Комби лада: Безопасность. Аксессуары для LADA Kalina хэтчбек

Все характеристики: Автомобиль ваз 21140 lada samara, категория тс: в, тип тс: легковые, комби (Хэтчбек), год выпуска: 2006, идентификационный номер (Vin): xta21140064290871, модель № двигателя: 2111, 4479530, № кузова: 4290871, цвет: серебристый металлик, мощность двигателя (Квт/л.с.): 56.00/76.14, птс 63Мм, 047051, 15.09.2006Г., гос.рег.знак к813Ес56.

Высокопроизводительный скрининг с использованием FRET с временным разрешением дает актин-связывающие соединения, которые модулируют структуру и функцию актин-миозин.

Abstract

Мы использовали новый метод FRET с временным разрешением (TR-FRET) для обнаружения малых молекул модуляторы актин-миозиновой структуры и функции. Актин-миозиновые взаимодействия играют решающую роль в генерации клеточной силы и движения. Многочисленные мутации и посттрансляционные модификации актина или миозина нарушают мышечную функцию и вызывают опасные для жизни синдромы.Здесь мы использовали биосенсор FRET для идентификации модуляторов, которые связываются с интерфейсом актин-миозин и изменяют структурную динамику этого комплекса. Мы прикрепили флуоресцентный донор к актину по Cys-374 и нефлуоресцентный акцептор к пептиду, содержащему 12 N-концевых аминокислот длинной изоформы основной легкой цепи миозина скелетных мышц. Сайт связывания актина этого акцепторно-меченного пептида (ANT) перекрывается с сайтом миозина, на что указывает ( a ) аналогичное расстояние, наблюдаемое в комплексе актин-ANT, как и в комплексе актин-миозин, и ( b ). ) значительное снижение актин-ANT FRET при связывании миозина.Высокопроизводительный FRET-скрининг библиотеки малых молекул (NCC, 727 соединений) с использованием уникального считывания времени жизни флуоресценции с беспрецедентной скоростью и точностью показал, что FRET значительно зависит от 10 соединений в микромолярном диапазоне. Большинство из этих «ударов» изменяют актин-активируемую миозиновую АТФазу и влияют на микросекундную динамику актина, определяемую временной анизотропией фосфоресценции. Мы пришли к выводу, что анализ актин-ANT TR-FRET позволяет обнаруживать фармакологически активные соединения, которые влияют на структурную динамику актина и функцию актомиозина.Этот анализ устанавливает возможность открытия аллостерических модуляторов актин-миозинового взаимодействия с конечной целью разработки методов лечения мышечных расстройств.

Ключевые слова: актин, миозин, флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET), пептид, высокопроизводительный скрининг (HTS)

Введение

Структурный переход актин-миозинового комплекса из слабого (плечо рычага вверх) в состояние сильного связывания (рычаг вниз) во время цикла АТФазы миозина создает силу сокращения мышц (1).Молекулярный механизм включает структурные переходы на границе раздела между актином и каталитическим доменом миозина и внутри домена легкой цепи миозина, который содержит сайты связывания для основных (ELC) ² и регуляторных легких цепей. Обе легкие цепи играют важную роль в регуляции актин-миозинового взаимодействия (2, 3). ELC являются высококонсервативными и выражаются в виде двух изоформ, A1 и A2. Принципиальное различие между ними состоит в том, что A1 содержит N-концевое удлинение (NTE) из 40–45 дополнительных аминокислот.Наша предыдущая работа показала, что когда миозин связывается с актином, NTE быстрых скелетных или сердечных ELC находится в непосредственной близости от актина (4, 5). N-концевые аминокислоты NTE, в частности первые четыре аминокислоты (APKK), высоко консервативны среди скелетных и сердечных мышц, а также среди видов (6). Эти положительно заряженные остатки лизина взаимодействуют с отрицательно заряженными глутаматами С-конца актина (7). Взаимодействие актин-NTE является функционально значимым, потому что изоформы миозина, имеющие NTEs, демонстрируют более высокую каталитическую эффективность и более медленную подвижность в отношении актина (3, 8, 9).

Модель актин-миозинового комплекса со скелетным миозином S1 (тяжелая цепь ( синий ), ELC ( зеленый ) и регуляторная легкая цепь ( красный )), прочно связанные с актином ( серый ) (19 ). Оранжевые сферы показывают место маркировки актина. Зеленый кружок

Недавние исследования в нашей лаборатории изучили структурные основы ELC-обусловленной модуляции актин-миозинового взаимодействия (4, 5, 10).FRET с временным разрешением (TR-FRET) с использованием донора на актине и акцептора на A1 NTE субфрагмента 1 скелетного миозина (S1) показал, что NTE играет важную роль в модуляции силового удара миозина (4). Сходные исследования сердечного (желудочкового) миозина S1 предоставили прямое понимание механизма нарушения взаимодействий актин-миозин за счет кардиомиопатической мутации в домене легкой цепи (5). Многие мутации или посттрансляционные модификации как актина, так и миозина вызывают опасные для жизни мышечные расстройства, и возможности лечения остаются ограниченными (11).Мы предполагаем, что этот подход TR-FRET может быть использован в качестве инструмента для скрининга соединений, которые восстанавливают дефекты в структуре и функции актомиозина. Низкомолекулярные модуляторы структурной динамики актомиозина представляют собой потенциальные лидеры для будущих разработок лекарств, и этому поиску в значительной степени способствуют недавние разработки высокопроизводительных методов скрининга на основе FRET, которые измеряют влияние соединений на расстояние между донорными и акцепторными зондами на взаимодействующие белки (1, 12, –15).

В настоящем исследовании мы пометили актин на Cys-374 с помощью флуоресцентного донора, флуоресцеин-5-малеимида (FM), и прикрепили нефлуоресцентный акцепторный зонд дабцил к N-концу пептида из 12 аминокислот, происходящего от N-конца. NTE скелетной мышцы кролика A1 ().Использование этого меченного дабцилом пептида, обозначенного как ANT, было вдохновлено предыдущими сообщениями, показывающими, что первые 13 аминокислотных остатков NTE являются важными регуляторами актин-миозинового взаимодействия (16) и влияют на сократимость мышечных клеток (17). Ключевым преимуществом ANT по сравнению с ранее использованным нами миозином, меченным акцептором (4), является то, что он может быть синтезирован и очищен в больших количествах, что облегчает крупномасштабный высокопроизводительный скрининг (HTS). Мы предположили, что соединения, влияющие на взаимодействие актин-ANT, вероятно, нарушают структурные и ферментативные свойства актин-миозина.Здесь мы измерили TR-FRET от актина до ANT с помощью высокоточного планшет-ридера времени жизни флуоресценции (FLTPR) (18) в присутствии и в отсутствие соединений из библиотеки малых молекул. Хиты этого анализа, определяемые как соединения, оказывающие действие более чем на 4 S.D. от среднего значения, были проанализированы дополнительно, чтобы определить их влияние на активность актин-активируемой миозин-АТФазы, чтобы оценить потенциал этого подхода TR-FRET для открытия лекарств.

Результаты

Актин – ANT Биосенсор FRET

Разрешенные по времени затухания флуоресценции меченного донором актина в присутствии возрастающих концентраций меченного акцептором пептида (ANT) (,

А , TR-FRET. Показана разрешенная во времени флуоресценция 2 мкм донорского меченого актина (D-актина) в отсутствие (

Добавление ANT к FM-актину уменьшало время жизни донора ( A , черный до красный ), что указывает на FRET. Анализ распада FRET показал, что среднее расстояние ( R ) между двумя зондами составляло 3,3 ± 0,2 нм, что очень хорошо согласуется с расстоянием, обнаруженным для зондов на Cys-374 на актине и на Cys-16 на NTE. А1 (4). Добавление NTE-содержащих S1 к комплексу актина и ANT увеличивало время жизни ( A , репрезентативный распад S1, имеющих NTE, красный до синий ), что указывает на то, что S1 либо вытесняет, либо диссоциирует связанный с актином ANT.Анализ форм сигналов FRET не смог разрешить эти две возможности. Эффективность FRET 〈 E 〉, рассчитанная из среднего срока службы в независимом от модели анализе, обобщена в B . Добавление изоформ S1 с NTE (скелетный S1, 75% A1 + 25% A2; скелетный S1A1, 100% A1; сердечный S1, 100% A1) оказало значительное влияние на FRET, тогда как добавление изоформы S1 ( S1A2, 0% A1), не содержащий NTE, не влиял на FRET между актином и ANT ( B ).Эти результаты показывают, что ANT разделяет перекрывающийся сайт связывания на актине со всеми протестированными NTE ELC. Добавление АТФ к безнуклеотидной смеси актина, ANT и S1 увеличивало FRET между актином и ANT для NTE-содержащих изоформ S1, но не для S1A2 ( B ). Этот результат служит дополнительным доказательством перекрытия сайтов связывания ANT и NTE, поскольку АТФ вызывает диссоциацию всех конструкций S1 от актина. Сходство взаимодействий актин-ANT и актин-NTE дополнительно подтверждается наблюдением, что оба они чувствительны к ионной силе; добавление 0.1 м KCl в комплекс актин-ANT также значительно снижает скорость распада донора ( A , красный до зеленый ). Такая чувствительность к ионной силе определяет электростатическую природу этого взаимодействия и отражает основанное на модели предположение, что положительно заряженная NTE связывается с кластером отрицательно заряженных остатков в C-концевой области актина (19). Эти результаты ясно показывают, что актин-ANT FRET чувствителен к ассоциации S1 NTEs с актином, а также к ионной силе; оба фактора, как известно, являются сильными модуляторами актин-миозинового взаимодействия (19).Таким образом, мы заключаем, что наш сенсор актин-ANT FRET обладает достаточной чувствительностью для использования в поиске модуляторов актин-ANT FRET в тесте HTS.

Актин – ANT FRET. A , репрезентативное затухание флуоресценции меченного донором актина (2 мкм) в отсутствие (только D, черный , такой же, как D-актин в A ) и в присутствии 50 мкм ANT (Ctrl, красный , то же, что D-актин + 50 мкм ANT в A ) и после добавления к Ctrl насыщающего (5 мкм) скелетного S1 ( синий ), S1 + насыщающего (3 мм) АТФ ( пурпурный ) или 0 .1 м KCl ( зеленый ). Только распады D (, черный, ) и Ctrl (, красный, ) включены в настоящий рисунок для целей визуализации и сравнения. B , FRET между актином и ANT в отсутствие (Ctrl) и присутствие различных изоформ S1 (скелетный SS1, сердечный CS1, скелетный S1A1, скелетный S1A2), без и с 3 мМ АТФ и 0,1 м KCl. Планки погрешностей , S.D.

Высокопроизводительный скрининг библиотеки клинической коллекции Национального института здравоохранения (NCC) для выявления соединений, которые модулируют актин-ANT FRET

С помощью датчика актин-ANT FRET мы выполнили HTS библиотеки NCC (727 соединений).Библиотека NCC представляет собой набор небольших молекул, которые ранее были протестированы в клинических испытаниях и, следовательно, имеют известные профили безопасности. Полную библиотеку NCC наносили на три 384-луночных планшета Greiner с черными стенками и черным дном с контрольными лунками, не содержащими лекарств (50 нл ДМСО), на каждой стороне отдельных планшетов (см. «Экспериментальные процедуры»). Для каждого скрининга в один набор планшетов с лекарством загружали 2 мкм FM-меченого актина (только донор), а в другой набор загружали 2 мкм FM-актина и 50 мкм ANT (донор-акцептор).Все планшеты инкубировали в течение 20 мин при 25 ° C перед считыванием. FM-актин возбуждали лазером с длиной волны 473 нм, и формы волны затухания флуоресценции с временным разрешением считывались в FLTPR в течение 20 и 120 минут. Двухэкспоненциальная аппроксимация использовалась для получения времени жизни только донорных (τ _D ) и донорно-акцепторных образцов (τ _DA ). Мешающие (по своей природе флуоресцентные) соединения удаляли с использованием контрольного скрининга с 2 мкм немеченого актина. Гистограмма среднего распределения FRET для соединений NCC была построена и подогнана к кривой Гаусса ( A ) для получения среднего и S.D. Эффективность FRET, 〈 E 〉, была рассчитана для каждой скважины с использованием уравнения 1 ( B ). Коэффициент Z ′ для этого экрана был рассчитан как 0,8 ± 0,1 с использованием элементов управления, содержащих только ДМСО, что подтверждает надежность этого экрана HTS (14, 20). Этот скрининг был выполнен в трех экземплярах с тремя различными препаратами донорных и акцепторных образцов. На всех трех экранах наблюдалось отличное согласование. Из 27, 21 и 23 совпадений на трех экранах всего 10 соединений ( B , красный ) воспроизводимо изменили средний FRET более чем на 4 S.D. больше, чем среднее значение для контрольных образцов. Это истинная вероятность попадания в 35–45%. Соединения, которые не изменяли воспроизводимо средний FRET, считались ложноположительными. 10 оставшихся хитовых соединений были дополнительно протестированы в анализах FRET концентрация-ответ.

HTS библиотеки NCC на основе TR-FRET для соединений, модулирующих актин-ANT FRET. A , графики гистограмм всех соединений с экрана NCC после удаления флуоресцентных соединений показывают среднюю эффективность FRET, равную 0.45 ± 0,003. B , FRET из типичного экрана NCC с порогом совпадения (> 4 среднеквадратичного отклонения), обозначенным пурпурными линиями . Воспроизводимые совпадения с трехкратных экранов показаны красным цветом .

Анализ реакции на концентрацию FRET

Используя те же условия, что и в первичном скрининге, мы исследовали зависимость FRET от концентрации каждого воспроизводимого хитового соединения (0,5–100 мкм). Существенные зависящие от концентрации эффекты на FRET наблюдались для большинства идентифицированных совпадений ().Актин-ANT FRET ( E ) для каждого соединения определяли при каждой концентрации и впоследствии нормализовали до контроля, содержащего только ДМСО ( E ₀ ). Зависимость нормализованного изменения FRET от концентрации ( E / E ₀ ) была подогнана с использованием уравнения Хилла, которое обычно используется в фармакологических исследованиях для анализа данных «концентрация-ответ» лекарственных препаратов (21). Все пораженные соединения снижали актин-ANT FRET при микромолярных концентрациях с заметными различиями в очевидном EC ₅₀ (концентрация, необходимая для полумаксимального эффекта) кривой FRET (, A и B ).Значения EC ₅₀ приведены в. Зависимость от концентрации указывает на то, что эти соединения взаимодействуют с актином. Концентрация-ответ двух известных миозин-связывающих препаратов, OM и Myk 461, не влияла на актин-ANT FRET ( C ). Этот контрольный эксперимент дополнительно указывает на структурную специфичность идентифицированных хитовых соединений для актина. Будущие исследования соединений, которые, как известно, взаимодействуют с актином, также будут информативными.

Концентрационная реакция воспроизводимых хитовых соединений на FRET. A и B , поражающие соединения снижали FRET в зависимости от концентрации. C , миозин-специфические соединения, OM и MYK461, не показали зависимости от концентрации (контрольный эксперимент). Планки погрешностей , S.D.

Таблица 1

Функциональная характеристика попаданий FRET на активность актомиозиновой АТФазы

Функциональные эффекты 10 пораженных соединений на актин-активируемую миозиновую АТФазу () измеряли в зависимости от концентрации. Концентрация актина (2 мкм) и миозина была выбрана такой же, как в измерениях FRET для согласованности.Ни одно из соединений не изменяло Mg-АТФазу S1 скелета или сердца в отсутствие актина (0,007 ± 0,002 S ^-1 в отсутствие соединения и 0,009 ± 0,002 S ^-1 в присутствии соединений). Однако большинство соединений Hit влияли на актин-активированную АТФазу скелетного S1 (75% A1 и 25% A2), а также сердечного S1 (100% A1) в зависимости от концентрации. Это неудивительно, потому что и скелетный, и сердечный S1 содержат преимущественно изоформу A1. Значительное ингибирование актин-активируемой АТФазы как для скелетного, так и для сердечного миозина наблюдалось для трех соединений: флуфеназина, тиорадизина и новантрона ().Хонокиол активировал оба. Флутамид, дантролен и карведиол имели небольшие и сходные эффекты на обе АТФазы.

Концентрационная зависимость АТФазной активности acto-S1. A и B , скелетный acto-S1. C и D , кардиальный acto-S1. Данные нормализованы по значению АТФазы в отсутствие соединений. Планки погрешностей , S.D.

Некоторые соединения показали значительно различающиеся эффекты на миозин скелета и сердца, что предполагает возможность выявления эффекторов, специфичных для изоформ.Тегасерод оказывал двухфазное действие на сердечный acto-S1, а его ингибирующие эффекты на скелетный acto-S1 были гораздо более значительными. Мефлохин активировал сердечный acto-S1 в низких концентрациях, но не оказывал активирующего действия на скелетный acto-S1. Фенотиазин подавлял кардиальный acto-S1, в то же время слегка активируя скелетный acto-S1.

Значимые эффекторы показывают хорошую корреляцию значений EC ₅₀ , определенных с помощью анализов FRET и АТФазы (). Флуфеназин, тиорадизин и новантрон снижали актин-активированную АТФазу как скелетного, так и сердечного S1 на 50% при их значениях EC ₅₀ 10-25 мкм ().Уменьшение активности АТФазы, индуцированное этими тремя соединениями, было пропорционально уменьшению FRET (, A и B ), что указывает на то, что функциональные эффекты связаны со структурными изменениями в обоих видах комплекса acto-S1.

Соотношение структура – ​​функция. A , изменение ATPase по сравнению с FRET для acto-S1 скелета. B , изменение АТФазы по сравнению с FRET для сердечного acto-S1. Значительные ингибиторы показывают, что изменение FRET пропорционально изменению АТФазы. C , изменение FRET по сравнению с конечной анизотропией . D , изменение FRET против время жизни фосфоресценции. Связанное с соединением изменение FRET пропорционально анизотропии актина, предполагая связанное с соединением изменение в структуре актина. Планки погрешностей , S.D.

Переходная фосфоресцентная анизотропия

Изменения FRET (), вызванные соединениями, предполагают, что эти Hit-соединения связывают актин и модулируют его структурные свойства. Чтобы проверить эту возможность, мы измерили вызванные соединениями изменения в структурной динамике актина с использованием временной фосфоресцентной анизотропии (TPA) актина, меченного по Cys-374 с помощью эритрозин иодацетамида (ErIA) (22, –24).Два параметра распада TPA характеризуют динамику актина: конечная анизотропия ( a ), связанная с крупномасштабной крутильной гибкостью филамента (, A – D ), и время жизни ( b ), связанное с окружающей средой зонда. рядом с концом C актина (, A , E и F ). Типичная анизотропия фосфоресценции затухает в присутствии одного из Hit-соединений, тиоридазина ( B ), демонстрирует зависящее от концентрации увеличение конечной анизотропии и уменьшение интенсивности сигнала из-за уменьшения времени жизни фосфоресценции.Влияние всех хитовых соединений на оба параметра распада TPA суммировано в ( C – F ). Наиболее значительные изменения наблюдались в присутствии флуфеназина (, C и E ), тиоридазина и новантрона (, D и F ). Увеличение анизотропии актина в присутствии флуфеназина и тиоридазина предполагает значительное снижение крутильной гибкости филамента. Индуцированное новантроном резкое уменьшение анизотропии предполагает значительное увеличение крутильной гибкости и / или фрагментацию или деполимеризацию актиновых филаментов.Соединения, которые влияют на анизотропию, также уменьшают время жизни эритрозинового зонда, предполагая, что изменения в гибкости актина связаны с изменениями в окружающей среде зонда, увеличивая воздействие гасящего эффекта кислорода растворителя. Изменения как анизотропии, так и времени жизни фосфоресценции были примерно пропорциональны изменениям в эффективности FRET (, C и D ), предполагая, что индуцированные соединениями изменения FRET связаны с изменениями в структурной динамике актина.Соединения, наиболее эффективные по своему действию на TPA и FRET, также были наиболее эффективны в изменении актин-активируемой миозиновой АТФазы (). Семь других соединений вызывали также значительные, но менее выраженные изменения в TPA и актомиозиновой АТФазе (), подтверждая ранее наблюдаемые корреляции между динамикой актина и механизмом активации миозиновой АТФазы (10, 22, 23).

TPA ​​меченного ErIA актина. A , схематическое представление микросекундной динамики детектирования актина с помощью измерений TPA. I _V и I _H — это компоненты излучаемого света с вертикальной и горизонтальной поляризацией, используемые для расчета анизотропии (см. «Экспериментальные процедуры»). B , TPA разлагает ErIA-актин в присутствии увеличивающихся концентраций тиоридазина (0–100 мкМ), типичного соединения. C и D , конечная анизотропия в присутствии хитовых соединений, которая уменьшается с амплитудой отражения глобальной динамики вращения актинового филамента. E и F , время фосфоресценции распадов, измеренное в присутствии соединений, отражающее локальные структурные изменения вблизи сайта связывания зонда. Планки погрешностей , S.D.

Обсуждение

FRET с временным разрешением показал, что флуоресцентно меченый 12-аминокислотный пептид (ANT), соответствующий NTE A1 ELC (), связывается с C-концевой областью актина с K _d = 16 мкм. На это взаимодействие актин-ANT влияет сильное связывание изоформ S1 и увеличение ионной силы (), подтверждая перекрытие между ANT и миозин-связывающими областями на актине.Сам по себе ANT не изменял актин-активируемую или миофибриллярную АТФазу (, C и D ). Отсутствие эффекта ANT на K _m имеет два возможных объяснения: ( a ) хотя ANT и S1 конкурируют за связывание актина в отсутствие АТФ ( B ), аффинность ANT 16 мкм ( B ) для актина примерно на 2 порядка ниже, чем субмикромолярное сродство S1 к актину (4), и ( b ) ANT и S1 не конкурируют в присутствии АТФ ( B ).Преимущество использования ANT с низким сродством для зондирования границы раздела актомиозина состоит в том, что он с большей вероятностью может конкурировать с фармацевтически активными соединениями с низкой концентрацией, что увеличивает вероятность обнаружения большего количества «пораженных» соединений. Следовательно, FRET между зондами на актине (донор) и ANT (акцептор) использовался в качестве сенсора в высокопроизводительном скрининговом анализе для идентификации соединений, которые изменяют границу раздела актин-миозин. Мы идентифицировали 10 соединений из небольшой (NCC) библиотеки, которые влияют на FRET (и) в зависимости от концентрации.Большинство из них также изменяют актин-активируемую миозиновую АТФазу как скелетного, так и сердечного S1, а также структурные состояния актинового филамента. Таким образом, мы разработали высокопроизводительный анализ на основе актина, в котором изменения FRET связаны со структурными и функциональными изменениями всего комплекса acto-S1.

Действительность датчика FRET актин-ANT

Обнаруженное расстояние ( R = 3,3 ± 0,2 нм) между зондами на актин и ANT в комплексе актин-ANT хорошо согласуется с расстоянием, наблюдаемым между Cys-16 в A1 ELC (скелетный, 2.9 ± 0,2 нм; cardiac, 3,5 ± 0,2 нм) и Cys-374 актина в прочно связанном комплексе acto-S1 (4, 5), что указывает на то, что ANT связывается с A1 ELC-связывающими областями актина. Эта возможность дополнительно подтверждается эффектами связывания S1 на сигнал FRET между актином и ANT (). В отсутствие АТФ связывание S1 скелета (75% A1 + 25% A2), S1A1 скелета (100% A1) и сердечного S1 (100% A1) с комплексом актин-ANT значительно снижает FRET, тогда как добавление S1A2 (0% A1) не изменило сигнал FRET.Таким образом, только мышечные S1, имеющие NTE, были способны вытеснять пептид из С-концевой области актина. С другой стороны, FRET не подвергался влиянию в присутствии АТФ, где S1 слабо связывается и вращательно неупорядочен, а расстояние между A1NTE и актином значительно увеличивается по сравнению с таковым в прочно связанном комплексе (25, 26). FRET комплекса актин-ANT также значительно снижается за счет увеличения ионной силы (0,1 м KCl), что дополнительно подтверждает сходство между взаимодействием ANT-актин и актин-A1NTE; структурная модель комплекса acto-S1A1 (19) показывает, что положительно заряженный N-конец A1 связывается с кластером отрицательно заряженных остатков в C-концевой области актина (19).Таким образом, мы заключаем, что наш сенсор актин-ANT FRET ( a ) хорошо имитирует связывание актин-A1NTE, ( b ) имеет потенциал в качестве платформы для открытия аллостерических модуляторов взаимодействия актин-миозин и ( c ) может в конечном итоге помочь в разработке методов лечения мышечных заболеваний.

Hit-соединения, идентифицированные в анализе HTS

Основная цель этого HTS — выявить новые низкомолекулярные эффекторы с терапевтическим потенциалом для расстройств, связанных с мутациями в актине или миозине.Низкомолекулярные эффекторы, предназначенные для нацеливания и модуляции изоформ миозина поперечно-полосатой и гладкой мускулатуры для лечения заболеваний, демонстрируют многообещающие результаты в доклинических и клинических испытаниях (11, 27). В нашей работе мы сосредоточены на модуляции актина. Мы идентифицировали 10 фармакологически активных соединений, которые влияют как на структуру актина, так и на функциональное взаимодействие с миозином. Наиболее выраженные эффекты наблюдались у флуфеназина, тиоридазина и новантрона. Флуфеназин и тиоридазин используются в качестве антипсихотических средств (28), тогда как новантрон используется для лечения рассеянного склероза (29) ().Эффекты других идентифицированных соединений менее выражены, но все же значительны, особенно при более высоких концентрациях. Тегасерод (30) и мефлохин (31) используются для лечения таких состояний, как синдром раздраженного кишечника и малярия. Дантролен является постсинаптическим миорелаксантом и воздействует на рецептор рианодина (32). Карведилол уже известен как β-блокатор и используется для лечения высокого кровяного давления и сердечной недостаточности (33). Хонокиол, традиционная медицина, имеет несколько применений (34). Флутамид является антагонистом рецепторов андрогенов и обладает противораковой активностью (35).

Все идентифицированные соединения в настоящее время используются в качестве лекарств. Хотя эти лекарства терапевтически эффективны, они также обладают значительными побочными эффектами на мышечную функцию, такими как сердечная аритмия (29, 33). Таким образом, неудивительно, что эти соединения были идентифицированы как хиты, поскольку они действительно связаны с изменением функции мышц. Некоторые из нежелательных побочных эффектов могут быть связаны с описанными здесь эффектами на структуру актина и взаимодействие с миозином (). Эффективное лекарство должно обеспечивать баланс между терапевтической пользой и нежелательными побочными эффектами.Этот баланс, вероятно, зависит от относительной аффинности связывания с актином и другими клеточными мишенями. Наши хитовые соединения влияют на актин, когда присутствуют в микромолярных концентрациях, что указывает на умеренное сродство связывания с актином. Если связывание с терапевтически желательными мишенями намного сильнее, терапевтические эффекты могут быть достигнуты при достаточно низких дозах, чтобы избежать воздействия на структуру актина. С другой стороны, лекарственное изменение структуры актина может быть полезным при исследовании рака как метод подавления функции актинового цитоскелета в злокачественных клетках; например, Новантрон используется в химиотерапии некоторых видов рака (31).

Наши результаты имеют фармакологическое значение, помогая понять нежелательные побочные эффекты многих лекарств. Актин присутствует в каждой клетке человека, и его взаимодействие с множеством изоформ миозина и множеством связывающих актин белков имеет важное значение для жизнеспособности клеток. Хотя актин является очень консервативным белком, различные изоформы актина не могут быть замещены в живых тканях (36, 37). В нашем HTS-анализе используется система мышечный актин-миозин для обнаружения соединений, но эти соединения также могут связываться с клеточным актином.Нашими будущими целями являются скрининг более крупных библиотек в поисках лекарств, специфичных для изоформ актина (, т.е. скелетных мышц, против гладких мышц, против сердечных мышц, против немышечных), необходимых для безопасного клинического применения. Дальнейшие усилия в области медицинской химии потребуются для повышения специфичности и уменьшения побочных эффектов.

Механизм действия

Специфичные для соединения структурные и функциональные изменения в актин-ANT FRET, фосфоресценции и актин-активируемой АТФазе (и) предполагают, что разные хитовые соединения связываются в разных областях актина.Связывание и функциональные эффекты каждого соединения зависят от структуры соединения и структуры целевой области актина. Например, два из идентифицированных соединений, флуфеназин и тиоридазин, структурно подобны трифлуоперазину, известному ингибитору миозиновой АТФазы (38), и имеют очень похожие эффекты на актомиозин-АТФазу и распады ТРА (и). Некоторые соединения по-разному влияют на скелетный и кардиальный миозин (10), подтверждая взаимодействие со специфическими для изоформ миозина регионами на границе актомиозина.Этот интерфейс, вероятно, различен для скелетного и сердечного S1, на что указывают значительные различия в актин-активируемой АТФазе. Мы рассматриваем несколько возможных механизмов, с помощью которых связывание хитовых соединений изменяет взаимодействие между С-концом актина и участком связывания NTE. Некоторые соединения могут связываться с С-концом актина и изменять его локальную структуру. Другие соединения могут связываться с другими участками актина и иметь аллостерические эффекты. Другие соединения могут изменять микросекундную гибкость актина (22, –24).Каждый способ связывания может приводить к замещению ANT, на что указывает уменьшение FRET (), уменьшение времени жизни фосфоресценции () из-за повышенного воздействия буферного кислорода на зонд и / или изменения гибкости актина из-за местного и аллостерические изменения мономеров. Примеры отдаленных аллостерических изменений актина были ранее задокументированы с использованием сайт-специфических модификаций (39). Наши предыдущие исследования актин-связывающих белков продемонстрировали связь между изменениями гибкости актина (измеряемыми с помощью TPA) и функциональными взаимодействиями с миозином и другими актин-связывающими белками (22, –24).Такая связь наблюдается и в настоящих исследованиях ().

Ни одно из этих соединений не влияет на базальную Mg-АТФазу (без актина) скелетного или сердечного S1, что подтверждает их актиновую специфичность. Кроме того, FRET концентрация-ответ с двумя известными миозин-специфическими соединениями (11, 27) не показала никаких эффектов (), обеспечивая дополнительное указание на то, что соединения, идентифицированные в этом скрининге, действуют на актин, влияя на функцию актомиозина. Это уникально, потому что предыдущие кампании по открытию лекарств в этой области использовали миозин в качестве основной мишени (11, 27).Наш будущий скрининг более крупных библиотек будет сосредоточен на поиске соединений, специфичных для скелетных или сердечных мышц.

Заключение

Используя высокую точность нашей технологии TR-FRET в сочетании со структурой межмолекулярного биосенсора FRET, включающего актин и ANT, мы создали и проверили платформу HTS, которая может обнаруживать низкомолекулярные эффекторы, которые влияют на функциональное взаимодействие актина и миозина. Этот инструмент может быть использован в будущем для скрининга более крупных библиотек и закладывает основу для открытия аллостерических модуляторов других интересующих актин-связывающих белков, где нацелены белок-белковые взаимодействия.

Экспериментальные процедуры

Белковые препараты и маркировка

Актин получали из скелетных мышц кролика экстракцией ацетонового порошка в холодной воде, как описано ранее (23). Cys-374 в F-актине метили с помощью донорного / фосфоресцентного зонда FRET следующим образом. FM / ErIA (Life Technologies, Inc.), свежерастворенный в N , N -диметилформамиде (500 мкм), смешивали с 50 мкм F-актином и инкубировали в течение 1 часа при 25 ° C, затем 18 часов. при 4 ° C.Мечение прекращали добавлением 10 мм DTT. После 30 мин осаждения при 350000 × г осадок F-актина суспендировали в буфере G-Mg (5 мм Трис, 0,5 мм АТФ, 0,2 мм MgCl ₂ , pH 7,5) с последующим осветлением при 300000 × . g в течение 10 мин. Актин снова полимеризовали в течение 30 мин при 25 ° C в присутствии 3 мМ MgCl ₂ и центрифугировали при 300000 × g в течение 10 мин, и осадок суспендировали в буфере F-Mg (3 мм MgCl ₂ , 10 мМ Трис, pH 7.5), содержащий 0,2 мМ АТФ. Меченый F-актин был немедленно стабилизирован против деполимеризации и денатурации путем добавления 1 молярного эквивалента фаллоидина. Скелетную мышцу S1 получали α-химотриптическим перевариванием миозина скелетных мышц кролика (10), а β-кардиальную S1 получали α-химотриптическим перевариванием бычьего β-сердечного миозина (5), как описано ранее. Изоформы скелетных мышц S1, S1A1 и S1A2 были очищены, как сообщалось в нашем более раннем исследовании (10).

N-концевой пептид

N-концевой пептид A1 ELC скелета кролика был синтезирован и очищен LifeTein Co.Немеченый пептид ацетилировали по N-концу и амидировали по C-концу: Ac-APKKDVKKPVAA-NH ₂ ( M _r 1292,6). Меченый пептид имел дабцил, конъюгированный с первым A на N-конце, dabcyl-APKKDVKKPVAA-NH ₂ () и амидированный C-конец ( M _r 1501,85). Синтезированные пептиды очищали и превращали в соли HCl для удаления остаточных солей из процедуры синтеза и получали в виде лиофилизированного порошка.Пептид имел чистоту> 99% по данным ВЭЖХ и МС. Перед экспериментами пептиды растворяли в H ₂ O (добавляли непосредственно во флакон), разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C. Конечная концентрация немеченого пептида была определена с использованием предоставленной молекулярной массы, а концентрация меченного дабцилом пептида (ANT) была рассчитана путем измерения оптической плотности при 434 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции дабцила, 22,850 см ^-1 м ⁻¹ .

Сбор данных флуоресценции

Измерения времени жизни флуоресценции были выполнены высокоточным FLTPR (Fluorescence Innovations, Inc., Миннеаполис, Миннесота) (13, –15). FM-меченный донорный актин возбуждали микрочип-лазером с длиной волны 473 нм (Bright Solutions, Cura Carpignano, Италия), а излучение фильтровали с помощью длиннопроходных фильтров 488 нм и полосовых фильтров 517/20 нм (Semrock, Рочестер, Нью-Йорк). (13, 18). Этот прибор обеспечивает высокопроизводительное определение времени жизни флуоресценции с высокой точностью за счет использования уникальной технологии прямой записи формы сигнала (40). Эффективность этого FLTPR была ранее продемонстрирована с помощью HTS на основе FRET, которая нацелена на Са-АТФазу саркоплазматического ретикулума (SERCA) и рецептор рианодина (14, 15).

Пилотный скрининг с библиотекой NCC

Соединения NCC (727 соединений) получали в 96-луночные планшеты и переформатировали в 384-луночные промежуточные полипропиленовые планшеты (Greiner Bio-One, Кремсмюнстер, Австрия) с использованием многоканального манипулятора с жидкостями BioMek. FX (Бекман Коултер, Майами, Флорида). Планшеты для анализа получали путем переноса 50 нл 10-миллиметровых исходных материалов соединения или ДМСО из исходных планшетов на 384-луночные черные полипропиленовые планшеты (Greiner) с использованием акустического дозатора Echo 550 (Labcyte).Соединения NCC форматировали в трех планшетах, причем в первые две и последние две колонки загружали 50 нл ДМСО и использовали для контроля без лекарств. Конечная концентрация соединений составляла 10 мкМ. Затем эти аналитические планшеты герметично закрывали с использованием термосварочного устройства для микропланшетов PlateLoc (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) и хранили при -20 ° C. Перед скринингом планшеты со смесью уравновешивали до комнатной температуры (25 ° C). Перед скринингом 2 мкм FM (донор)-меченый актин без или с 50 мкм акцепторно-меченым (ANT) пептидом (50 мкл / лунка) распределяли с помощью дозатора Multidrop Combi Reagent Dispenser (Thermo Fisher Scientific) в 384-луночные аналитические планшеты, содержащие соединения.Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут перед записью данных с помощью FLTPR.

Анализ данных TR-FRET и HTS

Сигналы TR-FRET были проанализированы во всем мире независимыми от модели и независимыми методами, как описано ранее (4, 5). Наблюдаемая форма волны только донора (FM-актин) F _Dobs ( t ) была аппроксимирована моделированием F _Dsim ( t ), состоящим из многоэкспоненциального затухания F _D ( t ) ( A , черный ), свернутый с функцией отклика прибора IRF (t).Наблюдаемая форма донорно-акцепторного сигнала (FM-актин + ANT) F _{D + Aobs} ( t ) ( A , красный , синий , пурпурный и зеленый ) соответствовали мультиэкспоненциальная функция, использующая тот же подход. Независимая от модели средняя по ансамблю эффективность FRET 〈 E 〉, которая эквивалентна результату измерения стационарной флуоресценции, задается уравнением 〈 E 〉 = 1 — 〈τ _DA 〉 / 〈Τ _D 〉, где в скобках указано среднее значение.Структурное состояние, зависящее от модели, было решено с использованием следующего:

F _{D + Aobs} ( т ) = (1 — X _DA ) F _D ( т ) + X _DA F _DA ( т )

(уравнение 1)

F _D ( т ) = exp⁡ (- т / 〈 τ _D 〉)

(уравнение 2)

F _DA ( т ) = exp⁡ (- т / 〈 τ _DA 〉)

(Ур.3)

〈 τ _DA 〉 / 〈 τ _D 〉 = 1 + ( R / R ₀ ) ⁻⁶

(уравнение 4)

где F _DA ( t ) — это форма волны флуоресценции с временным разрешением донорно-акцепторного комплекса, X _DA — это доля присоединенных к актину доноров, которые связаны и передают энергию меченным акцептором ANT, R — эффективное донорно-акцепторное расстояние в комплексе, а R ₀ — расстояние (3.6 нм), при котором FRET составляет 50% для этой донорно-акцепторной пары (4).

Волновые формы для каждой лунки в HTS были аппроксимированы двухэкспоненциальной функцией затухания с использованием минимизации методом наименьших квадратов. Эффективность FRET E определялась как частичное уменьшение времени жизни донорной флуоресценции за счет акцептора, E = 1 — 〈τ _DA 〉 / 〈τ _DA 〉.

Качество анализа определяли на основе контролей (образцы, содержащие только ДМСО) на каждом планшете, как индексировано коэффициентом Z ′, значением 0.5 или выше, что свидетельствует об отличном качестве анализа (14, 20). Соединение считалось хитом, если оно изменяло E на> 4 S.D. относительно контрольных образцов ( E ₀ ), которые подвергались воздействию 0,1% ДМСО. Пороговое значение может быть дополнительно отрегулировано для ограничения количества совпадений в соответствии с ресурсами, доступными для оценки посредством вторичных (ортогональных) анализов.

FRET: анализ «концентрация-реакция»

Хит-соединения растворяли в ДМСО, чтобы получить 10-миллиметровый маточный раствор, который серийно разводили в 96-луночных материнских планшетах.Хиты были проверены при восьми концентрациях (0,5–100 мкм). Соединения (1 мкл) переносили из материнских планшетов в 384-луночные аналитические планшеты с использованием жидкостного манипулятора Mosquito HV (TTP Labtech Ltd., Хартфордшир, Великобритания). Та же процедура распределения, что и для пилотного скрининга, применялась в анализах FRET «концентрация – ответ». Концентрационная зависимость изменения FRET была аппроксимирована уравнением Хилла (21),

E = E0 + (Emax⁡Cα / EC50α + Cα)

(уравнение 5)

, где E и E ₀ представляют собой FRET в присутствии и в отсутствие соединения, E _max — максимальный эффект, C — концентрация лекарственного средства, EC ₅₀ — концентрация лекарственного средства, при которой достигается 50% максимального эффекта, а α — коэффициент сигмоидности Хилла.Анализы «концентрация-ответ» двух известных миозин-специфичных соединений, OM и Myk 461, также были выполнены в качестве контролей для подтверждения структурной специфичности соединений.

Актин-активированная АТФаза

Актин-активированная АТФаза S1 Активность АТФазы измеряли при 25 ° C в F-Mg буфере, содержащем 3 мМ АТФ с 2 мкМ F-актина и 5 мкМ скелетного / сердечного S1. Концентрация-ответ лекарственных средств (0–100 мкм) на АТФазу измеряли в присутствии соединений, а ЕС ₅₀ определяли путем подгонки данных к графику Хилла.Данные «концентрация АТФазы – ответ» были нанесены на график как нормализованные по отношению к АТФазе актомиозина в отсутствие соединений (). Базальную Mg-АТФазу S1 измеряли в тех же условиях в отсутствие актина.

Переходная фосфоресцентная анизотропия

Стабилизированный фаллоидином ErIA – F-актин разбавляли в буфере F-Mg до 2,0 мкм и добавляли соединения в определенных концентрациях (0–100 мкм). Чтобы максимизировать сигналы фосфоресценции и предотвратить фотообесцвечивание красителя, кислород удаляли из образца путем 5-минутной инкубации с глюкозооксидазой (55 мкг / мл), каталазой (36 мкг / мл) и глюкозой (45 мкг / мл).Фосфоресценцию измеряли при 25 ° C, как описано ранее (10). Актин ErIA возбуждали вертикально поляризованным импульсом длительностью 1,2 нс от лазера FDSS 532-150 (CryLas) на длине волны 532 нм, работающего с частотой повторения 100 Гц. Фосфоресцентное излучение отбирали с помощью стеклянного отсекающего фильтра с длиной волны 670 нм (Corion), регистрировали фотоумножителем (R928, Hamamatsu) и оцифровывали переходным дигитайзером (CompuScope 14100, GaGe) с временным разрешением 1 мкс / канал. Распад TPA был рассчитан как r ( t ) = ( I _V ( t ) — GI _H ( t )) / ( I _V ( t ) + 2 GI _H ( t )), где I _V ( t ) и I _H ( t ) являются вертикально и горизонтально поляризованными компонентами сигнал излучения, обнаруженный под углом 90 ° с помощью одного детектора и поляризатора поляроида, который чередовался между двумя ориентациями каждые 500 лазерных импульсов. G — инструментальный поправочный коэффициент, определяемый путем выполнения измерения с горизонтально поляризованным возбуждением, для которого скорректированное значение анизотропии установлено равным нулю. Распад TPA был получен путем регистрации 10 циклов по 1000 импульсов (500 в каждой ориентации поляризатора), что соответствует общему времени сбора данных около 2 минут. Распад TPA был проанализирован путем расчета окончательной анизотропии ( r _∞ ), определяемой как среднее значение r во временном окне от 400 до 500 мкс, которое, как было показано ранее, обеспечивает наиболее чувствительное и точное измерение. микросекундной вращательной динамики актина (10).Интенсивность фосфоресценции и среднее время жизни рассчитывали, как описано ранее (41).

Вклад авторов

П. Г., Э. П. и Д. Д. Т. разработали исследование. П. Г. и Е. П. подготовили образцы, провели биохимические эксперименты и проанализировали данные. К. С. П. спроектировал, построил и обслужил FLTPR. P. G., E. P. и B. D. G. получили и проанализировали данные флуоресценции. П. Г., Э. П. и Д. Д. Т. написали статью.

Нацеливание на белок-белковые взаимодействия для терапевтического открытия с помощью высокопроизводительного скрининга на основе FRET в живых клетках