Лада 4 х 4: Новое имя LADA Niva Legend

Содержание

Шины для lada 4854 9db8b2b0

Nokian Tyres (63 товара)

Amtel (1 товар)

BFGoodrich (12 товаров)

Barum (1 товар)

Bridgestone (37 товаров)

Cachland (2 товара)

Centara (2 товара)

Continental (43 товара)

Cordiant (13 товаров)

Dunlop (23 товара)

Falken (1 товар)

Gislaved (6 товаров)

Goodyear (35 товаров)

Habilead (2 товара)

Hankook (36 товаров)

Kormoran (13 товаров)

Kumho (18 товаров)

LandSail (5 товаров)

Laufenn (4 товара)

Marshal (10 товаров)

Matador (12 товаров)

Maxxis (4 товара)

Michelin (40 товаров)

Nexen (21 товар)

Nitto (10 товаров)

Ovation (1 товар)

Pirelli (25 товаров)

Roadstone (1 товар)

Sailun (11 товаров)

Sava (4 товара)

Tigar (11 товаров)

Tigar Ice (1 товар)

Toyo (30 товаров)

Triangle (9 товаров)

Triangle TR646 (1 товар)

Tunga (2 товара)

Uniroyal (1 товар)

Viatti (8 товаров)

Yokohama (33 товара)

Кама (12 товаров)

Производитель
  • Nokian Tyres
  • Amtel
  • BFGoodrich
  • Barum
  • Bridgestone
  • Cachland
  • Centara
  • Continental
  • Cordiant
  • Dunlop
  • Falken
  • Gislaved
  • Goodyear
  • Habilead
  • Hankook
  • Kormoran
  • Kumho
  • LandSail
  • Laufenn
  • Marshal
  • Matador
  • Maxxis
  • Michelin
  • Nexen
  • Nitto
  • Ovation
  • Pirelli
  • Roadstone
  • Sailun
  • Sava
  • Tigar
  • Tigar Ice
  • Toyo
  • Triangle
  • Triangle TR646
  • Tunga
  • Uniroyal
  • Viatti
  • Yokohama
  • Кама

Новости - Юбилейный выпуск LADA 4х4 40th Anniversary

Напомним, что 5 апреля этого года внедорожник LADA 4x4 отметил свое 40-летие и в честь этого события АвтоВАЗ запустил серийное производство новой юбилейной комплектации - LADA 4х4 40th Anniversary.

Главные особенности юбилейного выпуска выражены в новых цветовых решениях, хромированных элементах, кожаной обивке салона и других юбилейных деталях. Ну и конечно, юбилейный выпуск лимитирован - всего будет выпущено 1977 Нивы 4х4 40th Anniversary.

Теперь по порядку изменений. Начнем с отличительных особенностей экстерьера.

Оригинальные цвета кузова

По словам руководителя проекта Lada 4×4 Натальи Воробьёвой, юбилейный выпуск будет представлен в нескольких цветах, и некоторые из них будут абсолютно новыми.

«Один из таких – бежевый, напоминает вариант 1977 года. Я говорю, «напоминает», потому что цвет выполнен по современной технологии: он глубокий и переливающийся».

Кроме бежевого будут представлены и другие однотонные цвета кузова: красный, белый, терракотовый, серо-синий. Ну а для любителей яркого стиля, часть юбилейных автомобилей будет окрашена в камуфляж. Пятнистая поверхность создана сочетанием трех цветов - светло-зеленого, темно-зеленого и черного.


Шильдики «40 Anniversary»

Неотъемлемый атрибут юбилейной серии - это оригинальные шильдики на передних крыльях, задней двери и крышке бардачка. Причем на шильдике в салоне отображается уникальный порядковый номер автомобиля: от 0001 до 1977 - эта цифра означает год начала производства LADA 4х4 и количество машин в ограниченной серии.

Литые диски

Оригинальные литые диски с шинами Pirelli Scorpion ATR 185/75 R16 93T добавляют уникальности юбилейному выпуску.

Что же касается интерьера, то в салоне юбилейной Нивы 4х4:

  • комбинированный кожаный салон разных цветов: серого и черного, бежевого и коричневого, для камуфляжных машин предусмотрены черные сиденья с контрастной прострочкой;
  • кожаный руль с контрастной прострочкой;
  • новые вставки в обшивки дверей;
  • накладки на порогах с названием модели из нержавеющей стали;
  • ворсовые коврики с вышитым логотипом 40 «Anniversary»;
  • логотип серии нанесен на обивку сидений;
  • новая приборная панель (новая разметка и оранжевая шкала).

Технические характеристики юбилейной Нивы 4х4 изменений не претерпели.

Старт продаж LADA 4х4 40th Anniversary намечен на июнь 2017 года, так что следите за новостями и удачи на дорогах!


Новый Лада Нива Легенд 4х4 3д (Lada Niva Legend 3дв) от 298500 в кредит, со скидкой, цены и комплектации

Цена 298 500 ₽ 315 500 ₽ 354 500 ₽ 374 500 ₽ 383 500 ₽
Цена без скидки 607 900 ₽ 624 900 ₽ 663 900 ₽ 683 900 ₽ 692 900 ₽
Системы безопасности
Антиблокировочная система
Дневные ходовые огни
Крепления для детских сидений ISOFIX
Подголовники задних сидений 2 шт.
Противотуманные фары
Система экстренной связи ЭРА-ГЛОНАСС
Усилитель экстренного торможения
Электронная система распределения тормозных усилий
Интерьер
Бортовой компьютер
Обивка потолка черного цвета
Оригинальная обивка сидений
Розетка 12V
Розетка 12V в багажном отделении
Экстерьер
16 легкосплавные диски Grizzly двухцветные
16 легкосплавные диски Niagara
16 легкосплавные диски Niagara черные
16 стальные диски
Бамперы, окрашенные в цвет кузова
Запасное колесо штампованное временного использования 16'
Запасное колесо штампованное полноразмерное 16'
Легкая тонировка стекол
Окраска цветами металлик
Комфорт
Аудиоподготовка
Гидроусилитель рулевого управления
Дополнительная виброизоляция
Кондиционер
Обогрев зеркал
Подогрев передних сидений
Электропривод зеркал
Электростеклоподъемники передние

Lada 4х4 обновилась: нивоводы запрыгают от радости - тест-драйв, обзор Lada (ВАЗ) 2121 (4x4)

«Автомобиль не коньяк, с возрастом лучше не становится», — однажды сказал создатель «Нивы» Пётр Михайлович Прусов. При этом патриарх отечественного автопрома признавался: никто не предполагал, что его детище продержится на конвейере 40 лет! По самым оптимистичным прогнозам, модель должна была выпускаться максимум до 2006-го.

Сейчас датой отставки называют 2021 год. И чтобы продлить «вечную молодость», вазовцы подготовили весьма объёмный пакет доработок, самой заметной составляющей которого станет новый интерьер. Полностью новый! Заново спроектированы передняя панель и климатическая установка. До этого такой подарок «Ниве» перепадал — только не падайте — в 1994 году.

Нынешняя Lada 4×4 будет выпускаться, пока не закончится действующее Одобрение типа транспортного средства, поэтому текущая модернизация — далеко не последняя

Вот только из-за кризиса радикальное обновление салона было решено отложить. На сколько? Вазовцы пожимают плечами: «Скорее всего, до 2017-го, но может случиться всякое». Пока денег хватило лишь на мероприятия по «снижению трудоёмкости обслуживания и повышению надёжности известных слабых мест шасси». Итак, в августе этого года 3- и 5-дверные Lada 4x4 получат:

Независимое крепление переднего моста

В начале семидесятых, проектируя свой первый внедорожник, инженеры из Тольятти сомневались: не будет ли несущий кузов испытывать повышенных нагрузок от переднего ведущего моста? В результате долгих споров родилось компромиссное решение — редуктор закрепили непосредственно на двигателе. Эту конструкцию нивоводы называют «привязанным» мостом.

Комментируя «отвязку» переднего моста от двигателя, вазовцы загадочно добавляют: «Теперь можно устанавливать любой мотор». Но появится ли новый движок под капотом Lada 4x4, не говорят

Получилось надёжно, но... В том, что классические «Нивы» отчаянно трясутся на холостых оборотах, виновато как раз характерное крепление — так как силовой агрегат потяжелел, конструкторам пришлось поставить более жёсткие опоры. Другая «фирменная особенность» машины, клевок при старте, тоже является последствием принятого решения — это «приходит» реактивный момент от моста.

Интересно, что способ «отвязки» редуктора на заводе придумали давным-давно — например, Chevrolet Niva (это, напомним, вазовская «Нива» второго поколения) изначально имела независимый от двигателя мост. Но на серийных Lada 4x4 старую задумку реализовали только сейчас. Трястись и шуметь модель-ветеран стала действительно меньше.

Новый ступичный узел

На первых полосах тольяттинских газет чаще других встречается реклама «Установка нерегулируемых ступиц на Lada 4x4». Да-да, проверять и регулировать величину зазора конического ступичного подшипника на «Нивах» нужно каждые 10-15 тысяч км! А автомобилисты старой закалки, не решившиеся на установку тюнинг-комплекта, не ленятся повторять данную операцию через 6-7 тысяч...

Чем модернизированная Lada 4x4 отличается от дореформенной? Мы отметили все применённые инженерами решения на одной интерактивной картинке

Новые передние ступицы — с двухрядным радиально-упорным подшипником, который, наконец, избавит нивоводов от постоянных хлопот. Притом вазовцы уверяют: их конструкция — надёжнее тех, что предлагали мастера тюнинга, так как рассчитана на предельно жёсткие ударные нагрузки и качественно защищена от попадания грязи и влаги.

Модернизированную подвеску

Как говорил бывший главный конструктор автогиганта Владимир Губа, «Lada 4x4 — как старая квартира. Начинаешь делать ремонт, берёшься за одно, а следом вылезает другое...» Так, изменение ступичного узла позволило переработать конструкцию поворотного кулака, а модернизация последнего — скорректировать кинематику передней подвески.

Пока пакет доработок получили только машины, поставляемые на экспорт. Модернизированные внедорожники для внутреннего рынка (включая версию Urban) начнут выпускать примерно через месяц

В ходе доводки передние пружины сделали жестче, а амортизаторы пришлось переделать полностью — это газонаполненные (!) СААЗ, клапаны для которых поставляет ZF. Из мелочей отметим новые подушки стабилизатора, что больше не должны «выдавливаться» из обойм на бездорожье, и новые тормозные диски — их конструкция аналогична переднеприводным моделям.

Прогресс — налицо. Эффект «козления», наконец, безоговорочно капитулировал! Вдобавок здорово выросла скорость движения по ямам и буграм: на старой машине ехать по разбитому асфальту можно со скоростью 60-80 км/ч, а на новой вполне комфортно валить под сотню. Надёжность? Обещано, что даже жёсткие «продубасы» не убьют подвеску раньше, чем через 90 тысяч километров пробега.

Новые боковины кузова

То, что при штамповании боковин кузова теперь используется новая оснастка, — это действительно важно. Стали меньше зазоры, аккуратнее переходы... И чтобы установить колонки аудиосистемы, больше не нужно, как прежде, орудовать дрелью и болгаркой! В каркасе двери появились штатные места под динамики и проводку.

Интерьер внедорожника регулярно обновлялся по мелочи (например, внедрялись новые обивки дверей, появились потолочная и центральная консоли), но глубокой реорганизации салона не было вот уже 22 года

Читайте также

Lada 4х4 Urban: новые бамперы, старые проблемыНужны ли внедорожнику пластиковые бамперы? Пока «нивоводы» отрицательно качали головами, АвтоВАЗ занялся выпуском «городской» Lada 4х4, получившей приставку Urban

Ещё одним действительно важным нововведением стала замена стеклоподъёмника, ведущего свою родословную от «копеек». Со старым механизмом «бесфорточные» боковые стёкла — широкие и тяжёлые — перекашивались и подклинивали. Между прочим, на решение этой, казалось бы, простой проблемы заводу потребовалось больше 15 лет...

Скажем честно: смысл всех этих обновлений поймут только заядлые нивоводы. Нерегулируемые подшипники? После этих слов владелец «Нивы» запрыгает от радости, а современный автомобилист недоумённо пожмёт плечами: какими они ещё должны быть? А уж то, что раньше инсталляция акустики была проблемой, — вообще находится за гранью понимания.

Но, поверьте, то, что модернизация модели-ветерана движется крохотными шажками (на заводе их называют «фазами») — вина отнюдь не конструкторов. Все решения, что серийно внедрены на внедорожники Lada 4x4 этим летом, были анонсированы разработчиками 7 лет назад. Однако маркетологи дали «добро» и выделили средства только сейчас. Как говорится, лучше поздно...

LADA Sport ROSNEFT укрепила лидерство в гоночном классе «Туринг» - Газета.Ru

Прослушать новость

Остановить прослушивание

Команда LADA Sport ROSNEFT после прошедшего 22 августа на подмосковной трассе Moscow Raceway 4-го этапа Российской серии кольцевых гонок (РСКГ) увеличила отрыв в классе «Туринг», сообщает пресс-служба «Роснефти».

По результатам успешного выступления LADA Sport ROSNEFT в рамках 3-го этапа на трассе в Санкт-Петербурге, в московской гонке по правилам чемпионата всем автомобилям команды из Тольятти был добавлен лишний вес. Это делается для сохранения конкуренции в чемпионате и недопущения доминирования одной из команд. 

В первой гонке класса «Туринг» бронзу завоевал Кирилл Ладыгин, чья медаль стала единственной для LADA Sport ROSNEFT на московском этапе. Несмотря на это, Ладыгин увеличил свой отрыв в личном зачете пилотов, в том числе благодаря сходу с трассы своего главного конкурента Дмитрия Брагина. 

Следующая гонка чемпионата РСКГ состоится на трассе «Казань Ринг» 12 сентября.

Официальное топливо Российской серии кольцевых гонок — высокооктановый бензин Pulsar-100 от «Роснефти». Его используют все участники соревнований, отмечая безотказную работу технически сложных автомобилей, чувствительных к качеству компонентов и горюче-смазочных материалов.  Технологии, испытанные в жестких условиях автоспорта, доступны теперь всем автомобилистам — заправить свою машину топливом Pulsar можно на АЗС компании.

В 2021 году команда LADA Sport ROSNEFT начала использовать новое спортивное моторное масло Rosneft Magnum Racing. Благодаря специальной рецептуре, разработанной в лаборатории «РН – смазочные материалы», масло обеспечивает повышенную защиту двигателя при экстремальных режимах работы. Rosneft Magnum Racing имеет высокие эксплуатационные свойства, оптимально сочетает термическую стабильность, сопротивляемость к окислению и улучшенную защиту от износа. Масло Rosneft Magnum Racing успешно прошло комплексные испытания. Продукт получил положительное заключение экспертов ТМС Motorsport и специалистов Lada Sport. Новое масло Rosneft Magnum Racing с недавнего времени поступило в розничную продажу.

LADA Sport ROSNEFT является действующим абсолютным чемпионом РСКГ. В 2021 году команда из Тольятти выступает в обновленном составе и на доработанной гоночной технике.

С 2015 года «Роснефть» является титульным спонсором команды, поддерживая успехи пилотов LADA. Благодаря такому сотрудничеству LADA Sport ROSNEFT стала ведущей командой в российских кольцевых гонках, а автомобильный рынок получил ряд инновационных продуктов, которые изначально создавались для гоночной команды.

Сверхвысокая эффективность FRET NaGdF 4: Tb 3 + -Rose Бенгальский биосовместимый нанокомпозит для применения в фотодинамической терапии с возбуждением рентгеновскими лучами

DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2018.09.001. Epub 2018 5 сен. Венли Чжан 1 , Сяофэн Чжан 2 , Ингли Шэнь 3 , Фэн Ши 3 , Чаоцзюнь Сун 4 , Тяньшуай Лю 2 , Пэн Гао 2 , Бин Лань 2 , Мяо Лю 3 , Sicheng Wang 5 , Ли Фань 6 , Хунбин Лу 7

Принадлежности Расширять

Принадлежности

  • 1 Школа биомедицинской инженерии, Четвертый военно-медицинский университет, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, PR China.Электронный адрес: [email protected]
  • 2 Школа биомедицинской инженерии, Четвертый военно-медицинский университет, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, PR China.
  • 3 Шэньси Ключевая лаборатория передовых энергетических устройств, Шэньси Инженерная лаборатория передовых энергетических технологий, Ключевая лаборатория прикладной поверхностной и коллоидной химии, Национальное министерство образования, Школа материаловедения и инженерии, Педагогический университет Шэньси, Сиань 710119, Китай.
  • 4 Школа наук о жизни Северо-Западного политехнического университета, 127 (th) Youyi West Road, Xi'an, Shaanxi 710072, China.
  • 5 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Кейс Вестерн Резерв, 10900 Евклид авеню, Кливленд, Огайо 44106, США.
  • 6 Кафедра фармацевтического анализа, Фармацевтический факультет и Государственная ключевая лаборатория биологии рака (CBSKL), Четвертый военно-медицинский университет, 169th Changle West Road, Xi'an, Shaanxi 710032, China.Электронный адрес: [email protected]
  • 7 Школа биомедицинской инженерии, Четвертый военно-медицинский университет, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, PR China. Электронный адрес: [email protected]

Элемент в буфере обмена

Венли Чжан и др. Биоматериалы.2018 ноя.

Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2018.09.001. Epub 2018 5 сен.

Авторы

Венли Чжан 1 , Сяофэн Чжан 2 , Ингли Шэнь 3 , Фэн Ши 3 , Чаоцзюнь Сун 4 , Тяньшуай Лю 2 , Пэн Гао 2 , Бин Лань 2 , Мяо Лю 3 , Sicheng Wang 5 , Ли Фань 6 , Хунбин Лу 7

Принадлежности

  • 1 Школа биомедицинской инженерии, Четвертый военно-медицинский университет, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, PR China.Электронный адрес: [email protected]
  • 2 Школа биомедицинской инженерии, Четвертый военно-медицинский университет, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, PR China.
  • 3 Шэньси Ключевая лаборатория передовых энергетических устройств, Шэньси Инженерная лаборатория передовых энергетических технологий, Ключевая лаборатория прикладной поверхностной и коллоидной химии, Национальное министерство образования, Школа материаловедения и инженерии, Педагогический университет Шэньси, Сиань 710119, Китай.
  • 4 Школа наук о жизни Северо-Западного политехнического университета, 127 (th) Youyi West Road, Xi'an, Shaanxi 710072, China.
  • 5 Департамент биомедицинской инженерии, Университет Кейс Вестерн Резерв, 10900 Евклид авеню, Кливленд, Огайо 44106, США.
  • 6 Кафедра фармацевтического анализа, Фармацевтический факультет и Государственная ключевая лаборатория биологии рака (CBSKL), Четвертый военно-медицинский университет, 169th Changle West Road, Xi'an, Shaanxi 710032, China.Электронный адрес: [email protected]
  • 7 Школа биомедицинской инженерии, Четвертый военно-медицинский университет, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, PR China. Электронный адрес: [email protected]

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Параметры отображения

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Ограничение глубины проникновения света делает недействительным применение фотодинамической терапии при глубоко расположенных опухолях.Фотодинамическая терапия с возбуждением рентгеновскими лучами (X-PDT), которая основана на возбужденных рентгеновскими лучами люминесцентных наночастицах (XLNP), обеспечивает новую стратегию для PDT в глубоких тканях. Однако используемая высокая доза рентгеновского излучения и неспецифическая цитотоксичность нанокомпозита наночастицы-фотосенсибилизатор (NPs-PS) затрудняют применение X-PDT in vivo. Для решения этих проблем был разработан простой и эффективный нанокомпозит NPs-PS с использованием наночастиц β-NaGdF 4 : Tb 3+ и широко применяемого PS под названием Rose Bengal (RB).Благодаря идеально согласованному спектру излучения НЧ и поглощения РБ при возбуждении рентгеновскими лучами и ковалентного сопряжения большого количества РБ на поверхности НЧ для минимизации расстояния передачи энергии, система продемонстрировала сверхвысокую эффективность FRET до 99,739%, что приводит к максимальное производство синглетного кислорода для ФДТ со значительно повышенной противоопухолевой эффективностью. Посредством модификации поверхности НЧ 2-аминоэтилфосфоновой кислотой превосходная биосовместимость была достигнута даже при высокой концентрации 1 мг / мл.Эффективность X-PDT in vivo была обнаружена примерно на 90% от ингибирования роста опухоли HepG2 с дозой рентгеновского излучения всего 1,5 Гр, что показывает лучшую противоопухолевую эффективность при том же уровне дозы рентгеновского излучения, о котором сообщалось до сих пор. Настоящая работа обеспечивает многообещающую платформу для X-PDT in vivo в глубоких опухолях.

Ключевые слова: Противоопухолевый нанокомпозит; Терапия глубоких опухолей; FRET; Задноземельные наночастицы; Фотодинамическая терапия с рентгеновским возбуждением.

Авторские права © 2018. Издано Elsevier Ltd.

Типы публикаций

  • Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

Условия MeSH

  • Передача энергии резонанса флуоресценции
  • Нанокомпозиты / химия *
  • Фотосенсибилизирующие агенты / химия *
  • Синглетный кислород / метаболизм

LinkOut - дополнительные ресурсы

  • Полнотекстовые источники

  • Другие источники литературы

  • Исследовательские материалы

  • Разное

[Икс]

цитировать

Копировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

20-ладовый деревянный гриф для грифа для акустической гитары Запасные части Гриф для акустической гитары

Деревянный гриф на 20 ладов для запасных частей для акустической гитары Гриф для акустической гитары




21809XC Sabian Percussion Effect.Регулируемая подставка Korg STBTL для метронома Beatlab. 440 Гц Perfect Pitch G Note Горловая чакра Цветная радуга Матовый кварцевый кристалл Поющая чаша 8 дюймов, Гриф из дерева 20 ладов для акустической гитары Запасные части Гриф для акустической гитары . Черный PND Wster WS-1816 Караоке Пойте вместе с микрофоном динамика Bluetooth, Muslady Standard Bb Латунный духовой духовой инструмент с мундштуком Сумка для переноски Тюнер для чистки салфетки, нержавеющая сталь с круглым сердечником, средний 5 струн 45-125 Обновленные струны DR Hi-Beam. Гриф из дерева на 20 ладов для запасных частей для акустической гитары Гриф для акустической гитары . Восстановленный винтажный кожаный чехол для хранения виниловых пластинок, черный - 7 дюймов, без пыли / царапин, ретро кожаный чехол для переноски альбомов с пластинками 25+ 45 об / мин..050 DAddario FXB050 FlexSteels Бас-гитара Однострунная длинная струна, красное сандаловое дерево Erhu Bow Hook с головкой винта Erhu Bow Adjust Tool Accessory. Гриф из дерева на 20 ладов для запасных частей для акустической гитары Гриф для акустической гитары .


20 ладов деревянный гриф грифа для акустической гитары запасные части гриф для акустической гитары

20-ладовый деревянный гриф для грифа для акустической гитары Запасные части Гриф для акустической гитары

Zantt Мужская верхняя одежда из флиса и искусственного меха Утепленная длинная куртка с капюшоном в магазине мужской одежды.ПОЛНЫЙ КОМФОРТ: струящаяся майка с круглым вырезом и широким вырезом под горло. мытье рук или посуды и снятие обрезков; 4. Вы обязательно найдете подходящие кепки для себя. Обратите внимание на размер при покупке. Может решить проблемы чрезмерного износа шин и рулевого управления. Гарантия возврата денег или замены, встроенный циркуляционный вентилятор и вентиляционная решетка, новые плечевые ремни LocoModiv с запатентованной системой UniLoop, позволяющие легко переключаться между входящими в комплект черными и неоново-зелеными плечевыми ремнями.Регулируемое кольцо с перьями из стерлингового серебра 925 пробы принцессы Кайли, желтое золото 10k Penn State University Nittany Lions Mascot Disc Logo Disc Pendant 16x15mm: Одежда. Трикотажная ткань очень дышащая. INDEXER Женский кошелек MUNDI из искусственной кожи с защитой RFID одного размера i875x (черный / цветочный) в магазине женской одежды. ВНИМАНИЕ - Цвет может незначительно отличаться от изображения, в основном из-за освещения и различных мониторов. Размеры упаковки: 6 x 5 x 4 дюйма. Солнцезащитные очки Nike EV0886-906 Spirit (один размер), Деревянная накладка на гриф на 20 ладов для акустической гитары Запасные части Гриф для акустической гитары , дата первого размещения: 30 апреля.оба являются ведущими мировыми поставщиками ювелирных материалов, детская туника для девочек San Diego Hat Company с арбузным принтом и бахромой (для маленьких / больших детей), розовая. Один размер: одежда. Ручки переключения передач серии Elite изготовлены из компонентов высочайшего качества, что обеспечивает превосходное ощущение при каждой смене. / SAIT - это частная компания, основанная в 970 году. Мы рассматриваем домашний декор как возможность добавить искусства в дом и сплотить коллективное сообщество художников. Если у вас есть какие-либо вопросы или комментарии о том, как мы можем стать лучше.У тебя будет приятель по фильмам. Предназначен для использования в качестве сока / воды или для хранения коктейлей и безалкогольных напитков в идеальных пропорциях. Носик из делрина или нержавеющей стали с нейлоновым фиксирующим элементом или без него - Пози-шестигранник - Плунжеры с шестигранной головкой позволяют легко устанавливать и снимать с задней стороны с помощью шестигранного ключа и многого другого, чтобы вам было уютно в холодную погоду. Вы получите то, что вы видите на основной картинке: короткие брюки Zimaes-Men Sports 1/2 Length Jogger со средней талией и шнурком Silm Fit в магазине мужской одежды, 1 пара креольских антиаллергенных серег из нержавеющей стали, красивая пара кожаных французских ботинок 60-х годов. , 4XL = {34 "длина корпуса x 30" грудь}, Гриф из дерева 20 ладов для акустической гитары Запасные части Гриф для акустической гитары .Гарантированное обслуживание клиентов A + или возврат денег. -Цвета варьируются в зависимости от наличия. TIPgifts придумал и создал модные бумажные коврики для салфеток для многих других мероприятий, они выглядят так, как будто их редко использовали. Пожалуйста, дайте мне знать, какую версию вы хотите "Красный" "один или" фиолетовый "при покупке ➤ Украсьте свои клатч-кошельки. СРОКИ ПРОЦЕССА НАСТРОЙКИ. Эти бусины имеют размер примерно 2–2. Стильная вечеринка на следующей вечеринке в Кентукки. Этот милый баннер украшен красными розами примерно 1-2 в диаметре и лошадьми на каждом конце со словами RUN FOR THE ROSES.и из шахматной серии Swanks 1950-х годов. Мы разговаривали с женщинами размером 4 и 12 размером. Ожерелье Turqoise с подвеской от Dobka. ▓▓▓ 【СТАНДАРТНЫЙ РАЗМЕР】 ▓▓▓. но не забудьте УКАЗАТЬ ВАШИ РАЗМЕРЫ в разделе комментариев во время покупки. Она поистине красавица и, кажется, мечтает обо всем, что ждет в будущем. Расстояние между отверстиями (от центра к центру): 3, Гриф из дерева на 20 ладов для запасных частей для акустической гитары Гриф для акустической гитары , это великолепный способ отпраздновать кого-то особенного.Мы не закупаем ломтики массового производства в магазинах для рукоделия - мы режем, жили и / или носили десятилетиями. Не стесняйтесь задавать вопросы по вашим запросам. Это позволяет мне избежать платы за листинг Etsy. Керамические фарфоровые тарелки и миски. Миры Диснея и новые персонажи из серии KINGDOM HEARTS: миры Диснея и персонажи, которых раньше не было в KINGDOM HEARTS. Глубже проникает в канавки и снижает изгиб стержня. Trans Globe Lighting Trans Globe импортирует 40385 BK Transitional One Light подвесной фонарь из коллекции Avalon в черном цвете.а также повседневную одежду, где безопасность является плюсом. Увеличьте громкость и приготовьтесь к потрясающему звуку вплоть до самых глубоких басов. Разработано для подростков от 12 до 18 лет. Если вы хотите, чтобы мы быстро проверили и гарантировали соответствие вашего автомобиля. легче и меньше повреждает, чем металлические или пластиковые клинья. : Компрессионные носки - отлично подходят для бега. Настройте его для достижения рекордных результатов, Гриф с деревянным грифом на 20 ладов для запасных частей для акустической гитары Гриф для акустической гитары .

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматической классификации данных FRET одиночных молекул с использованием глубокого обучения

Существенных изменений:

1) Неясно, как предварительное обучение модели может учесть бесконечное количество возможных состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума и т. Д. данные обучения? Например, максимальная вероятность перехода между состояниями в наборе обучающих данных 0,2 может привести к смещению анализа в сторону долгоживущих состояний FRET.Авторы должны это прокомментировать.

Это действительно очень верный комментарий, который является центральным для процесса, поскольку существует бесконечное количество возможных перестановок данных FRET, а неправильное обучение модели может привести к смещенному выбору трассы. Мы благодарим рецензентов за то, что они позволили нам прокомментировать этот вопрос, так как это могло быть неясно в рукописи.

Чтобы внести как можно меньшее смещение в сторону конкретных состояний FRET, мы стремились сгенерировать репрезентативную часть всей выборки пространства smFRET, равномерно большого количества бесконечных возможных перестановок данных ( состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума ) .Чтобы проверить это и дополнительно охарактеризовать данные обучения, мы предприняли ряд осторожных шагов, которые описаны ниже:

a) Состояния и занятия FRET . Количество состояний FRET в данной трассе выбиралось равномерно от 1 до 4 состояний. Каждому состоянию случайным образом присваивалось значение FRET путем равномерной выборки от 0 до 1. Для трасс с более чем одним состоянием требовалось минимальное расстояние 0,1 FRET между состояниями (т. Е. Случайная единообразная выборка повторялась до тех пор, пока требование не было выполнено). способен отличать реальные переходы от шумовых колебаний.Мы проверили, что все состояния FRET, а также занятость 150 тыс. Трасс в обучающих данных были равномерно распределены между 0 и 1, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 3A. Мы поняли, что это могло быть неясно в исходной заявке, поэтому мы подробно описали это в подразделе «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET» в новой версии. Кроме того, мы исправили легенду к рисунку 1 - добавление к рисунку 3A: «Трассы smFRET были сгенерированы с 1-4 случайно определенными состояниями FRET […]», поскольку из-за ошибки формулировки в нем говорилось, что трассы были сгенерированы с 1, 2 или 3 говорится в исходном сообщении.

б) Вероятность перехода и время жизни. Мы благодарим рецензентов за то, что они заметили ошибку формулировки в исходном материале «с вероятностью перехода ниже 0 и 0,2». Вероятность перехода для каждого кадра следа из заданного состояния в другое равномерно дискретизируется между 0 и 0,2. Вероятности перехода релевантны между состояниями, так что в системе с 4 состояниями с максимально допустимыми вероятностями перехода 0,2, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре равна 0.2 * (4-1 состояния) = 0,6. С другой стороны, в системе с двумя состояниями с вероятностями перехода между состояниями 0,01, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,01 * (2-1 состояния) = 0,01. Таким образом, средний срок службы вышеупомянутых систем составляет 1 / 0,6 = 1,7 кадра и 1 / 0,01 = 100 кадров соответственно. Распределение времени жизни всех обучающих данных представляет собой равномерно взвешенное среднее по экспоненциальным затуханиям для каждого возможного количества состояний FRET и вероятностей перехода, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 3B.Моделирование методом Монте-Карло на 10 000 трассировок с вероятностями перехода сэмплирования равномерно от 0 до 0,2 на 2–4 трассах состояний подтверждает, что наши обучающие данные соответствуют базовой модели (рисунок 1 - приложение к рисунку 3B). Следовательно, мы выбираем широкий диапазон вероятностей переходов, равномерно охватывающий как долгоживущие, так и короткоживущие состояния FRET, стремясь быть похожими на большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретных времен жизни. Признавая, что это могло быть неясно в рукописи, мы добавили новый рисунок 1 - рисунок 3B с распределениями времени жизни и моделированием Монте-Карло вместе с кратким описанием того, как они были получены в подразделе «Материалы и методы» «Синтетический smFRET». генерация данных ».

c) Путь перехода следует цепи Маркова, которая случайным образом генерируется из матрицы перехода с вероятностями, выбранными, как описано выше. Марковская цепь каждой моделируемой трассы генерируется с использованием реализации скрытой марковской модели пакета Python с открытым исходным кодом под названием pomegranate. Чтобы убедиться, что обучающие данные выбирают подмножество всех возможных путей перехода единообразно, мы построили график плотности переходов для n = 10 000 смоделированных трасс. Это убедительно иллюстрирует полностью случайный и однородный путь перехода, как и ожидалось.Признавая, что эта критически важная информация не была реализована в первоначальном представлении, мы добавили график как новый рисунок 1 - рисунок в приложении 3C, и внесли дополнительные пояснения в подраздел «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET».

г) Уровень шума. Экспериментальные данные могут использоваться для выборки широкого диапазона уровней шума в зависимости от биологической системы, оборудования, экспериментальной установки и т.д. из основных истинных значений FRET.Затем к интенсивности был добавлен шум путем выборки из нормального распределения со значениями σ, равномерно распределенными между 0,01 и 0,30. Для имитации дробового шума поверх был добавлен дополнительный слой гамма-шума с вероятностью 0,8. Чтобы обосновать выбранный диапазон значений σ, мы построили моделируемые распределения FRET для различных уровней шума, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 4. Широкий диапазон уровней шума, который мы выбираем в обучающих данных, напоминает большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретное SNR из-за единообразной выборки, поддерживающей наши обучающие данные, и, таким образом, модель не смещена в сторону конкретного SNR в заданном диапазоне значений σ.В пересмотренной версии как в подразделе «Производительность DeepFRET», так и в разделе «Обсуждение» мы разъяснили, что в режиме, в котором скорости перехода аналогичны временному разрешению визуализации, динамические трассы smFRET могут быть неправильно классифицированы моделью как зашумленные. Имитация трассировки и повторное обучение модели (или изменение настроек визуализации) решат эту проблему.

Мы признаем, что, несмотря на наши строгие попытки внести как можно меньшую систематическую ошибку путем единообразной выборки всех параметров, специализированные пользователи могут иметь лучшее суждение и знание своих конкретных систем, уровней шума, времени жизни состояний или вероятностей перехода среди других параметров.При обучении модели может существовать некоторая систематическая ошибка, определяющая пределы интервалов для выбранных параметров. Таким образом, если опытный пользователь хочет адаптировать модель для лучшего удовлетворения своих конкретных потребностей, DeepFRET реализует удобный интерфейс моделирования трассировки, в котором новые трассы FRET могут быть легко смоделированы на основе определяемых пользователем параметров (см. Рисунок 1 - приложение к рисунку 6). и используется для переобучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https://github.com/hatzakislab/DeepFRETModel). Мы дополнительно подчеркнули это в новом абзаце в разделе «Обсуждение».

2) Сравнение DeepFRET с человеческой точностью в выборе «чистых следов» не кажется подходящим сравнением (и, очевидно, быстрее). Ручной выбор трассировки, как правило, больше не является стандартным средством анализа данных smFRET с учетом свободно доступных автоматизированных альтернатив с открытым исходным кодом (например, HAMMY, ebFRET, SPARTAN и т. Д.). Сравнение с другими доступными программными пакетами важно, чтобы убедить пользователей в превосходной или, по крайней мере, эквивалентной производительности DeepFRET при автоматическом выборе трассировки.Авторы должны включить такое сравнение в исправленную версию рукописи.

Мы хотим подчеркнуть, что основная цель этой рукописи - предоставить интуитивно понятную платформу, требующую минимального вмешательства человека, которая, как прокомментировали рецензенты, «[…] может снизить порог для экспертизы smFRET, позволяя большему количеству ученых воспользуйтесь преимуществами этого мощного инструмента », , вместо того, чтобы доказывать неправоту существующих надежных программных пакетов, разработанных и эксплуатируемых экспертами в данной области.Мы также признаем, что ручной выбор трассировки не должен быть стандартным средством анализа данных smFRET, но, несмотря на широкий спектр доступных пакетов программного обеспечения для анализа данных smFRET, только некоторые из них реализуют расширенную автоматическую сортировку трасс. HAMMY и ebFRET как рецензенты предложили сосредоточиться на извлечении кинетической скорости и предложить простые пороговые значения, основанные на интенсивности и значениях FRET. Удаление следов за пределами этих простых пороговых значений часто требует дополнительного ручного выбора. iSMS предлагает более продвинутую сортировку по интенсивности донора / акцептора, среднему FRET и средней стехиометрии для данных ALEX, а также автоматическое обнаружение фотообесцвечивания. SPARTAN предлагает более обширные реализации для автоматической сортировки (всего 26 параметров) и оптимизирован для данных, отличных от ALEX. Однако фактические пороговые критерии могут значительно различаться для каждой группы и экспериментальной системы (Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Yao et al., 2015). Специализированные группы хорошо обучены ориентироваться в этих множественных критериях и точно определять свои собственные, которые оптимизированы для работы с их конкретными системами (Aznauryan et al., 2016; Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Wu et al., 2018; Yao et al., 2015). Однако разнообразие этих критериев сортировки может внести ненужную систематическую ошибку в и без того сложную серию обработки данных, особенно с учетом того, что появление коммерческих инструментов быстро расширило сферу smFRET.

Чтобы напрямую ответить на комментарии рецензентов, мы выполнили два типа экспериментальных проверок. Сначала мы сравнили DeepFRET напрямую с возможностями сортировки HAMMY, ebFRET, SPARTAN и iSMS на смоделированных данных, достоверность которых известна. Затем мы сравнили SPARTAN и iSMS, у которых есть расширенные возможности сортировки, на наборах экспериментальных данных, опубликованных другими группами.

В первом случае мы объединили 200 смоделированных наземных трассировок smFRET с 1800 смоделированными трассами nonmFRET (Рисунок 4 - дополнение к рисунку 3A и Материалы и методы для распределений FRET и описаний параметров, соответственно) и реконструированные файлы TIF, которые будут соответствовать в необработанные данные smFRET.Мы смоделировали как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, поскольку iSMS оптимизирован для данных ALEX, в то время как HAMMY, ebFRET и SPARTAN оптимально работают с данными, не относящимися к ALEX. Файлы tif были загружены в соответствующие программные пакеты и использованы для извлечения и сортировки трасс с применением показателя качества 0,80 в DeepFRET, параметров сортировки по умолчанию в SPARTAN (кроме порога фонового шума), пороговых значений интенсивности, стехиометрии и FRET в iSMS, пороговых значений интенсивности. в порогах HAMMY и FRET в ebFRET. Мы обнаружили, что DeepFRET, SPARTAN и iSMS восстанавливают базовое истинное распределение FRET до различных уровней детализации, в то время как простые значения интенсивности и пороговые значения FRET для HAMMY и ebFRET потребуют дальнейшей сортировки для получения оптимальных результатов.Примечательно, что DeepFRET, как было обнаружено, сортирует трассы, по крайней мере, так же или лучше, чем SPARTAN и iSMS, без какой-либо настройки параметров (рисунок 4 - приложение к рисунку 3B). Мы настоятельно отмечаем, что опытные пользователи смогут точно настроить все возможные пороговые значения, чтобы лучше соответствовать достоверным данным. Однако в реальном эксперименте, где достоверная информация неизвестна, задача становится более сложной, и параметры точной настройки могут быть искажены, особенно для неспециализированных пользователей. Классификация на основе единого порога, предлагаемая DeepFRET, может иметь решающее значение для большего числа ученых, чтобы воспользоваться этим инструментом.

Во втором случае мы сравнили производительность трех программных пакетов, предлагающих расширенную сортировку, на экспериментальных данных, опубликованных другими группами. Выбор наборов данных, отличных от ALEX и ALEX, опубликованных Kilic et al. (Kilic et al., 2018) и Hellenkamp et al. (Hellenkamp et al., 2018), соответственно, обеспечивает надлежащее тестирование в различных настройках FRET и наборах данных. Мы использовали практически настройки по умолчанию в обоих программах и обрезали данные до первых 10 кадров каждой кривой, минимизируя обесцвечивание без использования жесткого порога по умолчанию при FRET <0.2 в СПАРТАНСКОМ. Наш анализ показывает, что все три пакета программного обеспечения способны воспроизводить опубликованные распределения FRET из необработанных файлов tif с небольшими расхождениями (рисунок 4 - приложение к рисунку 4). DeepFRET демонстрирует производительность, эквивалентную или превосходящую существующие сложные программные пакеты, также на экспериментальных данных. Мы подчеркиваем, что существующие программные пакеты очень надежны, и опытные пользователи смогут перемещаться и оптимизировать все необходимые настройки для отдельных наборов данных.Сила DeepFRET заключается в его способности анализировать как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, воспроизводимым образом, требуя лишь минимального вмешательства человека и, следовательно, минимального опыта в установке пороговых значений, a , что позволяет большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного орудие труда. Признавая отсутствие сравнения с существующим программным обеспечением, мы добавили новый рисунок 4 - рисунки 3-4. Мы также переименовали подраздел «Производительность DeepFRET на реальных данных» в «Производительность DeepFRET на реальных данных, сравнение с существующим надежным программным обеспечением для анализа smFRET», а также добавили новый параграф в раздел, в котором подробно обсуждается сравнение на смоделированных реальных данных и опубликованные данные.

3) Аналогичным образом, лучший способ доказать возможности анализа трассировки DeepFRET - это взять несколько наборов данных и сравнить результаты анализа HAMMY, ebFRET и т. Д. С DeepFRET. Авторы должны включить такой сравнительный анализ более чем одного набора данных в исправленную версию рукописи.

Чтобы ответить на комментарий рецензентов, мы напрямую сравнили производительность DeepFRET с опубликованными результатами на двух экспериментальных наборах данных (ALEX и не-ALEX) в разных группах (рисунок 4 - дополнение к рисунку 4 и ответ на комментарий 2).Мы обнаружили, что DeepFRET смог воспроизвести опубликованные распределения smFRET с использованием простого порога качества 0,80 без дальнейшего вмешательства человека, и, более того, так же или лучше, чем существующее программное обеспечение (см. Также ответ на комментарий рецензента 2). Эти данные дополнительно подтверждают производительность и мощность DeepFRET по сравнению с другим существующим программным обеспечением, требующим определенных пользователем пороговых значений, что может потребовать специальных знаний от пользователей. Мы объяснили сравнение в основном тексте и добавили новый рисунок 4 - приложение к рисунку 4 в рукописи.

4) Было бы полезно, если бы в разделе «Обсуждение» авторы могли обсудить ограничения инструмента. Обсуждение случаев, когда их инструмент может дать сбой, будет полезным для исследователей, которые хотят использовать свой инструмент или развить его. Например, в разделе «Материалы и методы» отмечается, что фотофизические эффекты, которые иногда наблюдаются в экспериментах с smFRET, могут быть проблематичными для метода (похоже, что инструмент, скорее всего, классифицирует их как бесполезные трассы, даже если они могут отражать «истинный» сигнал от эксперимента [e.грамм. наблюдение PIFE в работе от группы TJ Ha]).

После комментария рецензентов мы добавили новый параграф в раздел «Обсуждение», в котором излагаются ограничения текущей версии DeepFRET и то, что можно сделать в будущем для ее улучшения. Как отмечалось в предыдущих разделах, DeepFRET точно работает как с смоделированными, так и с экспериментальными данными двухцветного smFRET в нескольких лабораториях. Ограничения, обсуждаемые в обновленной версии рукописи, могут быть устранены опытными пользователями путем моделирования новых обучающих данных и повторного обучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https: // github.com / hatzakislab / DeepFRET-Model), как описано в разделе Материалы и методы.

Артикул:

Азнаурян, М., Сондергаард, С., Ноер, С.Л., Шиотт, Б., Биркедал, В., 2016. Прямой взгляд на сложное многопутевое складывание теломерных G-квадруплексов. Nucleic Acids Res. 44, 11024–11032. DOI: 10.1093 / nar / gkw1010

Фессл, Т., Уоткинс, Д., Оутли, П., Аллен, В.Дж., Кори, Р.А., Хорн, Дж., Болдуин, С.А., Рэдфорд, С.Е., Коллинсон, И., Тума, Р., 2018. Dynamic действие механизма Sec во время инициации, транслокации белка и терминации. eLife 7. doi: 10.7554 / eLife .35112

Gouge, J., Guthertz, N., Kramm, K., Dergai, O., Abascal-Palacios, G., Satia, K., Cousin, P., Hernandez, N., Grohmann, D., Vannini, А., 2017. Молекулярные механизмы Bdp1 в сборке TFIIIB и инициации транскрипции РНК-полимеразы III. Nat. Commun. 8, 130.

DOI: 10.1038 / s41467-017-00126-1

Schärfen, L., Schlierf, M., 2019. Мониторинг в реальном времени вызванных белком конформационных изменений ДНК с использованием одномолекулярного FRET.Методы 169, 11–20.

DOI: 10.1016 / j.ymeth.2019.02.011

Цубояма, К., Тадакума, Х., Томари, Ю., 2018. Конформационная активация аргонавта посредством различных, но скоординированных действий систем шаперонов hsp70 и hsp90. Мол. Ячейка 70, 722-729.e4. DOI: 10.1016 / j.molcel.2018.04.010

Ву, С., Лю, Дж., Ван, В., 2018. Анализ ферментного катализа, модулируемого конформационной динамикой, с помощью одномолекулярного FRET. J. Phys. Chem. В 122, 6179–6187.

DOI: 10.1021 / ACS.jpcb.8b02374

Яо, К., Сасаки, Х.М., Уэда, Т., Томари, Ю., Тадакума, Х., 2015. Одномолекулярный анализ целевой реакции расщепления ферментным комплексом Drosophila RNAi. Мол. Cell 59, 125–132. DOI: 10.1016 / j.molcel.2015.05.015

https://doi.org/10.7554/eLife.60404.sa2

Исследование доступности теломерных последовательностей с помощью FRET-PAINT: свидетельство зависящего от длины уплотнения теломер | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Одноцепочечные теломерные выступы имеют длину около 200 нуклеотидов и могут образовывать тандемные G-квадруплексные (GQ) структуры, которые снижают их доступность для нуклеаз и белков, активирующих ответ на повреждение ДНК.Неизвестно, будут ли эти тандемные GQ складываться дальше, образуя компактные надстройки, которые могут обеспечить лучшую защиту более длинных теломер. Мы сообщаем об одномолекулярных измерениях, где доступность 24–144 нуклеотидных молекул теломерной ДНК человека опрашивается короткой молекулой ПНК, которая комплементарна одиночному повтору GGGTTA, как это реализовано в методе FRET-PAINT. Связывание цепи PNA с доступными последовательностями GGGTTA приводит к дискретным всплескам FRET, которые анализируют с точки зрения их времени пребывания, частоты связывания и топографического распределения.Частоты связывания были больше для связывания с промежуточными областями теломерной ДНК по сравнению с 3'- или 5'-концами, что позволяет предположить, что эти области более доступны. Примечательно, что частота связывания на теломерный повтор монотонно снижается с увеличением длины теломер. Эти результаты согласуются с тем, что теломеры образуют более компактные структуры большей длины, что снижает доступность этих критических участков генома.

ВВЕДЕНИЕ

Человеческие теломеры состоят из длинных участков повторов гексануклеотида d (GGGTTA), которые заканчиваются 3'-одноцепочечным выступом, длина которого составляет несколько сотен нуклеотидов (нт) (1–5).После каждого раунда репликации теломеры укорачиваются до тех пор, пока не запустится старение или апоптоз, когда длина выступа укорачивается до ~ 50 нуклеотидов (6). Теломераза, обратная транскриптаза, удлиняет теломеры, добавляя повторяющиеся сегменты d (GGGTTA) к 3'-концу, используя матрицу РНК TERRA. Теломераза высоко экспрессируется в большинстве раковых клеток (7–9), тогда как в нормальных клетках ее активность очень низкая (10). Четыре повтора последовательности d (GGGTTA) образуют структуру G-квадруплекса (GQ) in vitro (11,12) и in vivo (13-17).Сложенные копланарные тетрады, стабилизированные спариванием оснований типа Хугстина и одновалентными катионами, являются характеристиками структуры GQ (18–20). Структуры GQ очень стабильны и, как предполагается, защищают в остальном уязвимые теломерные выступы от ферментативной активности за счет уменьшения их доступности (21). Человеческие теломерные GQ ингибируют активность теломеразы, делая концы теломеров недоступными для теломеразо-опосредованного удлинения (22-24). Этот потенциал в сочетании с их отчетливой планарной структурой сделал их привлекательной мишенью для противораковых препаратов, которые стабилизируют GQ против активности теломеразы (25).Следовательно, изучение доступности теломерных выступов человека и характеристик складывания теломерных GQ имеет большое значение.

В многочисленных исследованиях сообщалось о взаимосвязи между условиями раствора и стабильностью, топологией и путями сворачивания одиночных молекул GQ (20,24,26–30) и их взаимодействием с небольшими молекулами, стабилизирующими GQ (31). Их стабильность против связывающих оцДНК белков (32,33) и геликаз (34–36) также была исследована. Однако теломерные выступы достаточно длинные, чтобы вмещать ~ 10 тандемных GQs, которые могут формировать структуры более высокого порядка, которые влияют на общую доступность теломер (37-39).Достижения в синтезе теломерных повторов высокой чистоты, значительно более длинных, чем обычно используемые четыре d (GGGTTA) повтора, позволили расширить биофизические исследования на последовательности, которые лучше имитируют теломерные выступы. Более ранние работы (40–47) были сосредоточены на понимании структур, образованных множественными GQ, потенциальных взаимодействий между ними и того, как такие взаимодействия влияют на общую компактность и стабильность. Однако консенсуса по этим вопросам пока не достигнуто. В различных исследованиях были обнаружены незначительные взаимодействия, стабилизирующие взаимодействия стекирования или нарушенное сворачивание и дестабилизирующие взаимодействия из-за соседних свернутых GQ, т.е.е. отрицательное сотрудничество. Краткое изложение этих исследований приводится ниже. Для краткости последовательность d (GGGTTA) в этом резюме и остальной части рукописи будет называться «G-Tract».

Используя биофизические анализы, Yu et al. пришел к выводу, что теломерные последовательности, которые содержат 8-16 G-трактов, образуют последовательные тандемные GQ, связанные с линкерами TTA, наподобие beads-on-a-string, с незначительными взаимодействиями стэкинга между GQ (40). Используя аналогичные методы и моделирование молекулярной динамики, Petraccone et al. предположил, что последовательности, содержащие 8-12 G-трактов, образуют структуры более высокого порядка с двумя или тремя смежными GQ, соответственно (41). Два исследования с помощью атомно-силовой микроскопии на теломерной последовательности длиной 96 нуклеотидов дали разные результаты, где Xu et al. сообщил о формировании компактной структуры из четырех тандемных GQ (42), в то время как Wang et al. сообщил только о двух тандемных GQ (43). В исследовании оптического пинцета Punnoose et al. сообщил, что GQs формируются случайным образом в длинных выступах теломер в течение секунд, но эти GQ были отделены друг от друга неструктурированными G-трактами (44).Это наблюдение было оправдано тем, что в процессе сворачивания преобладала кинетика, а не термодинамика. Используя электронную микроскопию, Kar et al. показали, что очень длинные (до 20 000 нуклеотидов) теломерные последовательности человека в одноцепочечной ДНК (оцДНК) могут спонтанно конденсироваться в цепочки больших дискретных бусообразных частиц двух разных размеров, сжимая теломерную ДНК почти в 12 раз в длину ( 45). В исследовании ЯМР Sannohe et al. предложил образование стержневидных структур высшего порядка в Br G-замещенных теломерных олигонуклеотидах человека (46).В другом биофизическом исследовании Vorlíčková et al. сообщил, что термостабильность GQs снижается с увеличением числа G-Tract для 1-17 длинных теломерных последовательностей G-Tract, указывая тем самым на дестабилизирующие взаимодействия между тандемными GQs (47). Учитывая чувствительность конформации и стабильности даже одного теломерного GQ к условиям отжига, хранения и ионным условиям (48), мы полагаем, что некоторые расхождения между этими исследованиями связаны с факторами, связанными с подготовкой образцов и условиями анализа.

В этом исследовании мы исследовали, как доступность теломер изменяется в зависимости от длины последовательности и положения сайтов-мишеней внутри теломер. Последовательности теломерной ДНК, содержащие 4–24 G-тракта (24–144 нуклеотида), которые могут образовывать 1–6 тандемных GQ, были исследованы на уровне одной молекулы с использованием метода FRET-PAINT (49,50), который объединяет DNA-PAINT ( 51) (Накопление точек для визуализации в наномасштабной топографии) с помощью спектроскопии резонансного переноса энергии Фёрстера одиночных молекул (smFRET).DNA-PAINT использовался в качестве метода сверхвысокого разрешения, поскольку он позволяет флуоресцентно меченным ДНК-зондам временно связываться с различными областями системы и позволяет локализовать сайты связывания с высокой точностью. Накапливая большие наборы таких событий связывания и локализации, распределенных во времени, стало возможным создавать структуры за пределами дифракционного предела. Теломерные последовательности, которые были исследованы в этом исследовании, также имеют несколько сайтов связывания (G-тракты), которые распределены по теломерному выступу и не обязательно статичны.Следовательно, опрос таких сайтов с помощью зондов, которые временно связываются, может выявить детали лежащих в основе структур. Однако теломерные последовательности образуют компактные структуры, которые имеют характерную длину в диапазоне 1-10 нм, что сложно разрешить даже для микроскопии сверхвысокого разрешения. С другой стороны, это идеальный диапазон для smFRET, который побудил нас синтезировать элементы DNA-PAINT, такие как временное связывание флуоресцентно меченых нуклеиновых кислот, с помощью спектроскопии smFRET, которая позволяет разрешать субнанометровые расстояния в масштабе длины интерес.

В нашем подходе короткая цепь пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), которая комплементарна одиночному G-тракту и флуоресцентно помечена акцепторным флуорофором (Cy5), вводится в микрофлюидный канал, содержащий частичный дуплекс ДНК с иммобилизованной поверхностью. (pdDNA) конструкции. Конструкции pdDNA помечены донорным флуорофором (Cy3) и содержат теломерные последовательности на своих выступах (рис. 1A и B). Cy3-pdDNA с иммобилизованной поверхностью служит в качестве стыковочной конструкции, а Cy5-PNA - в качестве цепи формирования изображения.Молекула Cy5-PNA временно связывается с G-трактами, которые не являются частью GQ, что приводит к сигналу FRET, который варьируется в зависимости от того, насколько далеко Cy5-PNA связывается с Cy3. Используя достаточно низкую концентрацию Cy5-PNA, каждое событие связывания и диссоциации можно детектировать отдельно от других событий. Мы определили, как частота, время пребывания и топография событий связывания меняются для шести различных конструкций ДНК, которые могут образовывать 1–6 GQ. Для каждой из этих конструкций мы также охарактеризовали, как время пребывания и частота связывания изменяются для разных сегментов последовательности, например.грамм. 3 'конец, средняя часть или 5'-конец.

Рисунок 1.

Схема конструкций ДНК и пример трассировки smFRET. ( A ) Частичные дуплексные конструкции ДНК были образованы из биотинилированной короткой цепи (меченной донорным флуорофором Cy3) и более длинной цепи, которая содержит теломерный выступ с 4–24 повторами последовательности GGGTTA. Для краткости показаны только три из шести исследованных конструкций. Конструкции 4G-Tract, 16G-Tract и 24G-Tract могут складываться максимум в один, четыре и шесть тандемных GQ соответственно.( B ) Схема поверхности канала smFRET, где конструкции pdDNA иммобилизованы на ПЭГилированной поверхности посредством связывания биотин-нейтравидин. Донорный флуорофор возбуждается в режиме ПВО лазерным лучом с длиной волны 532 нм. Нить ПНК, которая помечена акцепторным флуорофором (Cy5), комплементарна G-тракту и связывается с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени, прежде чем диссоциировать. Эти события связывания приводят к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET.( C ) Пример графика времени smFRET, который показывает пять событий связывания с одним теломерным выступом. Время выдержки для одного из этих событий связывания указано оранжевыми стрелками. Привязка к разным сегментам свеса приводит к разным уровням FRET.

Рисунок 1.

Схема конструкций ДНК и пример трассировки smFRET. ( A ) Частичные дуплексные конструкции ДНК были образованы из биотинилированной короткой цепи (меченной донорным флуорофором Cy3) и более длинной цепи, которая содержит теломерный выступ с 4–24 повторами последовательности GGGTTA.Для краткости показаны только три из шести исследованных конструкций. Конструкции 4G-Tract, 16G-Tract и 24G-Tract могут складываться максимум в один, четыре и шесть тандемных GQ соответственно. ( B ) Схема поверхности канала smFRET, где конструкции pdDNA иммобилизованы на ПЭГилированной поверхности посредством связывания биотин-нейтравидин. Донорный флуорофор возбуждается в режиме ПВО лазерным лучом с длиной волны 532 нм. Нить ПНК, которая помечена акцепторным флуорофором (Cy5), комплементарна G-тракту и связывается с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени, прежде чем диссоциировать.Эти события связывания приводят к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET. ( C ) Пример графика времени smFRET, который показывает пять событий связывания с одним теломерным выступом. Время выдержки для одного из этих событий связывания указано оранжевыми стрелками. Привязка к разным сегментам свеса приводит к разным уровням FRET.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ДНК-конструкции

Последовательности

ДНК и ПНК приведены в дополнительной таблице S1.Конструкции пдДНК были получены путем отжига короткой (18 нт) стволовой цепи с биотином на 3'-конце и Cy3 на 5'-конце, а также длинной цепи, которая содержит последовательность, комплементарную стеблю и 4-24 G-трактам. . Две нити нагревали до 95 ° C в течение 3 минут с последующим охлаждением до 30 ° C с шагом снижения температуры на 5 ° C и ожиданием в течение 3 минут на каждом этапе в термоциклере (Hybaid Omn-E Thermal Cycler). . Реакцию отжига проводили при 150 мМ KCl и 2 мМ MgCl 2 (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовались 150 мМ LiCl и 2 мМ MgCl 2 ).

Длинные цепи с 8–24 G-трактами были приобретены у Eurofins Genomics (Луисвилл, Кентукки, США) без дополнительной очистки, в то время как неочищенный 4G-тракт и очищенная с помощью ВЭЖХ стволовая цепь были приобретены у Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Все неочищенные нити очищали в лаборатории с использованием денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE). Дополнительный рисунок S1 показывает рентгенограммы денатурирующего PAGE для очищенных олигонуклеотидов ДНК, меченных радиоактивным изотопом Phosphorus-32.Очищенная с помощью ВЭЖХ короткая стыковочная цепь Cy5-PNA была приобретена у PNA Bio (Thousand Oaks, CA, USA). Схемы конструкций pd-4G-Tract, pd-16G-Tract и pd-24G-Tract показаны на рисунке 1A, где предполагались антипараллельная конформация GQ и максимальное количество укладок GQ.

Подготовка проб и анализ smFRET

Просверленные лазером кварцевые предметные стекла и покровные стекла были тщательно очищены гидроксидом калия (КОН) и ацетоном с последующим травлением пираньи, нанесением аминосиланового покрытия и пассивированием на основе сложного эфира NHS полиэтиленгликоля (ПЭГ).Смесь ПЭГ с соотношением 100: 2 м-ПЭГ-5000: биотин-ПЭГ-5000 (Laysan Bio Inc.) использовали для пассивации поверхности. ПЭГ запрещает неспецифическое связывание молекул ДНК и ПНК с поверхностью, тогда как биотин-ПЭГ-5000 предлагает точку прикрепления для молекул биотинилированной ДНК, которые соединяются с биотин-ПЭГ через нейтравидин. Дополнительный раунд ПЭГилирования проводили с использованием небольшого (333 Да) МС (ПЭГ) 4 (приобретенного у Thermofisher Scientific) для уплотнения слоя ПЭГ. Камеры для образцов были подготовлены путем наложения двусторонней ленты между предметным стеклом и покровным стеклом, оба из которых были ПЭГилированы.Камеру обрабатывали 1% (об. / Об.) Tween-20 (15 мин инкубации) с последующей обширной промывкой и введением 0,01 мг / мл нейтравидина.

Образцы пдДНК разводили до ~ 40 пМ в несколько этапов и инкубировали в камере для образцов в течение 2–5 минут при 150 мМ KCl (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовалось 150 мМ LiCl) и 2 мМ MgCl 2 , который также сохраняется при всех измерениях. Затем камеры промывали буфером для визуализации для удаления избытка ДНК.Этот протокол привел к иммобилизации 300–330 молекул на область изображения ∼50 × 100 мкм 2 . Буфер для визуализации содержал трис-основание (50 мМ, pH 7,5), 2 мМ Trolox, 0,8 мг / мл глюкозы, 0,1 мг / мл глюкозооксидазы, 0,1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ MgCl 2 и 150. мМ KCl (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовалось 150 мМ LiCl вместо 150 мМ KCl) и 40 нМ Cy5-PNA. Исходный раствор цепи Cy5-PNA нагревали в течение 10 мин при 85 ° C для увеличения растворимости.После извлечения его из термостата пробирка, содержащая ПНК, оставлялась при комнатной температуре на 15 мин, прежде чем она была разбавлена ​​в 100 раз раствором для визуализации. Раствор для визуализации, содержащий Cy5-PNA, инкубировали с молекулами ДНК в канале в течение 15 минут до видеозаписи. Фильмы из 2000 кадров были записаны при времени интегрирования кадров 100 мс / кадр.

ФРЕТ-КРАСКА

Схема анализа FRET-PAINT представлена ​​на рисунке 1B. При возбуждении лазерным лучом на длине волны 532 нм образцы пдДНК с иммобилизованной поверхностью, меченные Cy3, дают почти нулевой FRET, если только цепь Cy5-PNA не связывается с G-трактом на выступе.Всплески интенсивности акцептора и эффективности FRET происходят, когда Cy5-PNA связывается с G-трактом.

Настройка визуализации

Измерения проводились с использованием флуоресцентной установки полного внутреннего отражения (TIR) ​​призменного типа, оснащенной микроскопом Olympus IX-71 и камерой Andor IXON EMCCD (IXON DV-887 EMCCD, Andor Technology, CT, США, сейчас является частью Oxford Instruments). Камера IXON имеет размер 512 × 512 пикселей и размер пикселя 16 мкм. Донорный флуорофор возбуждали лазерным лучом с длиной волны 532 нм (Spectra Physics Excelsior).Водный объектив Olympus (60 ×, 1,20 NA) использовался для сбора сигнала флуоресценции. Общее увеличение в нашей установке составляет 90x, что дает эффективный размер пикселя 178 нм. Интенсивность лазерного луча составляла примерно 1 кВт / см 2 .

Анализ данных

Записанные фильмы были проанализированы с использованием специального программного обеспечения, написанного на C ++, для создания временных графиков интенсивности донора ( I D ) и интенсивности акцептора ( I A ) для каждой молекулы.Используя специальный код MATLAB, временные кривые были проверены, чтобы убедиться, что они представляют отдельные молекулы. Фон вычитали из каждой из этих выбранных молекул, которые затем использовали для определения времени пребывания, частоты связывания и распределений FRET, представленных в этой рукописи. Эффективность FRET ( E FRET ) была рассчитана с использованием E FRET = I A / ( I A + I D ).E Гистограммы популяции FRET (фиг. 2A) были построены на основе отобранных следов одиночных молекул, которые показали по меньшей мере одно событие связывания цепи Cy5-PNA. Вклад молекул был нормализован таким образом, чтобы каждая молекула вносила равный вклад в гистограмму, а общая популяция гистограммы была нормализована до 100%. Отобранные одиночные молекулы, которые не показали никакого события связывания, способствовали возникновению пика только для донора (DO), что связано с утечкой излучения донора в акцепторный канал.Пик DO использовался в качестве эталона для смещения DO E FRET до нуля и изменения масштаба диапазона FRET.

Рис. 2.

Нормализованные гистограммы FRET на основе FRET-PAINT. ( A ) Каждая нормализованная гистограмма эффективности FRET построена из сотен коротких событий связывания PNA, как показано на рисунке 1C (точные числа приведены в подписи к рисунку 3, где эти события анализируются с точки зрения времени их пребывания). По мере увеличения количества G-трактов увеличивается популяция состояний с более низкой эффективностью FRET, поскольку становятся доступными сайты связывания, расположенные дальше от донора.Количество молекул (теломерные выступы, которые имели хотя бы одно событие связывания) на каждой гистограмме составляет N = 127, 170, 210, 260, 185 и 230 для 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и конструкция 24G-Tract соответственно. Красная стрелка в конструкции 24G-Tract указывает уровень E FRET = 0,13, который используется в качестве порогового значения на рисунке 3. ( B ) Отношение общей популяции [ E FRET <0,50] к На графике нанесены состояния [ E FRET > 0,50].Как и ожидалось, это соотношение увеличивается с увеличением количества G-трактов.

Рис. 2.

Нормализованные гистограммы FRET на основе FRET-PAINT. ( A ) Каждая нормализованная гистограмма эффективности FRET построена из сотен коротких событий связывания PNA, как показано на рисунке 1C (точные числа приведены в подписи к рисунку 3, где эти события анализируются с точки зрения времени их пребывания). По мере увеличения количества G-трактов увеличивается популяция состояний с более низкой эффективностью FRET, поскольку становятся доступными сайты связывания, расположенные дальше от донора.Количество молекул (теломерные выступы, которые имели хотя бы одно событие связывания) на каждой гистограмме составляет N = 127, 170, 210, 260, 185 и 230 для 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и конструкция 24G-Tract соответственно. Красная стрелка в конструкции 24G-Tract указывает уровень E FRET = 0,13, который используется в качестве порогового значения на рисунке 3. ( B ) Отношение общей популяции [ E FRET <0,50] к На графике нанесены состояния [ E FRET > 0,50].Как и ожидалось, это соотношение увеличивается с увеличением количества G-трактов.

Уровни E FRET и время выдержки (τ) событий связывания во временных графиках smFRET были охарактеризованы автоматическим и свободным от смещения методом обнаружения шагов, Stepfinder (52), который может определять шаги в большие наборы данных, не требуя предварительного знания об их распределении. Он начинается с подбора данных за один шаг с таким расположением и размером, которые дают наименьший остаточный хи-квадрат (53).На рисунке 3A показана временная диаграмма smFRET и соответствующее соответствие Stepfinder (красная линия). Частоты связывания (общее количество событий связывания / общее время наблюдения) рассчитывали на основе совпадений Stepfinder . Общее время наблюдения - это сумма времени индивидуального наблюдения для каждой молекулы, полученная по временным графикам smFRET. Индивидуальное время наблюдения для каждой молекулы - это период от начала записи до фотообесцвечивания донора или до конца записи, в зависимости от того, что наступит раньше.{- 1}} $ | ⁠. Анализ начальной загрузки (54) использовался для определения планок ошибок, связанных с частотами связывания для каждой конструкции G-Tract. В анализе начальной загрузки сценарий MATLAB сгенерировал 20 000 наборов начальной загрузки с уровнем достоверности 95% из набора данных, в котором перечислено количество событий привязки в каждой временной трассе (включая трассировки, которые не показали какой-либо привязки). Общее количество событий привязки в каждом наборе начальной загрузки было разделено на общее время наблюдения для каждого набора. Это приводит к распределению частот, как показано на рисунке 5A, которое может быть подогнано к функции Гаусса для определения пиковой частоты и стандартного отклонения.Положения пиков этих распределений превосходно согласуются со средними частотами, определенными путем деления общего количества событий привязки на общее время наблюдения фактического набора данных (а не сгенерированных наборов данных начальной загрузки). Стандартное отклонение этих распределений использовали для оценки неопределенности частот связывания, представленных на фиг. 5B-C. В таблице 1 представлено общее количество временных графиков, общее количество событий связывания, общее время наблюдения и результирующая частота связывания для каждой конструкции ДНК.

Рисунок 3.

Определение характерного времени задержки. ( A ) Пример графика времени smFRET, который показывает семь событий связывания PNA с одним теломерным выступом. Подгонка Stepfinder (красная линия) используется для характеристики уровней FRET и времени выдержки (τ) событий привязки. Пунктирная линия на позиции E FRET = 0,13 представляет пороговый уровень, используемый для рассмотрения пакета FRET как события связывания PNA, а не шума.Пакеты сигналов также должны удовлетворять условию τ≥300 мс, чтобы считаться связывающим событием. ( B ) Распределение времени пребывания, определенное из Stepfinder , пригодных для каждой конструкции. Распределения лучше описывались двойной экспоненциальной (красная линия) подгонкой по сравнению с одиночной экспоненциальной (пунктирная голубая линия) подгонкой, которая последовательно занижала количество событий с более длительным временем пребывания. В двойной экспоненте | $ {t_1} $ | (более быстрый спад) - характерное время для коротких времен и | $ {t_2} $ | (более медленный распад) - характерное время для долгих времен.Количество событий связывания в гистограммах для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 331, 394, 561, 556, 563 и 604 соответственно.

Рисунок 3.

Определение характерного времени задержки. ( A ) Пример графика времени smFRET, который показывает семь событий связывания PNA с одним теломерным выступом. Подгонка Stepfinder (красная линия) используется для характеристики уровней FRET и времени выдержки (τ) событий привязки. Пунктирная линия при E FRET = 0.13 представляет собой пороговый уровень, используемый для того, чтобы рассматривать пакет FRET как событие связывания PNA, а не шум. Пакеты сигналов также должны удовлетворять условию τ≥300 мс, чтобы считаться связывающим событием. ( B ) Распределение времени пребывания, определенное из Stepfinder , пригодных для каждой конструкции. Распределения лучше описывались двойной экспоненциальной (красная линия) подгонкой по сравнению с одиночной экспоненциальной (пунктирная голубая линия) подгонкой, которая последовательно занижала количество событий с более длительным временем пребывания.В двойной экспоненте | $ {t_1} $ | (более быстрый спад) - характерное время для коротких времен и | $ {t_2} $ | (более медленный распад) - характерное время для долгих времен. Количество событий связывания в гистограммах для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 331, 394, 561, 556, 563 и 604 соответственно.

Таблица 1. Статистика

, использованная для расчета частоты связывания на рисунке 5. N ДНК относится к количеству проанализированных молекул ДНК (временные кривые), N B к количеству событий связывания ПНК, T tot к общему времени наблюдения, f среднее к средней частоте ( N B / T до ) и f пик к пиковой частоте распределения бутстреппинга на рисунке 5A

Построить .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-тракт 1632 9065 9065 9065 9065 9065 9065 9065 12G-Tract 1651 476

5,17 5,16
16G-Tract 2252 557 110646 5.03 5,20
20G-тракт 1748 449

4,84 4,48
24G-тракт 1794 566 9065 9065 9065 9065 9065 6,36 9065 9065 9065 9065 9065 6,3
9065 9065 6
Построить . N ДНК . N B .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-тракт 1632 9065 9065 9065 9065 9065 9065 9065 12G-Tract 1651 476

5,17 5,16
16G-Tract 2252 557 110646 5.03 5,20
20G-тракт 1748 449

4,84 4,48
24G-тракт 1794 566 9065 9065 9065 9065 6,36 9065 9065
Таблица 1. Статистика

, использованная для расчета частоты связывания на рисунке 5. N ДНК относится к количеству проанализированных молекул ДНК (временные диаграммы), N B к количеству событий связывания PNA, T до к общему времени наблюдения, f среднему к средней частоте ( N B / T до ) и f пик к пиковой частоте распределения бутстрепинга на рисунке 5A

Построить .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-тракт 1632 9065 9065 9065 9065 9065 9065 9065 12G-Tract 1651 476

5,17 5,16
16G-Tract 2252 557 110646 5.03 5,20
20G-тракт 1748 449

4,84 4,48
24G-тракт 1794 566 9065 9065 9065 9065 9065 6,36 9065 9065 9065 9065 9065 6,3
Построить . N ДНК . N B .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
8G-тракт 1632 9065 9065 9065 9065 9065 9065 9065 12G-Tract 1651 476

5,17 5,16
16G-Tract 2252 557 110646 5.{- [{({x - {x_0}}) / {t_2}}]}} $ | ⁠) экспоненциальных функций затухания к гистограммам на рисунке 3B. Происхождение также использовалось для проверки статистических гипотез на рисунках 3B, 4B, C и 5D. Количество молекул или количество событий связывания, включенных в каждый набор данных, указано в заголовке соответствующего рисунка.

Рисунок 4.

Распределение времени пребывания. ( A ) Контурные графики времени пребывания и . Уровни FRET. Диапазон времени выдержки от 1 до 7 с показан здесь, в то время как контурные графики для более коротких интервалов времени приведены на дополнительном рисунке S4.Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323, соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C). ( B ) Среднее время пребывания в различных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET находятся ближе к 3'-концу конструкции ДНК. (C) Время пребывания для каждого диапазона FRET в (B) усредняется по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для разных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

Рисунок 4.

Распределение времени пребывания. ( A ) Контурные графики времени пребывания и .Уровни FRET. Диапазон времени выдержки от 1 до 7 с показан здесь, в то время как контурные графики для более коротких интервалов времени приведены на дополнительном рисунке S4. Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323, соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C).( B ) Среднее время пребывания в различных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET находятся ближе к 3'-концу конструкции ДНК. (C) Время пребывания для каждого диапазона FRET в (B) усредняется по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для разных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

Рисунок 5.

Частоты связывания ПНК. ( A ) Гистограммы частоты привязки из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, в то время как разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением. Каждая гистограмма была создана из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) График разброса средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-тракт (красный) для всех событий (включая как короткое, так и длительное время пребывания).Частота связывания имеет тенденцию увеличиваться по мере увеличения количества G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на каждый G-тракт последовательно снижается. ( C ) График разброса средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-тракт (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ> 2t 1 ). Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все связывающие события. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) вычисляются из стандартных отклонений гауссовой аппроксимации распределений в (A).( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5'-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET. Планки погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

Рисунок 5.

Частоты связывания ПНК. ( A ) Гистограммы частоты привязки из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, в то время как разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением.Каждая гистограмма была создана из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) График разброса средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-тракт (красный) для всех событий (включая как короткое, так и длительное время пребывания). Частота связывания имеет тенденцию увеличиваться по мере увеличения количества G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на каждый G-тракт последовательно снижается. ( C ) График разброса средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-тракт (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ> 2t 1 ).Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все связывающие события. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) вычисляются из стандартных отклонений гауссовой аппроксимации распределений в (A). ( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5'-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET.Планки погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ FRET-PAINT для исследования доступности длинных теломерных выступов

Анализ FRET-PAINT был разработан для изучения доступности тандемных GQ, образованных в длинных теломерных последовательностях (рис. 1A и B). Связывание цепи формирователя изображения, Cy5-PNA, с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени приводит к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET ( E FRET ).Связывание с разными G-трактами приводит к пакетной передаче с разными уровнями E FRET . На рисунке 1C показан пример временной диаграммы smFRET, демонстрирующей такие всплески.

Выбор ПНК в качестве цепи формирователя изображения был решающим для этого анализа. Диссоциация цепи формирователя изображения должна быть достаточно быстрой, чтобы гарантировать, что отдельные события связывания с стыковочной конструкцией не перекрываются, что устанавливает верхний предел концентрации цепи формирователя изображения. С другой стороны, концентрация должна быть достаточно высокой, чтобы наблюдать большое количество событий связывания и получать надежную статистику (50).Концентрация цепи Cy5-PNA поддерживалась на уровне 40 нМ, что было достаточно высоким, чтобы дать надежную статистику связывания, но достаточно низким, чтобы поддерживать низкий фон флуоресценции и незначительные ложноположительные пики FRET из-за неспецифического связывания Cy5-PNA с поверхностью в близость стыковочных сооружений. Нить имидж-сканера также должна оставаться привязанной к стыковочной конструкции в течение достаточно длительного времени, чтобы обеспечить надежное обнаружение событий привязки, то есть по крайней мере в несколько раз дольше, чем время интеграции кадра (100 мс для наших измерений).Обычно этого можно достичь, используя более длинные стренги тепловизора, которые имеют больше дополнительных оснований для стыковочной конструкции. Однако использование более длинных цепей имидж-сканера потребует, чтобы они связались более чем с одним G-трактом, что приведет к перекрестным помехам между соседними G-трактами. В идеале нить тепловизора должна дополнять только один G-тракт, например 6 нт или меньше. Несмотря на то, что использовались последовательности, отличные от нашей, время диссоциации для цепей формирователя изображения ДНК длиной 6 н., 7 н., 8 н. И 9 н. Было указано как 3.7 мс, 4,8 мс, 63 мс и 670 мс соответственно (50). Учитывая это время диссоциации и ограничения во временном разрешении анализов smFRET (10–100 мс), минимально возможная длина цепи сканера ДНК будет 8–9 нуклеотидов. Однако наши исследования демонстрируют, что время диссоциации более 1 с возможно с цепью визуализатора PNA, которая комплементарна одному G-тракту.

Дополнительные рисунки S2 и S3 демонстрируют измерения, подтверждающие принцип действия, которые подтверждают использование анализа FRET-PAINT для изучения доступности длинных теломерных выступов.Присутствие GQ и их стабильность, как ожидается, будут влиять как на частоту связывания, так и на время пребывания цепей PNA на теломерных выступах. Ожидается, что GQ с более высокой стабильностью будут разворачиваться реже, что приведет к менее частым событиям связывания PNA. Ожидается, что после их сворачивания более стабильные GQ будут более эффективно вытеснять любые связанные цепи ПНК из теломерных выступов. Чтобы проверить, наблюдаются ли они в данных FRET-PAINT, мы сравнили время пребывания и частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в 150 мМ KCl и 150 мМ LiCl.Поскольку K + значительно более эффективен в стабилизации GQ по сравнению с Li + , мы ожидаем более длительное время пребывания и более высокие частоты связывания в LiCl по сравнению с KCl, что подтверждено данными, представленными на дополнительных рисунках S2B-C и S3. Средние частоты связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract были в 8,4 и 6,8 раз соответственно выше в LiCl по сравнению с KCl (дополнительный рисунок S2B-C). Характерные времена выдержки ( t 2 ) составили 2.В 1 раз и в 2,5 раза дольше в LiCl по сравнению с KCl для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract, соответственно (дополнительный рисунок S3). Кроме того, мы сравнили влияние небольшой молекулы, стабилизирующей GQ (36), на частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в KCl (дополнительный рисунок S2B, C). Как для конструкций 12G-Tract, так и для 16G-Tract частоты связывания были в 2,9 раза ниже с небольшой молекулой по сравнению с ее отсутствием. Наконец, мы сравнили частоты связывания в KCl и LiCl для конструкции, которая не может образовывать GQ (конструкция 1G-Tract) и имеет единственный сайт связывания.Мы наблюдали практически одинаковые частоты связывания для конструкции 1G-Tract в KCl и LiCl (дополнительный рисунок S2A), предполагая, что различия, которые мы наблюдали для конструкций, образующих GQ, обусловлены вариациями в стабильности GQ.

Гистограммы пакетов FRET для конструкций 4G-Tract, 8G-Tract, 12G-Tract, 16G-Tract, 20G-Tract и 24G-Tract показаны на рисунке 2A. По мере увеличения количества G-трактов более низкие состояния FRET становятся более населенными, так как сайты связывания дальше от донора становятся доступными для Cy5-PNA.Увеличение популяции нижних состояний FRET количественно определяется отношением общей популяции состояний [E FRET <0,50] к [E FRET > 0,50], как показано на рисунке 2B. С увеличением количества G-Tract в свесе это соотношение увеличивается с 0,13 для 4G-Tract до 0,72 для 24G-Tract. Уплотнение выступа за счет образования GQ позволило изучить такие длинные последовательности с помощью FRET.

Анализ времени выдержки

Программа Stepfinder использовалась для характеристики уровней E FRET и времени пребывания (τ) событий связывания во временных графиках smFRET.На рисунке 3A показана временная диаграмма smFRET с подгонкой Stepfinder (красная линия). Пунктирная линия на E FRET = 0,13 ( E FRET = 0,25 до коррекции DO) указывает пороговый уровень FRET для рассмотрения пакета FRET как события связывания Cy5-PNA. Этот пороговый уровень FRET был определен на основе распределений FRET, представленных на рисунке 2A. Как показано красной стрелкой на гистограмме 24G-Tract, самой длинной конструкции, которую мы изучили, популяции FRET незначительны из-за событий связывания в E FRET <0.13. Также требовалось, чтобы события оставались выше этого порогового уровня FRET для 4 последовательных точек, т.е. τ ≥300 мс, чтобы отличить их от случайных флуктуаций сигнала. Распределение времени пребывания для всех конструкций показано на рисунке 3B. Распределения времени пребывания аппроксимируются с использованием функций одинарного и двойного экспоненциального затухания, которые показаны пунктирными голубыми линиями и сплошными красными линиями на Рисунке 3B. Полученные параметры подгонки двойного экспоненциального затухания приведены в дополнительной таблице S2.Двойное экспоненциальное совпадение было значительно лучше, чем одинарное экспоненциальное совпадение для всех конструкций ( P <0,001 для всех конструкций). F-статистика для этого сравнения приведена в дополнительной таблице S3. Двойная экспоненциальная аппроксимация дала постоянную времени быстрого спада t 1 и более медленную константу затухания t 2 , которые перечислены на соответствующих гистограммах на рисунке 3B. В то время как время быстрого затухания одинаково для всех конструкций (≈0.7 ± 0,1 с), более медленные константы распада находятся в диапазоне 4,0–8,6 с, без явной зависимости от длины. Согласованность коротких времен пребывания для разных конструкций подразумевает, что они являются результатом одного и того же механизма, такого как частичная гибридизация PNA с G-трактами или с петлями TTA в GQ.

Данные времени пребывания могут быть дополнительно проанализированы, чтобы исследовать, приводит ли связывание PNA к различным сегментам конструкции, которые должны давать разные уровни FRET, к разному времени пребывания.Контурные графики времени пребывания и . E FRET были созданы, чтобы ответить на этот вопрос (Рисунок 4A). Чтобы исключить случаи короткого связывания, которые могут быть следствием частичной гибридизации зонда PNA с теломерными последовательностями, мы включили в эти контурные графики времена пребывания, превышающие 1,0 с. Для ясности рисунков верхний предел на этих графиках установлен на уровне 7,0 с, даже несмотря на то, что малонаселенные карманы существуют при более длительном времени пребывания. Контурные графики, которые включают более короткие времена пребывания (<1.0 с) приведены на дополнительном рисунке S4. Связывание Cy5-PNA с 3'-концом и 5'-концом конструкции ДНК приводит к более низким и более высоким уровням FRET, соответственно. Как показано на рисунке 2A, совокупность нижних состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением длины выступа. Чтобы оценить среднее время выдержки для различных положений выступа, шкала E FRET (0,0–1,0) была разделена на пять сегментов FRET равной ширины 0,2, как показано белыми пунктирными линиями на рисунке 4A. Для каждой конструкции было рассчитано среднее время пребывания в каждом из этих сегментов, как показано на рисунке 4B.За исключением конструкции 20G-Tract, односторонний анализ ANOVA не показал значимой разницы между средним временем пребывания для разных сегментов FRET для любой из конструкций. Чтобы получить глобальное среднее значение, время пребывания для каждого диапазона FRET было усреднено по всем конструкциям (рис. 4C). Однофакторный анализ ANOVA в этом случае также не показал существенной разницы во времени пребывания для разных сегментов FRET. Статистика одностороннего теста ANOVA приведена в дополнительной таблице S4. На основании этого мы делаем вывод, что время пребывания для связывания с разными сегментами теломерного выступа не различимо в пределах разрешающей способности наших измерений.

Частота связывания PNA

Доступность теломер может быть определена количественно путем расчета частоты связывания цепей Cy5-PNA с G-трактами. Частота связывания рассчитывается путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения для каждой конструкции. Количество событий привязки было определено с использованием настраиваемого кода MATLAB, который обрабатывал соответствия, сгенерированные Stepfinder , и подсчитывал события привязки, которые имеют время задержки> 300 мс и E FRET > 0.13, как описано ранее.

На рис. 5A показано распределение средних частот, полученное с помощью анализа бутстрэппинга. Пиковые значения этих распределений превосходно согласуются с вычисленными средними частотами связывания, полученными путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения. Разброс распределений описывает неопределенность средних частот связывания. Планки погрешностей на рисунках 5B и C представляют собой стандартное отклонение гауссовых подходов к распределениям начальной загрузки, показанным на рисунке 5A.

Рисунок 5B показывает, что частота связывания обычно увеличивается с увеличением длины теломер, что согласуется с увеличением числа потенциальных сайтов связывания. С другой стороны, частота связывания на G-тракт последовательно снижается с длиной теломер (Рисунок 5B, где включены как короткие, так и длинные времена пребывания). Подобные тенденции также наблюдаются, когда рассматриваются только события связывания с τ> 2 t 1 , чтобы исключить события, которые потенциально представляют собой частичную гибридизацию PNA (рис. 5C).Уменьшение частоты связывания G-тракта с увеличением длины теломер предполагает уплотнение в структуре, которое становится более заметным по мере увеличения длины теломер. Это может быть связано с образованием структур более высокого порядка, возможно, опосредованным стэкингом GQ.

На Фигуре 5D показаны частоты связывания, классифицированные на основе их уровней FRET, где шкала FRET разделена на пять сегментов, как на Фигуре 4B. Как и ожидалось, из-за близости донорского флуорофора к доступным сайтам связывания в более коротких конструкциях (таких как 4G-Tract или 8G-Tract) более высокие частоты связывания наблюдаются для более высоких сегментов FRET.Частоты связывания более равномерно распределены для более длинных конструкций (таких как 20G-Tract или 24G-Tract), поскольку участки связывания, расположенные дальше от донорского флуорофора, становятся доступными для связывания ПНК. Чтобы проверить, демонстрируют ли наблюдаемые частоты связывания значительные различия для разных сегментов FRET, был проведен односторонний анализ ANOVA с повторными измерениями, который показал значительные различия в пределах каждой конструкции. Результаты этого теста приведены в дополнительной таблице S5. Это особенно важно для более длинных конструкций, которые показывают более высокие частоты связывания в промежуточных сегментах по сравнению с 3 'или 5' концами.Мы также выполнили тест попарного сравнения для сегментов FRET конструкции 20G-Tract и 24G-Tract, в котором частоты связывания для разных сегментов сравниваются с каждым из других сегментов. Результаты этого анализа представлены в виде контурного графика значений t на дополнительном рисунке S5 и в виде таблицы в дополнительной таблице S6. Эти анализы показывают, что GQ на 3'- и 5'-концах выступов в среднем менее доступны по сравнению с промежуточными областями, что согласуется с GQ, ингибирующими экзонуклеазную активность на концах теломеров (55).

Наши исследования демонстрируют, что даже несмотря на то, что события связывания становятся более частыми по мере увеличения длины теломерной ДНК, частота связывания на G-тракт последовательно снижается с увеличением длины теломер, указывая на общее уплотнение структуры на более длинных участках. Это дает потенциальную основу для понимания того, как более длинные теломерные выступы уменьшают их доступность, формируя более компактные структуры. Это уплотнение будет способствовать защите концов теломеров от нуклеазной активности или агентов, которые в противном случае вызывали бы повреждение ДНК.Это также сделало бы теломерные выступы менее доступными для связывающих оцДНК белков, таких как RPA, накопление которых на теломерах будет запускать контрольную точку повреждения ДНК. С другой стороны, более компактная структура может также сделать теломерные GQ менее доступными для малых молекул и предъявить более строгие требования к потенциальным противораковым лекарствам, разработанным для ингибирования активности теломеразы.

По техническим причинам мы демонстрируем возможность использования FRET-PAINT в качестве инструмента для изучения доступности теломерных последовательностей, сходных по длине с теми, которые встречаются в физиологических условиях.Используя ПНК в качестве зонда, который образует более стабильный гетеродуплекс с ДНК по сравнению с гомодуплексом ДНК-ДНК или гетеродуплексом ДНК-РНК, можно было уменьшить размер зонда так, чтобы один G-тракт опрашивается за раз, сохраняя при этом измеримое время ожидания (∼1 с). Наши исследования также демонстрируют возможность распространения этого подхода на более сложные условия, где доступность теломер изучается в присутствии белков шелтерина, ДНК-связывающих белков, геликаз или агентов краудинга.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Все данные FRET отдельных молекул, представленные в этой рукописи, могут быть предоставлены по запросу от соответствующего автора.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим доктора Лука Лёффа (Технический университет Делфта, Нидерланды) за то, что он поделился с нами программой Stepfinder и за его помощь в ее реализации.Мы хотели бы поблагодарить Кристин Йегер и Викторию Рейнольдс (статистический консалтинг, библиотеки Кентского государственного университета) за их помощь в проведении статистического анализа. Мы благодарим Эрика Йоки за его помощь в вычитке и редактировании рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальные институты здравоохранения, США [1R15GM109386 и 1R15GM123443 - H.B]. Финансирование платы за открытый доступ: NIH [1R15GM123443].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Блэкберн

E.H.

Строение и функции теломер

.

Природа

.

1991

;

350

:

569

-

573

.2.

Макаров

В.Л.

,

Hirose

Y.

,

Langmore

J.P.

Длинные G-хвосты на обоих концах хромосом человека предполагают механизм деградации С-цепи для укорочения теломер

.

Ячейка

.

1997

;

88

:

657

-

666

.3.

Райт

W.E.

,

Тесмер

В.М.

,

Huffman

K.E.

,

Levene

S.D.

,

Shay

J.W.

Нормальные человеческие хромосомы имеют длинные теломерные выступы, богатые G, на одном конце

.

Genes Dev.

1997

;

11

:

2801

-

2809

. 4.

Стюарт

S.A.

,

Бен-Порат

I.

,

Кэри

V.J.

,

O’Connor

B.F.

,

Hahn

W.C.

,

Weinberg

R.A

Эрозия теломерного однонитевого выступа при репликативном старении

.

Nat. Genet.

2003

;

33

:

492

-

496

. 5.

Verdun

R.E.

,

Karlseder

J.

Репликация и защита теломер

.

Природа

.

2007

;

447

:

924

-

931

.6.

Rhodes

D.

,

Lipps

H.J.

Обзор и сводка G-квадруплексов и их регуляторные роли в биологии

.

Nucleic Acids Res.

2015

;

43

:

8627

-

8637

.7.

Testorelli

C.

Теломераза и рак

.

J. Exp. Clin. Cancer Res.

2003

;

22

:

165

-

169

.8.

Hanahan

D.

,

Weinberg

R.A.

Признаки рака: следующее поколение

.

Ячейка

.

2011

;

144

:

646

-

674

.9.

Джафри

M.A.

,

Ansari

S.A.

,

Alqahtani

M.H.

,

Shay

J.W.

Роль теломер и теломеразы в развитии рака и достижения в области терапии, направленной на теломеразу

.

Геном Мед

.

2016

;

8

:

69

.10.

Shay

J.W.

,

Райт

W.E.

Теломеры и теломераза в нормальных и раковых стволовых клетках

.

FEBS Lett.

2010

;

584

:

3819

-

3825

.11.

Хендерсон

E.

,

Hardin

C.C.

,

Прогулка

S.K.

,

Тиноко

I.

,

Блэкберн

E.H.

Теломерные олигонуклеотиды ДНК образуют новые внутримолекулярные структуры, содержащие пары оснований гуанин · гуанин

.

Ячейка

.

1987

;

51

:

899

-

908

.12.

Sen

D.

,

Gilbert

W.

Образование параллельных четырехцепочечных комплексов богатыми гуанином мотивами в ДНК и его значение для мейоза

.

Природа

.

1988

;

334

:

364

-

366

. 13.

Biffi

G.

,

Tannahill

D.

,

McCafferty

J.

,

Balasubramanian

S.

Количественная визуализация структур G-квадруплексов ДНК в клетках человека

.

Nat. Chem.

2013

;

5

:

182

-

186

. 14.

Оганесян

L.

,

Karlseder

J.

Теломерная броня: слои торцевой защиты

.

J. Cell Sci.

2009

;

122

:

4013

-

4025

. 15.

Хендерсон

A.

,

Wu

Y.

,

Huang

Y.C.

,

Чавес

E.A.

,

Platt

J.

,

Johnson

F.B.

,

Брош

Р.М.

,

Сен

D.

,

Лансдорп

P.M.

Обнаружение G-квадруплексной ДНК в клетках млекопитающих

.

Nucleic Acids Res.

2014

;

42

:

860

-

869

0,16.

Zhang

S.

,

Sun

H.

,

Wang

L.

,

Liu

Y.

,

Chen

H.

,

Li

Q.

,

Гуань

А.

,

Лю

М.

,

Tang

Y.

Мониторинг G-квадруплексов ДНК в живых клетках в реальном времени с помощью низкомолекулярного флуоресцентного зонда

.

Nucleic Acids Res.

2018

;

46

:

7522

-

7532

. 17.

Di Antonio

M.

,

Ponjavic

A.

,

Radzevičius

A.

,

Ranasinghe

R.T.

,

Каталано

М.

,

Чжан

X.

,

Шен

Дж.

,

Нидхэм

Л.-М.

,

Ли

S.F.

,

Кленерман

D.

et al. .

Одномолекулярная визуализация образования G-квадруплексов ДНК в живых клетках

.

Nat. Chem.

2020

;

12

:

832

-

837

0,18.

Gellert

M.

,

Lipsett

M.N.

,

Дэвис

Д.Р.

Образование спирали гуаниловой кислотой

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1962

;

48

:

2013

-

2018

,19.

Neidle

S.

,

Parkinson

G.N.

Строение теломерной ДНК

.

Curr. Opin. Struct. Биол.

2003

;

13

:

275

-

283

.20.

Бердж

S.

,

Parkinson

G.N.

,

Hazel

P.

,

Todd

A.K.

,

Neidle

S.

Квадруплексная ДНК: последовательность, топология и структура

.

Nucleic Acids Res.

2006

;

34

:

5402

-

5415

. 21.

Hwang

H.

,

Kreig

A.

,

Calvert

J.

,

Lormand

J.

,

Kwon

Y.

,

Daley

J.M.

,

Sung

P.

,

Opresko

P.L.

,

Myong

S.

Длина теломерного выступа определяет структурную динамику и доступность для теломеразы и ALT-ассоциированных белков

.

Строение

.

2014

;

22

:

842

-

853

. 22.

Wang

Q.

,

Liu

J.Q.

,

Чен

З.

,

Zheng

K.W.

,

Chen

C.Y.

,

Хао

Y.H.

,

Tan

Z.

Образование G-квадруплекса на 3'-конце теломерной ДНК ингибирует его удлинение с помощью теломеразы, полимеразы и раскручивание с помощью геликазы

.

Nucleic Acids Res.

2011

;

39

:

6229

-

6237

. 23.

Cheong

В.В.

,

Хедди

Б.

,

Lech

C.J.

,

Phan

A.T.

Ксантин и 8-оксогуанин в G-квадруплексах: образование тетрады G · G · X · O

.

Nucleic Acids Res.

2015

;

43

:

10506

-

10514

0,24.

Spiegel

J.

,

Adhikari

S.

,

Balasubramanian

S.

Структура и функции G-квадруплексов ДНК

.

Trends Chem

.

2020

;

2

:

123

-

136

0,25.

Neidle

S.

Теломерный G-квадруплекс человека: Текущее состояние теломерных G-квадруплексов как терапевтических мишеней при раке человека

.

FEBS J.

2010

;

277

:

1118

-

1125

0,26.

Серый

R.D.

,

Trent

J.O.

,

Стулья

J.B.

Пути складывания и разворачивания теломерного G-квадруплекса человека

.

J. Mol. Биол.

2014

;

426

:

1629

-

1650

0,27.

Bessi

I.

,

Jonker

H.R.A.

,

Richter

C.

,

Schwalbe

H

Вовлечение долгоживущих промежуточных состояний в сложный путь сворачивания теломерного G-Quadruplex человека

.

Angew. Chem. - Int. Эд.

2015

;

54

:

8444

-

8448

. 28.

Marchand

A.

,

Gabelica

V.

Пути сворачивания и неправильного сворачивания G-квадруплекса ДНК

.

Nucleic Acids Res.

2016

;

44

:

10999

-

11012

,29.

Bhattacharyya

D.

,

Arachchilage

G.M.

,

Basu

S.

Катионы металлов в складчатости и стабильности G-квадруплекса

.

Фронт. Chem.

2016

;

4

:

38

.30.

Fujii

T.

,

Podbevšek

P.

,

Plavec

J.

,

Sugimoto

N.

Влияние ионов металлов и косолютов на топологию G-квадруплекса

.

J. Inorg. Biochem.

2017

;

166

:

190

-

198

.31.

Maleki

P.

,

Ma

Y.

,

Iida

K.

,

Nagasawa

K.

,

Balci

H.

Исследование одной молекулы флуоресцентно меченное производное теломестатина и G-квадруплексные взаимодействия

.

Nucleic Acids Res.

2017

;

45

:

288

-

295

. 32.

Ray

S.

,

Bandaria

J.N.

,

Qureshi

M.H.

,

Yildiz

A.

,

Balci

H.

Образование G-квадруплекса в теломерах усиливает защиту POT1 / TPP1 от связывания RPA

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2014

;

111

:

2990

-

2995

. 33.

Ray

S.

,

Qureshi

M.H.

,

Малкольм

Д.У.

,

Budhathoki

J.B.

,

elik

U.

,

Balci

H.

RPA-опосредованное разворачивание систематически изменяющихся структур G-квадруплекса

.

Biophys. J.

2013

;

104

:

2235

-

2245

. 34.

Budhathoki

J.B.

,

Ray

S.

,

Urban

V.

,

Janscak

P.

,

Yodh

J.G.

,

Балчи

H.

RecQ-ядро BLM разворачивает теломерный G-квадруплекс в отсутствие ATP

.

Nucleic Acids Res.

2015

;

42

:

11528

-

11545

0,35.

Budhathoki

J.B.

,

Stafford

E.J.

,

Йод

J.G.

,

Balci

H.

АТФ-зависимый G-квадруплекс, разворачивающийся с помощью геликазы Блума, обнаруживает низкую процессивность

.

Nucleic Acids Res.

2015

;

43

:

5961

-

5970

0,36.

Maleki

P.

,

Mustafa

G.

,

Gyawali

P.

,

Budhathoki

JB

,

Ma

Y.

,

Nagasawa

K.

,

Balci

H.

Количественная оценка воздействия низкомолекулярных лигандов на стабильность G-квадруплекса против геликазы Блума

.

Nucleic Acids Res.

2019

;

47

:

10744

-

10753

0,37.

Chandradoss

S.D.

,

Haagsma

A.C.

,

Lee

Y.K.

,

Hwang

J.H.

,

Nam

J.M.

,

Joo

C.

Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков

.

J. Vis. Exp.

2014

;

86

:

e50549

.38.

Neidle

S.

Квадруплексные нуклеиновые кислоты как новые терапевтические мишени

.

J. Med. Chem.

2016

;

59

:

5987

-

6011

. 39.

Abraham Punnoose

J.

,

Cui

Y.

,

Koirala

D.

,

Yangyuoru

P.M.

,

Ghimire

C.

,

Shrestha

P.

,

Mao

H.

Взаимодействие G-квадруплексов в 3-м теломерном оверхенге полной длины

.

J. Am. Chem. Soc.

2014

;

136

:

18062

-

18069

.40.

Yu

H.Q.

,

Miyoshi

D.

,

Sugimoto

N.

Характеристика структуры и стабильности длинных теломерных G-квадруплексов ДНК

.

J. Am. Chem. Soc.

2006

;

128

:

15461

-

15468

.41.

Petraccone

L.

,

Spink

C.

,

Trent

J.O.

,

Garbett

N.C.

,

Mekmaysy

C.S.

,

Giancola

C.

,

Chaires

J.B.

Структура и стабильность теломерных квадруплексов человека высшего порядка

.

J. Am. Chem. Soc.

2011

;

133

:

20951

-

20961

.42.

Xu

Y.

,

Ishizuka

T.

,

Kurabayashi

K.

,

Komiyama

M.

Последовательное образование G-квадруплексов в теломерио-повешенной ДНК человека: защитная оболочка структура концов теломер

.

Angew. Chemie - Int. Эд.

2009

;

48

:

7833

-

7836

.43.

Ван

Х.

,

Нора

Г.J.

,

Ghodke

H.

,

Opresko

P.L.

Исследования одиночных молекул физиологически релевантных теломерных хвостов выявили механизм POT1, способствующий разворачиванию G-квадруплексов

.

J. Biol. Chem.

2011

;

286

:

7479

-

7489

.44.

Abraham Punnoose

J.

,

Ma

Y.

,

Hoque

M.E.

,

Cui

Y.

,

Sasaki

S.

,

Guo

AH

,

Nagasawa

K.

,

Mao

H.

Случайное образование G-квадруплексов в выступах полных теломер человека приводит к кинетический шаблон складывания с целевыми свободными G-Tracts

.

Биохимия

.

2018

;

57

:

6946

-

6955

.45.

Кар

A.

,

Jones

N.

,

Ozlem Arat

N.

,

Fishel

R.

,

Griffith

JD

Long Repeating (TTAGGG) n одноцепочечная ДНК самоконденсируется в компактные бисерные нити, стабилизированные образованием G-квадруплекса

.

J. Biol. Chem.

2018

;

293

:

9473

-

9485

.46.

Sannohe

Y.

,

Sato

K.

,

Matsugami

A.

,

Shinohara

K. ichi

,

Mashimo

T.

,

Katahira

M.

,

Sugiyama

H. удлиненные олигонуклеотиды

.

Bioorganic Med. Chem.

2009

;

17

:

1870

-

1875

0,47.

Ворличкова

М.

,

Хладкова

J.

,

Kejnovská

I.

,

Fialová

M.

,

Kypr

J.

Топология гуанинового тетраплекса теломер ДНК человека определяется количеством (TTAGGG) повторов

.

Nucleic Acids Res.

2005

;

33

:

5851

-

5860

. 48.

Maleki

P.

,

Budhathoki

J.B.

,

Roy

W.A.

,

Balci

H.

Практическое руководство по изучению структур G-квадруплексов с использованием одномолекулярного FRET

.

Мол. Genet. Геномика

.

2017

;

292

:

483

-

498

.49.

Auer

A.

,

Strauss

M.T.

,

Schlichthaerle

T.

,

Jungmann

R.

Быстрая визуализация DNA-PAINT без фона с использованием зондов на основе FRET

.

Nano Lett.

2017

;

17

:

6428

-

6434

.50.

Ли

J.

,

Park

S.

,

Hohng

S.

Ускоренная микроскопия FRET-PAINT

.

Мол. Мозг

.

2018

;

11

:

70

,51.

Jungmann

R.

,

Steinhauer

C.

,

Scheible

M.

,

Kuzyk

A.

,

Tinnefeld

P.

,

Simmel

F.C.

Кинетика одиночных молекул и микроскопия сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной визуализации временного связывания на ДНК оригами

.

Nano Lett.

2010

;

10

:

4756

-

4761

. 52.

Loeff

L.

Противодействие микробам: освещение адаптивного иммунитета CRISPR с использованием флуоресценции одиночных молекул

.

2017

;

Делфтский технологический университет

.53.

Kerssemakers

J.W.J.

,

Лаура Мунтяну

E.

,

Laan

L.

,

Ноетцель

T.L.

,

Janson

M.E.

,

Dogterom

M

Динамика сборки микротрубочек при молекулярном разрешении

.

Природа

.

2006

;

442

:

709

-

712

. 54.

Эфрон

Б.

,

Тибширани

Р.J.

Введение в Bootstrap

.

1993

;

NY

Chapman & Hall

0,55.

Тан

J.

,

Кан

Z.Y.

,

Яо

Y.

,

Wang

Q.

,

Hao

Y.H.

,

Tan

Z.

G-квадруплекс преимущественно образуется на самом 3'-конце теломерной ДНК позвоночных

.

Nucleic Acids Res.

2008

;

36

:

1200

-

1208

.

© Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

4 порта RFMC - FRET - Doric Lenses Inc.

Rotary Mini Cube
Диапазон длин волн от 350 до 1100 нм
Совместимость оптического волокна - Диаметр сердцевины 200 или 400 мкм
- NA 0.От 37 до 0,57
Спектральная полоса - Возбуждение: 420-445 нм
- Излучение: 460-500 нм, 528-542 нм
Затухание в оптическом фильтре > OD 5 за пределами полосы
Размеры 57 мм x 63 мм x 26 мм
Встроенные детекторы
Чувствительность детектора - 0,38 A / Вт при 550 нм
- 0,60 A / Вт при 960 нм (пик)
Усиление 3 уровня: 1x, 10x, 100x
Трансимпедансное усиление - 2.0 E09 V / A (1x)
- 2,0 E10 V / A (10x)
- 2,0 E11 V / A (100x)
Коэффициент преобразования
@ 550 нм
- 0,76 В / нВт (1x)
- 7,60 В / нВт (10x)
- 76,0 В / нВт (100x)
Уровень насыщения
@ 550 нм
- 7,2 нВт (1x)
- 0,72 нВт (10x)
-72 пВт (100x)
NEP <12 фВт / √Гц
Пропускная способность - постоянный ток: 0 - 1000 Гц
- переменный ток: 30 - 1000 Гц
Электрический интерфейс BNC
Выходное напряжение 0.От 0 до 5,5 В
Выходное сопротивление 50 Ом
Тип датчика Кремниевый фотодиод
Область датчика 1 x 1 мм
Входное напряжение 12 В постоянного тока (с блоком питания)
Встроенные светодиоды
Максимальный ток 500 мА
Размер излучателя Диаметр 400 мкм - NA0.22
Выходная мощность
(волокно 200 мкм)
Светодиод 400-410 нм = 60 мкВт
Светодиод 460-490 нм = 90 мкВт
Выходная мощность
(волокно 400 мкм)
Светодиод 400-410 нм = 220 мкВт
Светодиод 460-490 нм = 375 мкВт

Sadowsky 24-ладовый современный бас MetroLine, корпус из болотного ясеня, 4-струнный - синий прозрачный сатин

Sadowsky MetroLine 24-ладовый современный бас, корпус из болотного ясеня, 4-струнный - синий прозрачный сатин

Роджер Садовски всегда стремился к достижению цели еще больше улучшить и без того очень удачный дизайн басов, сделав ряд детальных улучшений.Вместе с электроникой, которую он разработал сам, ему удалось поднять хорошо известное басовое звучание J / J на ​​новый уровень, так что сегодня вы можете говорить о типичном тоне Садовски: никогда не резкое или пронзительное звучание, с сильным, мощным звуком. но никогда не бывает мутных басов с присутствующими, но не слишком агрессивными средними частотами и сладким и воздушным диапазоном высоких частот. Все особенности этого современного басового звука также можно найти в бас-гитаре 24-Fret Modern серии MetroLine, произведенной исключительно в Германии. Все басы легкие, около 8.9 фунтов (4,0 кг). Хороший выбор для басистов, которые ищут легкое решение для сцены в дополнение к современному звучанию басов. Глубокие вырезы для лучшего воспроизведения, 24 лада, звукосниматели Soapbar в современном положении рядом с бриджем, активная электроника с истинным байпасом, Vintage Tone Control, усиление высоких и низких частот, сверхлегкие тюнеры Sadowsky и специальный бридж Sadowsky для быстрого выпуска струн соответствуют всем требованиям современного игра на басу. 4-струнная бас-гитара в гладком корпусе из болотного ясеня уменьшенного размера в форме J-Style и современного внешнего вида без накладок выполнена в синем прозрачном атласном отделке.
  • Садовский MetroLine 24-ладовый современный бас
  • правосторонняя версия
  • 4-струнный электрический бас
  • 34 дюйма (864 мм) длинная шкала
  • конструкция на болтах
  • Корпус из американского болотного ясеня
  • Кленовый гриф
  • Клен гриф
  • радиус гриф 12 дюймов
  • Гайка Sadowsky Just-A-Nut III
  • Ширина гайки 1,5 дюйма (38,5 мм)
  • 24 лада из нейзильбера (ширина: 0,094 дюйма (2,4 мм) / высота: 0.051 "(1,3 мм))
  • пассивный звукосниматель Sadowsky Soapbar в современном положении (гриф)
  • пассивный звукосниматель Sadowsky Soapbar в современном положении (бридж)
  • активная 2-полосная электроника Sadowsky (усиление низких и высоких частот) с Vintage Tone Control ( VTC)
  • регуляторы громкости / баланса / винтажного тембра (P / P) / высоких и низких частот (сложены)
  • функция push / pull на ручке VTC для обхода предусилителя
  • Головки Sadowsky Light с открытой шестерней
  • Sadowsky S -защитные замки
  • Мост Садовского с быстрой разблокировкой струны
  • хромированная фурнитура
  • Синяя этикетка Садовского 045 - 105 струн
  • Синяя прозрачная атласная отделка
  • без накладок
  • вес ок.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *