Красная лада х рей: LADA представила юбилейные версии Vesta и XRAY

Содержание

Лада Икс Рей (63 фото)

Концерн «АвтоВАЗ», что расположен в городе Тольятти, представил на суд отечественных автолюбителей новый кроссовер В-класса более четырёх лет назад. С тех пор интерес к этому «высокому хэтчбеку» не уменьшается.

Строгость линий, мощность двигателя, высокая безопасность автомобиля этой модели, энергоёмкость и отличная управляемость — главные фишки, перенятые у прототипа — Renault Sandero. Производители усилили подвеску, добавили подрамник, увеличив жёсткость. Всё это дало возможность адаптировать автомобиль для российских дорог.

Оригинальность этой модели автомобиля придают использование более 600 деталей, которые ранее никогда не использовались концерном «АвтоВАЗ».

 

Тюнинг Лада Икс Рей Спорт

 

Оранжевая Лада Икс Рей на плитах под мостом

 

Кроссовер Лада Икс Рей в осенних горах

 

Концепт Лады Икс Рей мчится по дороге через солнечный весенний лес

 

Руководство АвтоВАЗ и губернатор Самарской области на стенде презентации Лады Икс Рей

 

Красная Лада Икс Рей на фоне ГЭС

 

Охряная Лада Икс Рей Кросс в осенней степи

 

Экстремальный тест-драйв белой Лады Икс Рей по осеннему бездорожью

 

Лада Икс Рей Кросс в урбанистичной фотосессии

 

Лада Икс Рей Кросс на стенде автосалона в неоновых лучах

 

Багажник Лады Икс Рей

 

Лада Икс Рей на площадке на осеннем побережье

 

Красная и оранжевая Лады Икс Рей на осенней трассе

 

Три Лады Икс Рей в оригинальны цветах на фоне здания

 

Вид сверху на оранжевую Ладу Икс Рей на площадке у моря

 

Лада Икс Рей цвета манго на ступеньках

 

Лада Икс Рей и Лада Веста на фоне офисного здания

 

Два кроссовера Лада Икс Рей Кросс на горной дороге

 

Золотистая Лада Икс Рей Кросс на горной дороге у озера

 

Красная Лада Икс Рей едет среди сугробов и берёз

 

Городской тест-драйв Лады Икс Рей

 

Подкапотное пространство Лады Икс Рей

 

Серебристая Лада Икс Рей на фоне вечернего мегаполиса

 

Фотомодель у Лады Икс Рей на стенде автосалона

 

Новая белая Лада Икс Рей Спорт на стенде автосалона

 

Коричневая Лада Икс Рей на осенней городской набережной

 

Красный хэтчбек Лада Икс Рей на фоне Москва-сити

 

Коричневый хэтчбек Лада Икс Рей в фотосессии в горах

 

Лады Икс Рей на зимней парковке автосалона продаж

 

Промоутер рядом с золотистым кроссовером Лада Икс Рей Кросс

 

Красная Лада Икс Рей на брусчатке городской набережной

 

Посетители разглядывают Ладу Икс Рей Кросс в автосалоне

 

Салон Лады Икс Рей, приехавшей на презентацию в Минск

 

Бардачок на торпеде Лады Икс Рей

 

Лада Икс Рей в дилерском автосалоне

 

Тест-драйв Лады Икс Рей с комплектом зимних шин

 

Концепт Лады Икс Рей 2012 на фоне фермы

 

Табличка с клиренсом Лады Икс Рей на стенде автосалона

 

Коричневая Лада Икс Рей на городской улице

 

Клюквенно-красная Лада Икс Рей на высоком холме на фоне осеннего пейзажа

 

Оранжево-золотая Лада Икс Рей в рекламной фотосессии у воды

 

Белый хэтчбек Лада Икс Рей на фоне офисного здания

 

Бортовой компьютер в концепте Лады Икс Рей 2012 года

 

Чёрно-белый интерьер Лады Икс Рей Эксклюзив

 

Золотистый хэтчбек Лада Икс Рей Кросс на стенде автосалона

 

Руль пятидверного хэтчбека Лада Икс Рей

 

Золотистая Лада Икс Рей мчится по городу

 

Приборная панель Лады Икс Рей

 

Лада Икс Рей на замёрзшем зимнем озере

 

Заснеженная Лада Икс Рей на парковке горнолыжного курорта

 

Песочная Лада Икс Рей мчится по улице

 

Заднее сиденье в интерьере Лады Икс Рей

 

Песочный хэтчбек Лада Икс Рей на фоне облаков над долиной

 

Руль и торпеда Лады Икс Рей Кросс

 

Золотистая Лада Икс Рей в вечерней фотосессии

 

Лада Икс Рей на фоне зимнего города

 

Чёрный салон Лады Икс Рей

 

Оливково-зелёный хэтчбек Лада Икс Рей в динамичном ракурсе

 

Концепт внедорожника Лада Икс Рей 4х4 цвета мокко

 

Серебристый хэтчбек Лада Икс Рей

 

Концепт-кар Лада Икс Рей в динамичном ракурсе

 

Чёрная Лада икс Рей Спорт Концепт 2016 в профиль

 

Кроссовер Лада Икс Рей Кросс цвета охры

официальные дилеры Лада Х Рей в Мск

Продажей новых автомобилей Lada XRAY 2021 в Москве занимаются четырнадцать официальных дилеров. Стоимость хэтчбека в автосалонах Мск смотрите по соответствующим ссылкам.

Лучшие цены на Lada XRAY

Все предложения от дилеров

Купите авто с максимальной выгодой

МАС Моторс

г. Москва, Варшавское шоссе, 132А, к.1

+7 (495) 120-01-32

RIA Авто

г. Москва, Волоколамское шоссе, 120

+7 (495) 649-61-20

АвтоГермес: Волгоградский проспект

Официальный дилер

г. Москва, ул. Сормовская, д. 21 А, стр. 1

+7 (495) 136-46-00

АвтоГермес: Варшавское шоссе

Официальный дилер

г. Москва, Варшавское шоссе, д. 561

+7 (495) 136-46-00

АвтоГермес: шоссе Энтузиастов

Официальный дилер

г. Москва, шоссе Энтузиастов, 59

+7 (495) 136-46-00

АвтоГермес: Дмитровское шоссе

Официальный дилер

г. Москва, Дмитровское шоссе, д. 161а

+7 (495) 136-46-00

АвтоГермес: Каширское шоссе

Официальный дилер

г. Москва, Каширское шоссе, д.41 ,стр 2

+7 (495) 136-46-00

АвтоГермес: Ярославское шоссе

Официальный дилер

г. Москва, ул.Красная Сосна, д. 5, стр. 1

+7 (495) 136-46-00

Lada Кунцево

Официальный дилер

г. Москва, ул.Горбунова,14

+7 (495) 141-28-27

Яхрома-Лада

Официальный дилер

г. Москва, Шлюзовой переулок, д.1

+7 (495) 154-76-73

Брайт Парк

Официальный дилер

г. Москва, Симферопольское шоссе, д.22 стр.5

+7 (499) 145-88-45

Техинком: Строгино

Официальный дилер

г. Москва, ул. Кулакова, владение 24, корпус 3

+7 (495) 154-83-72

Техинком: МКАД 14 км

Официальный дилер

г. Москва, МКАД 14км. (внешняя сторона), Коммерческий проезд, д. 8, к.2

+7 (495) 154-83-72

Техинком: МКАД 47 км

Официальный дилер

г. Москва, МКАД 47км. (внешняя сторона), стр.3

+7 (495) 154-83-72

Техинком: Щелковское шоссе

Официальный дилер

г. Москва, Щёлковское ш., д. 100, корп. 1

+7 (495) 154-83-72

Торгмаш

Официальный дилер

г. Москва, Мытищинский р-он,ул.Центральная ,вл.2,стр.1 (МКАД 88 км)

+7 (495) 292-72-40

Секреты дизайна LADA XRAY Sport раскрыл Стив Маттин » MassCars.ru

Секреты дизайна LADA XRAY Sport раскрыл Стив Маттин

В новом видео шеф-дизайнер LADA Стив Маттин раскрывает секреты спортивной версии кроссовера XRAY Sport. Концепт этого автомобиля АВТОВАЗ показал в конце августа этого года на Московском автошоу. Также концепт-кар LADA XRAY Sport смогут вживую увидеть посетители автовыставки в Тольятти «MOTOR-EXPO 2016», которая пройдет с 22 по 25 сентября.

Стив Маттин во время презентации LADA XRAY Sport рассказал следующее: «Здесь (Ред. – в LADA XRAY Sport) применяется тот же стратегический подход, что и в случае с Vesta Sport. Спереди вы можете увидеть схожие, очень сильные и агрессивные формы. Отличительные изменения в Х-лезвиях, которые теперь расположены под большим углом. Мы поиграли с черными, зеркальными материалами и добавили красную полосу, которая вносит нотку спортивности. Сбоку автомобиля мы видим графику, соответствующую тематике концепта Лада Веста Спорт. Она усиливает Х-черты и вызывает ассоциации с гоночным автомобилем, так же как у Vesta в случае с WTCC. Такой же дизайн колес. Машина занижена для спортивного и динамичного вождения. Накладки на пороги, черная зеркальная крыша. Сзади мы видим дополнительный спойлер для увеличения прижимной силы. Также как и на Vesta Sport – агрессивный дизайн заднего бампера. Спойлер увеличивает прижимную силу. Тоже самое можно увидеть в нижней части бампера, где имеется выдающийся диффузор. Бампер поделен на три секции с цветовым оформлением. По бокам имеются темные вставки с маленькими пластинами, которые добавляют «огонька» в общее восприятие автомобиля. Это объемное отверстие уменьшает объем задка, особенно в сочетании с красной полосой, ныряющей под противотуманный фонарь. В целом характер автомобиля последователен в дизайне вместе с Веста Спорт Концепт. Если мы вновь посмотрим на передний бампер, то увидим его агрессивный стиль. Здесь имеется большая оптическая черная поверхность. Это в целом меняет восприятие переднего бампера. Это подчеркивается новой формой хромированных лезвий под необычным углом, что в сочетании с черным глянцем и черными матовыми вставками (также как и на Веста Спорт) придает новый интересный внешний вид. Красная полоса соединяет левую и правую части. Вместо окрашенной в цвет кузова, она вносит интересную нотку спортивного характера».

Lada X-RAY — автонастрой

С 2012 год поклонники отечественного автопрома ожидают выхода новой модели производства АвтоВАЗ – Лады Х-Рей. И недаром, ведь Ладу ХРей можно назвать одним из самых успешных дебютантов АвтоВАЗа – после того, как показ модели буквально «взрорвал» автомобильный мир, концепт стал новым лицом стилистики отечественного автопроизводителя. Так что же это за автомобиль? Давайте разберемся поподробнее. Лада Х-Рей характеристики, фото и цены вы сможете найти в этой статье.

На первый взгляд может показаться, что Lada ХРей – это внедорожник или кроссовер, но такими терминами это авто не позиционируется даже инженерами АвтоВАЗа. По мнению представителей компании, Лада Х-Рей – это, так сказать, обычный «высокий хэтчбек». Соответственно, транспортное средство теперь занимает собственную своеобразную нишу.

Экстерьер Лада Х-Рей

Что касается внешнего вида, то как вы сами можете посмотреть на фото, новая Х-Рей смотрится очень современно и привлекательно. Передняя часть транспортного средства выполнена в так называемом X-стиле, а хромические элементы только подчеркивают великолепный дизайн авто. На дверях Лада Х-Рей вы можете увидеть X-образные выштамповки. Благодаря низким обвесам и покатой крыше, а также тому, что лобовое стекло машины достаточно наклонено, авто еще более уверенно и динамично управляется на дороге.

 

 

 

 

В целом же новая Лада Х-Рей своим внешним видом значительно отличается от того образца, который был представлен публике в 2014 году. Модель двухгодичной давности была трехдверной, а раздутые формы и прочие стильные элементы кузова только подчеркивали уверенность и мощь авто.

Однако предсерийная модель имеет определенные изменения. В частности, оптика в ней теперь не такая заточенная, больше округлая. Решетка радиатора стала чуть больше по своим размерам, а интерфейс капота был незначительно изменен. Контур переднего бампера остался таким же, однако снизу появилась так называемая губа. По утверждению разработчиков, она способствует оптимизации показателей аэродинамики. Также следует отметить, что теперь бампер оборудован и круглыми противотуманными фарами.

Интерьер ХРэй

Интерьер Лады Х-Рей не менее интересный и оригинальный. Приборная панель незатейлива в целом по дизайну, однако по факту она достаточно информативна. Все приборы установлены в трех так называемых колодцах, а справа от водительского места вы можете увидеть экран бортового компьютера. Руль выполнен очень оригинально и современно, и имеет интересный четырехспицевый дизайн с ярко выраженным рельефом. В более «фаршированных» версиях Лада Х-Рей на руле также установлены кнопки для управления различными функциями.

Фото салона автомобиля

 

 

 

Посредине торпеды разработчики установили семидюймовый ЖК-дисплей, вокруг которого расположены оригинальные с виду дефлекторы вентиляции. Чуть ниже установлен блок управления системой климат-контроля. Но это все характерно для автомобилей полной комплектации. Что касается более дешевых версий авто, то здесь все гораздо проще – вместо дисплея установлена обычная магнитола с простыми дефлекторами кондиционера или печки. В целом внутренняя отделка салона выполнена из жесткого текстурного пластика, а сами сиденья обтянуты приятной на ощупь тканью.
Передние кресла не только красивы с виду, но и очень удобны благодаря функции боковой поддержки и возможности регулировки. Так называемый высокий хэтчбек внутри оснащен множеством различных мини-отсеков для мелких вещей.

Основные из них расположены:

  • в дверях, здесь находятся большие карманы с подстаканниками
  • под передним пассажирским сидением есть выдвигающийся ящик
  • под торпедой также расположены несколько отсеков и подстаканников

Заднее сиденье было правильно спроектировано, в результате чего пассажиры сзади никогда не будут себя чувствовать, «как шпроты в банке». Пассажирам предлагается довольно большой запас свободного пространства, но все без фанатизма.

Перейдем к объему багажника. В состоянии разложенных задних сидений объем багажника составляет 376 литров, в то время как при сложенных сидениях этот показатель увеличивается до 1382 л. Следует отметить, что при складывании сидений площадка получается идеально ровной. На дне багажника вы можете увидеть запасное колесо диаметром 15 дюймов, несмотря на то, что по факту авто оборудуется 16-дюймовыми колесами.

Трансмиссия Lada X-Ray

Потребителю предлагается на выбор одна из двух трансмиссий. Х-Рей оборудуется пятиступенчатой «механикой» и роботизированной КПП. Что касается механической коробки то, как заявили в свое время представители авто-концерна, АвтоВАЗ решил отказаться от собственных КПП. Теперь Лада Х-Рей будет комплектоваться «механикой» JR5 французского производства. Такое решение было принято в результате того, что инженеры АвтоВАЗа поняли, что трансмиссии французского производства работают гораздо тише отечественных.

Что касается «робота», то Х-Рей будет укомплектована той же коробкой передач, которая устанавливается на Ладу Весту. Эта роботизированная коробка была разработана на основе традиционной отечественной «механики», но в процессе создания агрегата участвовали специалисты из немецкой компании ZF. Зарубежные разработчики помогли российским специалистам модифицировать электронную часть. Система сцепления будет комплектоваться продукцией от всемирно известного разработчика Валео. Следует отметить, что установка роботизированной трансмиссии обусловлена не только невысокой ценой, но и экономией топлива. Кроме того, по утверждениям представителей концерна, теперь водитель получает возможность безболезненного старта движения на этой коробке в сильный мороз. В свою очередь, традиционные гидтротрансформаторные «автоматы» требуют немного времени, чтобы прогреться перед началом езды.

Технические характеристики Лада Х-Рей

Лада Хрей оборудуется одним из трех четырехцилиндровых двигателей, которые полностью соответствуют требованиям экологического стандарт «Евро-5»:
Самый простой вариант – автомобиль оснащен 1.6-литровым ДВС ВАЗ 21129 и 16-клапанным газораспределительным механизмом. Мощность автомобиля составляет 106 л.с. Коробка передач – механическая «пятиступка». Согласно заявленным характеристикам, до 100 км/ч Х-Рей может разогнаться за 11.9 сек, максимальная скорость в этом случае составляет 170 км/ч. Что касается расхода топлива, то по городу он составит около 7.5 л.

Средний вариант Лада Х-Рей будет оснащен 16-клапанным ДВС производства «Рено-Ниссан» объемом 1.6 л. ГРМ в этом двигателе будет цепным. Мощность авто, оснащенного механической КПП, составляет 114 «лошадок». Машина сможет разогнаться до 100 км/ч за 10.3 сек, а максимально возможная скорость разгона составляет 171 км/ч. Расход топлива в данном случае составит около 6.9 л в смешанном режиме езды.

Самая «совершенная» версия Лады Х-Рей оборудуется мотором ВАЗ 21176 объемом 1.8 л. Мощность двигателя составляет 122 л.с. В этом случае машинка оснащается 5-ступенчатой роботизированной коробкой передач. До «сотки» авто разгонится за 10.9 сек, а максимально возможная скорость составит 183 км/ч. Что касается расхода топлива, то в режиме езды по городу он не должен превышать 7.1 л. Данные технические характеристики достаточно конкурентны в этом ценовом диапазоне.

Шасси автомобиля Xray

Хэтчбек Лада Х-Рей представляет собой переднеприводное транспортное средство. Собственно, именно это стало причиной того, что Х-Рей не получил статус кроссовера. Однако на сегодняшний день множество других моделей так называемых городских внедорожников оборудуются только передним приводом.

По сообщению представителей АвтоВАЗа, Х-Рей оборудуются подвеской от Рено Сандеро и платформой шасси типа В0. По своей конструкции она представляет собой независимую схему со стойками МакФерсон. Задняя часть авто оснащена торсионной балкой, а конструкция в целом оборудована газовыми амортизаторами Tenecco и пружинами Mubea.

Полноприводная версия получит название Х-Рей Кросс, эта модификация в АвтоВАЗе считается уже кроссовером. Авто оборудуется платформой шасси от Renault Duster. Таким образом, Лада будет иметь независимую «ходовку». Спереди установлены стойки МакФерсон, а сзади многорычажная система. Также следует отметить, что полноприводные версии оснащаются электромагнитной муфтой Ниссан. Обе версии оборудованы дисковыми тормозами на передней оси, а также ГУРом.

Комплектация и цены Лада Х-Рей

Цена на Ладу Х-Рей, как и во всех других случаях, будет зависеть от комплектации. В продаже представлены несколько версий:

  • Оптима.
  • Комплектация Топ.
  • Топ Престиж.
Актуальная цена Лада Х-Рей, комплектаций 2016 года

 

 

 

 

Даже в самой простой версии Lada X-Ray Оптима комплектация превзошла ожидания автоэкспертов. В частности, в ней уже имеются передние подушки безопасности, а также различные системы, такие как ABS, ASR, ESP, EBD и EBA. В целом комплектация Х-Рей выглядит достаточно солидно, поскольку она оснащена 16-дюймовыми «титанами», светодиодами в оптике, а также повторителями поворотов на зеркалах. Что касается интерьера, то здесь все тоже неплохо – передние стеклоподъемники, функция настройки руля по наклону, медиа-система с четырьмя динамиками, Блютуз, бортовой компьютер и мультируль. В автомобили с мощностью двигателя 110 «лошадок» добавляются кондиционер, а также система подогрева передних сидений.

В Топ версии ручки дверей будут выкрашенными, также добавятся «противотуманки» и даже система для правильной парковки — парктроник. Кроме того, комплектация дополняется электрическим приводом настройки зеркал, а также их обогревом, мультимедийной системой с GPS и семидюймовым экраном. Акустика авто модернизирована.

Лучшая комплектация Топ престиж имеет все функции, представленные выше. Помимо прочего, авто также оборудуется датчиками дождя, света, системой климат-контроля, обогревом ветрового стекла и даже камерой заднего вида! Кроме того, в версии Топ Престиж появится тонировка. Более полная информация, цена и комплектации представлены выше на картинках. Удачи в выборе характеристики и комплектации будущего автомобиля, если вам понравилась статья, то не забудьте поделиться ссылкой в социальных сетях.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемые самосогласованными сетями FRET.

  • 1

    Хенцлер-Вильдман, К. и Керн, Д. Динамические личности белков. Nature 450 , 964–972 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 2

    Крукенберг, К.А., Стрит, Т.О., Лавери, Л.А., и Агард, Д.А. Конформационная динамика молекулярного шаперона Hsp90. Q. Rev.Биофиз. 44 , 229–255 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • 3

    Pearl, L.H. & Prodromou, C. Структура и механизм механизма молекулярного шаперона Hsp90. Annu. Rev. Biochem. 75 , 271–294 (2006).

    CAS Статья Google ученый

  • 4

    Taipale, M. et al. Количественная сеть взаимодействия шаперонов раскрывает архитектуру путей гомеостаза клеточного белка. Cell 158 , 434–448 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 5

    Некерс, Л. и Воркман, П. Ингибиторы молекулярных шаперонов Hsp90: мы еще на месте? Clin. Cancer Res. 18 , 64–76 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 6

    Портер, Дж. Р., Фриц, К. С. И Депью, К. Открытие и разработка ингибиторов Hsp90: многообещающий путь лечения рака. Curr. Opin. Chem. Биол. 14 , 412–420 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • 7

    Rohner, N. et al. Загадочные изменения в морфологической эволюции: HSP90 как конденсатор потери глаз у пещерных рыб. Science 342 , 1372–1375 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 8

    Миклер, М., Хесслинг, М., Ratzke, C., Buchner, J. & Hugel, T. Большие конформационные изменения Hsp90 только слабо связаны с гидролизом АТФ. Nat. Struct. Мол. Биол. 16 , 281–286 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 9

    Али, М. и другие. Кристаллическая структура замкнутого шаперонного комплекса Hsp90-нуклеотид-p23 / Sba1. Nature 440 , 1013–1017 (2006).

    CAS Статья Google ученый

  • 10

    Сидера, К.& Patsavoudi, E. Ингибиторы HSP90: текущие разработки и потенциал в терапии рака. Противораковые средства. Drug Discov. 9 , 1–20 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 11

    Крукенберг, К.А., Фёрстер, Ф., Райс, Л.М., Сали, А. и Агард, Д.А. Множественные конформации E. coli Hsp90 в растворе: понимание конформационной динамики Hsp90. Структура 16 , 755–765 (2008).

    CAS Статья Google ученый

  • 12

    Jahn, M. et al. Заряженный линкер молекулярного шаперона Hsp90 модулирует контакты доменов и биологическую функцию. Proc. Natl. Акад. Sci. США 111 , 17881–17886 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 13

    Comstock, M.J. et al. Белковая структура. Прямое наблюдение взаимосвязи структура-функция в ферменте, обрабатывающем нуклеиновую кислоту. Наука 348 , 352–354 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • 14

    Шулер Б. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J. Нанобиотехнология 11 (Приложение 1), S2 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 15

    Ha, T. et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 93 , 6264–6268 (1996).

    CAS Статья Google ученый

  • 16

    Hohlbein, J. et al. Конформационные ландшафты ДНК-полимеразы I и мутаторных производных устанавливают контрольные точки верности для вставки нуклеотидов. Nat. Commun. 4 , 2131 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 17

    Машаги, А., Kramer, G., Lamb, D.C., Mayer, M.P. И Танс, С.Дж. Действие шаперона на уровне одной молекулы. Chem. Ред. 114 , 660–676 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 18

    Калинин С.В. и др. Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Nat. Методы 9 , 1218–1225 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 19

    Мущелок, А.и другие. Система нанопозиционирования для структурного анализа макромолекул. Nat. Методы 5 , 965–971 (2008).

    CAS Статья Google ученый

  • 20

    Brunger, A.T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S. & Weninger, K.R. Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct. Биол. 173 , 497–505 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • 21

    Продромоу, К.и другие. Структурная основа устойчивости к радициколу грибка hsp90. ACS Chem. Биол. 4 , 289–297 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 22

    Ли, Н.К. и другие. Точные измерения FRET в одиночных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Biophys. J. 88 , 2939–2953 (2005).

    CAS Статья Google ученый

  • 23

    Шиау, А.К., Харрис, С.Ф., Саутворт, Д. И Агард, Д.А. Структурный анализ E. coli hsp90 обнаруживает драматические нуклеотид-зависимые конформационные перестройки. Cell 127 , 329–340 (2006).

    CAS Статья Google ученый

  • 24

    Доллинз Д.Э., Уоррен Дж. Дж., Иммормино Р.М. И Гевирт, Д.Т. Структуры комплексов нуклеотидов GRP94 выявляют механистические различия между шаперонами Hsp90. Mol. Cell 28 , 41–56 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 25

    Graf, C., Lee, C.T., Eva Meier-Andrejszki, L., Nguyen, M.T. И Майер, М. Различия в конформационной динамике внутри семейства шаперонов Hsp90 раскрывают механизмы понимания. Front Mol Biosci 1 , 4 (2014).

    Артикул Google ученый

  • 26

    Hellenkamp, ​​B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M. & Hugel, T. Определение структурных ансамблей и коррелированной динамики многодоменного белка. Протокол обмена http://dx.doi.org/10.1038/protex.2016.078 (2016).

  • 27

    Мюллер, Б.К., Зайчиков, Э., Бройхле, К., Лэмб, Д.К. Импульсное перемежающееся возбуждение. Biophys. J. 89 , 3508–3522 (2005).

    Артикул Google ученый

  • 28

    Кудрявцев, В.и другие. Комбинация MFD и PIE для точных измерений передачи энергии резонансного форстеровского одиночного парного сигнала. Chemphyschem 13 , 1060–1078 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 29

    Arfken, G. Математические методы для физиков 3-е изд. 428–436 (Academic Press, 1985).

  • 30

    Case, D. et al. Amber14 (Калифорнийский университет, Сан-Франциско, 2014 г.).

  • 31

    Йоргенсен, У.Л., Чандрасекхар, Дж., Мадура, Дж. Д., Импи, Р. В., Кляйн, М. Сравнение простых потенциальных функций для моделирования жидкой воды. J. Chem. Phys. 79 , 926–935 (1983).

    CAS Статья Google ученый

  • 32

    Maier, J.A. и другие. ff14SB: Повышение точности параметров боковой цепи и остова белка из ff99SB. J. Chem. Теория вычисл. 11 , 3696–3713 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • 33

    Дарден, Т., Йорк, Д. и Педерсен, Л. Сетка частиц Эвальд: метод N · log (N) для сумм Эвальда в больших системах. J. Chem. Phys. 98 , 10089–10092 (1993).

    CAS Статья Google ученый

  • 34

    Шрейк, А. и Рупли, Дж. А. Окружающая среда и воздействие растворителя атомов белка.Лизоцим и инсулин. J. Mol. Биол. 79 , 351–371 (1973).

    CAS Статья Google ученый

  • 35

    Хамфри В., Далке А. и Шультен К. VMD: визуальная молекулярная динамика. J. Mol. График. 14 , 33–38 (1996).

    CAS Статья Google ученый

  • Отслеживание промежуточных соединений Са2 + АТФазы в реальном времени с помощью рассеяния рентгеновских лучей в растворе

    ВВЕДЕНИЕ

    Аденозин-5′-трифосфат (АТФ) -зависимый транспорт ионов Ca 2+ через сарко / эндоплазматический ретикулум (SR / ER) мембрана восстанавливает уровни кальция в цитоплазме после передачи сигналов кальция.Этот процесс очень активен при прекращении мышечного сокращения и является центральным для физиологии мышц и сердца ( 1 ), но также, например, в секреторной ( 2 ) и нейрональной ( 3 ) тканях. Аденозинтрифосфатаза (АТФаза) (SERCA) SR / ER Ca 2+ проходит через мембрану SR / ER и катализирует активный транспорт из цитоплазмы в SR / ER двух ионов Ca 2+ ( 4 ). Нарушения функциональности SERCA и, следовательно, гомеостаза Ca 2+ , могут приводить к патологическому мышечному контролю, например, при сердечных заболеваниях, и нарушении секреторных функций ( 5 ).Гидролиз АТФ в активном центре, расположенном в цитоплазматических доменах A (исполнительный механизм), N (связывание нуклеотидов) и P (фосфорилирование), и связывание ионов в M (мембранном) домене перемещают белок между состояниями высокого (E1) и низкого (E2) ионное сродство, сопровождающееся альтернативным доступом к внутренним сайтам связывания ионов (рис. 1). Используя ингибиторы, аналоги АТФ и металлофториды, SERCA был захвачен и кристаллизован в промежуточных состояниях, описывающих цикл реакции на атомистическом уровне ( 6 , 7 ).Полученные кристаллические структуры показывают, что транспорт Ca 2+ связан с обширными меж- и внутридоменными перестройками, которые связывают гидролиз АТФ с переносом ионов. Однако кристаллические структуры демонстрируют динамику только в локальном пространственном масштабе ( 8 , 9 ), в то время как крупномасштабная динамика вызывает исчезновение особенностей электронной плотности и, кроме того, ключевые структурные промежуточные соединения, связанные с аденозин-5′-дифосфатом (ADP) и высвобождение Ca 2+ отсутствуют (рис.1А). Мониторинг в реальном времени динамики SERCA, возможно, может разрешить переходные структурные состояния, недоступные для известных протоколов захвата, а также ответить на фундаментальный вопрос, в какой степени структурные перестройки, определенные с помощью рентгеновской кристаллографии в смесях детергент-липид, сохраняются в нативной мембране, которая имеет высокоспецифичный состав липидов ( 10 ).

    Рис. 1 Основные состояния, участвующие в SERCA-опосредованном транспорте Ca 2+ .

    ( A ) Схема реакционного цикла основных состояний SERCA и кристаллических структур (PDB ID), используемых при уточнении структуры.[Ca 2 ] E1P-ADP и [Ca 2 ] E1P: ADP представляют собой переходные и ковалентные состояния фосфорилирования, [Ca 2 ] E1P и [Ca 2 ] E2P представляют собой фосфорилированные состояния без ADP, тогда как E2P, E2-P и E2: P i относятся к ковалентным состояниям, переходным состояниям гидролиза и состояниям фосфофермента, связанным с P i . ( B ) SERCA [Ca 2 ] E1 (PDB ID: 2C9M) и ( C ) E2-P (PDB ID: 3N5K) кристаллические структуры с N (красный), P (синий), A (желтый ) и домены M (серый), встроенные в имитаторы мембран саркоплазматического ретикулума [состоящие из фосфатидилхолина (синий), фосфатидилэтаноламина (красный), фосфатидилсерина (оранжевый), фосфатидилинозитола (зеленый) и сфингомиелина (розовый), необходимые для конформации липидов]). для достижения перехода E1-to-E2, связанного с транспортом Ca 2+ .

    В нормальных физиологических условиях транспортный цикл [обзор в ( 7 , 11 )] инициируется, когда белок SERCA обеспечивает доступ двух ионов Ca 2+ и одной молекулы АТФ к сайтам связывания в M и N доменов, соответственно, формируя, таким образом, состояние, связанное с Ca 2+ , с закрытой цитоплазматической головной частью ([Ca 2 ] E1ATP) (рис. 1). Перестройка в первую очередь N-домена для приближения к P-домену создает основу для аутофосфорилирования Asp 351 , которое происходит через переходный ([Ca 2 ] E1P-ADP) и ковалентный ([Ca 2 ] E1P: ADP ) состояния образования фосфоферментов.Структурные перестройки в высокоэнергетическом состоянии [Ca 2 ] E1P-ADP приводят к деформации домена A, который, таким образом, тянет трансмембранные (TM) спирали M1 – M2 к цитоплазме, чтобы закупорить ионы Ca 2+ . Кристаллические структуры. соответствующие состояниям Ca 2+ -связанного E1 ([Ca 2 ] E1) и Ca 2+ -включенного фосфорилированного E1 ([Ca 2 ] E1P-ADP), показали, что связывание АТФ и фосфорилирование связаны с большими структурными изменениями в цитоплазматических доменах, переходящими от открытого и динамичного к компактному и стабильному расположению ( 6 , 7 ).Однако масштабы этого структурного изменения обсуждались. Например, было высказано предположение, что гибкость N-домена вызвана отсутствием АТФ и, следовательно, не зависит от остального белка, и что кристаллизованные открытые [Ca 2 ] состояния E1 представляют собой лишь некоторые из возможных состояний. в присутствии Ca 2+ , который может не быть доминирующим, если вообще присутствует в физиологических условиях с высоким содержанием АТФ в цитоплазме ( 12 ).Структуры не содержащего Ca 2+ промежуточного соединения E1 демонстрируют более компактное расположение с открытым цитоплазматическим путем, ведущим к сайтам связывания Ca 2+ ( 13 , 14 ). представляет собой открытое наружу состояние E2P, захваченное BeF 3 , которое следует за диссоциацией ADP в цитоплазму ( 6 , 7 ). В этом состоянии структурные перестройки домена A индуцируют движения M1-M6, приводящие к искаженным сайтам Ca 2+ , экспонированным в просвет SR, чтобы обеспечить высвобождение Ca 2+ .Следовательно, в настоящее время существует пробел в структурных знаниях, связанных с переключателем доступности через мембрану. Структуры состояний Ca 2+ , включающих [Ca 2 ] E1P и [Ca 2 ] E2P, связанные с высвобождением АДФ (на этой стадии чувствительны к АДФ) и инициированием высвобождения кальция в просвет SR, ведущего к АДФ -инчувствительное состояние E2P пока неизвестно. Однако эти промежуточные соединения наблюдались, например, по данным биохимической ( 15 ) и флуоресцентной микроскопии ( 16 ).Остальная часть реакционного цикла проходит через состояния E2, связанные с протонированием посредством 2-3 H + (E2-P) и дефосфорилированием (E2: P i и E2), что в конечном итоге приводит к конформации E1 и высвобождению протона для Кинетика и динамика реакционного цикла SERCA сильно зависят от температуры и условий образца. Например, исследования с временным разрешением, изолирующие частичные реакции, предположили, что этапами, ограничивающими скорость в реакционном цикле SERCA, являются переход E1P – E2P ( 17 ) или реформация состояния E1 после дефосфорилирования E2P ( 18 ), я.е. переходы внутрь-наружу или наруж-внутрь относительно мембраны в зависимости от используемого состояния образца. Следовательно, выбор экспериментальных условий, в которых накапливается ограничивающее скорость состояние при переходе E1P-E2P, может, в принципе, позволить структурные методы, которые исследуют конформационные изменения в реальном времени, чтобы предоставить структурную информацию о неуловимых, связанных с Ca 2+ , фосфорилированных промежуточных соединениях. , если они были задействованы в согласованных действиях. Кроме того, поскольку мембраны SR быстро сокращающихся скелетных мышц кролика состоят из SERCA до> 90% от общего содержания белка ( 19 ), эта характеристика динамики белка может быть выполнена непосредственно в естественной среде.В ранних исследованиях дифракции падения рентгеновских лучей на пастбище, индуцированное лазером высвобождение АТФ из заключенного в клетку АТФ [АТФ γ- (1- [2-нитрофенил] этил) сложный эфир] использовалось для запуска синхронизации циклов реакции SERCA, что позволило обнаружить реакцию промежуточное соединение, соответствующее фосфорилированному Ca 2+ -связанному состоянию в пределах одноциклового оборота ( 20 ). В том же исследовании аналогичное состояние [Ca 2 ] E1P наблюдалось для накопления в стационарных условиях, что указывает на то, что переход E1P – E2P может быть этапом, ограничивающим скорость в транспортном реакционном цикле Ca 2+ . .Однако эксперименты по ламеллярной дифракции на частично дегидратированных мультислоях SR могут разрешить только различия профилей, перпендикулярных нормали мембраны, в то время как исследования рассеяния в растворе в принципе позволяют моделировать трехмерные оболочки белковых структур. -XSS) может использоваться для характеристики тонкой структурной динамики в фотоактивных химических веществах ( 21 ), димеризации белков ( 22 ), а также для отслеживания конформационных изменений растворимых белков ( 23 26 ), а также как мембранные белки в мицеллах детергентов ( 8 , 27 ) и нанодисках ( 28 ).Также был предложен гибридный подход, способный разрешить как локальные, так и глобальные структурные перестройки ( 29 ). В этих экспериментах с накачкой и зондированием обычно используется импульс лазера накачки для запуска желаемой реакции, за которым следует рентгеновский зондирующий импульс. Устройства ввода на синхротронах третьего поколения могут доставить 10 10 фотонов на образец за один импульс рентгеновского излучения длительностью ~ 100 пс ( 30 ). Интенсивность зондирующего импульса может быть увеличена путем выбора микросекундных последовательностей одиночных рентгеновских импульсов.Это увеличивает отношение сигнал-шум и подходит для отслеживания структурной динамики сложных биологических макромолекул, которые обычно реагируют во временном масштабе от микро до миллисекунд.

    В этой работе мы использовали методологию TR-XSS для отслеживания структурной динамики SERCA между 20 мкс и 200 мс после лазерно-индуцированного фотолиза клеточного АТФ, тем самым охватывая как одноцикловую, так и стационарную динамику. Выбранные экспериментальные условия были специфичными для исходного состояния [Ca 2 ] E1. Моделирование предымпульсного состояния TR-XSS предполагает компактное расположение цитоплазматических доменов в растворе по сравнению с кристаллическими структурами [Ca 2 ] E1.Кинетический анализ структурной динамики после фотолиза клеточного АТФ соответствовал двум переходам со временем нарастания переходного состояния на 1,5 мс (промежуточное состояние) и нарастанием устойчивого состояния на 13 мс (позднее состояние). В промежуточном состоянии наблюдались перестройки домена, соответствующие связыванию АТФ и фосфорилированию состояния E1. Позднее состояние показало обширное вращение домена A в сторону положения E2P, но при этом домены P, N и M оставались в основном в положениях E1.Эта конформация раскрывает сайт связывания АДФ. Следовательно, модель позднего состояния TR-XSS описывает ранее ненаблюдаемую структуру, которая соответствует ADP-чувствительному [Ca 2 ] состоянию E1P.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Мембранные белки, осуществляющие активный транспорт через липидные бислои, имеют решающее значение для широкого спектра клеточных процессов, таких как генерация ионных градиентов. Поскольку мембранные переносчики обычно очень динамичны и демонстрируют функциональную зависимость от окружающей мембраны, попытки идентифицировать лежащие в основе молекулярные принципы функционирования и заболевания в идеале должны отслеживать транспортную реакцию в липидной среде при комнатной температуре в режиме реального времени.Учитывая сложность липидной среды и масштаб времени от микромиллисекунд, в котором работают мембранные транспортеры, получение прямых структурных данных представляет собой большую проблему и еще не стандартизировано. Методология TR-XSS, используемая в этой работе, регистрирует структурные отпечатки пальцев в режиме реального времени, что в сочетании с подходящими подходами к структурному уточнению может предоставить структурные данные временных промежуточных соединений, участвующих, например, в мембранном транспорте, наряду с их кинетикой. Структурное уточнение основывается на существовании структурных данных с высоким разрешением, и поэтому методологию TR-XSS следует рассматривать как дополнительный метод в структурной биологии, который очень своевременен, поскольку он извлекает выгоду из, e.g., последние разработки в области криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ).

    В этой работе мы отслеживали динамику транспорта в белке SERCA после лазерно-индуцированного доступа к АТФ. Временная эволюция разностных сигналов, извлеченные константы скорости, связанные с переходным промежуточным состоянием, и накопление ограничивающего скорость состояния согласуются с наблюдаемыми скоростями фосфорилирования и оборота ферментов ( 32 ). В процедуре структурного уточнения нам нужно было смоделировать предымпульсное состояние для получения разностных данных.Выбранные экспериментальные условия с избытком Ca 2+ для насыщения сайтов связывания ионов SERCA, но без доступного АТФ, должны лучше всего описываться состоянием E1, связанным с Ca 2+ . Однако структурные особенности состояния [Ca 2 ] E1 обсуждаются. Кристаллические структуры формы [Ca 2 ] E1 (PDB ID: 2C9M или 1SU4) принимают открытую конформацию цитоплазматических доменов ( 38 ), что резко контрастирует с более компактными структурами, обнаруженными в структурах других состояний SERCA. .Более того, обширные структурные перестройки, необходимые для перехода от открытого к компактному расположению растворимых доменов, не согласуются с резонансным переносом энергии Фёрстера, который не показал значительных изменений расстояния между доменами N и P в состояниях E1 и E2 (90 · 103 12 ). Модель предымпульсного состояния TR-XSS состояния [Ca 2 ] E1, представленная здесь, показала заметное уменьшение междоменного расстояния N-A по сравнению с кристаллическими структурами [Ca 2 ] E1 (рис.4), что указывает на преимущественно компактную конформацию цитоплазматических доменов (см. Схему на рис. 6). Однако, хотя большая часть структурного ансамбля демонстрирует замкнутое расположение цитоплазматических доменов, вполне вероятно, что также отбираются образцы более открытых конформаций, хотя и реже ( 11 ). Вариации экспериментальных условий определяют, какое состояние SERCA накапливается в устойчивое состояние. Например, наблюдали, что состояние [Ca 2 ] E1P доминирует в присутствии KCl и высокой концентрации Ca 2+ ( 39 41 ).Кроме того, с помощью микроскопии с резонансным переносом энергии флуоресценции одной молекулы (FRET) было показано, что АТФаза Ca 2+ из Listeria monocytogenes в условиях насыщения Ca 2+ демонстрирует лимитирующую стадию фосфорилирования и использует короткую -живой интермедиат с окклюзией кальция, который предшествует необратимой стадии, связанной с высвобождением ионов Ca 2+ ( 16 ). При аналогичных условиях насыщения Ca 2+ мы получаем прямую структурную информацию о состоянии, в котором несмещенное моделирование предполагает положение домена A, который находится между кристаллическими структурами [Ca 2 ] E1P-ADP и E2P. состояний, но с доменами N и P все еще в ориентации E1.В состоянии E2P мотив TGES в домене A реструктурирован, чтобы защитить фосфорилированный Asp 351 от цитоплазмы, что делает белок SERCA нечувствительным к возможным обратным реакциям, индуцированным ADP. В поздней конформации TR-XSS мотив TGES в домене A начал приближаться к фосфорилированному Asp 351 (рис. 5D), и сайт связывания ADP экспонируется в цитоплазму и, следовательно, примирован для ADP. выпускать. Таким образом, уточненное состояние позднего TR-XSS (с временем нарастания 13 мс) может представлять неуловимое ADP-чувствительное состояние [Ca 2 ] E1P SERCA, которое после связывания ADP может преобразовывать АТФ из [Ca 2 ] E1P ( схему на рис.6). Триггером, высвобождающим наблюдаемую динамику, очень вероятно завершение фосфорилирования, которое, в сущности, нарушает напряженную конфигурацию цитоплазматических доменов. Одномолекулярные FRET исследования Listeria Ca 2+ -АТФазы показывают, что белок претерпевает очень быстрые и крупномасштабные конформационные изменения после фосфорилирования ( 16 ). Функция белка ( 42 ) требует усилий в области структурной биологии для мониторинга структуры и динамики белка в естественной среде.Эти исследования часто затруднены из-за неоднородности белков в нативных мембранах. Мембрана SR представляет собой исключение, поскольку она содержит> 90% белков SERCA ( 19 ), что позволяет проводить структурные исследования в естественной среде. Однако учет вклада окружающей липидной динамики в эксперименты TR-XSS чрезвычайно сложен, и в настоящее время не существует стандартизированных методов ( 8 , 27 , 28 ). Поскольку цитоплазматические домены SERCA существенно выступают из мембраны и обнаруживают сильно доминирующие конформационные изменения, было обнаружено, что вклад окружающих липидов незначителен.Чтобы подготовить почву для характеристики менее выраженных структурных изменений белков, лишенных выступающих подвижных частей, необходимо разработать стратегии, позволяющие учитывать влияние рассеяния от окружающих липидов. Наконец, с технической точки зрения, измерения фотоактивных химикатов с помощью TR-XSS ( 21 ), светочувствительные белки ( 8 , 23 28 ) и димеризация белков ( 22 ) проложили путь к данным, представленным в этом исследовании. Используя лазерно-индуцированную активацию заключенного в клетку соединения для запуска транспортной реакции, наши опытно-конструкторские работы позволили расширить метод TR-XSS, включив в него мембранные белки, которые по своей природе не чувствительны к световой активации, что резко увеличивает количество потенциальных биологических мишеней, поддающихся воздействию. метод TR-XSS.Кроме того, ожидаемая повышенная яркость, например, в синхротронах Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) –Extremely Brilliant Source (EBS) (Гренобль, Франция) и лаборатории MAX IV (Лунд, Швеция) будет способствовать дальнейшему улучшению отношения сигнал-шум в TR-XSS эксперименты, что упрощает обнаружение и определение характеристик переходных промежуточных продуктов в ранее недоступных временных режимах.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Sarcoplasmic reticulum Ca

    2+ Препарат АТФазы P-типа Мембраны SR из быстро сокращающихся скелетных мышц кролика получали согласно ( 43 ) и суспендировали в буфере, содержащем 150 мМ MOPS KOH (pH 7.0), 150 мМ KCl и 75 мкМ CaCl 2 с последующим центрифугированием при 140000 г в течение 40 мин с последующим ресуспендированием в том же буфере с добавлением 5 мМ MgCl 2 , 10 мМ дитиотриетола и 10 мМ АТФ в клетке с нитрофениэтиловым эфиром (NPE) (конечные концентрации) при конечной концентрации 25 мг / мл мембран SR. Чтобы избежать нарушения естественной среды, мы воздержались от экстракции детергентом белка SERCA и, следовательно, сохранили чистоту природного белка 90% ( 19 ).

    Сбор данных TR-XSS

    Эксперименты TR-XSS проводились на выделенном канале с временным разрешением ID09 в ESRF в Гренобле, Франция ( 44 ). Поскольку высвобождение АТФ является необратимой реакцией, очищенные и концентрированные мембраны SR, содержащие SERCA, прокачивались с постоянной скоростью потока 3 мкл / мин через кварцевый капилляр размером 300 мкм (Hampton Research), тем самым пополняя образец для каждого цикла «насос-зонд». . АТФ с клетками NPE в образце фотолизовали наносекундным лазером Ekspla NT342B на длине волны 355 нм.Лазерный луч фокусировался в месте расположения образца в эллиптическое пятно размером 1 мм на 0,25 мм с плотностью энергии 1 мДж / мм 2 . Лазер попал в капилляр со стороны, длинной осью, параллельной направлению падающего рентгеновского луча (60 мкм на 100 мкм). Рентгеновский луч, генерируемый ондулятором в вакууме, имел ширину полосы по энергии Δ E / E = 3% и пиковую энергию 17,5 кэВ. Расстояние между образцом и детектором составляло 400 мм, а коническая камера, заполненная гелием, была помещена между образцом и детектором для уменьшения фонового рассеяния от воздуха.Импульсы рентгеновского излучения длительностью 20 мкс выделялись от синхротрона в многосгустковом режиме с помощью высокоскоростного вращающегося прерывателя. Температура в экспериментальной клетке составляла 294 К. Каждый эксперимент генерировал данные с определенной временной задержкой между лазерной вспышкой и рентгеновским импульсом. Удовлетворительное отношение сигнал / шум было достигнуто после измерения в каждую временную точку ~ 1000 раз. Чтобы избежать экспериментального отклонения в измерениях, временные задержки регистрировались в заранее определенном порядке и перемежались с отрицательной временной задержкой после трех временных задержек: -50 мкс, 20 мкс, 10 мс, 100 мс, -50 мкс, 5 мс, 1 мс. , 20 мс, −50 мкс, 50 ​​мс, 2 мс и 200 мс.Следовательно, результирующий временной ряд составил 20 мс, 1 мс, 2 мс, 5 мс, 10 мс, 20 мс, 50 ​​мс, 100 мс и 200 мс. Интенсивность рассеянного рентгеновского излучения регистрировалась на камере устройства с зарядовой связью (ПЗС) с использованием импульсов рентгеновского излучения длительностью 20 мкс, и перед считыванием каждого детектора накапливалось 40 импульсов. Временной ряд был повторен 27 раз, и разностные профили рассеяния, следовательно, являются средними из 1080 измерений, для которых потребовалось всего 20 мг мембран SR. Эксперименты проводились с частотой повторения 1 Гц, что обеспечивало полное пополнение образца в промежутках между циклами.Поскольку полученные данные TR-XSS также содержат реакцию растворителя на нагревание ( 45 ), эти эффекты были устранены в соответствии с предыдущим протоколом ( 23 ) (рис. S1C). Контрольные эксперименты с буфером или клеточным АТФ в буфере не показали явной разницы в интенсивностях при 10 и 200 мс (рис. S6, D и E).

    Обработка данных

    Записанные изображения XSS были интегрированы по азимуту для получения радиальных кривых интенсивности S ( q , ∆ t ) как функции величины вектора рассеяния q = 4πsinθ / λ, где 2θ — угол отклонения, λ — длина волны рентгеновского излучения, а ∆ t — временная задержка между фотоактивирующим лазерным импульсом и рентгеновским зондирующим импульсом.Для получения разностных спектров «темные» эталоны -50 мкс были вычтены из каждого спектра после нормализации в области q от 2,0 до 2,1 Å -1 , где ожидаются минимальные различия. Данные о разнице, которые разошлись более чем в 3,5 раза по сравнению со стандартным отклонением для данной временной задержки, рассматривались как выбросы и исключались из дальнейшего анализа. В результате сохранялось не менее 85% данных для каждой временной точки. Следовательно, полученные разностные кривые рассеяния содержат только сигналы структурных перестроек в образце.

    Анализ SVD

    Набор данных TR-XSS был организован в матрицу м × n , содержащую разностные интенсивности рассеяния, записанные в значениях 799 ( м ) q и 9 ( n ) временных точках и разложены с использованием SVD согласно следующему уравнению ∆S (q, ∆t) = U (q) SvV (∆t) T

    (1)

    Здесь U ( q ) — м × м матрица, содержащая ортонормированные базисные спектры набора данных ∆ S . S v — это диагональная матрица m × n , указывающая вклады базисных спектров (сингулярные значения), а V (∆ t ) — это матрица n × n , описывающая изменение базисных спектров во времени. Исходя из этого, были определены основные компоненты, содержащие сигнал в наборе данных. В соответствии с полученными результатами SVD, которые показали один доминирующий компонент (рис. S1, D и E), амплитуды пиков в позднем базисном спектре были значительно больше по сравнению с ранним и промежуточным спектрами.

    Спектральное разложение

    Чтобы охарактеризовать переходные промежуточные продукты во времени, для описания разностных спектров TR-XSS использовались кинетические модели с увеличивающимся числом состояний. Данные разностного рассеяния SERCA от 0 до 2,35 Å -1 были спектрально разложены в соответствии с последовательными кинетическими моделями Раннее → k1 Промежуточное → k2 Позже константы скорости соответствуют образованию переходных состояний. Кинетические модели предполагают необратимые шаги и то, что ранние состояния формируются одновременно с лазерным импульсом.Для получения не зависящих от времени базисных спектров и констант скорости, связанных с образованием переходных структурных промежуточных состояний, мы выполнили спектральную декомпозицию с глобальной подгонкой к данным разностного рассеяния SERCA S ( q , ∆ t ) в соответствии с ∆S (q, ∆t) теория = Ured (q) C (∆t)

    (2)

    где U красный ( q ) — матрица м × k , содержащая первые k компонентов, а C (∆ t ) представляет собой матрицу k × n с кинетическими профилями для k различных переходов.Последний определяется интегральными уравнениями скорости [промежуточный] = k1k2 − k1 (e − k1t − e − k2t)

    (4)

    [поздно] = 1 + [(k1 * e − k2t) — (k2 * e− k1t)] / (k2-k1)

    (5)

    Константы скорости были оптимизированы с помощью глобального уточнения наименьших квадратов между экспериментальными и восстановленными данными. Чтобы оценить соответствие экспериментальным данным, линейные комбинации полученных базисных спектров и соответствующих плотностей населенностей были подогнаны к экспериментальным разностным данным. Модель с тремя состояниями привела к лучшему глобальному методу наименьших квадратов ( S = 1.9 × 10 −6 ; Рис. 2A) по сравнению с модельным переходом между двумя состояниями ( S = 2,9 × 10 −6 ) или распадом одного состояния ( S = 1,2 × 10 −5 ). Полученные базовые спектры были подвергнуты 10-точечному сглаживанию, что позволило избежать экспериментального шума.

    Структурное уточнение

    Кривые разностного рассеяния рассчитывали с использованием программного обеспечения CRYSOL ( 46 ). Профили разности с поправкой на атомы и растворитель показали очень похожие характеристики, но с поправкой на растворитель, которая привела к несколько худшим R-факторам, что, вероятно, зависит от того, что везикулы интактных мембран SR плохо моделируются при допущении водного окружения.Поэтому, чтобы избежать введения дополнительного подгоночного параметра и возможного переобучения экспериментальных данных, мы использовали атомное рассеяние для сравнений, которые не включали модель мембраны. Кристаллическая структура SERCA, соответствующая состоянию [Ca 2 ] E1 (PDB ID: 2C9M), представляет собой «основное» состояние начального предымпульса. В качестве представителей основных промежуточных состояний SERCA были выбраны восемь кристаллических структур. Все структуры были модифицированы, чтобы они содержали только белок и такое же количество аминокислотных остатков.Полученные расчетные разностные профили рассеяния были скорректированы с учетом использования полихроматического излучения путем свертки с измеренным спектром ондулятора. R-фактор был определен для измерения соответствия между разностными кривыми XSS, предсказанными на основе структурных моделей, и экспериментальными данными разностного рассеяния в диапазоне 0 q -1 R = Σ (∆Stheory − c * ∆Sexperiment) 2∑ ( c * ∆Sexperiment) 2

    (6)

    Здесь ∆ S эксперимент представляет собой разностный базисный спектр XSS из спектрального разложения экспериментальных данных, ∆ S теория представляет собой рассчитанную разностную кривую XSS из данной структурной модели, а c — коэффициент масштабирования, который может изменяться, чтобы можно было сравнивать показания детектора и расчеты CRYSOL.Чтобы измерить тепловую динамику белка при комнатной температуре (то есть минимальном R-факторе), целевые спектры разности были получены из первого и последнего кадров в моделировании целевой молекулярной динамики (TMD). R-фактор 0,1 был рассчитан на основе динамики, отображаемой после полного перехода, то есть, когда белок смещен в сторону целевой структуры и, следовательно, исследует динамику, не переходя в другое состояние.

    Целевое моделирование MD

    Кристаллическая структура, соответствующая состоянию [Ca 2 ] E1 (PDB ID: 2C9M), была центрирована в блоке моделирования с размерами 200 Å на 200 Å на 200 Å и сольватирована водами TIP3P с использованием CHARMM- GUI ( 47 ) и расслаблен в минимизации энергии наискорейшего спуска с 5000 шагов в GROMACS 5.1.4 пакет моделирования ( 48 ), за которым следует короткое уравновешивание постоянного числа (N), объема (V) и температуры (T) (NVT) на 25 пс с временным шагом 1 фс при температуре 303,15 K, поддерживаемой Схема температурной связи Носа-Гувера ( 49 , 50 ). Параметры силового поля описывались аддитивным силовым полем для белков CHARMM36 ( 51 ). В семи целевых МД-моделированиях состояние [Ca 2 ] E1 приводилось к каждому из следующих состояний (и кристаллических структур): [Ca 2 ] E1ATP (PDB ID: 3N8G), [Ca 2 ] E1P -ADP (ID PDB: 1T5T), [Ca 2 ] E1P: ADP (ID PDB: 3BA6), E2P (ID PDB: 3B9B), E2-P (ID PDB: 3N5K), E2: Pi (ID PDB: 3FGO) и E2 (идентификатор PDB: 3NAL).В симуляциях TMD использовалась коллективная переменная RMSD из плагина для молекулярной динамики (PLUMED) ( 52 ). Для траекторий 10 нс использовалась муфта давления Парринелло-Рахмана ( 53 , 54 ) и термостат Носа-Гувера ( 49 , 50 ). Координаты белков извлекались каждые 100 пс, что давало 100 структур на траекторию и состояние TMD. Рассчитанное рассеяние из состояния [Ca 2 ] E1 затем вычиталось из каждого из полученных из 100 белковых структур, равномерно распределенных по траекториям перехода, для получения 100 разностных профилей рассеяния.

    Мембранные моделирование MD

    Мембрана SR, содержащая 366 димиристоиламинодезоксифосфатидилхолина (DDPC), 138 пальмитоилолеоилфосфотидилэтаноламин (POPE), 48 фосфатидилсерин (POPS), 12OP-мезоилмобиолеоилфосфотидран, была создана с использованием 12OP-мезоэлементолеоилфосфотидрана (SMD-спиноилмобиолеоилфосфотидрана). Строитель ( 55 ) в CHARMM-GUI ( 47 ). Белковые структуры SERCA были вставлены в модель мембраны SR в соответствии с базой данных Orientations of Protein in Membranes ( 56 ).Параметры силового поля описывались дополнительным силовым полем CHARMM36 для белка ( 51 ) и липидов ( 57 ). Энергия каждой системы моделирования была минимизирована с помощью метода наискорейшего спуска с 5000 шагами, с последующим постепенным уменьшением ограничений на тяжелые атомы белков и липидов для трех последовательных 25-пс моделирования NVT. В этом моделировании использовался временной шаг 1 фс, а температура 303,15 К поддерживалась с использованием схемы температурной связи Берендсена ( 58 ).За этим последовали три последовательных моделирования NPT длительностью 100 пс с дальнейшим постепенным снятием ограничений, связанных с тяжелыми атомами. В последнем моделировании 100 пс липиды полностью не удерживались, и им позволяли расслабиться вокруг удерживаемого белка. В этом моделировании использовался временной шаг 2 фс, а давление поддерживалось постоянным на уровне одного бара с использованием полуизотропного баростата давления Берендсена ( 58 ). Конформации белка, используемые в процедуре структурного уточнения, затем были получены в 300 -ns неограниченное моделирование, по одному для каждого состояния.В этих симуляциях использовался временной шаг 2 фс, а температура поддерживалась на уровне 303,15 K с помощью термостата Носа-Гувера ( 49 , 50 ) и полуизотропного баростата Парринелло-Рахмана ( 53 , 54 ) использовался для регулирования давления. Набор из 200 белковых структур был извлечен из неограниченного моделирования 2C9M (предымпульсное состояние) и вычтен из каждой из структур, созданных из моделирования переходных моделей, соответствующих промежуточному и позднему состояниям, соответственно.Комбинация привела к получению 40000 разностных профилей, которые сравнивали с промежуточным и поздним базисными спектрами. Поскольку в динамике структурной структуры транспорта SERCA преобладают большие конформационные изменения в растворимых доменах, выступающих из мембраны, влияние окружающих липидов на разностное рассеяние должно быть меньше. незначительный. Чтобы проверить, может ли включение перекрестных членов рассеяния на окружающие липиды и исключенный растворитель изменить структурную интерпретацию, мы смоделировали беспорядок из одного участка мембраны SR, рассчитав разностные профили рассеяния dS ( q ), включая 200-Å 2 Дебая. — Фактор Валлера B, как описано ранее ( 27 , 59 ).

    Статистический анализ

    Для оценки ошибок при описании локализации цитоплазматических доменов мы выбрали 10 структур в предымпульсном, промежуточном и позднем состояниях из траекторий моделирования мембраны, которые показали лучшие результаты с точки зрения R-фактора экспериментальных промежуточных и поздних базисных спектров. . R-факторы находились в пределах 0,05 от наилучшего соответствия. Среднеквадратичные значения RMSD доменов A, P, N и M были рассчитаны по отношению к типичным кристаллическим структурам [Ca 2 ] E1, [Ca 2 ] E1P: ADP, E2P и E2-P состояний. (Идентификаторы PDB: 2C9M, 3BA6, 3B9B и 3N5K).Средние и SD вычисленных RMSD домена для 10 пар приведены в таблице S3.

    Благодарности

    Финансирование: Эта работа была поддержана Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (2015/768) для HR, докторской стипендией IWT, предоставленной Agentschap Innoveren & Ondernemen (VLAIO) AS, Lundbeck Foundation через фонд BRA328STRUC -2019-546) и DANDRITE (R248-2016-2518) в PN, а также стартовый грант Шведского исследовательского совета (2016-03610), грант на интеграцию карьеры Марии Кюри (FP7-MC-CIG-618558), Магнус Бергваллс Стифтелсе ( 2016-01593) и Оке Вибергс Штифтелсе (M16-0164) — М.A. Вычисления были выполнены на ресурсах, предоставленных Шведской национальной инфраструктурой для вычислений (SNIC) через Центр высокопроизводительных вычислений Север (HPC2N) в рамках проекта SNIC 2018 / 2-32. A.D. был софинансирован Международной академией трансляционных исследований Уильяма Харви и получил финансирование от Седьмой рамочной программы Европейского Союза для исследований, технологических разработок и демонстрационной деятельности в соответствии с соглашением о гранте No. 608765. Вклад авторов: М.А. задумал и разработал исследование. Х. H.R., M.N.P., A.B., P.N. и M.A. проанализировали данные. C.O. и П. предоставил образец. Все авторы внесли свой вклад в написание рукописи. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

    Спектральный FRET каждой тандемной конструкции mNeonGreen-Red FP. (A) Мультфильм …

    Живые клетки полагаются на транспорт и взаимодействие биомолекул для выполнения своих разнообразных функций. Мощным инструментарием для изучения этих высокодинамичных процессов в естественной среде являются методы флуоресцентной флуктуационной спектроскопии (FFS). Более подробно, FFS использует преимущества внутренней динамики, присутствующей в биологических системах, такой как диффузия, для вывода молекулярных параметров из флуктуаций сигнала, испускаемого ансамблем флуоресцентно меченных молекул.В частности, доступны два параметра: концентрация молекул и время их прохождения через объем наблюдения. Кроме того, молекулярные взаимодействия могут быть измерены путем анализа среднего сигнала, испускаемого одной молекулой — молекулярной яркости — и взаимной корреляции сигналов, обнаруженных от различных меченых видов. В настоящей работе несколько методов FFS были реализованы и применены в различных биологических контекстах. В частности, была проведена сканирующая флуоресцентная корреляционная спектроскопия (sFCS) для измерения динамики белков и взаимодействий на плазматической мембране (PM) клеток, а также анализ количества и яркости (N&B) для пространственного картирования молекулярной агрегации.Для учета технических ограничений и артефактов, связанных с образцами, например шум детектора, фотообесцвечивание или фоновый сигнал, было исследовано несколько схем коррекции. Кроме того, sFCS была объединена со спектральным детектированием и анализом распределения количества фотонов с более высоким моментом для определения нескольких частиц в PM. С помощью сканирующей флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии и кросс-корреляционной N&B были исследованы взаимодействия белка-предшественника амилоида 1 (APLP1), белка синаптической мембраны.Впервые непосредственно в живых клетках показано, что APLP1 претерпевает специфические взаимодействия при межклеточных контактах. Кроме того, показано, что ионы цинка индуцируют образование больших кластеров APLP1, которые обогащаются в местах контакта и связываются с кластерами на противоположной клетке. В целом, эти результаты предоставляют прямые доказательства того, что APLP1 является зависимым от ионов цинка белком нейрональной адгезии. В контексте APLP1 наблюдались расхождения в оценках олигомерного состояния, которые были приписаны нефлуоресцентным состояниям выбранной метки красного флуоресцентного белка (FP) mCardinal (mCard).Поэтому систематически оценивались множественные FP и их эффективность в измерениях белковых взаимодействий на основе FFS. Исследование показало превосходные свойства мономерного усиленного зеленого флуоресцентного белка (mEGFP) и mCherry2. Кроме того, простая схема коррекции позволила провести объективные измерения олигомеризации белков in situ путем количественной оценки нефлуоресцентных фракций меток FP. Процедура была экспериментально подтверждена для биологически релевантных белковых комплексов, состоящих до 12 мономеров.В последней части этой работы флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) и отслеживание отдельных частиц (SPT) были использованы для характеристики динамики диффузионного транспорта в модели бактериальной биопленки. Биопленки представляют собой прикрепляющиеся к поверхности сообщества бактерий, структурная организация которых обеспечивается внеклеточными полимерными веществами (EPS), которые образуют вязкий полимерный гидрогель. Представленное исследование выявило размер зонда и зависящее от концентрации полимера (аномальное) препятствие диффузии в восстановленной матричной системе EPS, вызванное переплетением полимерных цепей при физиологических концентрациях.Этот результат указывает на сетчатую организацию матрицы биопленки, которая допускает свободную диффузию мелких частиц, но сильно препятствует диффузии более крупных частиц, таких как бактериофаги. Наконец, показано, что деполимеризация матрикса ферментами фагового происхождения быстро облегчает свободную диффузию. В контексте фаговых инфекций такие ферменты могут стать ключом к предотвращению захвата в матриксе биопленки и способствовать эффективному инфицированию бактерий. В сочетании с нанесением фага ферменты, деполимеризующие матрицу, могут открыть новые противомикробные стратегии против мультирезистентных бактериальных штаммов в качестве многообещающей и более специфической альтернативы обычным антибиотикам.

    Границы | От структуры белка к функции с помощью оптической спектроскопии монокристаллов

    Введение

    Структурная биология вносит значительный вклад в достижение текущей цели по раскрытию молекулярных основ биологических процессов, начиная от жизни и заканчивая гибелью клеток, от состояния здоровья до патологических состояний. Эти интенсивные усилия и обилие генерируемой информации хорошо обобщены поразительным увеличением количества белковых структур, определенных с помощью рентгеновской кристаллографии, которые хранятся в банке данных о белках (рис. 1).Принимая во внимание, что большинство структур обеспечивают только статическое представление белков, кристаллографические методы с временным разрешением (Moffat, 1989; Hajdu, 1993; Hajdu et al., 2000; Schlichting and Chu, 2000) еще больше расширили исследования конформации белков. пейзаж. Наряду с этими усилиями, самые недавние достижения с использованием фемтосекундных импульсов от рентгеновских лазеров на свободных электронах позволили обнаружить ранние молекулярные события, вызванные светом на фотосистеме II (Kupitz et al., 2014) и фотоактивном желтом белке (Tenboer et al., 2014), открывая новые возможности для понимания динамики и функции белков.

    Рис. 1. Общее количество белковых структур, депонированных в Банк данных по белкам за год до конца 2014 г. (www.pdb.org) .

    Белковые структуры — это ключевая информация для различных областей исследований, в которых структурные данные используются для достижения очень разных целей, таких как выяснение взаимодействия белок-белок, определение каталитических механизмов ферментов и аллостерических регуляций, разработка лекарств через структуру. основанные и основанные на компьютере методы, понимание гибкости белка с помощью моделирования молекулярной динамики и прогнозирование структур белка с помощью моделирования гомологии.Следовательно, соответствие между структурой белка, определенной в кристалле, и структурой в растворе имеет решающее значение. Есть по крайней мере три различных вопроса, которые могут повлиять на определение и интерпретацию кристаллической структуры. Во-первых, кристаллическая структура — это модель, созданная с помощью ряда экспериментальных и вычислительных шагов, включая подгонку электронной плотности к аминокислотной последовательности, лиганду и молекулам воды, а также минимизацию энергии для устранения стерических конфликтов.В модели положение каждого атома связано с фактором B, который зависит от подвижности атома, и состояние протонирования ионизируемых групп не может быть определено, за исключением случаев, когда разрешение лучше, чем примерно 1 Å. Во-вторых, существует множество возможных «артефактов» кристаллов, включая эффекты, связанные с составом кристаллизационной среды, ограничениями сил решетки и повреждением рентгеновским излучением. В-третьих, нативный белок представляет собой совокупность множества различных конформаций, создающих так называемый энергетический ландшафт (Frauenfelder et al., 1991; Bryngelson et al., 1995; Карлсон, 2002; Boehr et al., 2009; Нусинов, Цай, 2014). Хорошо известно, что наиболее стабильная и самая густонаселенная конформация белка не обязательно является видом, который играет наиболее важную функциональную роль. Более того, менее растворимая конформация белка, вероятно, будет выбрана в процессе кристаллизации.

    Эти соображения вызывают несколько вопросов:

    — Какая конформация выбирается кристаллизацией и насколько она активна?

    — Насколько кристаллизованная конформация отличается от активной в растворе?

    — Как можно количественно оценить активность белка в кристалле и сравнить с его активностью в растворе?

    Ответ на эти вопросы для большинства белковых структур, депонированных в PDB, недостаточен.С более чем 100 000 решенных структур функциональные / спектроскопические / динамические измерения были выполнены для менее чем 100 белков в кристаллическом состоянии. В свою очередь, это означает, что многие функции белков и механизмы регуляции основаны на слабых основаниях, и многие исследования, направленные на разработку лекарств, используют шаткую конформацию мишени.

    Оценка функции белка в кристаллическом состоянии спектроскопическими методами

    Функциональные свойства в кристаллическом состоянии исследовались на протяжении многих лет с использованием преимущественно двух различных подходов: (i) измерение активности фермента на микрокристаллических суспензиях и (ii) спектроскопические исследования на монокристаллах.Первый подход включает анализы активности в условиях, в которых фермент находится в кристаллическом состоянии, а размер кристаллов таков, что скорость каталитической реакции не ограничивается диффузией реагента к активным центрам фермента и от них. Подходящий размер кристаллов рассчитывается по формуле, разработанной несколько лет назад на заре структурной биологии (Hoogenstraaten and Sluyterman, 1969). Этот редко используемый подход был использован для оценки активности микрокристаллов триптофансинтазы папаина (Hoogenstraaten and Sluyterman, 1969) (Ahmed et al., 1987) и пиридоксаль-5′-фосфат (PLP) -зависимые ферменты, инкапсулированные во влажные нанопористые силикагели микрометрового размера (Pioselli et al., 2004, 2005).

    Второй подход основан на спектроскопических методах, которые позволяют измерять динамические и функциональные свойства монокристаллов белка того же качества и размера, что и те, которые используются для структурного определения. К ним относятся микроспектрофотометрия поглощения в УФ-видимом диапазоне, микроспектрофлуориметрия, микроРамана и резонансного комбинационного рассеяния света, ИК и ЭПР.Наблюдаются спектральные изменения эндогенных или экзогенных хромофорных зондов, отражающие молекулярные события белка. Ранее было опубликовано несколько обзоров, обобщающих основные принципы, необходимые для проведения спектроскопических измерений на монокристаллах (Hofrichter, Eaton, 1976; Mozzarelli, Rossi, 1996; Pearson et al., 2004; Bourgeois and Royant, 2005; De La Mora- Rey and Wilmot, 2007; Pearson, Owen, 2009; Carey et al., 2011; McGeehan et al., 2011; Ronda et al., 2011b; Sage et al., 2011; фон Стеттен и др., 2015). Здесь мы преимущественно сосредоточимся на микроспектрофотометрии поглощения в УФ-видимой области, поскольку это наиболее широко используемый подход.

    Развитие оптической спектроскопии кристаллов белков в основном осуществлялось несколькими лабораториями (Eaton and Hochstrasser, 1967; Rossi and Bernhard, 1970; Berni et al., 1977; Eichele et al., 1978; Metzler et al., 1988). чтобы получить корреляцию между структурой и функцией из измерений, проводимых в одном и том же физическом состоянии.С увеличением числа решаемых белковых структур кристаллографы поняли важность и силу связи данных дифракции рентгеновских лучей со спектроскопическими измерениями. Это привело к развитию интерактивных и автономных микроспектрофотометров и лабораторий оптической спектроскопии на синхротронных объектах. Первый интерактивный микроспектрофотометр был разработан Hajdu (1993) и применен для исследования высвобождения фосфата, вызванного фотолизом связанного соединения, 3,5-динитрофенилфосфата, в кристаллах гликогенфосфорилазы b (Hadfield and Hajdu, 1994). ).Первая оптическая лаборатория в режиме онлайн и в автономном режиме была создана в ESRF Буржуа и его коллегами (Bourgeois et al., 2002), а затем реализована Гарманом (McGeehan et al., 2009) и Royant (von Stetten et al. ., 2015). В настоящее время спектроскопические приборы на основе монокристаллов присутствуют на большинстве синхротронов с каналами, предназначенными для кристаллографии белков (Pearson et al., 2004; Pearson and Owen, 2009; Pearson and Mozzarelli, 2011; von Stetten et al., 2015) (Таблица 1). Геометрия интерактивного микроспектрофотометра значительно варьируется от объекта к объекту в зависимости от геометрии линии пучка и конкретных потребностей.Некоторые проблемы и возможности онлайн-микроспектрофотометра для измерения УФ-видимой абсорбции, флуоресценции и комбинационного рассеяния были совсем недавно обобщены для оборудования, доступного в ESRF (von Stetten et al., 2015). Однако следует отметить, что не все онлайн-приборы работают с линейно поляризованным светом, что является строгим требованием для получения интенсивности поглощения, строго пропорциональной толщине кристалла, концентрации хромофора и коэффициентам экстинкции, т.е.е., спектры, подчиняющиеся закону Бера-Ламберта (Hofrichter, Eaton, 1976). Когда используется неполяризованный свет, только качественная информация получается из спектров, которые обычно имеют более низкое качество. В любом случае такие неполяризованные спектры полезны для определения возникновения реакции, для мониторинга динамики накопления и распада метастабильных промежуточных продуктов и окислительно-восстановительного состояния белка. Эта информация имеет решающее значение для определения времени замерзания-мигания в криокристаллографических экспериментах.Кроме того, спектроскопические измерения монокристаллов ценны для оценки того, вызывает ли рентгеновское излучение какое-либо нежелательное воздействие на кристаллы белка (Leiros et al., 2006 и ссылки в нем). К повреждениям, которые могут быть обнаружены спектроскопически, относятся фотовосстановление металлов, например превращение трехвалентного железа в двухвалентное и разрушение дисульфидов (см. Ниже), тогда как декарбоксилирование можно оценить только структурными методами, включая масс-спектрометрию.

    Таблица 1. Прибор для спектроскопии монокристаллов на синхротронных центрах .

    Примеры корреляции структуры и функции белка в кристаллическом состоянии

    В последние годы измерения монокристаллической оптической спектроскопии были выполнены для нескольких белков, как показано в таблице 2. Здесь мы сообщаем о некоторых репрезентативных исследованиях функции белков в кристаллическом состоянии, проведенных в нашей лаборатории, и о нескольких исследованиях, проведенных в других лабораториях. .

    Таблица 2. Белки, исследованные методом монокристаллической оптической микроспектрофотометрии с 2011 г. .

    Гемоглобины

    Аллостерическая модель Monod, Wyman and Changeux (MWC) была разработана для объяснения сигмоидальных кривых связывания, которые характеризуют взаимодействие между лигандами и некоторыми олигомерными белками (Monod et al., 1965). За прошедшие годы несколько исследований поставили под сомнение обоснованность модели MWC, примененной к Hb (Eaton et al., 1999, 2007; Peracchi and Mozzarelli, 2011), либо предлагая ее расширение, либо полностью отвергая. Ключевые предположения модели MWC состоят в том, что (i) существуют только два четвертичных состояния, T и R, и наделены разными функциональными свойствами, и (ii) в каждом четвертичном состоянии связывание лиганда полностью не кооперативно.Чтобы проверить достоверность модели MWC, были определены кривые связывания кислорода для кристаллов Hb, удерживаемых в T-состоянии силами решетки (Mozzarelli et al., 1991, 1997; Rivetti et al., 1993a; Bettati et al., 2009). . Поскольку структуры гемоглобина в отсутствие и в присутствии кислорода были получены из кристаллов, выращенных из полиэтиленгликоля того же размера и качества (Liddington et al., 1992; Paoli et al., 1996), что и использованные для функциональных измерений, простая структура -функция отношения могут быть выведены.Спектры поглощения были зарегистрированы как функция давления кислорода с помощью монокристаллического микроспектрофотометра (рис. 2A) с использованием света, линейно поляризованного вдоль кристаллических осей a и c орторомбических пластин (рис. 2B) (Mozzarelli et al., 1991; Rivetti). et al., 1993a). Фракционное насыщение определяли путем подгонки наблюдаемых спектров к линейной комбинации чистого дезокси-, окси- и metHb плюс базовый уровень (рис. 2C) (Ronda et al., 2008). Было обнаружено, что связывание кислорода не кооперативно, с p50, т.е.е., давление кислорода при половинном насыщении 130–150 торр при 15 ° C (табл. 3). Это сродство такое же, как у первой молекулы кислорода, которая связывается с Hb, определенное в растворе в присутствии сильных аллостерических эффекторов (Marden et al., 1990; Bruno et al., 2007). Чтобы оценить роль солевых мостиков и остатков на границе раздела α 1 β 2 в контроле сродства к кислороду, были построены кривые связывания для desArgHb (Kavanaugh et al., 1995), desHisHb (Bettati et al., 1997), кристаллы Cowtown Hb (His β146Leu) (Bettati et al., 1998) и для Hb Rothschild (Trp β37Arg) (Rivetti et al., 1993b), Tyr β35Phe, Tyr β35Ala (Kavanaugh et al., 2001) , Asn β108Gly, Asn β102Ala, Tyr β35Ala, Trp β37Glu и Tyr α42Ala (Noble et al., 2001) (таблица 3). Эти измерения подтвердили, что связывание кислорода с Hb в Т-состоянии не является кооперативным, конформация с низким сродством стабилизируется в кристалле, а His β146 играет ограниченную роль в контроле сродства к кислороду и ключевую роль в четвертичном переходе, как также недавно было предложено на основе по вычислительному анализу (Fischer et al., 2011). Примечательно, что влияние мутаций на сродство к кислороду, обнаруженное для мутантных кристаллов Hb, было таким же, как наблюдаемое в растворе для связывания первого кислорода. Кроме того, наблюдалась хорошая корреляция между p50 этих мутантов Hb, определенными в кристалле, и скоростью реакции первой молекулы CO с Hb в растворе (Noble et al., 2002). В целом, функциональные свойства, обнаруженные в кристаллах Hb в Т-состоянии, были такими же, как и в растворе в присутствии сильных аллостерических эффекторов.Надежность функциональных данных, полученных в кристаллах, была дополнительно оценена путем инкапсуляции Hb во влажные нанопористые силикагели либо в T-, либо в R-четвертичном состоянии в отсутствие и в присутствии аллостерических эффекторов (Shibayama and Saigo, 1995; Bettati and Mozzarelli, 1997; Abbruzzetti et al., 2001; Bruno et al., 2001a; Ronda et al., 2006). Инкапсуляция белков в силикагелях — мощная стратегия стабилизации третичных / четвертичных состояний (Bruno et al., 2011). Кривые связывания кислорода кристалла и геля Hb в отсутствие и в присутствии аллостерических эффекторов полностью совпадают (рис. 3).Эти эксперименты по равновесию инициировали обширную серию экспериментов по лазерному импульсному фотолизу повторного связывания CO с гелями Hb в состояниях T и R (Abbruzzetti et al., 2001; Viappiani et al., 2004, 2014), которые поддерживают третичное двойное состояние (TTS ) модель Eaton и сотрудников. Эта модель расширяет MWC с учетом существовавших ранее третичных равновесий, частично не связанных с четвертичными состояниями (Henry et al., 2002; Eaton et al., 2007). Модель TTS была дополнительно подтверждена резонансными рамановскими спектроскопическими исследованиями гелей Hb, отслеживающими четвертичный переход (Jones et al., 2012, 2014). Интересно отметить, что исследования гемоглобина, зафиксированного в определенном четвертичном состоянии путем кристаллизации или инкапсуляции, позволили выявить конформационные свойства, которые ускользают от внимания в растворе из-за мешающего перекрытия связывания и третичной и четвертичной релаксации.

    Рис. 2. (A) Спектры поглощения кристаллов Hb, собранные как функция давления кислорода между 0 и 760 торр, с электрическим вектором линейно поляризованного света, параллельным кристаллографическим осям a и c выращенных орторомбических кристаллов из полиэтиленгликоля размером около 20 × 60 мкм (Rivetti et al., 1993а). В спектрах кристаллов дезокси-Hb наблюдается пик примерно при 555 нм, тогда как в спектрах окси-Hb наблюдаются пики примерно при 541 и 577 нм. (B) Доля насыщения кислородом рассчитывалась путем аппроксимации наблюдаемого спектра (сплошная линия), записанного при определенном давлении кислорода, линейной комбинации (пунктирная линия) эталонных спектров, deoxyHb, oxyHb, metHb и базовой линии ( пунктирные линии) (Rivetti et al., 1993a). (C) Проекция гема вдоль оси кристаллов a, и c, которая приводит к более высокой интенсивности поглощения для спектров, записанных вдоль оси a .

    Таблица 3. Параметры связывания кислорода кристаллами гемоглобина .

    Рис. 3. Сравнение кривых связывания кислорода HbA в кристалле, в геле и в растворе . Связывание кислорода с: кристаллами Hb C в состоянии R (красная непрерывная линия) (Shibayama et al., 2011), гелями гемоглобина в состоянии R (красная пунктирная линия) (Shibayama and Saigo, 1995), в состоянии R Hb в растворе (красная штриховка -штриховая линия) (Yonetani et al., 2002), кристаллы Hb в Т-состоянии (синяя непрерывная линия) (Mozzarelli et al., 1997), гели в Т-состоянии в присутствии аллостерических эффекторов (синяя пунктирная линия) (Viappiani et al., 2004), гемоглобин в растворе в присутствии аллостерических эффекторов (синяя пунктирная линия) (Yonetani et al. , 2002), гели гемоглобина в Т-состоянии в отсутствие аллостерических эффекторов (зеленая пунктирная линия) (Bruno et al., 2001a), Т-состояние гемоглобина в растворе в отсутствие аллостерических эффекторов (зеленая пунктирная линия) (Poyart и др., 1978).

    Замечательное исследование было недавно проведено путем определения структуры и сродства связывания кислорода для девяти равновесных конформеров частично и полностью лигированных β – β-сшитых людей [α (Fe 2+ -CO) β (Ni 2+ ). )] [α (Ni 2+ ) β- (Fe 2+ -CO)] Hb в присутствии и отсутствии фосфата на трех изоморфных кристаллах, охватывающих конформации Hb от T до R2 (Shibayama et al., 2014). Был также идентифицирован ранее не идентифицированный промежуточный конформер между T и R, проявляющий промежуточное сродство к кислороду. Выявят ли эти находки новые функциональные и конформационные особенности Hb, еще предстоит установить, учитывая конформационные ограничения поперечного сшивания металло-гибридных производных Hb.

    Микроспектрофотометрические исследования монокристаллов Hbs рыб, а также HbI и HbII из Scapharca inaequivalvis представляют собой хорошие примеры функциональных и структурных данных, которые полностью согласуются и привели к прямой корреляции структура-функция в объяснении кооперативного поведения (Ronda et al. ., 2013а). Кривые связывания кислорода были определены для кристаллов гомодимерного HbI и обнаружили, что HbI проявляет в кристаллическом состоянии ту же кооперативность, что и в растворе (Mozzarelli et al., 1996). Это открытие полностью соответствует предположению, основанному на структурных данных, что чисто третичные конформационные изменения ответственны за кооперативное поведение (Chiancone et al., 1990). Кривые связывания кислорода тетрамерного HbII в кристалле, а также в гелях оказались явно некооперативными (Ronda et al., 2013a) (рисунок 4). Однако, когда была принята во внимание значительная функциональная неэквивалентность цепей A и B, данные связывания кислорода как кристаллами, так и инкапсулированными гелем HbII согласовывались с третичным вкладом в кооперативность, количественно аналогичным измеренному для HbI, как было предложено на основе X -дифракционные данные. Кроме того, результаты показывают, что для полной экспрессии кооперативного связывания лиганда HbII также требуются четвертичные переходы, затрудненные кристаллической решеткой и инкапсуляцией геля.

    Рис. 4. Сравнение кривых связывания кислорода HbII из Scapharca inaequivalvis в кристалле, в геле и в растворе . Связывание кислорода с: кристаллами HbII, выращенными в 2,2 M фосфате, измеренные при линейной поляризации света в двух перпендикулярных направлениях (штрих-пунктирная линия и штрих-точка), гели HbII в состоянии R (штрихпунктирная линия), HbII в состоянии T гели (сплошная линия), HbII в растворе (закрашенные перевернутые треугольники) (Ronda et al., 2013a).

    Чтобы получить представление об эффекте Рут, заметной зависимости сродства к кислороду и кооперативности от концентрации протонов, наблюдаемой в Hbs рыб, были проведены структурные и функциональные исследования кристаллов дезокси-Hb из антарктической рыбы Trematomus bernacchii (HbTb) при pH 6.2 и pH 8,4 (Ronda et al., 2013b). Принимая во внимание, что при низком pH лигирование вызывает незначительные структурные изменения, наблюдение, которое коррелирует с низким сродством и отсутствием кооперативности в связывании кислорода, при высоком pH лигирование вызывает значительные третичные изменения в Т-состоянии. Кривые связывания кислорода кристаллов HbTb в Т-состоянии соответствовали структурным данным. Эти находки показывают, что в отличие от Hbs млекопитающих в HbTb значительная степень кооперативности в связывании кислорода связана с третичными конформационными изменениями.Те же кристаллы HbTb были исследованы с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния в зависимости от дозы облучения, чтобы понять стабильность нитрозилированных производных (Merlino et al., 2013). Было обнаружено, что фотодиссоциация NO, инициируемая излучением, вызывает конформационный переход в бета-цепи, образуя пентакоординированный вид.

    В целом, спектроскопические исследования кристаллов Hbs позволили однозначно связать структурные изменения, обнаруженные кристаллографически, с молекулярными событиями, запускаемыми связыванием лиганда и, в конечном итоге, связанными с кооперативностью, а также различать структурные изменения, связанные с функцией и не связанные с функцией.

    Ферменты

    Монокристаллическая микроспектрофотометрия применялась для характеристики связывания лиганда и каталитической компетентности многих ферментов. В некоторых случаях использовались аналоги хромофорного субстрата, тогда как в большинстве случаев сигналы, генерируемые кофакторами, связанными с активным сайтом, отслеживались как подходящие репортеры молекулярных событий, связанных с функцией фермента.

    Типичными примерами исследований являются пиридоксаль-5′-фосфат (PLP) -зависимые ферменты цистализин (Spyrakis et al., 2014) и метионин-гамма-лиазой (Ronda et al., 2011a), а также железосодержащей катехол-1,2-диоксигеназой (Micalella et al., 2011).

    PLP представляет собой кофермент ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, аминов и кетокислот (Mozzarelli and Bettati, 2006). Спектральные свойства PLP зависят от связанного с ферментом субстрата, аналогов субстрата, ингибиторов и каталитических промежуточных продуктов, что дает сигнал для определения констант связывания и скорости реакций. Несколько PLP-зависимых ферментов были исследованы в кристаллическом состоянии, включая аспартатаминотрансферазу (Eichele et al., 1978; Моцарелли и др., 1979; Metzler et al., 1988), серингидроксиметилтрансфераза (Schirch et al., 1981), триптофансинтаза (Mozzarelli et al., 1989), цистатионин-бета-лиаза (Bruno et al., 2001b), O -ацетилсеринсульфгидрилаза ( Mozzarelli et al., 1998), DOPA-декарбоксилаза (Peracchi et al., 1994) и аминотрансфераза GABA (Storici et al., 2004).

    Цистализин катализирует расщепление цистеина на пируват, аммиак и сульфид. Фермент считается фактором вирулентности при пародонтите у взрослых, поскольку сульфид способствует гемолизу, поддерживая выживание и распространение патогенов в десневой щели.По этой причине цистализин является многообещающей мишенью для антибиотиков (Amadasi et al., 2007). Трехмерная структура фермента была определена в отсутствие и в присутствии неспецифического ковалентного ингибитора AVG (Krupka et al., 2000). Чтобы использовать эти структуры для кампании виртуального скрининга, направленной на идентификацию потенциальных ингибиторов активного центра, структура цистализина была сначала подтверждена путем определения спектральных свойств и связывания лиганда с помощью микроспектрофотометрии поглощения монокристаллов (Spyrakis et al., 2014). В целом, фермент в кристалле и в растворе демонстрирует одинаковые спектры поглощения для каталитических промежуточных продуктов, аналогичные значения pK и для остатка, контролирующего образование форм кетоенамина, и близкие константы диссоциации для глицина, серина и метионина (Рисунок 5). . На этом этапе проверки структура цистализина была использована в виртуальном скрининге, проводимом с использованием FLAP (Baroni et al., 2007). Был получен список соединений, которые, по прогнозам, действуют как обратимые нековалентные ингибиторы активного центра.Соединения были закреплены в активном центре цистализина с использованием GOLD (Jones et al., 1995), их энергия взаимодействия была оценена с помощью HINT (Kellogg et al., 2001; Spyrakis et al., 2004, 2007a, b; Amadasi et al., 2006). ; Marabotti et al., 2008; Salsi et al., 2010), а комплексы соединение-фермент проверяли визуально. Были отобраны 17 лучших соединений и проанализированы в растворе, выявлены два ингибитора с K i 25 и 37 мкМ (Spyrakis et al., 2014).

    Рис. 5. Связывание аналогов субстрата с PLP-зависимыми кристаллами цистализина .Спектры поглощения регистрировали в отсутствие (сплошная линия) и в присутствии (пунктирная линия) насыщающих концентраций (A) глицина, (B) L-серина и (C) L-метионина. Вставки: подгонка точек данных титрования к изотермам связывания с K d из (A) 6,3 ± 0,3 мМ, (B) 16 ± 2 мМ и (C) 33 ± 5 мМ (Spyrakis et al. ., 2014).

    Микроспектрофотометрическое исследование монокристаллов (Ronda et al., 2011a) было проведено на метионин-γ-лиазе (MGL), ферменте, который катализирует реакцию γ-элиминирования L-метионина с образованием α-кетомасляной кислоты, метантиола и аммиака.Свободные и ПЭГилированные MGL являются потенциальными биофармацевтическими препаратами против рака, поскольку раковые клетки демонстрируют сильную зависимость от метионина, а доставленные MGL способны снижать уровень метионина в клеточной среде (Takakura et al., 2006). Кроме того, MGL может активировать пролекарственный трифторметионин, который является признанным антибиотиком (Coombs and Mottram, 2001). Для применения в терапии рака, MGL должен быть генетически модифицирован, чтобы улучшить его каталитическую эффективность и стабильность, тогда как для использования в качестве эффективного пролекарственного активатора для антибиотикотерапии его активный центр должен быть полностью картирован, чтобы создать новый , более эффективно активируемые пролекарства.Следовательно, в обоих случаях наличие трехмерной структуры MGL дикого типа является фундаментальным требованием. Чтобы подтвердить структуру MGL, кристаллы фермента реагировали с субстратом метионином (рис.6), аналогом субстрата винилглицином и конкурентными ингибиторами глицином и циклосерином, контролируя реакцию с помощью микроспектрофотометрии монокристаллов (Ronda et al., 2011a). Было обнаружено, что наблюдаемые константы диссоциации несколько выше, чем в растворе, что указывает на некоторые изменения конформационного распределения в кристалле по отношению к раствору.Это открытие предполагает, что эту структуру MGL следует рассматривать с некоторой осторожностью и следует проводить дальнейшие действия для кристаллизации полностью активных MGL. Кроме того, трехмерная структура нативного фермента, определенная из кристаллов, выращенных в PEG, в присутствии сульфата аммония, выявила отсутствие альдиминовой связи между активным центром Lys210 и PLP, тогда как спектры поглощения, полученные для тех же кристаллов фермента согласуются с наличием альдиминовой связи.Различные гипотезы были предложены и обсуждены в свете спектральных и структурных данных.

    Рис. 6. Связывание метионина с кристаллами PLP-зависимой гамма-лиазы метионина . Спектры поляризованного поглощения регистрировали вдоль двух перпендикулярных направлений (светло-серый и темно-серый) для фермента в отсутствие (сплошные линии) и в присутствии 100 мМ L-метионина (пунктирная линия) (Ronda et al., 2011a).

    Катехол-1,2-диоксигеназа — это Fe (III) -зависимый фермент, который катализирует оксигенацию катехина и замещенных колец.Fe (III) координируется в тригонально-бипирамидной геометрии двумя остатками гистидина, двумя остатками тирозина и ионом гидроксила в экваториальной плоскости. Когда катехол связывается в активном центре, аксиальный тирозин и гидроксильный лиганд замещаются, обеспечивая прямую координацию диола с Fe (III). Фермент демонстрирует широкую полосу с центром около 440 нм, указывающую на переход заряда лиганд-Fe (III), типичный для координации тирозината с ионом Fe. Когда фермент связывает катекол ненадлежащим образом (т.е., в анаэробных условиях) наблюдается уменьшение интенсивности полосы 440 нм. Для определения структуры выделенных интермедиатов были получены поляризованные спектры поглощения на монокристаллах катехол-1,2-диоксигеназы из Acinetobacter radioresistens (Ar-1,2-CTD) (Micalella et al., 2011). Тем самым подтверждено сохранение координации металла в кристаллическом состоянии. Как и в растворе, непродуктивное связывание катехола наблюдалось в анаэробных условиях.Спектры также коррелировали с трехмерными структурами дикого типа и двумя мутантами, проявляющими более высокую специфичность к хлорокатеколам и разработанными в качестве основы для биореакторов, которые будут использоваться в биоремедиации (Micalella et al., 2014). В целом согласованность спектроскопических свойств Ar-1,2-CTD в растворе и в кристаллическом состоянии указывает на то, что координация Fe (III) и связывание лиганда, наблюдаемые с помощью рентгеновской кристаллографии, отражают свойства фермента в растворе.

    Зеленые флуоресцентные белки

    Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea victoria является прототипом большого семейства флуоресцентных белков (FP) морских организмов, демонстрирующих генетически закодированную яркую флуоресценцию в нескольких областях видимого спектра (Cubitt et al., 1995; Пахомов, Мартынов, 2008). Более того, FP были экстенсивно разработаны для получения сотен вариантов, характеризующихся отдельными флуоресцентными полосами, испускающимися от желтого до голубого, часто наделенными pH и редокс-чувствительными свойствами (Zhang et al., 2002; Remington, 2011). Эндогенный хромофор образуется в результате внутренней автокаталитической посттрансляционной модификации (циклизации и окисления) с участием трех консервативных аминокислот. Ключевым фактором, определяющим спектральную изменчивость FP, является природа и состояние ионизации остатков, окружающих эндогенный хромофор (Tsien, 1998).

    Несмотря на обилие структурной информации (из исследований дифракции рентгеновских лучей и, отчасти, ЯМР) и функциональных данных в растворе, на монокристаллах ФП было проведено лишь несколько исследований абсорбционной, флуоресцентной и рамановской спектроскопии (Bettati et al. др., 2011). В пионерских исследованиях Ward и соавторов использовалась стационарная флуоресценция с временным разрешением, чтобы убедиться, что кристаллизация не вызывает значительных структурных искажений (Perozzo et al., 1988). Несколько лет спустя две разные группы использовали поляризацию флуоресценции (Inoue et al., 2002) и микроспектрофотометрии поглощения поляризованного света (Rosell and Boxer, 2003; Royant and Noirclerc-Savoye, 2011) для извлечения информации о геометрических соотношениях между направлениями дипольных моментов хромофорных переходов, осями кристаллов и координатами белков. Такая информация представляет большой потенциальный интерес для спектроскопических приложений, основанных на геометрических факторах и их функционально-зависимых вариациях, таких как, например, резонансная передача энергии Форстера (FRET). Несколько других групп использовали спектроскопию кристаллов для подтверждения корреляции между кристаллическими структурами и спектроскопическими свойствами в растворе (Battistutta et al., 2000; Мало и др., 2007). Однако наиболее впечатляющие усилия по объединению спектроскопии монокристаллов с кристаллографическими исследованиями ФП были предприняты в последние годы Буржуа с соавторами (Royant et al., 2007; Adam et al., 2008, 2009; Lelimousin et al., 2009). ; Виолот и др., 2009). Специализированные абсорбционные и флуоресцентные спектрометры, собранные в Европейском центре синхротронного излучения в Гренобле, Франция, оснащены системой коррелированного по времени однофотонного счета для измерения времени жизни флуоресценции в кристаллическом состоянии или в растворе, при комнатной и криогенной температурах, а также рамановском режиме. зонд, который можно использовать в автономном режиме от микроспектрофотометра или в режиме онлайн с дифрактометрами (McGeehan et al., 2011). Это устройство использовалось для исследования структурной основы фотообесцвечивания, индуцированного рентгеновскими лучами или видимым светом, IrisFP, мутанта EosFP, способного к различным свойствам фотопреобразования, таким как необратимое фотопреобразование из зеленого в красный и обратимое фотопереключение между флуоресцентным и темным состояниями (Адам et al., 2008, 2009; Duan et al., 2013, 2014).

    С целью лучшего понимания взаимодействия между динамикой белковой матрицы и фотохимией и фотофизикой GFP, уделяя особое внимание кислотно-основным свойствам, наша группа в настоящее время исследует зависимость спектров поглощения кристаллов GFPmut2 от pH (Ser65Ala). , Val68Leu, Ser72Ala GFP), выращенные в щелочных или кислых условиях.Оба кристалла демонстрируют обратимые, зависящие от pH спектральные изменения, со значениями pK a и формами кривой перехода, которые отличаются друг от друга, а также от зависимости от pH, определенной в растворе. Эти результаты лежат в основе текущих исследований дифракции рентгеновских лучей, направленных на определение структурной основы наблюдаемого поведения и роли ключевых остатков, которые, как известно, влияют на структурную динамику GFP и состояние протонирования хромофора. Эти действия еще раз подчеркивают необходимость соотнесения структурной и функциональной информации, собранной в одном и том же физическом состоянии.

    Обнаружение повреждения кристаллов белка рентгеновским излучением спектроскопическими методами

    Во многих исследованиях сообщалось, что интенсивные рентгеновские лучи вызывают повреждение белков, вызывая сомнения в качестве решаемых белковых структур и создавая ограничения для структурного определения с высоким разрешением. Таким образом, в исследованиях проанализированы основные факторы, приводящие к радиационному повреждению белков (Garman and Weik, 2013).

    Проблема радиационного поражения, хорошо известная с момента появления кристаллографии белков, в течение многих лет ограничивалась сбором данных при криогенных температурах.Тем не менее, как (i) появление синхротронных источников третьего поколения, способных доставлять гораздо более высокие дозы излучения, и (ii) повышенный интерес к сбору рентгеновских данных при комнатной температуре как способу наблюдения биологически значимых конформаций, вызвали увеличение степень радиационного поражения. Это, в свою очередь, привело к возобновлению интереса к влияющим на них факторам. В частности, широко признано, что температура оказывает существенное влияние на определение степени повреждений, вызванных рентгеновскими лучами, а эффективное повреждение заметно зависит от общего количества нанесенных фотонов (Davis et al., 2013).

    Многие дополнительные методы, такие как оптическая люминесценция белковых кристаллов с возбуждением рентгеновскими лучами (Owen et al., 2012), электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) (Utschig et al., 2008), поглощение УФ-видимого излучения и поглощение рентгеновского излучения. спектроскопия (XAFS) (Antonyuk and Hough, 2011) была связана с кристаллографией для лучшего понимания процессов, связанных с радиационным повреждением, с целью предоставления практических рекомендаций по оптимизации условий сбора данных (Pearson et al., 2007; Херслет и Андерссон, 2011). Возможной стратегией уменьшения радиационного повреждения во время сбора данных кристаллографии белков является добавление поглотителей радикалов на стадии кристаллизации или замачивание кристаллов в растворе улавливателя радикалов перед сбором данных. Этот подход дал противоречивые результаты, в основном из-за расхождений в показателях для оценки повреждений и вариабельности реакций кристаллизационной среды с поглотителями радикалов, как продемонстрировала микроспектрофотометрия в режиме онлайн (Allan et al., 2013). Здесь мы сообщаем о нескольких репрезентативных случаях исследований с использованием спектроскопии кристаллов белка и рентгеновской кристаллографии для оценки радиационных повреждений.

    Путем комбинирования ЭПР, микроспектрофотометрии поглощения в УФ-видимой области в реальном времени и измерений рентгеновской кристаллографии было тщательно исследовано влияние рентгеновского излучения на кристаллы лизоцима. ЭПР показал радикализацию дисульфидной связи при дозе ~ 0,2 МГр, что ниже насыщающей дозы 0,5–0,8 МГр, наблюдаемой с помощью микроспектрофотометрии в УФ-видимом диапазоне для повреждения дисульфидной связи.Это исследование продемонстрировало, что дисульфидные связи снижаются при дозовом режиме облучения, который обычно применяется для сбора данных (Sutton et al., 2013). В аналогичном исследовании оценивали дозозависимое радиационное повреждение для бактериородопсина (Борщевский и др., 2014).

    Металлические центры в металлопротеинах особенно чувствительны к радиационному повреждению. Фотовосстановление имеет решающее значение при исследовании окислительно-восстановительных белков, поскольку белки вначале находятся в окисленном состоянии и восстанавливаются в конце сбора данных.Это, в свою очередь, может вызвать конформационные изменения и неопределенность во взаимосвязи структура-окислительно-восстановительное состояние белка и производных механизмов. В совсем недавней статье (Kekilli et al., 2014) сообщается о подробном исследовании кристаллов гемопротеина, подвергшихся воздействию синхротронного излучения, с помощью резонансной рамановской спектроскопии. Кроме того, кристаллы бычьей каталазы в отсутствие и в присутствии аммиака и оксида азота были исследованы с помощью рентгеновской кристаллографии и микроспектрофотометрии в реальном времени, выявив фотовосстановление центрального гемового железа (Purwar et al., 2011). Фотовосстановление редокс-активных белковых кофакторов также изучалось для ионов Mn в кислород-выделяющем комплексе фотосистем II (ФСII) с помощью рентгеновской эмиссионной спектроскопии с детектированием с дисперсией по длине волны (Davis et al., 2013). Ионы Mn, содержащиеся в активных центрах ФС II, находятся в степени окисления Mn (III) и Mn (IV) и, как известно, при рентгеновском облучении претерпевают фотовосстановление до Mn (II) и расщепление Mn di-μ. -oxo единицы (Yano et al., 2005). Радиационное повреждение ФСII было изучено на кинетической модели при различных экспериментальных скоростях наложения дозы и длине волны возбуждения.Было замечено, что высокая скорость нанесения дозы может быть полезной с точки зрения уменьшения радиационного повреждения чувствительных образцов, хотя высокая скорость нанесения дозы может генерировать другие радикалы или инициировать другие процессы (Davis et al., 2013).

    Структуры бычьего инсулина Т6 в комплексе с Ni ( 2+ ) и Cu ( 2+ ) были решены с использованием синхротронного излучения, что свидетельствует об ухудшении координации воды для сайта Cu (II) производного инсулина из-за радиационное повреждение.Спектры поглощения рентгеновских лучей (XAS) и спектроскопия ЭПР были использованы для получения информации о координации металлов и окислительно-восстановительном состоянии металла. Было обнаружено, что в производном инсулина меди во время индуцированного облучением фотовосстановления координационная геометрия изменяется в сторону более низких координационных чисел. Различные повреждения были изучены в зависимости от дозы облучения с использованием различных методов, то есть фотовосстановление контролировалось с помощью XANES, в то время как дифрактометр использовался для отслеживания структурных изменений вокруг атомов Cu.Твердое включение инсулина Cu в матрицу сахарозы частично подавляло фотовосстановление при 100 К, а дополнительное 30% подавление было получено путем охлаждения образцов до 20 К (Frankaer et al., 2014).

    Противоречия и синергия между рентгеновской кристаллографией и монокристаллической ультрафиолетовой и видимой микроспектрофотометрией

    Здесь мы обсуждаем репрезентативные случаи сильных расхождений между простыми результатами функциональных исследований, проведенных в кристалле, и структурной функциональной интерпретацией, а репрезентативные случаи, когда микроспектрофотометрические измерения были инструментами для определения структуры.

    Первый случай представляет собой структуру частично связанного лиганда человеческого Hb, где, по-видимому, только субъединицы α показали связанный кислород. Был сделан вывод, что тетрамер Hb функционально сильно асимметричен с кислородной нагрузкой и разгрузкой только α-гемами (Brzozowski et al., 1984). Поскольку спектры поляризованного поглощения, измеренные вдоль осей кристалла a и c , зависят от суммы проекций гемов α и β вдоль этих осей, а гемы α и β вносят различный вклад вдоль оптических осей кристалла, было возможно рассчитать отдельные кривые связывания кислорода и определить, что α-субъединицы связывают кислород со сродством примерно в два раза выше, чем β-субъединицы (Mozzarelli et al., 1997). Этот результат полностью согласуется с исследованиями растворов смешанного металлического гибрида Hb, α (Fe 2+ ) 2 β (Ni 2+ ) 2 , α (Ni 2+ ) 2 β ( Fe 2+ ) 2 , α (Fe 2+ ) 2 β (Zn 2+ ) 2 , αZn 2+ ) 2 β (Fe 2+ ) 2 (Shibayama et al., 1993; Miyazaki et al., 1999), а также на смешанных металлических гибридных кристаллах Hb (Bettati et al., 1996, 2009; Bruno et al., 2000). Эти результаты не могут быть согласованы с какой-либо основанной на структуре гипотезой о высокой разнице в сродстве к кислороду между α и β субъединицами и указывают на кристаллографические ловушки.

    Второй случай основан на сравнении гемоглобина с лигандом и без лиганда в Т-состоянии в присутствии аллостерических эффекторов. Был сделан вывод, что связывание кислорода связано со стабилизацией межсубъединичной коммуникации / конформации, ответственной за кооперативность в Т-состоянии (Paoli et al., 1997).Однако кривые связывания кислорода с Hb в кристаллах систематически характеризовались коэффициентом Хилла, близким к единице (таблица 3) (Bettati et al., 2009), что указывает на отсутствие кооперативности в Т-состоянии. Этот результат был подтвержден на всех проанализированных кристаллах Hb, включая металлогидриды и мутанты (таблица 3). Соответствующий и общий вывод из этих двух случаев состоит в том, что не все структурные изменения, обнаруженные кристаллографически, связаны с функциональными ролями. Следовательно, следует проявлять некоторую осторожность при «прямом» использовании структурных данных для предположения белковых механизмов.

    Первый пример очень тесной взаимодополняемости между микроспектрофотометрическими измерениями и рентгеновской кристаллографией представлен NAD-зависимым гликолитическим ферментом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH). Этот фермент был одним из первых, структурно охарактеризованных Россманном и соавторами (Moras et al., 1975), и одним из первых, исследованных с помощью микроспектрофотометрии (Berni et al., 1977; Mozzarelli et al., 1982). GAPDH катализирует окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-бисфосфоглицерата в присутствии NAD + и фосфата.Несмотря на интенсивные исследования, проводившиеся в течение нескольких десятилетий, структурное определение каталитического промежуточного соединения ацил-фермент оставалось неуловимым. С помощью микроспектрофотометрических исследований, контролирующих при 340 нм образование НАДН на монокристаллах GAPDH из Bacillus stearothermophilus , были определены экспериментальные условия накопления метастабильного промежуточного ацил-фермента (Moniot et al., 2008). На основании этих результатов кристаллы GAPDH пропитывались субстратом при требуемой концентрации субстрата в течение определенного времени перед мгновенным замораживанием.Определение структуры тиоацил-фермента позволило предложить новый каталитический механизм, при котором C3-фосфатная группа субстрата изменяет свою конформацию одновременно или после окислительно-восстановительной стадии.

    Второй характерный случай взаимодополняющей роли спектроскопии монокристаллов и рентгеновской кристаллографии — это исследование флавин-зависимого фермента фенилацетонмонооксигеназы (PAMO) из Thermobifida fusca (Orru et al., 2011). ПАМО катализирует энантиоселективное окисление Байера-Виллигера и сульфоксидирование фенилацетона, а также других субстратов.Монокристаллические УФ-видимые спектры фермента, собранные до и после восстановления и охлаждения при 100 К, а также после плавления и выдержки на воздухе, позволили исследовать окислительно-восстановительное состояние флавина и каталитическую способность фермента. Кроме того, спектры кристаллов PAMO, записанные в режиме реального времени при сборе рентгеновских данных, свидетельствовали о прогрессирующем снижении флавина в зависимости от воздействия рентгеновских лучей, таким образом определяя временное окно для структурного определения.

    Еще одним интересным примером сочетания рентгеновской кристаллографии и абсорбции, флуоресценции и рамановской спектроскопии монокристаллов является исследование молекулярного механизма необычно большого стоксового сдвига mKeima, мономерного красного флуоресцентного белка (Violot et al., 2009). Рамановские спектры на mKeima в кристаллическом состоянии позволили рационализировать специфическую зависимость полос поглощения от pH, поддерживая эффект «обратного протонирования», согласующийся с кристаллографическими данными, собранными при различных значениях pH. В отличие от нормального поведения GFP-подобных белков, цис- и транс-хромофорные конформации доминируют при кислом и щелочном pH соответственно.

    Выводы

    Монокристаллическая спектроскопия предоставляет ключевую функциональную информацию о белках в кристаллической решетке, позволяя оценить, вызвали ли силы решетки, конформационный отбор и рентгеновское облучение появление «артефактических» структур.Эти исследования имеют первостепенное значение, учитывая разнообразие научных областей, в которых структурные данные используются для понимания функции белков или для разработки новых лекарств. Растущее использование кристалл-спектрометров в режиме онлайн и в автономном режиме в синхротронных источниках ясно указывает на то, что только благодаря тесной связи между рентгеновской кристаллографией и спектроскопией можно предложить значимую и надежную структуру белка и функциональную корреляцию. В этом контексте оптическая спектроскопия монокристаллов оказалась наиболее широко используемым и наиболее мощным методом.

    Авторские взносы

    LR, SB, SB и PS внесли свой вклад в написание и подготовку рисунков, AM задумал работу и внес свой вклад в написание.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Сокращения

    PDB, банк данных белков; FP, флуоресцентный белок; Hb, гемоглобин; PLP, пиридоксаль-5′-фосфат; MGL, метионин-γ-лиаза.

    Список литературы

    Аббруццетти, С., Виаппиани, К., Бруно, С., Беттати, С., Боначчо, М., и Моцарелли, А. (2001). Функциональная характеристика гемовых белков, инкапсулированных во влажных нанопористых силикагелях. J. Nanosci. Нанотехнологии . 1, 407–415. DOI: 10.1166 / jnn.2001.058

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Adam, V., Carpentier, P., Violot, S., Lelimousin, M., Darnault, C., Nienhaus, G.U., et al. (2009). Структурные основы индуцированного рентгеновскими лучами временного фотообесцвечивания в фотоактивируемом зеленом флуоресцентном белке. J. Am. Chem. Soc . 131, 18063–18065. DOI: 10.1021 / ja6v

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Adam, V., Lelimousin, M., Boehme, S., Desfonds, G., Nienhaus, K., Field, M. J., et al. (2008). Структурная характеристика IrisFP, оптического маркера, подвергающегося множественным фотоиндуцированным преобразованиям. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 105, 18343–18348. DOI: 10.1073 / pnas.0805949105

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ахмед, С.А., Хайд, К. К., Томас, Г., и Майлз, Э. У. (1987). Микрокристаллы комплекса триптофансинтазы альфа 2 бета 2 из Salmonella typhimurium являются каталитически активными. Биохимия 26, 5492–5498. DOI: 10.1021 / bi00391a042

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Амадаси А., Бертольди М., Контестабиле Р., Беттати С., Челлини Б., ди Сальво, М. Л. и др. (2007). Пиридоксаль-5′-фосфатные ферменты как мишени для терапевтических агентов. Curr. Med. Chem . 14, 1291–1324. DOI: 10.2174 / 092986707780597899

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Амадаси А., Спиракис Ф., Коццини П., Абрахам Д. Дж., Келлог Г. Э. и Моцарелли А. (2006). Картирование энергетики взаимодействий вода-белок и вода-лиганд с «естественным» силовым полем HINT: инструменты прогнозирования для характеристики роли воды в биомолекулах. J. Mol. Биол . 358, 289–309. DOI: 10.1016 / j.jmb.2006.01.053

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Барони М., Кручиани Г., Шиабола С., Перруччо Ф. и Мейсон Дж. С. (2007). Общая справочная структура для анализа / сравнения белков и лигандов. Отпечатки пальцев для лигандов и белков (FLAP): теория и применение. J. Chem. Инф. Модель . 47, 279–294. DOI: 10.1021 / ci600253e

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Баттистутта, Р., Негро, А., и Занотти, Г. (2000). Кристаллическая структура и свойства рефолдинга мутанта зеленого флуоресцентного белка F99S / M153T / V163A. Белки 41, 429–437. DOI: 10.1002 / 1097-0134 (20001201) 41: 4 <429 :: AID-PROT10> 3.0.CO; 2-D

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бейтлих, Т., Кунель, К., Шульце-Бризе, К., Шуман, Р. Л., и Шлихтинг, И. (2007). Криорадиолитическое восстановление кристаллических гемовых белков: анализ УФ-видимой спектроскопией и рентгеновской кристаллографией. Дж. Синхротронный Радиат . 14, 11–23. DOI: 10.1107 / S09006049806

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Берни Р., Моцарелли А., Пеллакани Л. и Росси Г. Л. (1977). Каталитические и регулирующие свойства D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в кристалле. Спектральные свойства и химическая реакционная способность промежуточного хромофорного ацилфермента. J. Mol. Биол . 110, 405–415. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (77) 80079-X

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Беттати, С., Квятковски, Л. Д., Кавано, Дж. С., Моцарелли, А., Арноне, А., Росси, Г. Л. и др. (1997). Структура и сродство к кислороду кристаллического дез-гист-146beta человеческого гемоглобина в состоянии T. J. Biol. Chem . 272, 33077–33084. DOI: 10.1074 / jbc.272.52.33077

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Беттати, С., и Моцарелли, А. (1997). Гемоглобин в Т-состоянии некооперированно связывает кислород с аллостерическими эффектами протонов, гексафосфата инозита и хлорида. J. Biol. Chem . 272, 32050–32055. DOI: 10.1074 / jbc.272.51.32050

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Беттати, С., Моцарелли, А., и Перуц, М. Ф. (1998). Аллостерический механизм гемоглобина: разрыв солевых мостиков повышает сродство Т-структуры к кислороду. J. Mol. Биол . 281, 581–585. DOI: 10.1006 / jmbi.1998.1983

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Беттати, С., Моцарелли А., Росси Г. Л., Цунешигэ А., Йонетани Т., Итон В. А. и др. (1996). Связывание кислорода монокристаллами гемоглобина: проблема кооперативности и неэквивалентности альфа- и бета-субъединиц. Белки 25, 425–437. DOI: 10.1002 / prot.3

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Беттати, С., Паскуалетто, Э., Лолли, Г., Кампанини, Б., и Баттистутта, Р. (2011). Структура и спектроскопия монокристаллов зеленых флуоресцентных белков. Biochim. Биофиз. Acta 1814, 824–833. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2010.10.002

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Борщевский В., Раунд Е., Ерофеев И., Вейк М., Ищенко А., Гущин И. и др. (2014). Рентгеновское излучение в малых дозах вызывает структурные изменения белков. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 70, 2675–2685. DOI: 10.1107 / S139

  • 14017295

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Буржуазный, Д., Вернеде, X., Адам, В., Фиораванти, Э., и Урсби, Т. (2002). Микроспектрофотометр для исследования поглощения и флуоресценции кристаллов белка в УФ-видимом диапазоне. J. Appl. Крист . 35, 319–326. DOI: 10.1107 / S0021889802003837

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бруно С., Беттати С., Манфредини М., Моцарелли А., Болоньези М., Дериу Д. и др. (2000). Связывание кислорода кристаллами альфа (Fe2 +) 2beta (Ni2 +) 2 гемоглобина. Protein Sci . 9, 683–692. DOI: 10.1110 / л.с. 9.4.683

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бруно, С., Боначчо, М., Беттати, С., Риветти, К., Виаппиани, К., Аббруццетти, С., и др. (2001a). Конформации гемоглобина в Т-состоянии с высоким и низким сродством к кислороду. Protein Sci . 10, 2401–2407. DOI: 10.1110 / пс. 20501

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бруно, С., Ронда, Л., Аббруцетти, С., Виаппиани, К., Беттати, С., Maji, S., et al. (2011). «Инкапсуляция белков, конформации и нанобиоинструменты», в энциклопедии нанонауки и нанотехнологий , , изд. Х. С. Налва (Валенсия, Калифорния: American Scientific Publishers), 481–517.

    Google Scholar

    Бруно С., Ронда Л., Беттати С. и Моцарелли А. (2007). Улавливание гемоглобина в жестких матрицах: точная настройка свойств связывания кислорода путем изменения протоколов инкапсуляции. Artif. Клетки кровяного субстрата. Иммобиль. Биотехнология .35, 69–79. DOI: 10.1080 / 107311974541

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бруно С., Скьяретти Ф., Буркхард П., Краус Дж. П., Яносик М. и Моцарелли А. (2001b). Функциональные свойства активного ядра кристаллов цистатионин-бета-синтазы человека. J. Biol. Chem . 276, 16–19. DOI: 10.1074 / jbc.C000588200

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Брюнгельсон, Дж.Д., Онучич, Дж. Н., Соччи, Н. Д. и Волинс, П. Г. (1995). Воронки, пути и энергетический ландшафт сворачивания белка: синтез. Белки 21, 167–195. DOI: 10.1002 / prot.340210302

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Brzozowski, A., Derewenda, Z., Dodson, E., Dodson, G., Grabowski, M., Liddington, R., et al. (1984). Связь молекулярного кислорода с гемоглобином человека в Т-состоянии. Природа 307, 74–76. DOI: 10.1038 / 307074a0

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Chiancone, E., Верзили Д., Боффи А., Ройер В. Э. мл. И Хендриксон В. А. (1990). Кооперативный гемоглобин с напрямую сообщающимися гемами. Гомодимер Scapharca inaequivalvis . Biophys. Chem . 37, 287–292. DOI: 10.1016 / 0301-4622 (90) 88028-Q

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кумбс, Г. Х., и Моттрам, Дж. К. (2001). Трифторметионин, пролекарство, разработанное против патогенов, содержащих метионин-гамма-лиазу, обладает эффективностью in vitro и in vivo против Trichomonas vaginalis . Антимикробный. Агенты Chemother . 45, 1743–1745. DOI: 10.1128 / AAC.45.6.1743-1745.2001

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кубит, А. Б., Хайм, Р., Адамс, С. Р., Бойд, А. Э., Гросс, Л. А., и Цзян, Р. Ю. (1995). Понимание, улучшение и использование зеленых флуоресцентных белков. Trends Biochem. Sci . 20, 448–455. DOI: 10.1016 / S0968-0004 (00) 89099-4

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дэвис, К.М., Кошелева И., Хеннинг Р. В., Зайдлер Г. Т., Пушкарь Ю. (2013). Кинетическое моделирование рентгеновского повреждения металлопротеина. J. Phys. Chem. B 117, 9161–9169. DOI: 10.1021 / jp403654n

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Де Ла Мора-Рей, Т., и Уилмот, К. М. (2007). Синергия в рамках структурной биологии оптической спектроскопии монокристаллов и рентгеновской кристаллографии. Curr. Opin. Struct. Биол . 17, 580–586.DOI: 10.1016 / j.sbi.2007.09.005

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Duan, C., Adam, V., Byrdin, M., Ridard, J., Kieffer-Jaquinod, S., Morlot, C., et al. (2013). Структурные доказательства двухрежимного механизма фотообесцвечивания обратимо переключаемого флуоресцентного белка. J. Am. Chem. Soc . 135, 15841–15850. DOI: 10.1021 / ja406860e

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Eaton, W.А., Генри, Э. Р., Хофрихтер, Дж., Беттати, С., Виаппиани, К., и Моцарелли, А. (2007). Эволюция аллостерических моделей гемоглобина. IUBMB Life 59, 586–599. DOI: 10.1080/15216540701272380

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эйхеле Г., Карабельник Д., Халонбреннер Р., Янсониус Дж. Н. и Кристен П. (1978). Каталитическая активность кристаллов митохондриальной аспартатаминотрансферазы, обнаруженная с помощью микроспектрофотометрии. J. Biol. Chem . 253, 5239–5242.

    PubMed Аннотация | Полный текст | Google Scholar

    Эллис, М. Дж., Баффи, С. Г., Хаф, М. А., и Хаснайн, С. С. (2008). Оперативная оптическая и рентгеновская спектроскопия с кристаллографией: комплексный подход к определению структур металлопротеинов в функционально четко определенных состояниях. Дж. Синхротронный Радиат . 15, 433–439. DOI: 10.1107 / S09008014945

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Frankaer, C.Г., Моссин, С., Шталь, К., и Харрис, П. (2014). К точной структурной характеристике металлических центров в кристаллах белков: структуры производных бычьего инсулина Ni и Cu T (6). Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 70, 110–122. DOI: 10.1107 / S139

  • 13029040

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст

    Graczer, E., Merli, A., Singh, R.K, Karuppasamy, M., Zavodszky, P., Weiss, M. S., et al. (2011). Описание закрытия домена на атомном уровне в димерном ферменте: Thermus thermophilus 3-изопропилмалатдегидрогеназа. Mol. Биосист . 7, 1646–1659. DOI: 10.1039 / c0mb00346h

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хайду, Дж., Нойтце, Р., Сьегрен, Т., Эдман, К., Сёке, А., Уилмут, Р. К., и др. (2000). Анализ функций белков в четырех измерениях. Nat. Struct. Биол . 7, 1006–1012. DOI: 10.1038 / 80911

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Hoogenstraaten, W., и Sluyterman, A.Э. (1969). Активность папаина в кристаллическом состоянии. Biochim. Биофиз. Acta 171, 284–287.

    PubMed Аннотация | Полный текст

    Иноуэ, С., Шимомура, О., Года, М., Шрибак, М., и Тран, П. Т. (2002). Поляризация флуоресценции зеленого флуоресцентного белка. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 99, 4272–4277. DOI: 10.1073 / pnas.062065199

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джонсон, Б.Дж., Юкл, Э.Т., Клема, В. Дж., Клинман, Дж. П., и Уилмот, К. М. (2013). Структурные снимки окислительной полуреакции аминоксидазы меди: значение для активации O2. J. Biol. Chem . 288, 28409–28417. DOI: 10.1074 / jbc.M113.501791

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джонс, Э. М., Балакришнан, Г., Спиро, Т. Г. (2012). Реакционная способность гема не связана с четвертичной структурой в инкапсулированном в гель гемоглобине: исследование методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния. J. Am. Chem. Soc . 134, 3461–3471. DOI: 10.1021 / ja210126j

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джонс, Э. М., Монца, Э., Балакришнан, Г., Блуин, Г. К., Мак, П. Дж., Чжу, К. и др. (2014). Дифференциальный контроль реактивности гема в альфа- и бета-субъединицах гемоглобина: комбинированное рамановское спектроскопическое и вычислительное исследование. J. Am. Chem. Soc . 136, 10325–10339. DOI: 10.1021 / ja503328a

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кавано, Дж.С., Чафин, Д. Р., Арноне, А., Моцарелли, А., Риветти, К., Росси, Г. Л. и др. (1995). Структура и сродство к кислороду кристаллического desArg141 альфа гемоглобина человека A в состоянии T. J. Mol. Биол . 248, 136–150. DOI: 10.1006 / jmbi.1995.0207

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кавано, Дж. С., Вейдерт, Дж. А., Роджерс, П. Х., Арноне, А., Хуэй, Х. Л., Вежба, А. М. и др. (2001). Сайт-ориентированные мутации человеческого гемоглобина в остатке 35beta: остаток на пересечении интерфейсов alpha1beta1, alpha1beta2 и alpha1alpha2. Protein Sci . 10, 1847–1855. DOI: 10.1110 / пс. 16401

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст

    Кекилли Д., Дворковски Ф. С., Помпидор Г., Фукс М. Р., Эндрю К. Р., Антонюк С. и др. (2014). Отпечатки окислительно-восстановительных и лигандных состояний в кристаллических структурах гемпротеинов с помощью резонансной рамановской спектроскопии. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 70, 1289–1296. DOI: 10.1107 / S139

  • 14004039

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Келлог, Г.Е., Бернетт, Дж. К., и Абрахам, Д. Дж. (2001). Очень эмпирическое рассмотрение сольватации и энтропии: силовое поле, полученное из log Po / w. J. Comput. Помощь Мол. Des . 15, 381–393. DOI: 10.1023 / A: 1011136228678

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Крупка, Х. И., Хубер, Р., Холт, С. К., и Клаузен, Т. (2000). Кристаллическая структура цистализина из Treponema denticola : пиридоксаль-5′-фосфат-зависимый белок, действующий как гемолитический фермент. EMBO J . 19, 3168–3178. DOI: 10.1093 / emboj / 19.13.3168

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Купиц К., Басу С., Гротйоханн И., Фромме Р., Зацепин Н. А., Рендек К. Н. и др. (2014). Последовательная кристаллография фотосистемы II с временным разрешением с использованием фемтосекундного рентгеновского лазера. Nature 513, 261–265. DOI: 10.1038 / природа13453

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лейрос, Х.К., Тимминс, Дж., Равелли, Р. Б., и МакСвини, С. М. (2006). Зависит ли радиационное повреждение от мощности дозы, используемой при сборе данных макромолекулярной кристаллографии? Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 62, 125–132. DOI: 10.1107 / S043627

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Lelimousin, M., Noirclerc-Savoye, M., Lazareno-Saez, C., Paetzold, B., Le Vot, S., Chazal, R., et al. (2009). Внутренняя динамика в ECFP и Cerulean контролирует квантовый выход флуоресценции. Биохимия 48, 10038–10046. DOI: 10.1021 / bi

    3w

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лиддингтон Р., Деревенда З., Додсон Э., Хаббард Р. и Додсон Г. (1992). Кристаллические структуры высокого разрешения и сравнение дезоксигемоглобина в Т-состоянии и двух лигандированных гемоглобинов в Т-состоянии: Т (альфа-окси) гемоглобина и Т (мет) гемоглобина. J. Mol. Биол . 228, 551–579. DOI: 10.1016 / 0022-2836 (92) -8

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мало, Г.D., Pouwels, L.J., Wang, M., Weichsel, A., Montfort, W.R., Rizzo, M.A., et al. (2007). Рентгеновская структура Cerulean GFP: хромофор на основе триптофана, полезный для визуализации времени жизни флуоресценции. Биохимия 46, 9865–9873. DOI: 10.1021 / bi602664c

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Маработти, А., Спиракис, Ф., Факкиано, А., Коццини, П., Альберти, С., Келлог, Г. Э. и др. (2008). Прогнозирование распознавания аминокислотных и нуклеотидных оснований на основе энергии. J. Comput. Chem . 29, 1955–1969. DOI: 10.1002 / jcc.20954

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    МакГихан, Дж., Равелли, Р. Б., Мюррей, Дж. У., Оуэн, Р. Л., Сиприани, Ф., МакСвини, С. и др. (2009). Окраска криоохлажденных кристаллов: онлайн-микроспектрофотометрия. Дж. Синхротронный Радиат . 16, 163–172. DOI: 10.1107 / S0900

  • 29

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    МакГихан, Дж.Э., Буржуа Д., Роян А. и Карпентье П. (2011). Рамановская кристаллография биомолекул на синхротроне: приборы, методы и приложения. Biochim. Биофиз. Acta 1814, 750–759. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2010.07.021

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Merlino, A., Fuchs, M. R., Pica, A., Balsamo, A., Dworkowski, F. S., Pompidor, G., et al. (2013). Селективная индуцированная рентгеновскими лучами фотодиссоциация NO в кристаллах гемоглобина: данные кристаллографического исследования с использованием комбинационного рассеяния света. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 69, 137–140. DOI: 10.1107 / S04

    2229

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Metzler, C.M., Mitra, J., Metzler, D.E., Makinen, M.W., Hyde, C.C., Rogers, P.H., et al. (1988). Корреляция поляризованных абсорбционных спектроскопических и рентгеноструктурных исследований кристаллической цитозольной аспартатаминотрансферазы сердец свиней. J. Mol. Биол . 203, 197–220. DOI: 10.1016 / 0022-2836 (88)

    -7

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Micalella, C., Caglio, R., Mozzarelli, A., Valetti, F., Pessione, E., Giunta, C., et al. (2014). Гели Ормосил, допированные модифицированными катехол-1,2-диоксигеназами для биоремедиации хлорокатехинов. Biotechnol. Прил. Биохим . 61, 297–303. DOI: 10.1002 / bab.1162

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Micalella, C., Martignon, S., Bruno, S., Pioselli, B., Caglio, R., Valetti, F., et al. (2011). Рентгеновская кристаллография, масс-спектрометрия и микроспектрофотометрия монокристаллов: многопрофильная характеристика катехол-1,2-диоксигеназы. Biochim. Биофиз. Acta 1814, 817–823. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2010.09.008

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Миядзаки Г., Моримото Х., Юн К. М., Парк С. Ю., Накагава А., Минагава Х. и др. (1999). Магний (II) и цинк (II) -протопорфирин IX стабилизируют самое низкое сродство к кислороду гемоглобина человека даже сильнее, чем дезоксигем. J. Mol. Биол . 292, 1121–1136. DOI: 10.1006 / jmbi.1999.3124

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Монио, С., Bruno, S., Vonrhein, C., Didierjean, C., Boschi-Muller, S., Vas, M., et al. (2008). Улавливание промежуточного соединения тиоацилглицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Bacillus stearothermophilus . Прямое доказательство наличия триггерного механизма. J. Biol. Chem . 283, 21693–21702. DOI: 10.1074 / jbc.M802286200

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Морас Д., Олсен К. В., Сабесан М. Н., Бюнер М., Форд Г. К. и Россманн М.Г. (1975). Исследование асимметрии трехмерной структуры D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы омара. J. Biol. Chem . 250, 9137–9162.

    PubMed Аннотация | Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли А., Берни Р., Росси Г. Л., Вас М., Барта Ф. и Келети Т. (1982). Изомеризация белков при НАД + -зависимой активации бета (2-фурил) акрилоилглицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в кристалле. J. Biol. Chem . 257, 6739–6744.

    PubMed Аннотация | Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли А., Беттати С., Пуччи А. М., Буркхард П. и Кук П. Ф. (1998). Каталитическая способность O-ацетилсеринсульфгидрилазы в кристалле исследована с помощью поляризованной абсорбционной микроспектрофотометрии. J. Mol. Биол . 283, 135–146. DOI: 10.1006 / jmbi.1998.2038

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли, А., Беттати, С., Риветти, К., Росси, Г. Л., Колотти, Г., и Чианконе, Э. (1996). Совместное связывание кислорода с гемоглобином Scapharca inaequivalvis в кристалле. J. Biol. Chem . 271, 3627–3632. DOI: 10.1074 / jbc.271.7.3627

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли А., Оттонелло С., Росси Г. Л. и Фазелла П. (1979). Каталитическая активность аспартатаминотрансферазы в кристалле. Равновесный и кинетический анализ. Eur. J. Biochem .98, 173–179. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1979.tb13174.x

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли А., Перакки А., Росси Г. Л., Ахмед С. А. и Майлз Э. У. (1989). Микроспектрофотометрические исследования монокристаллов комплекса триптофансинтазы альфа 2 бета 2 демонстрируют образование промежуточных продуктов фермент-субстрат. J. Biol. Chem . 264, 15774–15780.

    PubMed Аннотация | Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли, А., Риветти, К., Росси, Г. Л., Итон, В. А., и Генри, Е. Р. (1997). Аллостерические эффекторы не изменяют сродство кристаллов гемоглобина к кислороду. Protein Sci . 6, 484–489. DOI: 10.1002 / pro.5560060230

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Моцарелли А., Риветти К., Росси Г. Л., Генри, Э. Р. и Итон, В. А. (1991). Кристаллы гемоглобина с четвертичной структурой Т не взаимодействуют с кислородом без эффекта Бора. Природа 351, 416–419.DOI: 10.1038 / 351416a0

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Нобл, Р. В., Хуэй, Х. Л., Квятковски, Л. Д., Пайли, П., Деянг, А., Вежба, А. и др. (2001). Мутационные эффекты на интерфейсах субъединиц человеческого гемоглобина: свидетельство уникальной чувствительности четвертичного состояния Т к изменениям в шарнирной области интерфейса альфа 1 бета 2. Биохимия 40, 12357–12368. DOI: 10.1021 / bi010988p

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ноубл, Р.В., Квятковски, Л. Д., Хуэй, Х. Л., Бруно, С., Беттати, С., и Моцарелли, А. (2002). Корреляция функциональных свойств белка в кристалле и в растворе: на примере гемоглобина в Т-состоянии. Protein Sci . 11, 1845–1849. DOI: 10.1110 / пс.0205702

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Орру Р., Дудек Х. М., Мартиноли К., Торрес Пазмино Д. Э., Роян А., Вейк М. и др. (2011). Снимки ферментативного катализа Байера-Виллигера: активация кислородом и промежуточная стабилизация. J. Biol. Chem . 286, 29284–29291. DOI: 10.1074 / jbc.M111.255075

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Орвилл А., Буоно Р., Коуэн М., Херу А., Ши-Маккарти Г., Шнайдер Д. К. и др. (2011). Коррелированная монокристаллическая электронная абсорбционная спектроскопия и рентгеновская кристаллография на канале NSLS X26-C. Дж. Синхротронный Радиат . 18, 358–366. DOI: 10.1107 / S09011006315

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Оуэн, Р.Л., Пирсон, А. Р., Минс, А., Бёлер, П., Томинет, В., и Шульце-Бризе, К. (2009). Новый многорежимный осевой спектрометр для кристаллографических макромолекулярных линий связи швейцарского источника света. Дж. Синхротронный Радиат . 16, 173–182. DOI: 10.1107 / S09008040120

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Оуэн, Р. Л., Йорк, Б. А., и Пирсон, А. Р. (2012). Возбужденная рентгеновскими лучами оптическая люминесценция белковых кристаллов: новый инструмент для изучения радиационных повреждений во время сбора дифракционных данных. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 68, 505–510. DOI: 10.1107 / S04

    2946

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Паоли М., Додсон Г., Лиддингтон Р. К. и Уилкинсон А. Дж. (1997). Напряжение в гемоглобине обнаруживается разрывом связи Fe-His (F8) в полностью связанном лиганом Т-состоянии. J. Mol. Биол . 271, 161–167. DOI: 10.1006 / jmbi.1997.1180

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Паоли, М., Лиддингтон, Р., Тейм, Дж., Уилкинсон, А., и Додсон, Г. (1996). Кристаллическая структура гемоглобина в Т-состоянии с кислородом, связанным на всех четырех геммах. J. Mol. Биол . 256, 775–792. DOI: 10.1006 / jmbi.1996.0124

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пирсон А. Р., Моцарелли А. (2011). Рентгеновская кристаллография объединяет спектроскопию, чтобы раскрыть структуру и функцию биологических макромолекул. Biochim. Биофиз. Acta 1814, 731–733.DOI: 10.1016 / j.bbapap.2011.04.010

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст

    Пирсон, А. Р., Пал, Р., Ковалёва, Э. Г., Дэвидсон, В. Л., и Уилмот, К. М. (2007). Отслеживание окислительно-восстановительных изменений, вызванных рентгеновскими лучами, в кристаллах комплекса метиламиндегидрогеназа / амицианин с использованием микроспектрофотометрии монокристаллов в УФ-видимом диапазоне. Дж. Синхротронный Радиат . 14, 92–98. DOI: 10.1107 / S09006051259

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Перакки, А., Моцарелли, А., Росси, Г., Доминичи, П., и Борри Вольтарторни, К. (1994). Монокристаллическая поляризованная абсорбционная микроспектрофотометрия ароматической декарбоксилазы L-аминокислоты. Белковый пепт. Lett . 1, 98–105.

    Пероццо, М. А., Уорд, К. Б., Томпсон, Р. Б., и Уорд, В. В. (1988). Дифракция рентгеновских лучей и флуоресцентный анализ с временным разрешением зеленых флуоресцентных кристаллов белка Aequorea. J. Biol. Chem . 263, 7713–7716.

    PubMed Аннотация | Полный текст | Google Scholar

    Пиоселли, Б., Беттати, С., Демидкина, Т. В., Закомирдина, Л. Н., Филлипс, Р. С., Моцарелли, А. (2004). Тирозинфеноллиаза и триптофаниндоллиаза, инкапсулированные во влажных нанопористых силикагелях: селективная стабилизация третичных конформаций. Protein Sci . 13, 913–924. DOI: 10.1110 / пс 03492904

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пурвар Н., МакГарри Дж. М., Костера Дж., Пачеко А. А. и Шмидт М. (2011). Взаимодействие оксида азота с каталазой: структурный и кинетический анализ. Биохимия 50, 4491–4503. DOI: 10.1021 / bi200130r

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Риветти К., Моцарелли А., Росси Г. Л., Генри, Э. Р. и Итон, В. А. (1993a). Связывание кислорода монокристаллами гемоглобина. Биохимия 32, 2888–2906. DOI: 10.1021 / bi00062a021

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Риветти, К., Моцарелли, А., Росси, Г. Л., Квятковски, Л.Д., Вежба А. М. и Нобл Р. В. (1993b). Влияние хлорида на связывание кислорода с кристаллами гемоглобина Ротшильда (beta 37 Trp–> Arg) в четвертичной структуре T. Биохимия 32, 6411–6418. DOI: 10.1021 / bi00076a014

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ронда Л., Бажулина Н. П., Морозова Е. А., Ревтович С. В., Чехов В. О., Никулин А. Д. и др. (2011a). Изучение взаимосвязи структура-функция метионин-гамма-лиазы с помощью микроспектрофотометрии и рентгеновской кристаллографии. Biochim. Биофиз. Acta 1814, 834–842. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2010.06.017

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ронда, Л., Беттати, С., Генри, Э. Р., Кашав, Т., Сандерс, Дж. М., Ройер, В. Е. и др. (2013a). Третичная и четвертичная аллостерия в тетрамерном гемоглобине из Scapharca inaequivalvis . Биохимия 52, 2108–2117. DOI: 10.1021 / bi301620x

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ронда, Л., Бруно, С., Фаджано, С., Беттати, С., и Моцарелли, А. (2008). Связывание кислорода с гем-белками в растворе, инкапсулированном в силикагелях, и в кристаллическом состоянии. Методы Энзимол . 437, 311–328. DOI: 10.1016 / S0076-6879 (07) 37016-X

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ронда, Л., Бруно, С., Виаппиани, К., Аббруццетти, С., Моцарелли, А., Лоу, К. С. и др. (2006). Спектроскопия кругового дихроизма третичных и четвертичных конформаций человеческого гемоглобина, заключенного во влажных силикагелях. Protein Sci . 15, 1961–1967. DOI: 10.1110 / пс. 062272306

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ронда, Л., Мерлино, А., Беттати, С., Верде, К., Бальзамо, А., Маццарелла, Л. и др. (2013b). Роль третичных структур в эффекте корня в гемоглобинах рыб. Biochim. Биофиз. Acta 1834, 1885–1893. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2013.01.031

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Роян, А., Carpentier, P., Ohana, J., McGeehan, J., Paetzold, B., Noirclerc-Savoye, M., et al. (2007). Успехи спектроскопических методов для биологических кристаллов. 1. Измерение времени жизни флуоресценции. J. Appl. Крист . 40, 1105–1112. DOI: 10.1107 / S0021889807044196

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сейдж Т., Чжан Ю., МакГихан Дж., Равелли Р., Вейк М. и ван Тор Дж. Дж. (2011). Инфракрасная кристаллография белков. Biochim. Биофиз. Acta 1814, 760–767.DOI: 10.1016 / j.bbapap.2011.02.012

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Салси, Э., Байден, А.С., Спиракис, Ф., Амадаси, А., Кампанини, Б., Беттати, С., и др. (2010). Разработка ингибиторов O -ацетилсеринсульфгидрилазы путем имитации природы. J. Med. Chem . 53, 345–356. DOI: 10.1021 / jm

    5e

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Самуни У., Ющак Л., Данцкер Д., Хан, И., Фридман, А. Дж., Перес-Гонсалес-Де-Аподака, Дж. И др. (2003). Функциональная и спектроскопическая характеристика полулигандированного гибридного железо-цинкового гемоглобина: свидетельство конформационной пластичности в Т-состоянии. Биохимия 42, 8272–8288. DOI: 10.1021 / bi020648j

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ширч Л., Моцарелли А., Оттонелло С. и Росси Г. Л. (1981). Микроспектрофотометрические измерения на монокристаллах митохондриальной серингидроксиметилтрансферазы. J. Biol. Chem . 256, 3776–3780.

    PubMed Аннотация | Полный текст | Google Scholar

    Шибаяма, Н., Сугияма, К., и Парк, С. Ю. (2011). Структуры и сродство к кислороду кристаллического человеческого гемоглобина C (beta6 Glu-> Lys) в четвертичных структурах R и R2. J. Biol. Chem . 286, 33661–33668. DOI: 10.1074 / jbc.M111.266056

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Симидзу, Н., Симидзу, Т., Баба, С., Хасегава, К., Ямамото, М., и Кумасака, Т. (2013). Разработка интерактивного микроспектрофотометра в УФ-видимом диапазоне для кристаллографического пучка макромолекул. Дж. Синхротронный Радиат . 20, 948–952. DOI: 10.1107 / S09013022887

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спиракис, Ф., Амадаси, А., Форнабайо, М., Абрахам, Д. Дж., Моцарелли, А., Келлог, Г. Э. и др. (2007a). Последствия подсчета конформаций стыкованного лиганда с использованием корреляций свободной энергии. Eur. J. Med. Chem . 42, 921–933. DOI: 10.1016 / j.ejmech.2006.12.037

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спиракис, Ф., Челлини, Б., Бруно, С., Бенедетти, П., Каросати, Э., Круциани, Г. и др. (2014). Нацелен на цистализин, фактор вирулентности Treponema denticola , поддерживающий пародонтит. ChemMedChem 9, 1501–1511. DOI: 10.1002 / cmdc.201300527

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спиракис, Ф., Cozzini, P., Bertoli, C., Marabotti, A., Kellogg, G.E., and Mozzarelli, A. (2007b). Энергетика взаимодействия белок-ДНК-вода. BMC Struct. Биол . 7: 4. DOI: 10.1186 / 1472-6807-7-4

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спайракис, Ф., Форнабайо, М., Коццини, П., Моцарелли, А., Абрахам, Д. Дж., И Келлог, Г. Э. (2004). Компьютерный анализ титрования мультипротического комплекса протеаза-лиганд ВИЧ-1. J. Am. Chem. Soc .126, 11764–11765. DOI: 10.1021 / ja0465754

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Стоунер-Ма, Д., Скиннер, Дж. М., Шнайдер, Д. К., Коуэн, М., Свит, Р. М., и Орвилл, А. М. (2011). Монокристаллическая рамановская спектроскопия и рентгеновская кристаллография на канале X26-C NSLS. Дж. Синхротронный Радиат . 18, 37–40. DOI: 10.1107 / S09010033601

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сторичи, П., Де Биасе, Д., Босса, Ф., Бруно, С., Моцарелли, А., Пенефф, К. и др. (2004). Структуры аминотрансферазы гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), пиридоксаль-5′-фосфата и фермента, содержащего кластер [2Fe-2S], в комплексе с гамма-этинил-ГАМК и противоэпилептическим препаратом вигабатрином. J. Biol. Chem . 279, 363–373. DOI: 10.1074 / jbc.M305884200

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Саттон, К. А., Блэк, П. Дж., Мерсер, К. Р., Гарман, Э.Ф., Оуэн, Р. Л., Снелл, Э. Х. и др. (2013). Понимание механизма индуцированного рентгеновскими лучами разрыва дисульфидной связи в кристаллах лизоцима на основе исследований ЭПР, оптического поглощения и дифракции рентгеновских лучей. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 69, 2381–2394. DOI: 10.1107 / S04

    2117

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Такакура Т., Ито Т., Яги С., Ноцу Ю., Итакура Т., Накамура Т. и др. (2006). Высокий уровень экспрессии и массовая кристаллизация рекомбинантной L-метионин гамма-лиазы, противоракового агента. Заявл. Microbiol. Биотехнология . 70, 183–192. DOI: 10.1007 / s00253-005-0038-2

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Тенбоер, Дж., Басу, С., Зацепин, Н., Панде, К., Милатианаки, Д., Франк, М., и др. (2014). Последовательная кристаллография с временным разрешением фиксирует промежуточные продукты фотоактивного желтого белка с высоким разрешением. Наука 346, 1242–1246. DOI: 10.1126 / science.1259357

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Утчиг, Л.М., Чемерисов, С. Д., Тиеде, Д. М., Полуэктов, О. Г. (2008). Исследование радиационных повреждений в кристаллах фотосинтетических реакционных центров с помощью электронного парамагнитного резонанса. Биохимия 47, 9251–9257. DOI: 10.1021 / bi800574e

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Viappiani, C., Abbruzzetti, S., Ronda, L., Bettati, S., Henry, E. R., Mozzarelli, A., et al. (2014). Экспериментальная основа новой аллостерической модели мультисубъединичных белков. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 111, 12758–12763. DOI: 10.1073 / pnas.1413566111

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Viappiani, C., Bettati, S., Bruno, S., Ronda, L., Abbruzzetti, S., Mozzarelli, A., et al. (2004). Новое понимание аллостерических механизмов улавливания нестабильных белковых конформаций в силикагелях. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 101, 14414–14419. DOI: 10.1073 / pnas.0405987101

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Виолот, С., Карпентье, П., Бланшуан, Л., и Буржуа, Д. (2009). Обратная зависимость протонирования хромофора от pH объясняет большой стоксов сдвиг красного флуоресцентного белка mKeima. J. Am. Chem. Soc . 131, 10356–10357. DOI: 10.1021 / ja

    5n

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    фон Штеттен, Д., Жиро, Т., Карпентье, П., Север, Ф., Терриен, М., Добиас, Ф. и др. (2015). В кристаллооптической спектроскопии (icOS) в качестве дополнительного инструмента на каналах макромолекулярной кристаллографии ESFR. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр . 71, 15–26. DOI: 10.1107 / S139

  • 1401517X

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Яно Дж., Керн Дж., Иррганг К. Д., Латимер М. Дж., Бергманн У., Глатцель П. и др. (2005). Рентгеновское повреждение комплекса Mn4Ca в монокристаллах фотосистемы II: пример кристаллографии металлопротеинов. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 102, 12047–12052. DOI: 10.1073 / pnas.0505207102

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Йонетани Т., Парк, С. И., Цунешигэ, А., Имаи, К., и Канаори, К. (2002). Глобальная аллостерическая модель гемоглобина. Модуляция сродства O (2), кооперативности и эффекта Бора гетеротропными аллостерическими эффекторами. J. Biol. Chem . 277, 34508–34520. DOI: 10.1074 / jbc.M203135200

    PubMed Аннотация | Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    .
  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *