Лада 2180: LADA Vesta 2181, 2180 , .

Lada: расставить PRIORитеты — журнал За рулем

Нынешняя «Приора» совсем недавно, можно сказать, на днях, претерпела косметическое обновление, похоже, последнее в своей судьбе. Ведь в дверь буквально ломится преемник, который, кстати, совсем необязательно будет называться Priora…

По первоначальному плану развития АВТОВАЗа автомобиль, построенный на платформе Lada В (не путать с В0), должен был появиться в 2015 году, но позднее график подкорректировали, и старт производства ВАЗ-2180 (именно под таким индексом в заводской документации проходит преемник «Приоры») перенесен на начало 2016-го. Надо полагать, что и эта дата не окончательная. Хотя, судя по многочисленным фото в Интернете прототипов (причем уже в облегченном камуфляже), раскатывающих по разбитым дорогам Тольятти, работа над новинкой находится в довольно продвинутой стадии.

Наиболее интригующим моментом, пожалуй, является позиционирование второго поколения Lada Priora. Ведь не секрет, что текущее по своим характеристикам играет на том же поле (кроме цены), что и более молодой соб­рат — Granta. Близкие габариты, практически одинаковые моторы, схема привода. Кстати, в салоне «Приоры» даже потеснее будет… Напрашивается вопрос: а какова цель вот такого нелогичного создания внутренней конкуренции? Неужто вазовцы всерьез считают, что наличием усиленной шумоизоляции или дополнительных дверных уплотнителей можно убедить покупателя, что одно авто стоит рангом выше другого? Сомнительно. Но в Тольятти не перестают напоминать, что автомобиль класса «С» — это следующая ступень, а ВАЗ-2180 — некий промежуточный вариант. Вопрос — какой? Я решил провести небольшое аналитичес­кое исследование.

ВАЗ-2180

Наиболее интригующим моментом является позиционирование второго поколения Lada Priora

Сначала в Сети появилось схематическое изображение профильной проекции «восьмидесятки», снятое, похоже, с какой-то технологической карты. По нему я попытался вычислить габарит новинки. Если взять за основу тот факт, что на машине установлен 15-дюймовый диск, то исходя из пропорции в длину авто получается чуть более 4,22 м (отталкиваться от 14-дюймовой размерности не имеет смысла — габарит новинки менее четырех метров маловероятен). С учетом погрешности измерений это соответствует длине нынешней «Приоры» (4350 мм). Но есть нюанс: если, опираясь на эту же пропорцию, попытаться вычислить высоту, то цифра получится более характерная для спорткара — 1,32 м. Так что я решил зайти с другой стороны и составил пропорцию исходя из высоты текущей модели (1420 мм). При таком подходе длина Lada 2180 оказалась равной приблизительно 4,53 м, что уже соответствует современным представителям гольф-класса (правда, наиболее свежие седаны сегмента «С» уже перемахнули за отметку в 4,6 м). Приблизительно такая же величина получается (чуть более 4,5 м), если взять за основу 16-дюймовый размер диска (и высота, кстати, почти в норме — 1,41 м). Делайте выводы. Но стоит оговориться: все эти расчеты слишком приблизительные, и точно сказать, останется ли новая модель в прежнем классе или переползет в следующий, пока нельзя.

ВАЗ 2180

Ну а что там внутри? Как известно, платформа Lada В — это почти полностью вазовская разработка, то есть отечественный продукт, что не может не радовать. По некоторым сведениям, в ее основе лежит «тележка» от почившего в бозе «проекта С». И здесь буква «С» говорит сама за себя. Но опять-таки реинкарнация произойдет не в чистом виде. К примеру, будут присутствовать элементы ходовой части нынешней «Приоры». Зато, предположительно, от «проекта С» новой модели достанется и разрабатывавшийся в его рамках двигатель объемом 1,8 л. А это уже аргумент в сторону повышения класса. В общем, поживем — увидим…

ВАЗ 2180

На схематическом изоб­ражении, скопированном с технологической карты, вдоль борта новой «Приоры» тянется незамысловатая горизонтальная подштамповка…

На схематическом изоб­ражении, скопированном с технологической карты, вдоль борта новой «Приоры» тянется незамысловатая горизонтальная подштамповка…

ВАЗ 2180

…но если приглядеться к шпионскому фото голого кузова ВАЗ-2180, то на дверях можно обнаружить «бумеранги» пресловутого «икс-рэя»

…но если приглядеться к шпионскому фото голого кузова ВАЗ-2180, то на дверях можно обнаружить «бумеранги» пресловутого «икс-рэя»

В лучах рентгена

Концепткар Lada X-Ray, продемонстрированный широкой публике в конце августа прошлого года на Московском автосалоне, буквально произвел фурор. Попадание с выбором нового лица для продукции Волжского автозавода оказалось строго в яблочко. Спасибо свежеприбывшему из-за рубежа на должность главного дизайнера Стиву Маттину! Обыгрывание буквы «Х» в облике фасада и боковин, впервые примеренное на концепте, решили продолжить и на серийных автомобилях. Но, сдается, Lada 2180 будет не первой моделью в производственной линейке, примерявшей новый фейс. По прог­рамме развития завода до 2020 года чуть раньше должен появиться хэтчбек BM-Hatch, построенный на франко-японской платформе В0. Предположительно, им станет перелицованный на манер «икс-рэя» Renault Sandero второго поколения.

Lada XRay Concept 2012

LADA BM-Hatch

Вердикт

Виктор Фомин, главный редактор:

Виктор Фомин

— А знаете, как хочется, чтобы с конвейера отечественного автозавода, да еще и с эмблемой российского бренда, наконец-то, сошел автомобиль, за который бы стоило голосовать собственным кошельком не только и не столько по причине его невысокой цены, но и благодаря отличному качеству сборки, хорошим ходовым свойствам и, что, пожалуй, наиболее важно, дизайну, не стыдному даже на фоне продукции самых именитых автопроизводителей! Может быть, детище АВТОВАЗа под индексом 2180 и станет той самой переломной вехой? Почему бы нет…

Облицовка зеркала заднего вида ВАЗ 2180 ЛАДА ВЕСТА для зеркала с повторителем поворота окрашенная — ВАЗ 2180 Веста

• Вес: 0,5 кг
• Размер: 31 х 25 х 19 см

Облицовка зеркала заднего вида ВАЗ 2180 ЛАДА ВЕСТА для зеркала с повторителем поворота окрашенная.

На заказ возможны другие цвета, неуказанные на сайте.

Как узнать номер цвета автомобиля ВАЗ: -Смотреть тут-

Цена указана за штуку (за одну облицовку).

• Автор: Александр Плисов | 13.04.2020 Получил пару накладок в цвет ангкор. Думал, что это заводские изделия, но оказалось, что это не так. Есть некоторые замечания по геометрии накладок и фиксаторов. Есть замечание по окраске — одна накладка гладкая на ощупь, а вторая шероховатая, что говорит о недостаточном слое лака. Ставлю 4 с минусом за эти недочёты. Из плюсов — эластичный пластик. Лапки фиксаторов гнутся, но не ломаются.

Карта сайта
Информация на ресурсе предназначена для детей старше шестнадцати лет

Новая Lada Priora 2180 проходит испытания в Тольятти / ВАЗ live / Вести Тольятти

Не стоит обольщаться, что Lada 2180 будет полностью вазовской разработкой. На АВТОВАЗе, наверное, знакомы с опытом зарубежных концернов, когда затраты на создание и производство новинки снижаются за счёт использования общих деталей. Наверное, часть запчастей может подкинуть Renault. А может, мы чересчур категоричны? Добьём финальным аккордом: в одном из последних выпусков журнала «За рулём» указывается, что на шинах стояла следующая маркировка «185/65R15», а колёсные диски «очень уж смахивают на логановские».

Ха-ха! Отличная попытка, АВТОВАЗ! Через окно можно увидеть часть приборной панели преемника Lada Priora, но это всё не то. Говорят, что в салоне пока царит хаос. Оно и понятно — пока не до салона.

Как сообщалось ранее, новая Lada Priora (по нашим сведениям, автомобиль будет именоваться «Приорой») может получить новый двигатель объёмом 1.8 литра, который можно будет сагрегатировать как с механической, так и с роботизированной коробкой передач. Мы публиковали информацию о вазовском турбированном двигателе объёмом 1.4 литра, который разрабатывается совместно с английской компанией Ricardo. Чисто теоретически он может найти своё место под капотом «Лада Бэ».

Первые фотографии со спойлером на крышке багажника Lada 2180. Гоняют, значит, «Ладу» по треку, раз о прижимной силе беспокоятся. В серийном исполнении спойлера, наверное, не будет. Если только в версии для WTCC (да-да, есть такие слухи).

Как известно, до 2017 года АВТОВАЗ выпустит 5 новых моделей, среди которых, безусловно, есть седан Lada 2180. Думаем, что семейство новой модели только им не ограничится — всё будет по аналогии с «Приорой». Если всё пойдёт хорошо, то первые серийные образцы новинки мы сможем увидеть в конце 2015 года.

tol.carobka.ru

ВАЗ 2180 ждем в 2016 году

Расставить приоритеты. Нынешняя «Приора» совсем недавно, можно сказать на днях, претерпела косметическое обновление, похоже, последнее в своей судьбе. Ведь в дверь буквально ломится преемник, который, кстати, совсем необязательно будет называться Priora… По первоначальному плану развития АВТОВАЗа автомобиль, построенный на платформе Lada В (не путать с В0), должен был появиться в 2015 году, но позднее график подкорректировали, и старт производства ВАЗ-2180 (именно под таким индексом в заводской документации проходит преемник «Приоры») перенесен на начало 2016-го.

Надо полагать, что и эта дата не окончательная. Хотя, судя по многочисленным фото в Интернете прототипов (причем уже в облегченном камуфляже), раскатывающих по разбитым дорогам Тольятти, работа над новинкой находится в довольно продвинутой стадии.

Наиболее интригующим моментом, пожалуй, является позиционирование второго поколения Lada Priora. Ведь не секрет, что текущее по своим характеристикам играет на том же поле (кроме цены), что и более молодой собрат – Granta. Близкие габариты, практически одинаковые моторы, схема привода. Кстати, в салоне «Приоры» даже потеснее будет…

Напрашивается вопрос: а какова цель вот такого нелогичного создания внутренней конкуренции? Неужто вазовцы всерьез считают, что наличием усиленной шумоизоляции или дополнительных дверных уплотнителей можно убедить покупателя, что одно авто стоит рангом выше другого? Сомнительно. Но в Тольятти не перестают напоминать, что автомобиль класса «С» – это следующая ступень, а ВАЗ-2180 – некий промежуточный вариант. Вопрос – какой?

Я решил провести небольшое аналитическое исследование.

Сначала в сети появилось схематическое изображение профильной проекции «восьмидесятая», снятое, похоже, с какой-то технологической карты. По нему я попытался вычислить габарит новинки. Если взять за основу тот факт, что на машине установлен пятнадцатидюймовый диск, то исходя из пропорции в длину авто получается чуть более 4,22 м (отталкиваться от четырнадцатидюймовой размерности не имеет смысла – габарит новинки менее четырех метров маловероятен).

С учетом погрешности измерений это соответствует длине нынешней «Приоры» (4350 мм). Но есть нюанс: если, опираясь на эту же пропорцию, попытаться вычислить высоту, то цифра получится более характерная для спорткара – 1,32 м.

Так что я решил зайти с другой стороны и составил пропорцию исходя из высоты текущей модели (1420 мм). При таком подходе длина Lada 2180 оказалась равной приблизительно 4,53 м, что уже соответствует современным представителям гольф-класса (правда, наиболее свежие седаны сегмента «С» уже перемахнули за отметку в 4,6 м). Приблизительно такая же величина получается (чуть более 4,5 м), если взять за основу шестнадцатидюймовый размер диска (и высота, кстати, почти в норме – 1,41 м). Делайте выводы. Но стоит оговориться: все эти расчеты слишком приблизительные, и точно сказать, останется ли новая модель в прежнем классе или переползет в следующий, пока нельзя.

Ну а что там внутри? Как известно, платформа Lada В – это почти полностью вазовская разработка, то есть отечественный продукт, что не может не радовать. По некоторым сведениям в ее основе лежит «тележка» от почившего в бозе «проекта С». И здесь буква «С» говорит сама за себя. Но опять-таки реинкарнация произойдет не в чистом виде. К примеру, будут присутствовать элементы ходовой части нынешней «Приоры». Зато предположительно от «проекта С» новой модели достанется и разрабатывавшийся в его рамках двигатель объемом 1,8 л. А это уже аргумент в сторону повышения класса. В общем, поживем – увидим…

На схематическом изображении, скопированном с технологической карты, вдоль борта новой «Приоры» тянется незамысловатая горизонтальная подштамповка. Но если приглядеться к шпионскому фото голого кузова ВАЗ-2180, то на дверях можно обнаружить «бумеранги» пресловутого «икс-рэя»

А знаете, как хочется, чтобы с конвейера отечественного автозавода, да еще и с эмблемой российского бренда, наконец-то сошел автомобиль, за который бы стоило голосовать собственным кошельком не только и не столько по причине его невысокой цены, но и благодаря отличному качеству сборки, хорошим ходовым свойствам и, что, пожалуй, наиболее важно, дизайну, не стыдному даже на фоне продукции самых именитых автопроизводителей! Может быть, детище АВТОВАЗа под индексом 2180 и станет той самой переломной вехой? Почему бы нет…

В лучах рентгена. Концепт-кар Lada X-Ray, продемонстрированный широкой публике в конце августа прошлого года на Московском автосалоне, буквально произвел фурор. Попадание с выбором нового лица для продукции Волжского автозавода оказалось строго в яблочко. Спасибо свежеприбывшему из-за рубежа на должность главного дизайнера Стиву Маттину! Обыгрывание буквы «X» в облике фасада и боковин, впервые примеренное на концепте, решили продолжить и на серийных автомобилях. Но, сдается, Lada 2180 будет не первой моделью в производственной линейке, примерявшей новый фейс. По программе развития завода до 2020 года чуть раньше должен появиться хэтчбек BM-hatch, построенный на франко-японской платформе ВО. Предположительно им станет перелицованный на манер «иксрэя» Renault Sandero второго поколения.

Конформационная гетерогенность РНК-полимеразы, наблюдаемая с помощью однопарной FRET-микроскопии

Abstract

Измерения кинетической, структурной и одномолекулярной транскрипции предполагают, что РНК-полимераза может принимать множество различных конформаций во время элонгации. Мы измерили геометрию ДНК и РНК в тройных элонгационных комплексах, используя однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции. Шесть различных синтетических комплексов удлинения транскрипции были сконструированы из ДНК, содержащей искусственный пузырек транскрипции, праймер РНК и ядерную РНК-полимеразу из Escherichia coli .Использовали два разных праймера РНК, 8-мерный и 5′-удлиненный 11-мерный. Флуоресцентные метки красителя прикрепляли в одном из трех положений на ДНК и на 5′-конце праймера РНК. Структурно восходящая ДНК проходит перпендикулярно предполагаемому выходному каналу РНК. При добавлении нуклеозид-трифосфат разделение гибридов ДНК / РНК происходит легко в 11-мерных комплексах, но не в 8-мерных комплексах. Было получено четкое доказательство того, что РНК-полимераза существует во множестве конформаций, среди которых она колеблется.

ВВЕДЕНИЕ

РНК-полимераза (РНКП) из Escherichia coli ( E. coli ) является ферментом, ответственным за синтез всей РНК в этом организме. Во время транскрипции РНК собирается в соответствии с последовательностью нуклеотидов на цепи ДНК-матрицы в определенных областях, распознаваемых РНКП. В этом процессе RNAP катализирует образование фосфодиэфирного мостика между 3′-концом формирующейся РНК и α -фосфатом входящего нуклеозидтрифосфата (NTP).RNAP перемещается по цепи ДНК, используя энергию, высвобождаемую при гидролизе NTP. Кроме того, RNAP отвечает за распознавание сайта начала транскрипции на ДНК (промоторе), а также за терминацию транскрипции. Следовательно, весь процесс синтеза РНК делится на три отдельных процесса: инициацию, удлинение и завершение.

Объемные кинетические измерения (1,2), определения структуры (3–7) и исследования удлинения отдельных молекул (8–10) предполагают, что RNAP существует во многих различных конформационных состояниях.В этой работе мы использовали флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) для изучения структурной неоднородности и динамики RNAP. FRET — это чувствительный оптический метод, который требует присутствия двух флуоресцентных красителей в непосредственной близости. Их называют донорными (D) и акцепторными (A) флуорофорами. При возбуждении донора энергия может передаваться акцептору безызлучательно с эффективностью, которая зависит от их пространственного разделения. Эффект FRET охватывает расстояния до ∼100 Å и чувствителен к изменениям расстояния между донорами и акцепторами (D-A) в масштабе 1-2 Å.Таким образом, этот метод хорошо подходит для изучения конформационных изменений внутри биомолекул, а также взаимодействий белок-белок и белок-нуклеиновая кислота. В литературе можно найти ряд отличных обзоров FRET (11–15). FRET также применялся для структурных исследований RNAP (16–21).

Метод FRET можно также использовать в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Однопарный FRET (spFRET) был впервые продемонстрирован Ha et al. (22) и с тех пор применяется к одно- и двухцепочечной ДНК, РНК и белкам (23–29).Исследования одиночных молекул имеют явные преимущества перед ансамблевыми экспериментами. Они позволяют наблюдать и исследовать различные субпопуляции внутри ансамбля. Более того, кинетическая информация может быть получена с помощью обрабатывающих ферментов, таких как RNAP. Кроме того, комплексы, которые неактивны, не помечены должным образом или демонстрируют другие типы аномального поведения, могут быть исключены из окончательного анализа.

В качестве первого шага в анализе динамики транскрипции RNAP мы использовали spFRET для исследования конформационной гетерогенности и гибкости комплекса элонгации транскрипции (TEC), включающего дуплекс ДНК, праймер РНК и RNAP, в котором ДНК и РНК были помечены парой красителей FRET.Благодаря этому подходу мы избежали трудностей, связанных со специфической маркировкой РНКП рядом с активным сайтом, и все еще были в состоянии исследовать структуру цепей ДНК и РНК внутри TEC. Эффективность FRET отдельных комплексов измеряли с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии в дальней зоне с двухцветным детектированием. По этим данным мы проанализировали структуру комплексов и изменения, сопровождающие удлинение. Кроме того, распределения в разделениях D-A были проанализированы на предмет статической и динамической неоднородности, включая структурные колебания, сопровождающие удлинение.После удлинения способность гибрида ДНК / РНК диссоциировать была исследована с использованием комплексов, полученных с 8-мерной РНК и 11-мерной РНК, что позволило понять конформационный переход в комплексе РНКП при длине РНК 9-10 нуклеотидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистка белка

Ядро RNAP было приготовлено из В-клеток E. coli в соответствии с Берджессом и Джендрисаком (30) с окончательной очисткой на смоле BioRex70 (BioRad Laboratories, Геркулес, Калифорния), обеспечивающей 100% удаление σ -субъединицы и> 95% чистого фермента ядра, что подтверждено с помощью SDS-гель-анализа.Более 90% молекул были активны в комплексообразовании с искусственной пузырьковой ДНК, устойчивой к гепарину.

ДНК с двойной меткой

ДНК из 171 пары оснований, которая содержала два внутренне прикрепленных флуорофора, разделенных 16 основаниями, была получена путем ферментативного лигирования синтетических фрагментов ДНК. Последовательность ДНК была взята на сайте промотора А1 бактериофага Т7 от положения -91 до +80. Согласно соглашению, +1 определяется как позиция, с которой начинается транскрипция; соседняя позиция выше по потоку обозначается как позиция -1.Флуоресцентные метки вводили в положения -4 и +13 на матричной цепи через амино-линкеры C6, присоединенные к положению C5 модифицированного нуклеотида тимина, и реагировали с n производными -гидроксисукцинимидилового эфира Cy3 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). или Cy5 (Amersham Biosciences). Фрагменты ДНК были лигированы отдельно в верхнюю и нижнюю цепи, используя короткие фрагменты противоположной цепи в качестве скобы. Полноразмерные цепи очищали с помощью ВЭЖХ, отжигали и отделяли от нелигированной ДНК с помощью ВЭЖХ.

Шаблон искусственного пузыря

Для создания комплексов искусственного пузыря были использованы следующие конструкции ДНК и РНК: Верхняя и нижняя цепи 40-мерной ДНК комплементарны, за исключением внутренней области из девяти оснований. Некомплементарная область не имеет пары оснований, вызывая искусственный пузырь в ДНК, подобный пузырьку транскрипции, образованному РНКП во время синтеза РНК. Нити ДНК были приобретены (IBA GmbH, Геттинген, Германия и MWG Biotech, Эберсберг, Германия) или синтезированы в Университете Ульма и очищены до гомогенности> 95% с помощью ионообменной ВЭЖХ на смоле monoQ (Amersham Bioscience) с использованием хроматографа MiLiChrom. (EcoNova, Новосибирск, Россия).Нити ДНК были модифицированы амино-линкером в одном из следующих мест: 1), 5′-конец неэлементной цепи (положение –18), углерод C5 тимин-модифицированного основания в положении 2), положение -2 на нестандартная прядь; и 3) в положении -12 матричной нити. Нити флуоресцентно метили путем их реакции с Cy3 NHS (Amersham Biosciences). Биотин был присоединен к немеченой нити на верхнем конце. Дуплекс ДНК получали смешиванием матричных и неэлементных цепей в молярном соотношении 1: 1, нагревания до 90 ° C с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры.Конечный дуплекс очищали с помощью ионообменной ВЭЖХ.

Использовали два разных праймера РНК: 8-мерный (5′-AUCGUGAG), который комплементарен цепи матрицы от положения -8 до -1, и 11-мерный (5′-AUUAUCGUGAG), который также комплементарен от положения От -8 до -1 и удлиняется тремя основаниями на 5′-конце, которые не комплементарны ни одной из цепей ДНК. Праймеры были предоставлены IBA GmbH, реагировали с карбоновой кислотой Alexa Fluor 647, сукцинимидиловым эфиром (Molecular Probes Europe, Лейден, Нидерланды) и очищались с помощью ВЭЖХ.

Образование искусственного пузырькового комплекса

ДНК-матрицу (100 пмоль) инкубировали с 150 пмоль ядра RNAP в 100 мкл л буфера BBh30 (20 мМ HEPES при pH 7,5, 6 мМ MgCl ₂ , 20 мМ NaCl и 5 мМ меркаптоэтанол) в течение 5 мин при 37 ° C. Добавляли праймер РНК (200 пмоль) и инкубировали еще 5 мин. Затем смесь наносили на колонку с гепарином-суперозой на 1 мл (Amersham Biosciences), которую промывали 3 мл буфера TDEG (50 мМ трис-HCl при pH 8, 1 мМ EDTA, 5 мМ меркаптоэтанол, 5% глицерин в / в. v) содержащий 50 мМ NaCl.ТЕС элюировали из колонки 2 мл буфера TDEG, содержащего 400 мМ NaCl. Свободное ядро ​​фермента элюировали из колонки с TDEG, содержащим 1 М NaCl. Фракцию ТЕС концентрировали и обессоливали с помощью четырех повторяющихся циклов центрифугирования-разбавления на установках Nanosep-100 (Pall Life Sciences, Анн-Арбор, Мичиган) и концентрировали до конечного объема 50 мкл л. Комплекс можно было хранить при + 4 ° C в течение нескольких дней без какой-либо значительной потери транскрипционной активности.

Влияние меток на TEC

На выход образования тройного комплекса не влияли метки ни на ДНК, ни на праймере РНК.Стабильность немеченых ТЕС и ТЕС, образованных мечеными ДНК и РНК, против гепарина тестировали путем инкубации ТЕС с гепарином и анализа их целостности с помощью неденатурирующего гель-электрофореза. Существенной разницы в стабильности меченых и немеченых комплексов не наблюдалось. Компетентность ТЕС в отношении элонгации проверяли путем инкубации нуклеотидов с ТЕС в течение заданного времени и анализа длины растущей цепи РНК с использованием денатурирующего гель-электрофореза. Флуоресцентные метки, использованные в этой работе, не оказали значительного влияния на долю транскрипционно компетентных ТЕС и кинетику элонгации.Напротив, флуоресцентные метки, помещенные на матрицу в положение -1 или +1, значительно снижали выход образования ТЕС и препятствовали транскрипции.

Подготовка образцов для измерений FRET

Проточная ячейка была сконструирована из кварцевого предметного стекла с двумя отверстиями и покровного стекла, скрепленных двусторонней липкой лентой. Перед сборкой в ​​ленте был вырезан канал, соединяющий два отверстия в кварцевой пластине. ТЕС прикрепляли к поверхности кварцевого предметного стекла с помощью связи биотин-стрептавидин-биотин.Поверхность держателя образца сначала насыщали биотинилированным БСА (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) путем инкубации с раствором 1 мг / мл (20 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,4) в течение 10 мин. Держатель образца промывали буфером, а затем раствором стрептавидина (300, мкг, г / мл в 20 мМ калий-фосфатном буфере) (Molecular Probes Europe). Еще через 10 мин его снова промыли и добавили образец (~ 20 пМ) в держатель. Непосредственно перед нанесением на поверхность образец разводили из исходного раствора в концентрации 100–500 нМ.Все измерения проводились с дегазированным буфером в присутствии поглотителей кислорода по рецепту Kim et al. (31). Буфер для экспериментов по удлинению представлял собой 10 мМ HEPES, 6 мМ MgCl ₂ , 50 мМ NaCl, 1 мМ меркаптоэтанол с pH 7,5.

Экспериментальная установка для измерения FRET одиночных молекул

Эксперименты с одиночными молекулами проводились на эпифлуоресцентном микроскопе (Axiovert 135 TV, Zeiss, Jena, Germany) с двухканальным конфокальным детектированием.Образец возбуждали аргон-криптоновым ионным лазером (модифицированная модель 164, Spectra-Physics, Маунтин-Вью, Калифорния), работающим на длине волны 514 нм. Лазерный свет подводился к микроскопу через одномодовое волокно (HPUC, OZ Optics, Carp, Канада), коллимировался и отражался через дихроичное зеркало (532/633 DCXR, AHF, Тюбинген, Германия) в объектив (C- Apochromat, 63 × W Korr, NA = 1,2, Zeiss), и сфокусировался на дифракционно-ограниченное пятно. Полная мощность лазера на образце была менее 5 мкм Вт, что соответствует плотности мощности 25 мкм Вт / мкм м ² .Сигнал флуоресценции собирался через тот же объектив, проходил через дихроичное зеркало, фокусировался на точечном отверстии (80 мкм м) для конфокальной геометрии и направлялся на два лавинных фотодиода (SPCM-AQR, EG&G Optoelectronics Canada, Vaudreuil, Canada ) через дихроичный светоделитель (650 DCXR, AHF) для обнаружения. Выходные данные лавинных фотодиодов регистрировались с помощью самодельной карты счета фотонов и программного обеспечения. Изображения были созданы путем сканирования образца в двух измерениях через наблюдательный объем с помощью пьезоэлемента (P-731.20, Physik Instrumente, Карлсруэ, Германия) с управлением по обратной связи.

Сбор и анализ данных

Эффективность FRET отдельных молекул рассчитывалась по формуле

(1)

, где α — поправочный коэффициент для эффективности обнаружения донорного канала относительно акцепторного канала, и I _D и I _A — интенсивности флуоресценции донорного и акцепторного каналов соответственно.Интенсивности вычисляли путем интегрирования детектированных фотонов в области 4 × 4 пикселей (560 × 560 нм ² ) в пятне флуоресценции в обоих каналах. Средние фоны зеленого и красного каналов были вычтены из соответствующих сигналов. Во время анализа изображения отдельных молекул визуально проверялись на наличие отклонений. Молекулы, которые обесцвечивались во время эксперимента, пространственно перекрывались с другими молекулами или находились в областях с неоднородным или высоким флуоресцентным фоном, были исключены из анализа. α -фактор определяли в экспериментах по отбеливанию spFRET для каждой пары красителей путем сравнения интенсивности обоих каналов до обесцвечивания акцептора с интенсивностью донора после отбеливания акцептора. Для нашей системы α было равно 1.0. Перекрестные помехи донорной флуоресценции в акцепторном канале удаляли путем умножения интенсивности донорного канала на экспериментально определенное соотношение перекрестных помех 5% и вычитания результата из интенсивности акцепторного канала перед расчетом эффективности FRET.

Расстояние D-A, R , было рассчитано с использованием

(2)

, где R ₀ — радиус Ферстера (то есть расстояние, на котором эффективность передачи энергии составляет 50%). Радиус Ферстера зависит от относительной ориентации диполя донора и акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления окружающей среды. Используя фактор ориентации 2/3 и измеренный квантовый выход Cy3, присоединенного внутри к двухцепочечной ДНК, мы рассчитали R ₀ 53 Å для пары Cy3-Cy5 FRET, используя показатель преломления 1 .33, в соответствии с Ishii et al. (28). R ₀ = 51 Å было получено для пары Cy3-Alexa647 FRET. В последнем случае мы использовали показатель преломления 1,4 (32), чтобы учесть тот факт, что пространство между донорной и акцепторной молекулами заполнено в основном белком, а не буфером.

Несколько областей образца сканировали три или шесть раз во время эксперимента. Свежий буфер промывали через держатель образца между последовательными сканированиями, чтобы избежать накопления глюконовой кислоты, образующейся в результате реакции глюкозы с кислородом в присутствии глюкозооксидазы.Любое смещение образца во время эксперимента было исправлено путем взаимной корреляции каждого последующего сканирования с предыдущим изображением. Сдвиг, если он есть, определялся по пику функции взаимной корреляции. Процедура анализа автоматически выбирает отдельные молекулы, требующие минимум 50 детектируемых фотонов от молекулы при каждом сканировании.

Влияние поверхности на ТЕС

Компетентность к удлинению ТЕС, связанного с поверхностью, была проверена путем измерения длины цепи РНК, образующейся после добавления NTP.Комплексы были привязаны к поверхности при более высоких концентрациях, чем те, которые используются для исследований одиночных молекул, а избыток комплексов смывается. После добавления NTP комплексы денатурировали на поверхности и извлеченную РНК анализировали с помощью денатурирующего гель-электрофореза. Было обнаружено, что более 95% комплексов являются транскрипционно компетентными, и не было заметной разницы между измерениями поверхностных комплексов и тех же комплексов, измеренных в растворе. Кроме того, изменения в разделении D-A при добавлении NTP были четко видны для комплексов R11 (см. Результаты и обсуждение) с использованием spFRET непосредственно на поверхности, что позволяет предположить, что на функциональность RNAP не влияет поверхность.В качестве дополнительного теста влияния поверхности на ТЭО мы также сравнили поверхности из биотинилированного полиэтиленгликоля и биотинилированного БСА (33). Для этих измерений ТЕС были сформированы с использованием холоферментной РНКП, ДНК, содержащей естественный промоторный сайт, и 11-мерного транскрипта РНК. ДНК и РНК были помечены аналогично искусственному пузырьковому комплексу T – 12 R8. Для обоих препаратов поверхности наблюдались широкие распределения, содержащие как высокую (> 70%), так и промежуточную (от 40% до 70%) эффективность FRET.Хотя небольшие различия в относительных популяциях компонентов с высоким и промежуточным уровнями показали некоторое влияние поверхности на белок, сходные распределения, полученные с двумя химически разными поверхностями, позволяют предположить, что на наши результаты не оказывают заметного влияния взаимодействия ТЕС с поверхностью. Это мнение подтверждается рядом исследований одиночных молекул биомолекул на функционализированных поверхностях, проведенных в нашей лаборатории (31,34–37).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Технико-экономическое обоснование использования ДНК с двойной меткой

FRET чувствителен к разделению донор-акцептор (DA) на 20–100 Å и изменениям в разделении DA на 1–2 Å, что делает его отличным инструментом для исследование структурной неоднородности биомолекул.Однако флуоресцентные маркеры часто прикрепляются с помощью длинных гибких линкеров, что создает некоторую неопределенность в структурной интерпретации разделения D-A. Кроме того, эффективность FRET также зависит от других факторов, включая относительную ориентацию диполей донорного и акцепторного перехода, квантовый выход донора и диэлектрическое окружение флуорофоров. Из ансамблевых измерений может быть получена единая эффективность FRET, в которой усредняется неоднородность в ансамбле из-за различных линкерных конформаций или диполярных ориентаций.Используя spFRET, мы можем не только определить среднюю эффективность FRET, но также измерить форму и ширину распределения эффективности FRET, что дает информацию о конформационной гетерогенности биомолекул. Однако при интерпретации происхождения любого наблюдаемого распределения требуется особая осторожность.

Чтобы изучить возможность использования spFRET для измерения конформационной гетерогенности, мы провели контрольные эксперименты на двухцепочечных (ds) молекулах ДНК. В отличие от более ранних измерений spFRET на ДНК (22,29,38,39), как донорные, так и акцепторные молекулы были прикреплены внутри, на расстоянии более 60 оснований от концов ДНК, что позволяет избежать осложнений, связанных с частичным плавлением ДНК на концах. .Разделение D-A составило 16 оснований, что соответствует ∼55 Å. Персистентная длина дцДНК составляет ∼500 Å (40). Следовательно, в масштабе 55 Å дцДНК можно рассматривать как жесткий стержень, что позволяет нам проверить влияние гибкости линкера и взаимодействий ДНК-краситель на ширину распределения эффективности FRET.

Гибкость донорных и акцепторных молекул оценивалась путем измерения анизотропии поляризации на ансамбле. Донор и акцептор показали достаточно высокую объемную анизотропию, r ₀ , равную 0.34 и 0,32 соответственно, что указывает на то, что ориентации дипольных моментов перехода обоих красителей довольно фиксированы на временной шкале времени жизни флуоресценции.

Для измерения одной молекулы фрагмент ДНК был прикреплен к поверхности посредством связи биотин-стрептавидин, при этом молекула биотина была связана с 5′-концом нефлуоресцентно меченой цепи ДНК. Схематическое изображение эксперимента показано на рис. Интенсивности донорной и акцепторной флуоресценции отдельных нитей ДНК определяли в отдельных каналах, когда образец сканировали в растровом режиме в конфокальном объеме детектирования (показаны как зеленых , желтых и красных точек в зависимости от относительной интенсивности два канала).Эффективность FRET и D-A-разделения 188 одиночных двухцепочечных молекул ДНК рассчитывались, как описано в разделе «Материалы и методы». Особым преимуществом одиночных молекул перед массовыми экспериментами является возможность выбора субпопуляций образца для включения в анализ. Следовательно, мы включили в анализ только те молекулы, которые имели как донорный флуорофор, так и флуоресцентно активную акцепторную молекулу. Гистограмма измеренных эффективностей FRET и разделения D-A показаны соответственно.

SpFRET исследование молекул ДНК, связанных с поверхностью. ( a ) Графическое изображение экспериментальной геометрии. ( b ) Флуоресцентное изображение отдельных молекул ДНК с двойной меткой, с низкой, средней и высокой эффективностью передачи энергии, показаны зеленым, желтым и красным соответственно. ( c ) Гистограммы эффективности FRET, измеренные в двух последовательных сканированиях. ( d ) Распределение донорно-акцепторных расстояний для ДНК с двойной меткой из двух последовательных сканирований.Расстояния между красителями рассчитывались с использованием R ₀ = 53 Å для пары красителей (Cy3, Cy5). ( e ) Гистограмма изменений разделения доноров и акцепторов между последовательными сканированиями. Линии представляют собой гауссовское соответствие фактического распределения (, сплошная линия, ) и смоделированное гауссово с шириной, как ожидалось для расширенного распределения дробового шума (, пунктирная линия ).

Мы характеризуем распределения, вычисляя средние значения и стандартные отклонения.Для распределения эффективности FRET в среднем составляет 0,36 ± 0,01, а стандартное отклонение составляет 0,10 ± 0,01. На и на всех следующих рисунках мы представляем результаты spFRET как распределения в видимом разделении D-A, а не в эффективности FRET, потому что распределение эффективности FRET происходит из-за изменений расстояния между донором и акцептором. Следовательно, форма распределения наиболее точно представлена ​​относительно видимого разделения D-A. Однако мы отмечаем здесь, что различная ориентация донора и акцептора также будет способствовать распределению кажущихся расстояний.

Распределение в разделениях D-A в диапазоне от 50 до 75 Å, со средним значением 58,7 ± 0,4 Å (статистическая точность) и стандартным отклонением 4,9 Å соответственно. Согласно молекулярной модели ДНК, расстояние между точками прикрепления составляет 57,1 Å. Трехмерная цилиндрическая модель ДНК (39,41) дает значение в диапазоне от 55,6 до 57,6 Å, в зависимости от расстояния от оси ДНК, выбранного для донора и акцептора. Следовательно, наш пик измеренного распределения D-A-разделений количественно согласуется с ожидаемым значением для линейного фрагмента B-ДНК.

Помимо среднего разделения DA, ширина распределения содержит информацию о неоднородности образца, которая может происходить из различных конформаций линкера, прикрепляющего краситель к ДНК, различной ориентации диполей перехода донора и акцептора и / или различные конформации ДНК. Распределение в разделениях D-A может быть статическим (неоднородным) или динамическим (однородным). В статическом или гетерогенном случае каждая молекула фиксируется в определенной конформации с четко определенным разделением D-A в течение временного интервала, исследуемого в эксперименте.Распределение возникает из-за того, что разные молекулы в ансамбле принимают различную конформацию. В динамическом или гомогенном случае каждая молекула колеблется среди всех возможных структур. Если колебания быстрые по сравнению с временной шкалой измерения, будет наблюдаться только среднее значение, а ширина распределения ограничена точностью измерения. Если динамика находится в масштабе времени измерения, распределение FRET будет широким, поскольку во время измерения различные молекулы находятся в разных структурах.Второе измерение за время, большее, чем время, необходимое для колебания молекул между различными структурами, покажет одинаковое общее распределение, но отдельные молекулы будут иметь D-A-разделение, очень отличающееся от такового в первом измерении. Следовательно, сравнивая распределение FRET, измеренное на одном и том же ансамбле отдельных комплексов в разное время, мы можем различать однородное и неоднородное расширение распределения на временной шкале эксперимента.

Мы измерили эффективность FRET идентичных молекул во второй раз после задержки в 10 мин. Распределения эффективности FRET и разделения D-A, показанные желтым цветом соответственно, очень похожи на первое измерение, показанное синим цветом. Кроме того, показана гистограмма изменения разделения D-A для отдельных молекул между первым и вторым сканированием. Стандартное отклонение распределения изменения разделения D-A составляет 2,5 Å, что значительно меньше ширины распределения разделения D-A (4.9 Å). Это различие указывает на то, что распределение разделений D-A имеет статический компонент в 10-минутном масштабе времени. Ширина распределения изменения разделения D-A значительно больше, чем ожидалось из статистики подсчета фотонов. Погрешность кажущегося разделения D-A для каждой молекулы может быть определена по количеству фотонов, измеренному в каждом канале. Более 96% молекул имеют погрешность фотонной статистики <1,2 Å (стандартное отклонение). Распределение Гаусса со стандартным отклонением 1.2 Å (и одно с 2,5 Å для сравнения) показано на. Очевидно, что ширина распределения не только определяется статистикой счета фотонов, но и содержит дополнительную составляющую. Этот дополнительный компонент может быть обусловлен конформационными флуктуациями красителей и линкеров на ДНК, но также может быть следствием триплетных переходов акцепторных или неодинаковых объемов детектирования. Здесь мы используем этот эксперимент просто в качестве контроля, чтобы показать, что ширина распределений FRET> 2,5 Å указывает на значительную неоднородность образца.Количественная интерпретация FRET-распределений ДНК с двойной меткой не входит в задачи данной работы.

Искусственные пузырьковые комплексы

Анализ трехмерных структур тройных комплексов ДНК, РНК и РНКП был целью многих исследований (5,6,18,21,42,43). Однако общего согласия по однозначной модели пока не достигнуто. Кроме того, желательна информация о функциональной динамике, но ее нелегко получить с помощью рентгеновской кристаллографии.Модельная структура TEC из Thermus aquaticus (любезно предоставлена ​​Сетом Дарстом), собранная из рентгеновских данных белка и дополненная результатами химического перекрестного сшивания и мутационного анализа для частей положений ДНК и РНК, дает предположение о том, как ДНК (цепочка-матрица в оранжевом и цепь без шаблона в коричневом ) и РНК (в синем ) могут быть пропущены через RNAP в TEC.

( a ) Структурная модель E.комплекс удлинения транскрипции coli (любезно предоставлен С. Дарстом, Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк). Цепь-матрица ДНК показана оранжевым цветом, цепь, не являющаяся шаблоном, — коричневым, а РНК — темно-синим. Нуклеотиды, к которым были присоединены донорная и акцепторная метки, показаны зеленым и красным соответственно. Белковая составляющая изображена затенением. Ион Mg ²⁺ в активном центре белка представлен пурпурной сферой. Пунктирная стрелка указывает путь поступающих нуклеотидных субстратов к активному центру.( b ) Графическая визуализация расположения донора с точностью до круга вокруг выходного канала РНК, рассчитанная из расстояний между донором и акцептором R8 (d _R8 ) и R11 (d _R11 ) комплексы и разделение РНК R8 и R11 (d _R8-R11 ).

В наших экспериментах с spFRET мы исследовали структуру и динамику TECs, используя в общей сложности шесть различных синтетических транскрипционных комплексов (три конструкции ДНК × две РНК).Комплекс содержал ДНК с внутренним искусственным пузырем из девяти несовпадающих оснований и праймер РНК, как описано в разделе «Материалы и методы». Использовали два разных праймера РНК: 8-мерный (R8), который комплементарен первым восьми основаниям области искусственного пузырька матричной цепи, и 11-мерный (R11), содержащий последовательность 8-мерного праймера. плюс некомплементарное восходящее (или 5′-конечное) расширение AUU. Фон Хиппель с соавторами (44–46) ранее показали, что комплексы искусственных пузырей являются транскрипционно компетентными.Искусственные пузырьковые ТЕС обладают такой же стабильностью и функциональными свойствами, что и ТЕС, сформированные с использованием естественной, полностью двухцепочечной (свободной от несоответствий) ДНК, содержащей промоторный сайт. Однако искусственные пузырьковые ТЕС не удлиняют эффективно растущую РНК до сайта терминации или до конца цепи ДНК.

Праймеры РНК метили акцептором FRET (Alexa 647, Molecular Probes) на 5′-конце. ДНК метили донором (Cy3, Amersham Bioscience) на нетемплатной цепи в положении -18 (NT-18) или -2 (NT-2), или на матричной цепи в положении -12 (T-12).Нуклеотиды, к которым линкер донора был присоединен к ДНК, показаны зеленым цветом, а положения 5′-концов РНК, к которым была присоединена молекула акцептора, показаны красным. Как обсуждается в разделе «Материалы и методы», мечение не влияет на стабильность и свойства удлинения флуоресцентно меченных комплексов.

Эффективность FRET отдельных ТИК была измерена для всех шести конструкций, описанных выше. Измерения повторялись в общей сложности шесть раз на одних и тех же молекулах.Три сканирования были сделаны перед инкубацией образца в течение 2 минут с 50 мкМ M АТФ, GTP и CTP, а затем были сделаны три сканирования. Гистограммы разделения D-A из первых трех сканирований показаны на. Как и в случае ДНК с двойной меткой, мы включили в анализ только комплексы, содержащие как донорную, так и акцепторную молекулы.

Распределение донорно-акцепторных расстояний на ТИК по измерениям spFRET. Молекула акцептора всегда была присоединена к 5′-концу РНК.Донор располагался на цепи ДНК в одном из следующих положений: ( a ) NT-18, ( b ) T-12, ( c ) NT-2. Комплексы собирали с использованием праймеров R8 ( темный оттенок ) и R11 ( светлый оттенок ).

Средние значения и стандартные отклонения распределений расстояний D-A для различных комплексов приведены в. Стандартные отклонения распределений значительно превышают разрешающую способность нашего прибора 2,5 Å, определенную по измерениям на ДНК с двойной меткой, что указывает на распределение D-A-разделения комплексов TEC.На основании измерений мы также рассчитали изменение разделения D-A, которое претерпел каждый комплекс между сканированиями (). Воспроизводимость измерений с использованием независимых пробоподготовок была лучше 5 Å. Анизотропия измерялась ансамблевыми измерениями как для донорных, так и для акцепторных молекул всех комплексов; они находились в диапазоне 0,30–0,39.

ТАБЛИЦА 1

Средние и стандартные отклонения (SD) распределений D-A и их временные изменения для шести измеренных комплексов, определенных как до, так и после добавления NTP

Для комплексов NT – 18 и NT – 2 распределения при разделении DA имеют один пик и симметричны. Для комплекса T – 12 R11 можно выделить две конформации. Напротив, три различных структурных конформации наблюдаются для комплекса T-12 R8 из распределения D-A-разделений в, с пиками, имеющими место около 30, 55 и 80 Å.Однако, поскольку пик при 80 Å не наблюдался в других пяти комплексах, он может не отражать функциональные ТЕС и поэтому не будет обсуждаться далее.

Структурное соответствие ТЕС

Данные FRET позволяют нам извлекать информацию о трехмерной структуре ТЕС. Предполагая, что 5′-конец 11-мерного праймера имитирует цепь протяженной одноцепочечной РНК внутри выходного канала РНК, мы можем определить местоположение донора с точностью до круга вокруг оси выходного канала РНК () .Если предположить, что модель достаточно аппроксимирует структуру 5′-конца РНК, расстояние между позициями метки комплексов R8 и R11 составляет 18,7 Å. Радиус круга ( ρ ) и расстояние между 5′-концом РНК R8 и плоскостью круга ( z ) были рассчитаны для трех разных ДНК-меток и включены в. Для комплексов NT – 18 и T – 12 угол между акцепторами R11 и R8 и акцептором и донорами R8, θ , составляет ∼90 °.Доноры располагаются в плоскости, перпендикулярной выходному каналу РНК, которая находится в пределах ± 4 Å от акцептора R8. Поскольку R8 полностью комплементарен матричной цепи, мы можем сделать вывод, что восходящая ДНК проходит перпендикулярно предполагаемому выходному каналу РНК. Напротив, плоскость, содержащая донор в комплексе NT-2, находится на ~ 13,1 Å выше акцептора R8.

ТАБЛИЦА 2

Сравнение измеренных разделений DA со структурной моделью с параметрами z , ρ и θ , как показано в

Точность измерений при разделении DA можно проверить путем сравнения измеренные значения с рассчитанными расстояниями между точками крепления линкеров структурной модели ().Для комплекса НТ – 18 согласие хорошее. Однако есть существенные различия для двух других комплексов (T-12 и NT-2). Фактически, разделение D-A для комплекса T-12 R8 размером 34,8 Å (или 31,1 Å только для первого пика) невозможно, если ДНК и РНК все еще гибридизуются в положении -8, а красители локализованы вокруг точек их присоединения. Положение Т-12 подставки-матрицы отделено от 5′-конца РНК четырьмя основаниями и, таким образом, должно иметь разделение ∼20 Å вместо 34.8 Å. Это несоответствие между дистанцией, измеренной с помощью FRET, и моделью комплекса Т-12 можно объяснить, отметив ключевое различие между комплексом NT-18, с одной стороны, и комплексами Т-12 и NT-2, с другой: Донорная метка является внешней по отношению к РНКП в комплексе NT-18 и внутренней по отношению к белку в последних двух комплексах. В канале ДНК конформационное пространство сильно ограничено. Для ДНК с внутренней меткой линкер состоит из 18 связей углерод-углерод и углерод-азот между основанием тимина и ароматической частью красителя Cy3.Как мы продемонстрировали в наших контрольных экспериментах на ДНК с двойной меткой, среднее разделение DA, определяемое по эффективности FRET, точно воспроизводит расстояние между точками прикрепления на ДНК, даже несмотря на то, что красители были прикреплены к ДНК довольно долго. , гибкие линкеры. Если линкеры способны симметрично колебаться в точке их присоединения, ожидается, что они увеличат ширину распределения, но не изменят среднее расстояние. Однако, если красители прикреплены к местам внутри TEC, где есть стерические препятствия и энергетические затраты на захоронение заряженного хромофора, это предположение может больше не быть верным.Длинные гибкие линкеры позволяют красителям прилипать к заряженным фрагментам на поверхности белка, даже если точка присоединения находится внутри TEC. Для согласованности мы усреднили две популяции с самым коротким разделением D-A для комплекса T – 12 R8 (). Выводы, сделанные в этой работе, остаются неизменными, если рассматривать только конформацию с кратчайшим расстоянием D-A.

По-прежнему существует расхождение между структурной моделью и результатами измерений для комплексов NT-2, которое нельзя объяснить только линкером.В модели положение -2 нити, не являющейся шаблоном, находится непосредственно над выходным каналом РНК. Это видно из того факта, что в модели изменение расстояния между донором в позиции NT-2 и акцептором на 5′-конце цепей РНК R8 и R11 (19 Å,) по существу одинаково. как расстояние между 5′-концом нитей R8 и R11 (18,7 Å). Для наших измерений донор находится на расстоянии 40 Å от оси выходного канала РНК. Как было видно с комплексами Т-12, внутреннее окружение белка смещает флуорофор на значительное расстояние от точки присоединения.Полностью удлиненный линкер может покрывать только ∼20 Å, указывая на то, что структурное расположение одноцепочечной части нетемплатной цепи в модели не описывает фактическую структуру TEC.

Точность определения расстояний с помощью FRET зависит от точности, с которой известно расстояние Ферстера, R ₀ . Неопределенности в R ₀ возникают из-за определения фактора ориентации, показателя преломления и изменений квантового выхода донора.Значения R ₀ , используемые в этом исследовании, предполагают коэффициент ориентации 2/3, который действителен только для гибких или случайно ориентированных диполей. Исследования анизотропии ПЭС показывают объемную анизотропию в диапазоне 0,30–0,39 как для донора, так и для акцептора. Эти большие значения означают, что свобода вращения красителей сильно ограничена, что может поставить под сомнение предположение о 2/3 для фактора ориентации. Однако высокая эффективность FRET комплексов T-12 R8 и R11 и промежуточная эффективность FRET других комплексов позволяют предположить, что фактор ориентации не является крайним.Мы оценили неопределенность в κ ² (используя уравнение 36 в (11)), предполагая, что стационарная анизотропия возникает из-за вращения флуорофоров, которое намного быстрее, чем вращение белка. По этим оценкам, экстремальные значения κ ² для наших комплексов находятся между 0,47 и 1,47. Абсолютные погрешности разделения D-A из-за κ ² приведены в. На точность измерений FRET также влияет показатель преломления.В нашей системе акцептор, а для большинства конструкций ТЕС также доноры скрыты внутри белка, где показатель преломления n отличается от показателя преломления растворителя. Как обсуждалось Parkhurst et al. Согласно (47), эффективный показатель преломления, определяющий связь между диполями перехода донора и акцептора, является нетривиальной проблемой, поскольку окружение красителя неоднородно. Как правило, для красителя в белке n может быть оценено как ∼1,4, значение между значениями в буфере (1.33) и белок (1,5) (32). Поскольку n входит в выражение для расстояния Ферстера в степени 2/3, максимальная ошибка точности разделения D-A составляет 4% при использовании показателя преломления 1,4. Расстояние Ферстера также зависит от времени жизни донора (хотя скорость передачи энергии зависит только от собственного времени жизни флуорофора). Часто наблюдается изменение квантового выхода флуоресцентных меток в биологических комплексах из-за взаимодействия красителя с белками или нуклеиновыми кислотами.Этот эффект также необходимо тщательно учитывать, чтобы избежать дополнительных ошибок при определении разделения D-A.

Конформационная неоднородность TEC

Для более детального рассмотрения конформационной неоднородности комплексов RNAP мы сравнили ширину полного распределения при разделении DA с шириной изменения разделения DA между последовательными сканированиями, по аналогии с тем, что было сделано для контрольных измерений на ДНК с двойной меткой. Одни и те же молекулы сканировались трижды с интервалом ∼10 мин.Результаты включены в. Для комплекса T – 12 R8 ширину распределения определяли с учетом и без включения второго и третьего пиков. Для комплексов NT-18 R8 и R11, T-12 R8 и R11 и NT-2 R11 стандартное отклонение изменения расстояния D-A между сканированиями меньше ширины всего распределения. Однако распределение изменений расстояния D-A слишком широкое, чтобы его можно было приписать экспериментальной неопределенности (как было определено из контрольных измерений на ДНК с двойной меткой), что указывает на то, что распределение в разделениях D-A содержит как гомогенные, так и гетерогенные компоненты.С комплексом NT-2 R8 и, в меньшей степени, с комплексом NT-2 R11 (при добавлении NTP) изменение разделения D-A имеет такую ​​же ширину, что и распределение разделений D-A. С этим комплексом распределение является однородным, что позволяет предположить, что структура неэлементной цепи не сильно зависит от различных конформаций TEC.

Однородное и неоднородное расширение распределения разделений D-A может быть продемонстрировано графически путем сравнения ширины полного распределения с шириной выбранной субпопуляции, как показано на.(R8) и c (R11) показывают гистограмму разделения D-A ( темное затенение ) для первого сканирования комплексов NT-18. Молекулы с начальным разделением D-A от 40 до 45 Å отмечены светлой штриховкой. Гистограмма DA-разделения двух последующих сканирований показана на (R8) и d (R11), темным оттенком для всех молекул и светлым оттенком для субпопуляции, выбранной из сканирования 1. Молекулы с начальным DA-разделением между 40-45 Å остаются на нижней стороне распределения на шкале времени нашего измерения (10 мин между сканированиями).В чисто гомогенно расширенном распределении D-A-разделений выбранная субпопуляция восстановит полную ширину всего распределения, если временной интервал между последовательными сканированиями больше, чем временной масштаб колебаний от одной конформации к другой. Субпопуляции с неоднородно расширенным распределением сохранят узкую ширину при последующих сканированиях. Из неоднородного расширения распределения разделений D-A мы делаем вывод, что существуют различные общие структуры TEC, которые стабильны в 10-минутном масштабе времени.

Конформационная неоднородность ТИК НТ – 18. Распределения донорно-акцепторных расстояний построены для комплексов, собранных с праймерами R8 ( a , b ) и R11 ( c , d ). Гистограммы показаны для: ( a ) Полного распределения ( темных оттенков, ) и доли молекул с донорно-акцепторным разделением между 40 и 45 Å ( светлых оттенков ), измеренных при первом сканировании. ( b ) Полное распределение ( темных оттенков, ) и доля молекул с начальным донорно-акцепторным разделением между 40 и 45 Å ( светлых оттенков ), измеренные во втором и третьем сканированиях.( c ) Полное распределение ( темных оттенков, ) и доля молекул с донорно-акцепторным разделением между 40 и 45 Å ( светлых оттенков ), измеренные при первом сканировании. ( d ) Полное распределение ( темных оттенков, ) и доля молекул с донорно-акцепторным разделением между 40 и 45 Å ( светлых оттенков ), измеренные во втором и третьем сканированиях.

Равномерное расширение распределения в разделениях D-A демонстрирует гибкость TEC.Ширина однородного уширения находится в диапазоне 5,0–5,5 Å, за исключением комплекса T – 12 R8, который показывает наибольшую степень неоднородного уширения и, по-видимому, сильно ограничен. Все позиции для мечения обладают сходной гибкостью, даже несмотря на то, что комплексы NT-2 были помечены на одноцепочечной части нетемплатной цепи. Следовательно, из-за однородного уширения TEC существует в подмножестве различных структурных конформаций, среди которых он непрерывно колеблется в физиологических условиях.

Разделение гибридов ДНК / РНК.

показывает результаты экспериментов spFRET в виде гистограмм разделения D-A шести конструкций TEC до ( темных оттенков, ) и после добавления NTP ( светлых оттенков, ). Гистограммы комплексов R8 () аналогичны до и после добавления NTP, с небольшими изменениями в разделении D-A, независимо от положения флуоресцентной метки. Напротив, распределения явно сдвигаются при добавлении NTP к комплексам R11 ().Эксперименты с объемным раствором также выявили более значительные изменения эффективности FRET при добавлении NTP для комплексов R11 по сравнению с R8. Мы проверили функциональность наших комплексов искусственных пузырьков, растягивая образцы в растворе и анализируя продукт РНК с помощью гель-электрофореза. РНК R8 и R11 может быть удлинена тремя основаниями (до положения +3) с субстратами АТФ и GTP и до положения + 5 / + 6 с добавлением нуклеотидов АТФ, GTP и CTP. Кроме того, мы проверили работоспособность ТИК, привязанных к поверхности.Следовательно, только комплексы R11 демонстрируют четкое изменение разделения D-A при добавлении NTP, хотя комплексы R8 и R11 претерпевают удлинение.

Донорно-акцепторные расстояния различных комплексов до ( темных оттенков, ) и после ( светлых оттенков, ) добавления NTP. Гистограммы показаны для комплексов ( a ) NT – 18 R8, ( b ) T – 12 R8, ( c ) NT – 2 R8, ( d ) NT – 18 R11, ( e ) Т – 12 R11 и ( f ) NT – 2 R11.

Структурный переход наблюдается как в бактериальных, так и в эукариотических РНКП, когда длина транскрипта достигает 10 нуклеотидов (48–50). Возникающая РНК должна отделяться от гибрида ДНК / РНК и вводиться в выходной канал РНКП. Наблюдение за тем, что комплексы R8 являются транскрипционно активными и все еще не показывают изменений в разделении D-A, означает, что 5′-конец РНК не отделяется от комплементарной цепи ДНК при добавлении NTP. Разница между нашими комплексами и нативными комплексами заключается в том, что комплементарная цепь ДНК конкурирует за повторное связывание с цепью матричной ДНК.Следовательно, у РНК нет стимула отделяться от гибрида ДНК-РНК. Фон Хиппель и его сотрудники также сообщили, что правильное смещение РНК не всегда наблюдалось для комплексов искусственных пузырей (45,46). Однако они добились правильного замещения, добавив 1000-кратный избыток праймера РНК. Избыточный праймер конкурирует за неспаренные основания ДНК матричной цепи, помогая возникающей цепи РНК отделяться от ДНК и выходить через канал РНК.

В отличие от комплексов R8, комплексы R11 с РНК-праймером, удлиненным выше трех некомплементарных оснований, показали легкое разделение ДНК и РНК при удлинении.Заметные изменения в D-A-разделении комплексов при добавлении NTP предполагают, что РНК обычно замещается 11-мерным праймером РНК. РНК уже введена в выходной канал, и комплементарная ДНК не требуется для продолжения диссоциации гибрида ДНК / РНК. Мы также провели эксперименты с использованием искусственного пузыря из пяти пар оснований и 8-мерного праймера РНК (данные не показаны). Здесь также наблюдались значительные изменения в разделении D-A при добавлении NTP как в массовых анализах, так и в экспериментах с одной молекулой, что позволяет предположить, что комплементарная ДНК играет роль в начальном разделении гибрида ДНК / РНК.Эти результаты согласуются с измерениями, выполненными Уилсоном и его сотрудниками с использованием искусственного пузыря из 12 пар оснований (51). Там замещение гибрида РНК-ДНК было более эффективным с 20-мерным праймером РНК, удлиненным на восемь нуклеотидов выше, чем с 12-мерным праймером РНК. Расширенный праймер предположительно расположен в канале выхода РНК, и после того, как разделение ДНК / РНК началось, правильное перемещение РНК происходит без проблем.

Конформационная гетерогенность ТЕС при удлинении

Мы также исследовали конформационную гетерогенность ТЕС РНКП при удлинении.показывает гистограммы разделения D-A NT-18 R11. Распределение разделения D-A до удлинения показано на. После элонгации с помощью АТФ, ГТФ и ЦТФ были выполнены еще три сканирования с интервалами ~ 10 мин. Распределение сканирования 1 после удлинения показано темным затенением в, среднее значение сканирований 2 и 3 дюйма и среднее значение всех трех сканирований в. Светлой штриховкой выделены те молекулы, которые показали разделение D-A 45–50 Å при первом сканировании после добавления NTP. В ширина D-A-распределения выделенных молекул значительно уже (стандартное отклонение 4.9 Å), чем ширина всего распределения (стандартное отклонение 6,1 Å). Стандартные отклонения соответствующих изменений разделения D-A составляют 4,9 и 5,5 Å для выделенных молекул и полного распределения соответственно. Обе ширины меньше, чем 6,1 Å от всего распределения в разделениях D-A, что указывает на то, что конформационная гетерогенность все еще присутствует в молекулах, которые были удлинены с помощью NTP. Сравнение ширины полного распределения со стандартным отклонением изменения разделения D-A, приведенное в, показывает, что конформационная гетерогенность сохраняется во всех удлиненных комплексах (хотя в меньшей степени в NT-2) в течение более длительного времени, чем эксперимент.

Конформационная неоднородность удлиненных ТЕС NT – 18 R11 ( a , b ) и взаимное преобразование конформаций во время удлинения ( c ). ( a ) Полное распределение ( темных оттенков, ) и доля молекул с донорно-акцепторным разделением между 45 и 50 Å ( светлых оттенков ), измеренные при первом сканировании после добавления NTP. ( b ) Полное распределение ( темная заливка, ) и доля молекул, отмеченных светлой штриховкой на панели и (при светлой заливке снова ), измеренные во втором и третьем сканированиях после добавления NTP.( c ) Полное распределение ( темная штриховка ) перекрывается с долей молекул с донорно-акцепторным расстоянием от 40 до 45 Å до удлинения (отмечено светлой штриховкой дюймов), измеренной во всех трех последовательных сканированиях после добавления НПТ.

На рисунке выделены молекулы, у которых начальное разделение D-A составляло 40–45 Å перед добавлением NTP. Ширина распределения выделенных молекул аналогична ширине полного распределения.Это верно как для комплексов NT-18 R11, так и для T-12 R11, которые демонстрируют значительный сдвиг в разделении D-A при добавлении NTP. Из этого наблюдения мы заключаем, что общая степень конформационной гетерогенности, измеренная здесь с помощью spFRET, полностью развивается при удлинении.

Чтобы контролировать динамику удлинения с помощью пары FRET на ДНК и РНК, требуется отделение растущей РНК от цепи ДНК-матрицы. Как мы показали выше, это может быть достигнуто путем удлинения праймера РНК выше по течению.В наших экспериментах доля комплексов, которые удлинялись за пределы искусственного пузыря до конца цепи матричной ДНК, составляла <2%, что близко к 4%, наблюдаемым фон Хиппелем (46). Мы не обнаружили никакой разницы в доле комплексов, которые могли транскрибироваться через искусственный пузырь для конструкций R8 и R11. Для многоэтапных исследований транскрипции spFRET может быть полезен TEC с природным промоторным сайтом на двухцепочечной ДНК в сочетании со схемой мечения ДНК и РНК, используемой здесь.

Принято считать, что комплекс удлинения RNAP существует во многих различных конформационных состояниях (1). Гибкость RNAP была сделана на основании нескольких структурных исследований. Сравнение рентгеновских структур дрожжевой РНКП II из разных кристаллических форм позволяет предположить подвижность в разных областях белка (3). Рентгеноструктурные измерения холофермента Thermus aquaticus RNAP отдельно и связанного с ДНК вилочного соединения показывают структурную изменчивость зажимного домена и β -лепестка (5,6).Van Heel и др. Сравнили структуры ядра и холофермента из E. coli с помощью криоэлектронной микроскопии (7) и идентифицировали большие конформационные перестройки, особенно в β ′ -субъединице. Чтобы наложить две молекулы РНКП из Thermus aquaticus и E. coli , которые имеют высокую степень гомологии последовательностей, требуется конформационное изменение почти на 25 Å при открытии канала ДНК / РНК (4). Это говорит о значительной конформационной свободе именно в области TEC, где расположены наши флуоресцентные маркеры.Используя spFRET, мы смогли измерить распределения в структурных конформациях TEC и наблюдать гибкость комплексов, поскольку они колеблются между этими конформациями.

Наблюдаемая конформационная гетерогенность может возникать из-за разных конформаций RNAP, которые кинетически конкурируют в идентичных положениях матрицы, как было подробно обсуждено Greive и von Hippel (52). Большинство молекул находится в состоянии, активном к удлинению, но меньшая часть может находиться в состоянии перед перемещением, состоянии паузы или состоянии остановки.Конформации приостановленного и заблокированного состояний могут быть изучены с использованием одномолекулярного FRET с матрицами ДНК, имеющими последовательности, которые, как известно, усиливают задержку или обратное отслеживание.

Система откачивающей помпы типа RND MexAB-OprM синегнойной палочки отбирает бактериальные языки, 3-оксо-ацил-гомосериновые лактоны для межклеточной коммуникации | BMC Microbiology

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

больше глубины | FRET | Karlrecords

Меня попросили написать статью для темного лорда МИККА ХАРРИСА.

С чего начать? Особенно для тех, у кого десятилетия релизов различных сольных проектов, коллабораций и псевдонимов, будь то отрывные биты в оригинальном NAPALM DEATH до сокрушительной техно-брутальности, как MONRELLA, или дикие драм-н-бэйс как QUOIT.Затем, конечно, есть могучий СКОРН и его многочисленные коллаборации с другими знаменитостями, такими как ДЖОН ЦОРН и БИЛЛ ЛАСВЕЛЛ (в PAINKILLER).

Вместо того, чтобы быть привязанным к жанрам или сценам, МИК ХАРРИС является одним из тех продюсеров, которые создают свой собственный уникальный звуковой мир, в котором обретают форму различные треки, стили и темпы, но в котором все звучит безошибочно характерно для музыки. создатель. Излишне говорить, что его работа повлияла на множество продюсеров, таких как SURGEON, REGIS, ONTAL, VATICAN SHADOW / PRURIENT, FAUSTEN, SHAPEDNOISE и др., И почти на всех в мире мощно мрачной, абразивной музыки, о которой вы можете упомянуть.И все же по прошествии всего этого времени впечатляет то, что ХАРРИС все еще стоит намного выше своих преемников и никогда не был превзойден в его собственной игре производства / исполнения.

После перерыва в несколько лет он вернулся с новым альбомом под вывеской FRET.

Работая в более быстром темпе, чем его материал SCORN, проект FRET впервые появился много лет назад на лейбле DOWNWARDS, прочно укоренив его в темном, индустриальном и техноидном мире, а совсем недавно появился на Tresor (микс Kern от OBJEKT), поддерживая характерная колоссальная басовая тяжесть и фактурная глубина.

А теперь полный альбом на KARLRECORDS, Берлин.

Поклонники HARRIS будут рады узнать, что, несмотря на темп 130 ударов в минуту, новейший FRET по-прежнему решительно избегает любых прямых басовых барабанов; каждый трек кренится, спотыкается, шатается и устремляется вперед с ударами в красиво нарушенной асимметрии.

У нас есть 10 треков сокрушительных ударных эсминцев, каждый из которых представляет собой бурю точного хаоса, с колоссальными низкими частотами, которые при определенных обстоятельствах вызовут ажиотаж.Классический звук HARRIS присутствует; жгучие волны искажения обратной связи, замысловатые, взаимосвязанные ритмы и холодная атмосфера скотобойни, особенно трек 6 «Застрял в треке в Salford Priors», который звучит так, будто вас постоянно подвешивают в воздухе от множества взрывов повсюду, каждый барабан бросает вас в воздухе, следующий сработает, прежде чем вы полностью упадете на землю.

Ленивые, вероятно, смешали бы это с термином «техно», но дисциплинированная жестокость, взрывной бас наземных мин и взаимосвязанные шрапнельные ритмы явно являются фирменным стилем Харриса, находящимся где-то между SCORN и QUOIT.

На поверхности треки кажутся обманчиво хаотичными, но каждый из них тщательно и мастерски скомпонован с большим вниманием к наслоениям и деталям. Поклонники MICK HARRIS радуются, темный лорд по-прежнему остается на вершине своей игры.

(Derek Szeto / Fausten / Combat Recordings)

METALS-Никель приближается к семилетнему максимуму из-за проблем с предложением на рынке

(Обновления с официальными ценами)

ЛОНДОН, 17 сентября (Reuters) — Цены на никель поднялись до семи процентов. годовые максимумы в пятницу, поскольку опасения по поводу предложения возобновились после того, как официальный представитель правительства Индонезии заявил, что страна рассматривает вопрос об уплате налогов на экспорт ингредиентов из нержавеющей стали.

Трейдеры заявили о фиксации прибыли после открытия Нью-Йорка, которое оказало давление на никель на Лондонской бирже металлов (LME), который упал на 0,2% до 19 360 долларов за тонну в 16:00 по Гринвичу. Цены на металл, используемый в аккумуляторных батареях электромобилей, на прошлой неделе достигли 20 705 долларов за тонну, что является самым высоким показателем с мая 2014 года.

«Запасы низкие, спрос выше, чем ожидалось, а поставки не поддерживаются. Идея введения Индонезией экспортных пошлин лишь усугубляет ситуацию », — сказал один торговец никелем.

ИНДОНЕЗИЯ: Министр инвестиций Бахлил Лахадалия сказал, что Индонезия изучает возможность взимания экспортной пошлины на никелевую продукцию с содержанием никеля менее 70%, чтобы стимулировать расширение внутренней перерабатывающей промышленности страны.

ЗАПАСЫ: Запасы никеля на складах MNISTX-TOTAL, зарегистрированных на LME, упали на 35% с апреля до 171 714 тонн.

Аннулированные варранты — металл, предназначенный для поставки — на 35% и одна компания, владеющая большим количеством варрантов, также усиливают озабоченность по поводу ограниченного рынка LME.

Это привело к увеличению премии за наличный металл по трехмесячному контракту CMNI0-3 до 32 долларов за тонну по сравнению с 15 долларами на момент закрытия торгов в четверг.

АЛЮМИНИЙ: Цены на металл, используемый в транспортной и упаковочной отраслях, близки к 13-летним максимумам на ожиданиях, что ускоренное сокращение производства в Китае для контроля выбросов приведет к значительному дефициту в этом году.

«Китаю необходимо сбалансировать экологию и экономику. Если дело дойдет до конфликта, я бы сказал, что Китай всегда будет склоняться в сторону экономики », — сказал аналитик Julius Baer Карстен Менке.

Высокие цены также были поддержаны опасениями по поводу сбоев в Гвинее, где имеются большие запасы бокситов, используемых для производства глинозема в качестве исходного сырья.

Трехмесячный выпускник вырос на 0,2% до 2 885,5 долларов.

ПРОЧИЕ МЕТАЛЛЫ: медь упала на 0,5% до 9 321 долл. За тонну, цинк упал на 0,1% до 3078 долл., Свинец упал на 1.На 2% до 2180 долларов, а олово подорожало на 0,3% до 34 140 долларов. (Отчетность Пратимы Десаи, редактирование Дэвида Гудмана и Луизы Хевенс)

Фрет Патрик — Антверпен 2180 (Антверпен), Frans Standaertlei 102, RE

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel in elektrische huishoudapparaten in gespecialiseerde winkels (47540)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel in elektrische huishoudapparaten in gespecialiseerde winkels (4754)

NACE-BEL (BE 2008): Handelsbemiddeling in auto’s en lichte bestelwagens (

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Гендель в auto’s en lichte bestelwagens (= 3,5 тонны) (4511)

NACE-BEL (BE 2008): (4531001)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Groothandel in onderdelen en accessoires van motorvoertuigen (4531)

NACE-BEL (BE 2008): (4532001)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel в onderdelen и аксессуары van motorvoertuigen (4532)

NACE-BEL (BE 2008): (4540101)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Handel in en onderhoud en reparatie van motorfietsen en delen en toebehoren van motorfietsen (4540)

NACE-BEL (BE 2008): (4540102)

NACE-BEL (BE 2008): (4540103)

NACE-BEL (BE 2008): (4540203)

NACE-BEL (BE 2008): Groothandel in elektrische huishoudelijke apparaten en audio- и videoapparatuur (46431)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Groothandel in elektrische huishoudelijke apparaten (4643)

NACE-BEL (BE 2008): Groothandel in verlichtingsapparatuur (46473)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Groothandel in huismeubilair, tapijten en verlichtingsapparatuur (4647)

NACE-BEL (BE 2008): Groothandel in kranten, boeken en tijdschriften (46491)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Groothandel in andere Consmentenartikelen (4649)

NACE-BEL (BE 2008): Groothandel in sport- en kampeerartikelen, встретил uitzondering van fietsen (46496)

NACE-BEL (BE 2008): Подробная информация о компьютерах, рандомаппаратуре и программном обеспечении в специальной лаборатории Винкельса (47410)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel в компьютерах, рандомном оборудовании и программном обеспечении в gespecialiseerde winkels (4741)

NACE-BEL (BE 2008): (4743001)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Подробная информация в аудио- и видеоаппаратуре в специальной лаборатории Винкельса (4743)

NACE-BEL (BE 2008): (4759201)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel in meubelen, verlichtingsbenodigdheden en andere huishoudelijke artikelen in gespecialiseerde winkels (4759)

NACE-BEL (BE 2008): (4759301)

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel в kranten en kantoorbehoeften in gespecialiseerde winkels (47620)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel в kranten en kantoorbehoeften in gespecialiseerde winkels (4762)

NACE-BEL (BE 2008): (4764001)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Detailhandel в sportartikelen in gespecialiseerde winkels (4764)

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel в damesbovenkleding в gespecialiseerde winkels (47711)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel в клединге в gespecialiseerde winkels (4771)

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel в херенбовенклединге в gespecialiseerde winkels (47712)

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel in baby- en kinderbovenkleding в gespecialiseerde winkels (47713)

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel в ондерклединге, нижнем белье и бэдклединге в gespecialiseerde winkels (47714)

NACE-BEL (BE 2008): Детальхандель в кледингаксессуарах в gespecialiseerde winkels (47715)

NACE-BEL (BE 2008): Detailhandel в dames-, heren-, baby- en kinderboven- onderkleding en kledingaccessoires в gespecialiseerde winkels (algemeen assortiment) (47716)

NACE-BEL (BE 2008): (4779301)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Detailhandel in antiquiteiten en tweedehandsgoederen in winkels (4779)

NACE-BEL (BE 2008): (4779303)

NACE-BEL (BE 2008): Markt- en straathandel в voedings- en genotmiddelen (47810)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Markt- en straathandel в voedings- en genotmiddelen (4781)

NACE-BEL (BE 2008): Markt- en straathandel in textiel, kleding en schoeisel (47820)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Markt- en straathandel in textiel, kleding en schoeisel (4782)

NACE-BEL (BE 2008): Markt- en straathandel в андере артикелен (47890)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Markt- en straathandel в андере артикелен (4789)

NACE-BEL (BE 2008): (47

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Detailhandel через postorderbedrijven или через Интернет (4791)

NACE-BEL (BE 2008): (47

)

NACE-BEL (BE 2008): Verhuur en lease van personenauto’s en lichte bestelwagens (

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Verhuur en lease van personenauto’s en lichte bestelwagens (

NACE-BEL (BE 2008): Verhuur en lease van vrachtwagens en overige motorvoertuigen (> 3,5 тонны) (77120)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Verhuur en lease van vrachtwagens en overige motorvoertuigen (> 3,5 тонны) (7712)

NACE-BEL (BE 2008): Verhuur en lease van televisietoestellen en andere audio- и videoapparatuur (77292)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Verhuur en lease van andere consmentenartikelen (7729)

NACE-BEL (BE 2008): (7

2)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Райсбюрео (7911)

NACE-BEL (BE 2008): (

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Bibliotheken en archieven (9101)

NACE-BEL (BE 2008): Отремонтировать компьютеры в рандомаппаратном исполнении (95110)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Ремонт компьютеров в рандомаппарате (9511)

NACE-BEL (BE 2008): Ремонтный фургон Consumentenelektronica (95210)

NACE Ред.2 (ЕС 2008): Ремонт микроавтобуса Consumentenelektronica (9521)

NACE-BEL (BE 2008): (9529004)

КДЕС Ред. 2 (ЕС 2008): Reparatie van andere consmentenartikelen (9529)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля бытовыми электротоварами, мебелью, осветительным оборудованием и прочими бытовыми товарами в специализированных магазинах (4759)

МСОК 4 (МИР): Продажа автотранспортных средств (4510)

МСОК 4 (МИР): Продажа автозапчастей и аксессуаров (4530)

МСОК 4 (МИР): Продажа, обслуживание и ремонт мотоциклов, запчастей и аксессуаров к ним (4540)

МСОК 4 (МИР): Оптовая торговля прочими хозтоварами (4649)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля компьютерами, периферийным оборудованием, программным обеспечением и телекоммуникационным оборудованием в специализированных магазинах (4741)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля аудио- и видеотехникой в ​​специализированных магазинах (4742)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля книгами, газетами и канцелярскими товарами в специализированных магазинах (4761)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля спортивным инвентарем в специализированных магазинах (4763)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля одеждой, обувью и кожаными изделиями в специализированных магазинах (4771)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля подержанными товарами (4774)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля продуктами питания, напитками и табачными изделиями в киосках и на рынках (4781)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля текстильными изделиями, одеждой и обувью на прилавках и на рынках (4782)

МСОК 4 (МИР): Розничная торговля прочими товарами в киосках и на рынках (4789)

МСОК 4 (МИР): Розничная продажа по почте или через Интернет (4791)

МСОК 4 (МИР): Аренда и лизинг автотранспортных средств (7710)

МСОК 4 (МИР): Аренда и лизинг прочих личных и хозяйственных товаров (7729)

МСОК 4 (МИР): Деятельность туристических агентств (7911)

МСОК 4 (МИР): Библиотечно-архивная деятельность (9101)

МСОК 4 (МИР): Ремонт компьютеров и периферийного оборудования (9511)

МСОК 4 (МИР): Ремонт бытовой электроники (9521)

МСОК 4 (МИР): Ремонт прочих личных и хозяйственных товаров (9529)

Электрогитара звукоснимателя Fernandes Burny SG VH-1 Арт. № 2180 |

Описание

Здравствуйте, я продавал на eBay из Японии, поэтому могу предоставить вам лучший сервис.

Этот товар распродан по всей Японии, и его очень сложно достать !!

В порядке очереди.

◆ Косметическое состояние

Подробное состояние продукта смотрите на фотографиях.

Электрогитара звукоснимателя Fernandes Burny SG VH-1

Производитель: FERNANDES

Марка: Burny

Модель: SG

(Передний и задний подборщик):

Голова похожа на Gibson

Гриф: прямой

Лад: 70%

Анкерный стержень: Неизвестно

Вес: 3420 г

Небольшие царапины, грязь, вмятины видны из-за возраста, но ничто не мешает использованию

Нет буквы на гудке

Регулировка заднего тона может двигаться не плавно

◆ Рабочее состояние

Нормальное

◆ Включая

Все, что вы видите на этом фото будет входить в комплект пакета.

Вы можете наслаждаться музыкой.

★ Этот продукт также доступен на других сайтах ЕС. Мы обновим его как можно скорее, но если этот продукт будет продан на другом сайте ЕС до того, как он будет продан на eBay, нам очень жаль, но мы отменим транзакцию на этом сайте.

★ Я изучил элемент (ы) и включил свои наблюдения как можно точнее в описание выше. Обратите внимание, что некоторые описания могут быть основаны на моем собственном мнении.Пожалуйста, прочтите его внимательно и поймите состояние товара перед подачей заявки.

Пожалуйста, оплатите в течение 3 дней после закрытия аукциона.

Доставка по всему миру из Токио. Для товаров с твердыми ящиками мы обычно упаковываем твердый ящик и его содержимое с помощью прокладочного материала (обычно пузырчатой ​​пленки). До сих пор не было проблем с этим способом доставки. Однако, если вы хотите, чтобы жесткий футляр был вложен в картон, я могу отправить его этим способом, если вы заплатите дополнительно 10 долларов.Это относится только к товарам, изначально имеющим жесткий футляр.

этот товар будет отправлен в течение 1 рабочего дня после подтверждения оплаты.

(воскресенье и праздничные дни — не рабочий день)

Доставка со страховкой и номером автоперевозки занимает 4-7 дней.

* Мы не можем использовать службу EMS (Почта Японии) для некоторых стран Центральной Азии (Казахстан, Кыргызстан, Таджикистан и т. Д.). Если ваш адрес доставки находится в этих регионах, пожалуйста, свяжитесь с нами перед подачей заявки.

Возврат принимается ТОЛЬКО в том случае, если товар не соответствует описанному.

* Импортные пошлины, налоги и сборы не включены в цену товара или стоимость доставки. Эти обязанности ответственность покупателей.
* Пожалуйста, свяжитесь с таможней вашей страны, чтобы определить, какие дополнительные расходы будут понесены до торгов / покупки.
* Эти сборы обычно взимаются транспортной компанией или когда вы забираете товар — не путайте их с дополнительными расходами на доставку.