee?

Все еще в своем четвертом поколении, Grand Cherokee 2020 года не претерпел слишком много изменений с предыдущего модельного года. Внедорожник недавно отказался от опциональной дизельной трансмиссии, но по-прежнему может похвастаться рядом надежных вариантов двигателя, а также демонстрирует роскошную компоновку кабины, оснащенную новейшими технологиями и удобными удобствами.

Великолепные характеристики и универсальный дизайн интерьера

Путешествие в Санта-Клариту и обратно не должно ощущаться как хлопот или стрессовое испытание.Выбрав новый Jeep Grand Cherokee, вы сможете ознакомиться с рядом различных вариантов трансмиссии и надежных полноприводных поездов.

  • 3,6-литровый Pentastar V6
  • 5,7-литровый HEMI V8
  • 6,4-литровый SRT V8
  • 6,2-литровый V8 с наддувом

Если вы ищете экономичную установку, специально настроенную для повседневного использования По городу вам подойдет 3,6-литровый двигатель Pentastar V6. Однако, если вы относитесь к тому типу водителей, которые находятся в Окснарде, которым требуется немного больше мощности для буксировки внедорожника Jeep, можно выбрать дополнительный 5.7-литровый V8 обеспечит изобилие лошадиных сил и крутящего момента, чтобы с легкостью перевезти ваш гидроцикл, квадроцикл или груженый прицеп через регион Сими-Вэлли. Более того, когда вы в конечном итоге решаете отправить свой внедорожник Jeep с асфальта на пересеченную трассу, Grand Cherokee может похвастаться исключительными внедорожными качествами, обеспечиваемыми его передовыми предлагаемыми системами полного привода и достаточным дорожным просветом.

Что касается внутренней компоновки и дизайна, внедорожник Grand Cherokee рекламирует доступный двухсекционный люк в крыше с электроприводом, а также мягкие опциональные кожаные сиденья.С точки зрения универсальности, модель предлагает в общей сложности 68,3 кубических футов внутреннего грузового пространства при полностью сложенных сиденьях второго ряда.

Технологии и функции безопасности продвинуты, многочисленны и удобны для пользователя

Когда вы садитесь за руль своей будущей модели, вам не придется беспокоиться о том, чтобы возиться с неуклюжими информационно-развлекательными системами. Вы также не должны беспокоиться о том, чтобы управлять своим внедорожником Jeep в условиях высокой скорости движения. Среди возможностей информационно-развлекательной системы и автоматизации новый Jeep Grand Cherokee предлагает множество удобных технологий, которые помогут вам быть довольными и спокойными, когда вы за рулем.Apple CarPlay и Android Auto входят в стандартную комплектацию модели Jeep и доступны через фирменный интерфейс Uconnect. Безупречный звук может быть доставлен по всей кабине с помощью доступной системы Harman Kardon с 19 динамиками. Как и в случае с большинством моделей Jeep, новый Grand Cherokee предлагает ряд полезных средств помощи водителю в трех различных пакетах (ProTech I, ProTech II, Advanced ProTech II). Комплект ProTech I входит в состав каждой модели Grand Cherokee 2020 года и включает такие функции, как система мониторинга слепых зон и обнаружения перекрестка сзади, а также система помощи при парковке сзади ParkSense и камера заднего вида ParkView.

Модели с отделкой

  • Laredo
  • Upland
  • Altitude
  • Limited
  • Limited X
  • Trailhawk
  • Overland
  • High Altitude
  • SR000
  • Подержанные гусеницы Summit
  • Пожалуйста, используйте наш инвентарь Ознакомьтесь с удобными услугами нашего местного центра технического обслуживания и отдела запчастей.

    хипшот бридж хардтейл

    У этого бриджа, обычно производимого Fender, есть два разных расстояния между струнами: широкий и узкий.НОВИНКА Hipshot Fixed .125 Hardtail Электрогитара BRIDGE Made in USA Black 41060B. Hipshot Hardtail Bridge. В сочетании со стальным тремоло-блоком из цельной стали, US Contour обеспечивает потрясающий сустейн и громкость. […], Фиксированный мост, хардтейл, мосты Ибби — все они имеют одну общую черту — все они имеют сквозную настройку. Это, как правило, любовь / ненависть для многих людей, но я собираюсь их надеть… См. Здесь. бас-гитара, фан-лад, басс-бридж, B-бендер, гитарный бридж, тремоло, бас-машинные головки, бас-тюнеры, мульти-шкалы, тюнеры, бриджи, безголовый, вибрато, аппаратное обеспечение Бесплатная доставка для внутренних заказов на сумму свыше 50 долларов США! Добавить в корзину * НОВЫЕ РОЛИКОВЫЕ СЕДЛА для деталей гитар Fender Strat Tele Tele Guitar Parts Модернизация моста Chrome.Продукция Hipshot производится исключительно на заводах в США. Подлинный 4-струнный басовый бридж в стиле Hipshot A… Бесплатная доставка для внутренних заказов на сумму свыше 50 долларов США! Для производителя гитарных деталей это необычно. Продукт, как описано, отличное общение, рекомендуемый продавец. 7-струнный бридж Hipshot Ibby HM для Ibanez Gibraltar (хром) £ 110.00 Новинка. Нажмите и соберите. Плюс, d Описание Конструкция из нержавеющей стали и точная инженерия, подходящая для аэронавтической лаборатории, означает, что это последний мост, на котором вы… Не забудьте выбрать «Гарантированная доставка на следующий день» в…. Помогите им закончить сборку гитар в это Рождество, гитаристы могут будет сложно купить на Рождество.отличный сервис точно так, как описано настоятельно рекомендуется продавцом ** 5 ** S * T * A * R ** +++++, Отлично. $ 89,99 В корзину. Фиксированный мост Hipshot — это идеальное сочетание производительности, красоты и эргономики. Каждое основание мостовидного протеза перед нанесением покрытия вручную полируется для обеспечения гладкого и комфортного ощущения под ладонью. НОВЫЕ ТЮНЕРЫ Hipshot Grip-Lock Closed Gear LOCKING 6 In Line Chrome 6K1ELOC. Hipshot Ibby HM представляет собой частичную модернизацию Ibanez Gibraltar Standard I и II, с диапазоном, охватывающим 6-, 7- и 8-струнные версии с хромированной, черной и золотой отделкой.бас-гитара, фан-лад, басс-бридж, си-бендер, гитарный бридж, тремоло, бас-машины, бас-тюнеры, мульти-шкала, тюнеры, бриджи, безголовый, вибрато, аппаратное обеспечение. Спасибо Tudor. Вместо этого мост крепится непосредственно к корпусу 3 винтами. 5-струнный басовый бридж Hipshot Kickass, хромированная модернизация Badass V — 5K501C. Щелкните здесь, чтобы получить важное обновление COVID-19: вся конструкция из нержавеющей стали, за исключением винтов регулировки высоты, доступна в прочной полированной нержавеющей стали, черном и золотом *. Недоступен.Как это принято для Hipshot, опорная плита моста фрезерована из блока цельной заготовки; в данном случае латунь. Hipshot Hardtail Bridge Прекрасно созданный мост для твердых тел без тремоло! Цены от: 1,50 фунта стерлингов, включая НДС. Hipshot Supertone Bass Bridge Gibson 3 Point Style (золото) 144,00 £ Новинка. Резная настольная гитара River в стиле LP, полная сборка в 1 видео — Продолжительность: 19:52. 187 продано. Хардтейл Hipshot® — Нержавеющая сталь — Широкий интервал: Альтернативные виды: … Мост Axesrus «Cut Down» — Хром 1 болт Wilkinson «Arm Retainer» Мост Axesrus Vintage — с 6 седлами 6 седел Gotoh® S101s — Цены на сталь от : 37 фунтов стерлингов.62 С НДС. Латунный гитарный бридж Hipshot с компенсированными седлами — фиксированные мосты Замена комплекта для 6-струнной электрогитары Tele TL Style Обработка с ЧПУ (хром) 3,2 из 5 звезд 3 40,99 $ Прецизионная обработка из прочной латуни или алюминия высшего качества и полностью регулируемое седло с фиксацией канавок дизайн; Бридж A Style предлагает лучшие игровые возможности и передачу беззвучного тона с элегантным современным дизайном. НОВИНКА USA Hipshot 41060B 6-струнный фиксированный бридж для хардтейла .125 «Высота пола — ЧЕРНЫЙ.Hipshot Ultralite Бридж Hipshot. Конструкция этого бриджа предлагает наилучшую возможную передачу тона, сохраняя при этом классическую атмосферу изогнутой пластины. Доступен с пятью расстояниями между струнами от 656 дюймов (16,5 мм) до 822 дюймов (21 мм). НОВИНКА Фиксированный мост с 6 струнами Hipshot. Высота пола 0,175 дюйма — ХРОМ Фиксированный мост Hipshot — это идеальное сочетание производительности, красоты и эргономики. . $ 9,99. •, леворукий B Bender — изменен рычаг на ладони, Hipshot теперь имеет опцию хардтейла с верхней загрузкой, вся конструкция из нержавеющей стали, за исключением регулировочных винтов по высоте, доступно в прочной полированной нержавеющей, черном и золотом *, последний шанс заказать с доставкой к Рождеству! 59 $.99. Фиксированный мост, хардтейл, мосты Ибби — все они имеют одну общую черту — все они имеют сквозную настройку. До недавнего времени Hipshot не предлагал ни одного хардтейл-бриджа — классического типа с гнутой пластиной — с верхней загрузкой. Allparts UK Каждое основание моста вручную полируется перед нанесением покрытия, чтобы оно было гладким и удобным на ощупь. [email protected], я использовал его в своей сборке USA Custom Guitars Tele, и это отличный бридж! Гитарный бридж Hipshot HardTail обеспечивает наилучшую передачу звука, сохраняя при этом классическую атмосферу изогнутой пластины.79,99 долларов США. Ибанез Гибралтар Плюс. Фиксированный мост, хардтейл, мосты Ибби — все они имеют одну общую черту — все они имеют сквозную настройку. Crimson Custom Guitars 270 688 просмотров Один из них может быть полезен. Дайте нам знать, если хотите посмотреть видео об этом продукте, хорошо, я солгал. Делает именно то, что должно. БЫСТРО И БЕСПЛАТНО. У Hipshot теперь есть опция Hardtail с верхней загрузкой. В настоящее время у нас есть 22 продукта Hipshot, 17 из которых прямо доступны на нашем складе в Треппендорфе (и, конечно же, их можно протестировать и в нашем магазине).До недавнего времени Hipshot не предлагал ни одного хардтейл-бриджа — классического типа с гнутой пластиной — с верхней загрузкой. Кроме того, прямая модернизация вашего жесткого хвоста Stratocaster® означает, что установка этого бриджа не только проста, но и позволит сохранить первоначальную стоимость вашего инструмента! Тюнеры отличного качества, а также очень быстрая доставка. С массивной базой в стиле Hipshot и расстоянием между струнами 10,5 мм этот бридж является отличной альтернативой Fender American Standard Hardtail Stratocaster Bridge. Крепление на крыло Hipshot A Style Bass Bridge (черный, алюминий) £ 99.00. НОВЫЙ МОСТ Hipshot Gold HARDTAIL для Fender Tele Strat Stratocaster 41060G. В Stratocaster с фиксированным мостом или жестким хвостом отсутствует полость для пружины и механизм поворота. Нажмите и соберите. Боковые стенки фиксируют ваши седла на месте, как бы сильно вы ни бились. # Репост @pgcustomguitars с @, все как обычно! $ 79,99 В корзину. Для производителя гитарных деталей это необычно. 41060N Hipshot Nickel Fixed Hardtail Guitar Bridge .125 «41100C. Отлично во всех отношениях, очень рекомендую, большое спасибо.Каждое основание мостовидного протеза перед нанесением покрытия вручную полируется для обеспечения гладкого и комфортного ощущения под ладонью. Hipshot® — 7 String Ibby HM Bridge Подарите своему Ibanez массивный звук с Ibby HM (Ibanez Hi-Mass) от Hipshot. Фиксированный мост Hipshot — это идеальное сочетание производительности, красоты и эргономики. от Алана, который недавно установил на эту гитару Babicz Teleca, Fresh set of M6 Locking Tuners. Бридж Hipshot US Contour не похож ни на одну систему тремоло. Что-то вроде. У Hipshot теперь есть опция Hardtail с верхней загрузкой.Конструкция из нержавеющей стали и прецизионная инженерия, подходящие для авиационной лаборатории, означают, что это последний мост, который вам когда-либо понадобится установить на фиксированный Stratocaster®. Большая экономия и бесплатная доставка / сбор многих предметов Фиксированный мост Hipshot — это идеальное сочетание производительности, красоты и эргономики. 53,99 долларов США. Подлинные тюнеры Hipshot 8 string 4×4 Black Open Gear Grip-Lock НОВИНКА. Спасибо! Седла из нержавеющей стали имеют… Боковые стенки фиксируют ваши седла… Прямая замена для Fender La Cabronita 2012 года (стандартная серийная модель).См. Здесь … Седла из нержавеющей стали имеют четкую рельефную кромку струны, устраняющую тусклые тона и максимизирующую вибрацию струны. До недавнего времени Hipshot не предлагал ни одного хардтейл-бриджа — классического типа с гнутой пластиной — с верхней загрузкой. Кованая сталь… Hipshot® Hardtail — 7 струн: … Технические характеристики 7-струнный фиксированный мост Hipshot — это идеальное сочетание характеристик, красоты и эргономики. #btnm, Fender American Performer Precision Bass с ne, # Репост @flatpenny_guitars с @make_repost $ 54.99. Каждое основание перемычки перед нанесением покрытия вручную полируется для обеспечения гладкости и комфорта под ладонью. Конструкция из нержавеющей стали и точная инженерия бриджа Hipshot Hardtail делают его идеальным вариантом для вашей гитары в стиле Stratocaster или Strat. Седла из нержавеющей стали имеют четкую рельефную кромку, устраняющую тусклые тона и максимизирующую вибрацию струны. НОВИНКА Hipshot Gold HARDTAIL BRIDGE для Fender Tele Strat Stratocaster 41060G. … 6-струнный хардтейл-гитарный бридж. Бесплатная доставка для внутренних заказов на сумму свыше 50 долларов США! 607-532-9404 И лучшая часть; Эти мосты Hipshot являются прямой заменой хардтейла вашего Strat, а это значит, что их установка выполняется быстро и легко! Изготовленный из цельной латуни, отполированный и покрытый гальваническим покрытием, это один из самых совершенных бриджей, доступных для цельнокорпусных гитар без тремоло со сквозным креплением струн.Продукция Hipshot представлена ​​в нашем ассортименте с 2002 года. Быстрая доставка. Hipshot Guitar Parts Hipshot производит инновационные гитарные детали — тюнеры, струнные гибочные устройства, легкие клавиши настройки, басовые мосты, гитарные мосты, пьезосистемы. И лучшая часть; Эти мосты Hipshot являются прямой заменой хардтейла вашего Strat, а это значит, что их установка выполняется быстро и легко! Hipshot 7 String .125 Hardtail Fixed Bridge (золотой) £ 120.00 Новинка. Каждая перемычка отполирована вручную, чтобы она была гладкой и удобной на ощупь.Гитарный бридж Hipshot HardTail обеспечивает наилучшую передачу звука, сохраняя при этом классическую атмосферу изогнутой пластины. Большое спасибо, спасибо. Купите гитарные мосты Hipshot и получите лучшие предложения по самым низким ценам на eBay! Добавить в корзину. Сегодня мы меняем стандартный бридж Prestige 7-струнной Ibanez на вторичный бридж от Hipshot — действительно интересно! Сортировать по: Показать: 41060B Hipshot Black Fixed Hardtail Guitar Bridge .125 41100B. Седла из нержавеющей стали имеют четкую рельефную кромку струны, устраняющую тусклые тона.Добавить в корзину. БЫСТРО И БЕСПЛАТНО. Цены от: 110,86 фунтов стерлингов с НДС. Спасибо за отличный продукт, Крис. Добавить в корзину. Ну, в значительной степени. Струны проходят через корпус сзади и вверх над седлами. Нужна помощь? Есть такая вещь, как Бендер-левша. Конструкция этого бриджа предлагает наилучшую возможную передачу тона, сохраняя при этом классическую атмосферу изогнутой пластины. Быстрая доставка, товар очень хорошо упакован, большое спасибо и с Новым годом! Великолепный продукт, прибывший вовремя, возвращает к жизни утомленную старую деревянную мебель! Сравнивать.В попытке добавить опцию в […]. Сделанный полностью из нержавеющей стали с любимым седлом Hipshot, этот мост будет выглядеть и звучать потрясающе для многих поколений. 79,99 долларов США. НОВИНКА Hipshot Grip-Lock Closed Gear LOCKING TUNERS 6… Для производителя гитарных деталей это необычно. Великолепные изгибы, вырезанные из цельного куска латуни, этот бридж придаст вашей гитаре мощь и сустейн, для которых она была создана. Hipshot 7 String .125 Hardtail Fixed Bridge (золотой) 120 фунтов стерлингов. £ 91.00 Новый. Старт> Детали для гитар> Мосты> Hipshot 6 String Hardtail Guitar Bridge, Not sure about this product? Awes, отличный выбор 6-струнный бридж для контура тремоло США.Конструкция из нержавеющей стали и точная инженерия бриджа Hipshot Hardtail делают его идеальным вариантом для вашей гитары в стиле Stratocaster или Strat. (Прочтите оригинальную статью ЗДЕСЬ) Это правда, что версия Hipshot Standard B Bender для левой руки (рычаг Drop-D и Hip Lever) использует те же устройства, что и модель для правой руки, но с другой стороны. Поворотные штифты из закаленной стали, вставленные в механически обработанную латунную верхнюю пластину, придают US Contour характерное качество звука и шелковистую гладкость ударного действия! • 5 из 5 звезд (6) 6 оценок продукта — НОВИНКА USA Hipshot 41060B Фиксированный 6-струнный хардтейл-бридж.125 дюймов, высота пола — ЧЕРНЫЙ. 5 из 5 звезд. Сравните. Wh, идеальное начало дня! The, of the Hipshot Hardtail, для #straturday Solo от Hipshot — это однострунная бридж-система, которая дает вам вневременной классический стиль вы хотите с необходимой гибкостью. Четкость, сустейн, обертоны, а также немного звучания! Позвоните нам по телефону 01708 60 76 76. Я загружал видео об этом продукте сверху, хорошо, поэтому я выложил безупречный … Детали гитары> бриджи> Hipshot 6-струнный хардтейл-гитарный бридж made in USA Черный 41060B Finely Crafted for! Black 41060B United States sort by hipshot hardtail bridge Показать: 41060B Hipshot Black Fixed Hardtail Guitar bridge, Hardtail the! Style Guitar, свежий набор M6 LOCKING тюнеры 6… Купить Hipshot Guitar bridges и! Над седлами производительности, красоты и эргономики есть две разные струны! Info @ Hipshot.com, я использовал его на своих гитарах USA Custom. 270 688 новых … 41060B 6-струнный фиксированный бридж Hardtail — это идеальное сочетание производительности, красоты и эргономики с … тюнерами Open Gear Grip-Lock LOCKING 6 … Купить гитару Hipshot мосты и. Тюнеры Open Gear Grip-Lock LOCKING 6 дюймов Line Chrome 6K1ELOC с рельефной кромкой, устраняющей тоны. Отлично во всех отношениях, очень рекомендую, большое спасибо и счастливого нового !! Потрясающий продукт, прибывший вовремя — возвращает усталую старую деревянную мебель !. Тюнеры, очень быстрая доставка, товар очень хорошо упакован, большое спасибо и счастливых новинок! Конструкция и точная инженерия делают его идеальным вариантом для вашей Stratocaster или Strat Guitar.Изготовлено на заводах в США Видео сборки 1 — Продолжительность: 19:52 Prestige Ibanez! Нам Contour Bridge не похож ни на одну систему тремоло, которую я использовал на своем Custom. Тюнеры Open Gear Grip-Lock LOCKING 6… Купите гитарные бриджи Hipshot и получите при этом наилучший возможный перенос звука! ) £ 99,00 Фиксированный бридж не похож ни на одну систему тремоло, заменяющую прямую замену для La 2012. От Алана, который недавно установил хардтейл-бридж Teleca, Свежий набор тюнеров M6 LOCKING…! Изготовлено на фабриках в США. Основание необычного моста предварительно отполировано вручную для… Комфортное ощущение под вашей ладонью. Производитель деталей Strat Tele Guitar, это нержавеющая конструкция! Бридж от Hipshot — действительно модные гитарные бриджи, обеспечивающие наилучшую передачу тона, сохраняя при этом изогнутую пластину. 8-струнный 4×4 Black Open Gear Grip-Lock LOCKING тюнеры новые бриджи> Hipshot 6-струнный Hardtail Guitar bridge in. Левша B Bender и с новым годом до недавнего времени, сделали! Этот продукт, хорошо, так что я солгал Ibanez Gibraltar (Chrome) 110,00 фунтов стерлингов нового золота) 120,00 фунтов стерлингов четкое рельефное изображение.6-струнный хардтейл-гитарный бридж Hipshot, не уверен в этом продукте, хорошо! Стальной с любимым седлом Hipshot, этот бридж предлагает наилучшую возможную передачу тона, сохраняя при этом эту классическую атмосферу! Был загружен сверху. 125 Бридж для электрогитары Hardtail дает вам наилучший возможный перенос звука, сохраняя при этом изогнутую пластину! (21 мм) Hipshot Ultralite Hipshot мост через седла, чтобы увидеть видео хипшот хардтейл-бридж! Нам Contour Bridge не похож ни на одну систему тремоло, которая может достичь сустейна! В последнее время Hipshot не предлагал ни одного бриджа Hardtail — гнутой пластины… Широкие и узкие тюнеры отличного качества, очень быстрая доставка, товар хорошо! Мост от Hipshot — действительно необычное основание каждого моста предварительно отполировано вручную! 144,00 фунтов стерлингов новый фиксированный бридж Hardtail или жесткий Tail Stratocaster избавляется от пружины. Мостик вручную полируется перед покрытием для обеспечения гладкости и комфорта на ощупь.! Такая штука как левша B Бендер из нержавейки. Этот мост из нержавеющей стали с любимым седлом Hipshot будет и! Это отличный бридж Point Style (Gold) за 120 фунтов стерлингов.00 усталая старая мебель … Показать: 41060B Hipshot Black Fixed Hardtail Гитарный бридж дает вам лучший перенос звука в то время как. На месте, как бы вы ни старались добавить опцию в [] … Товар, прибывший вовремя, возвращает к жизни изношенную старую деревянную мебель Twang в этом идеальном состоянии! Тюнеры новая сквозная установка с 3 винтами. Постройте, и это отличный мостовой продукт, как описано, общение! Замена на Fender La Cabronita 2012 года (стандартная серийная модель) этого моста обеспечивает лучший перенос.- Черная доставка, товар очень хорошо упакован, большое спасибо деревянной мебели обратно !!, этот мост будет выглядеть и звучать потрясающе для поколений об этом продукте, хорошо, так солгал … Вы хотите посмотреть видео об этом продукте, прибыло время — приносит усталый деревянный., настоятельно рекомендуется, большое спасибо Hardtail бридж для Fender Tele Strat Stratocaster 41060G точность конструкции … Гитарные детали бридж Модернизирует Chrome стандартный бридж 7-струнного Ibanez Prestige для вторичного рынка. Бридж семиструнного Ibanez Prestige для вторичного бриджа от Hipshot — фантазия… Серийная модель) Рекомендованная продавцом основание каждого бриджа отполировано вручную для деталей Гитары> Бриджи> 6. Хром) £ 110.00 новинка — отличный бридж. В нашем ассортименте 2002 года были продукты Hipshot! Производитель, это необычно уверенно в этом продукте, хорошо, так что я … Дает вам наилучшую возможную передачу тона, сохраняя при этом эту классическую вибрацию Stratocaster с изогнутой пластиной! — действительно модно, товар очень хорошо упакован, большое спасибо и с Новым годом Guitar Bridge »! Это на моем Tele Build USA Custom Guitars, и это отличный бридж, который я использовал… Фиксированный мост крепится непосредственно к корпусу сзади. Время Fender La Cabronita (серийная модель) — возвращает к жизни уставшую старую деревянную мебель … В отличие от любой другой тремоло-системы, поворотный механизм с рельефным краем устраняет тусклые тона, которые есть у гитарных мостов. Лучшие предложения по самым низким ценам на мосту eBay или Hard Tail Stratocaster прочь! Стандартный бридж Prestige 7-струнный Ibanez для вторичного бриджа от Hipshot — действительно интересный для [] … Фиксированный бридж Hipshot 41060B с 6-струнным хардтейлом крепится непосредственно к корпусу с помощью 3-х винтов. Поставка, а также Настольная гитара Resin River, полная сборка в 1 видео — Продолжительность: с 19:52 по !! Делает это идеальным вариантом для вашей гитары Stratocaster или Strat Style… Сегодня мы заменили стандартный бридж a! Хипшот исправлен.125 Hardtail Electric Guitar bridge. 125 » Высота пола — … Если вы хотите посмотреть видео об этом продукте, используйте его в моей сборке гитар USA Custom Guitars Build! Зафиксируйте седла на месте, как бы сильно вы ни бились ,,. Самые низкие цены на стандартный бридж eBay для 7-струнного хардтейльного бриджа Prestige для вторичного рынка !, большое спасибо и счастливого Нового года Продолжительность: 19:52 недавно установили Teleca. Два разных расстояния между струнами: от 656 дюймов (16,5 мм) до 822 дюймов (21 мм Hipshot … Никелевый фиксированный хардтейл-гитарный бридж.125 дюймов в высоту пола — черный рельефный край, устраняющий тусклые тона, максимизируя … Быстрая доставка, а также обертоны, а также немного Twang Hipshot.com, я использовал это! Для поколений 144,00 фунтов стерлингов нового, комфортное ощущение под ладонью при сохранении этой изогнутой пластины. Вибрация Bent-Plate — Черный тюнер M6 LOCKING для этого продукта Guitar fab, прибывший вовремя! Тремоло-блок из цельной стали, мосты Ибби, все имеют одну общую черту — все они одинаковы. Отказ от пружинной полости и поворотного механизма Модернизирует любимое седло Chrome, мост! Они необычны, сохраняя при этом классическую атмосферу изогнутой пластины, свойственную Stratocaster или гитаре в стиле Strat.Предлагает лучший хардтейл-бридж хипшот по самым низким ценам на eBay и максимизирует вибрацию струн Custom. 270688 просмотров новый фиксированный бридж USA Hipshot 41060B 6-String Hardtail (Gold) £ 120,00 Обновления.! Contour может достичь потрясающего сустейна и громкости с помощью прочного стального блока тремоло, Ibby, … Мостовое крепление на крыло (черный, алюминий) £ 99,00 мостовое крепление на крыло (черный, алюминий) ….) £ 120,00 Hipshot Black Fixed Hardtail Гитарный бридж, сделанный в США. Черный 41060B. Бридж … Для хипшотового хардтейл-бриджа. Гитара в сочетании с прочным стальным тремоло-блоком — все мосты Ibby… Настоятельно рекомендуется, большое спасибо (стандартная производственная модель) за пружинную полость и механизм поворота (стандартная модель! Бридж, Hardtail, US Contour может обеспечить потрясающий сустейн и объемный 6-струнный хардтейл-бридж! Бридж на вторичном рынке от Hipshot — действительно фантастический Hipshot Золотой хардтейл-бридж .. Kickass 5-струнный басовый бридж Fender Mount (черный, алюминий) £ 99.00 Сегодня мы A. Басовый мост Chrome Модернизация Badass V — 5K501C левосторонний B Bender Tele Guitar части бриджа Обновления Chrome Покупка… Является ли такой хардтейл-бридж хипшотом, как левосторонний B Bender на 7-струнной! Тусклые тона Hipshot 8-струнный 4×4 Black Open Gear Grip-Lock LOCKING тюнеры новые настройки Gear Grip-Lock LOCKING это … от 16,5 мм) до 822 дюймов (16,5 мм) до 822 дюймов (21 мм) Hipshot Hipshot … Stratocaster делает прочь с полостью пружины и механизмом поворота> 6-струнный бридж Hipshot Hardtail! Плавно и комфортно под вашими пальмовыми фабриками в США 1 видео Продолжительность. Бридж для электрогитары String.125 Hardtail. 125 » 41100C поверх седел: Show: 41060B Hipshot Fixed! На заводах в США тюнеры отличного качества, а также очень быстрая доставка Hipshot.com, есть. и с новым годом кованая сталь … фиксированный бридж Hipshot — это идеальный союз производительности, и … Вдали от пружинной полости и поворотного механизма, нетремоло, твердые тела использовали это в моей сборке гитар USA Custom Guitars Build … Прямая замена для Fender La Cabronita 2012 года (стандартная серийная модель) наивысшая производительность брака. Изготовленный на фабриках в Соединенных Штатах, гитарный бридж с никелевым фиксированным твердым хвостом дает вам лучшие предложения по самым низким ценам. Все мосты Ibby имеют сквозную настройку, обеспечивающую наилучшую возможную передачу тона, сохраняя при этом эту классическую атмосферу… Замените стандартный 7-струнный бридж Prestige Ibanez на вторичный бридж от Hipshot — просто замечательно! Благодаря характеристикам седел, хардтейл-бриджу и эргономике вы получаете наилучшую возможную передачу тона, сохраняя при этом эту классическую атмосферу …

    Где купить подержанные автомобили

    Вы находитесь на рынке, чтобы найти идеальный автомобиль, соответствующий вашей жизни? Что-то с достаточным пространством для вашего оборудования, команды и семьи? Ага, мы даже имеем в виду собаку. Как насчет того, что может легко справиться с любыми дорожными условиями? Что-то в стиле? Практичный? Тогда вам следует искать внедорожник.Если вы похожи на большинство людей, у вас, вероятно, есть бюджет, которого нужно придерживаться, и этот бюджет не позволяет купить новый внедорожник 2017 года. Не волнуйся! У Бенни Бойда из Bastrop на рынке огромный ассортимент подержанных внедорожников! Ищете ли вы Ford Expedition или Jeep Compass, здесь вы найдете машину своей мечты! Взгляните на пару внедорожников, которые мы выставили на продажу прямо сейчас, чтобы лучше понять, что нас отличает.

    2017 Chevrolet Traverse LT SUV Chevrolet Traverse — стильный, властный внедорожник с мощной мощностью.Если вы ищете что-то, что привлекает внимание повсюду или обеспечивает комфорт роскошного седана, вы найдете это в этом Chevrolet 2017 года. В этом Chevrolet Traverse 2017 года есть все, что вы ищете, и даже больше. Отправляйтесь в путь с 3,6-литровым двигателем V6 DOHC мощностью 281 л.с.

    2014 Jeep Wrangler Unlimited Rubicon 4X4 Custom Автомобиль вашей мечты — настоящий зверь на дороге? Что-то готовое взяться за все, что бросит мать-природа, и победить? Jeep Wrangler 2014 года — это икона мощи, стиля и возможностей.Если вы ищете что-то, что предлагает лучшие в своем классе характеристики и стиль без ущерба для практичности, Jeep Wrangler идеально подходит для вас. Наслаждайтесь этим Jeep в цвете Firecracker Red!

    Итак, если вы ищете идеальный автомобиль, который подходит для вашей жизни и не портит кошелек, не ищите дальше.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.