Х рей лада какой привод: Лада Х Рей — передний или полный привод

Уровень цен: ОПТ

Выбрать пункт выдачи заказов на карте

Запрошенный номер

Производитель и номер

Описание

Наличие

Срок

Цена

Привод левого переднего колеса, 391016613R

1 шт.

9 745 ₽

Привод левый Ларугс, Степвей, Х Рей

3 шт.

10 023 ₽

Привод переднего левого колеса(J)

68 шт.

10 535 ₽

Еще 10 предложений из 19 

от 3 дн

от 10 676 ₽

Аналоги для номера

Производитель и номер

Описание

Наличие

Срок

Цена

Сэви, Балаково

На нашем складе

Пыльник ШРУС /2180 Lada Vesta/ наруж. (с 2015 г.) ЭКСПЕРТ

21 шт.

292 ₽

Пыльник привода Лада Vesta наруж (СЭВИ)

2 шт.

306 ₽

Другие предложения

Пыльник ШРУС /2180 Lada Vesta/ наруж. (с 2015 г.) ЭКСПЕРТ

23 шт.

270 ₽

Еще 10 предложений из 44 

от 1 дн

от 272 ₽

На нашем складе

Пыльник ШРУС /2180 Lada Vesta/ наруж.

7 шт.

634 ₽

Пыльник ШРУСа наружного Lada Vesta (15-) FG840

2 шт.

720 ₽

Другие предложения

Пыльник ШРУСа LADA VESTA наружний

1 шт.

548 ₽

Еще 10 предложений из 214 

от 0 дн

от 587 ₽

На нашем складе

ШРУС Renault Sandero II (14-) Lada XRAY (15-) наруж.

2 шт.

2 049 ₽

ШРУС наружный

3 шт.

2 462 ₽

ШРУС наружный

3 шт.

2 516 ₽

Еще 10 предложений из 57 

от 1 дн

от 1 897 ₽

На нашем складе

ШРУС /Lada XRAY/ внутр. лев. (КПП Renault JR5)

2 шт.

3 085 ₽

Другие предложения

Шрус внутренний левый

2 шт.

2 775 ₽

Еще 10 предложений из 197 

от 1 дн

от 2 856 ₽

На нашем складе

Привод шрус в сб. Lada XRAY (15-) лев. (КПП Renault JR5) (наруж. 23 шл./внутр. 26 шл.)

1 шт.

5 799 ₽

Привод лев.Lada X-Ray (15-) (дв.h5Mk/КПП Renault JR5) AR845

1 шт.

6 741 ₽

Другие предложения

Привод шрус в сб. Lada XRAY (15-) лев. (КПП Renault JR5) (наруж. 23 шл./внутр. 26 шл.)

1 шт.

5 370 ₽

Еще 10 предложений из 128 

от 1 дн

от 5 944 ₽

На нашем складе

ШРУС /2180 Lada Vesta/ внутр. (КПП Renault Jh4)

2 шт.

1 776 ₽

Другие предложения

ШРУС /2180 Lada Vesta/ внутр. (КПП Renault Jh4)

2 шт.

1 644 ₽

Шрус наружный комплект

100 шт.

1 671 ₽

Еще 8 предложений 

от 6 дн

от 1 747 ₽

На нашем складе

ШРУС наружный (K4M)

1 шт.

1 910 ₽

ШРУС наружный (K4M) CV-P1243

2 шт.

2 065 ₽

Другие предложения

ШРУС наружный (K4M)

1 шт.

1 768 ₽

Еще 10 предложений из 120 

от 0 дн

от 1 768 ₽

На нашем складе

Граната «LADA X-RAY» (наружная) (КПП Renault JR5, VAZ 2180) «Finwhale»

1 шт.

2 322 ₽

ШРУС наружный LADA Xray 391007857R

1 шт.

2 357 ₽

Другие предложения

FJ230 FINWHALE ШРУС наружный LADA Xray / Largus; Clio IV / Sandero II / Stepway II

23 шт.

2 027 ₽

Еще 10 предложений из 53 

от 1 дн

от 2 130 ₽

На нашем складе

Шрус LADA X-RAY 15- внутр.лев.(КПП Renault JR5, Jh4) GA11000

8 шт.

3 525 ₽

Шрус LADA X-RAY 15- внутр.лев.(КПП Renault JR5 Jh4)

1 шт.

3 525 ₽

Другие предложения

Шрус LADA X-RAY 15- внутр.лев.(КПП Renault JR5 Jh4)

1 шт.

3 122 ₽

Еще 10 предложений из 60 

от 3 дн

от 3 122 ₽

На нашем складе

Привод в сборе LADA X-RAY 15-/SANDERO II 14- лев.(КПП Renault JR5) GC01068

1 шт.

7 196 ₽

Привод в сборе LADA X-RAY 15-/SANDERO II 14- лев.(КПП Renault JR5)

1 шт.

7 196 ₽

Другие предложения

Привод в сборе LADA X-RAY 15-/SANDERO II 14- лев.(КПП Renault JR5)

1 шт.

6 395 ₽

Еще 10 предложений из 70 

от 3 дн

от 6 395 ₽

На нашем складе

Полуось Рено Sandero Stepway 2, Lada XRAY левая

2 шт.

5 152 ₽

Другие предложения

Полуось Рено Sandero Stepway 2, Lada XRAY левая

2 шт.

4 771 ₽

Полуось Renault Clio IV 0.9TCE 90, 1.5DCI 12-, Logan MCV 1.5DCI 13-, Sandero 1.5DCI 13- левая

2 шт.

4 897 ₽

Еще 3 предложения 

от 5 дн

от 5 055 ₽

На нашем складе

Привод шрус в сб. Lada XRAY (15-) лев. (КПП Renault JR5) (наруж. 23 шл./внутр. 26 шл.)

2 шт.

6 475 ₽

Привод в сборе,левый

2 шт.

6 957 ₽

Другие предложения

привод HOLALada X-Ray (15-) левый КПП Renault JR5 (длина 650мм) 23/26 шл.CV51-030 (OEM 391016613R)

1 шт.

5 987 ₽

Еще 10 предложений из 44 

от 1 дн

от 5 996 ₽

ЧЕХОЛ ЗАЩИТНЫЙ НАРУЖНЕГО ШРУСА ПРИВОДА ПЕРЕДН. LADA LARGUS

2 шт.

383 ₽

ЧЕХОЛ ЗАЩИТНЫЙ ВНУТРЕННЕГО ШРУСА ПРИВОДА ПЕРЕДН. LADA LARGUS

2 шт.

447 ₽

ШРУС наружный для а/м LADA X-RAY/RENAULT SANDERO STEPWAY (к-кт)[10]

86 шт.

1 288 ₽

ШРУС Lada XRAY 15— наружный

1 шт.

1 527 ₽

ШРУС наружный LADA X-RAY, RENAULT SANDERO STEPWAY (комплект)

96 шт.

1 675 ₽

Еще 4 предложения 

от 5 дн

от 1 738 ₽

ПРИВОД ПЕРЕДНИЙ ЛЕВ.

1 шт.

9 908 ₽

Привод левый Ларугс, Степвей, Х Рей

7 шт.

10 023 ₽

ПРИВОД ПЕРЕДНЕГО ЛЕВОГО КОЛЕСА

1 шт.

10 655 ₽

Еще 8 предложений 

от 5 дн

от 11 312 ₽

Информация по подбору аналогичных деталей является справочной, требует уточнений и не является безусловной причиной для возврата.
Изображение детали на фотографии может отличаться от аналогов. В наименовании запчастей допускаются ошибки из-за не точности перевода с иностранных прайсов.

Содержание

Двигатель Лада Х Рей, технические характеристики моторов Lada XRay, особенности конструкции

Двигатель Лада Х Рей, точнее двигатели для компактного российского кроссовера порадуют своей мощностью. Ведь если учесть размер и небольшой вес автомобиля, то например 122 л.с. может оказаться вполне достаточно. Всего силовых агрегатов у Lada XRay будет три. Все они бензиновые, атмосферные, рядные 4-цилиндровые с 16-клапанным механизмом DOHC. Пожалуй на этом совпадения прекращаются, в остальном это различные силовые агрегаты. Интерес вызывают все моторы Лада Х Рей поэтому расскажем о каждом подробно.

Базовый двигатель Икс Рей ВАЗ-21129 рабочим объемом 1.6 литра мощностью 106 л.с. хорошо известен по другим моделям Lada. Двигатель инжекторный и имеет распределённый впрыск топлива с электронным управлением. При обрыве ремня клапана гнет однозначно. Да, за ремнем ГРМ нужно следить. А вот чугунный блок говорит нам о хорошей ремонтопригодности мотора. Гидрокомпенсаторов у данного силового агрегата нет, регулировка осуществляется подбором специальных «пятаков», как на обычном моторе ВАЗ-2108.

Особенностью силового агрегата Lada XRay 1.6 (106 л.с.) можно считать оригинальную систему впуска. При низких оборотах двигателя подача воздуха идет по более длинным впускным каналам, а с ростом оборотов наоборот – по коротким. То есть меняется состав топливной смести с обедненной к обогащенной и наоборот. Это позволило увеличить мощность практически во всех диапазонах работы двигателя. Без этой системы удавалось выжать из мотора только 98 л.с.

Кстати сочетаться мотор будет только с 5-ступенчатой механикой JR5 от Renault, но собранной на «Автовазе». Далее подробные характеристики данного силового агрегата Х-Рея.

Двигатель Лада Х Рей 1.6 (106 л.с.), расход топлива, динамика

  • Рабочий объем — 1597 см3
  • Количество цилиндров/клапанов — 4/16
  • Привод ГРМ — ремень
  • Диаметр цилиндра — 82 мм
  • Ход поршня — 75,6 мм
  • Мощность л.с./кВт — 106/78 при 5800 оборотах в минуту
  • Крутящий момент — 148 Нм при 4200 оборотах в минуту
  • Максимальная скорость — 172 километров в час
  • Разгон до первой сотни — 11.7 секунд
  • Расход топлива по городу — 9,3 литра
  • Расход топлива в смешанном цикле — 7,0 литра
  • Расход топлива по трассе — 5,9 литра

Второй мотор XRay того же объема 1.6 литра, но мощностью уже 110 л.с. Это разработка концерна Рено-Ниссан. Двигатель на автомобилях Nissan называется HR16, у Рено его именуют как h5M. Агрегат появился в 2006 году и с тех пор ставят на все массовые модели Рено-Ниссан по всему миру. Производство данного двигателя освоили на «Автовазе». Конструктивно агрегат серьезно отличается от ВАЗовских движков с чугунным блоком и ремнем ГРМ.

В основе двигателя Лада Х Рей 110 л.с. алюминиевый блок цилиндров и алюминиевая головка блока цилиндров. В качестве привода ГРМ используется цепь. 4-цилиндровый рядный 16-клапанный HR16DE или h5M не имеет гидрокомпенсаторов, но есть система смены фаз газораспределения на одном валу. Из особенностей агрегата можно отметить наличие двух форсунок на цилиндр. Выглядит HR16 в сборе с вариаторной коробкой вот так

Но на Икс Рей его будут ставить только с 5-ступенчатой коробкой Рено. Динамика двигателя довольно неплохая, ниже предлагаем более подробные характеристики.

Двигатель Lada XRay 1.6 (110 л.с.), расход топлива, динамика

  • Рабочий объем — 1598 см3
  • Количество цилиндров/клапанов — 4/16
  • Привод ГРМ — цепь
  • Диаметр цилиндра — 78 мм
  • Ход поршня — 83,6 мм
  • Мощность л.с./кВт — 110/81 при 6000 оборотах в минуту
  • Крутящий момент — 156 Нм при 4000 оборотах в минуту
  • Максимальная скорость — 171 километров в час
  • Разгон до первой сотни — 10.3 секунд
  • Расход топлива — н/д

Ну и третий и самый мощный двигатель для Х-Рея, это ВАЗовский агрегат рабочим объемом 1.8 литра мощностью 122 л.с. Этот двигатель будет сочетаться не только с роботизированным автоматом, но и с обычной механикой. Собственно производством двигателя довольно давно занималось дочернее предприятие «Автоваза» «Супер-Авто». Метод создания этого двигателя изначально заключался в расточке блока цилиндров под большие поршня. То есть брали обычный 16-клапанный движок объемом 1.6 литра и растачивали блок. У обычного 1.6 литрового двигателя диаметр цилиндра составляет 82 мм, а у измененного 82.5 мм. Но в последнее время от этой модернизации отказались, поскольку моторесурс двигателя был небольшой, а расход масла весьма серьезный.

Теперь объем 1.8 литра получают в основном за счет увеличения хода поршня. То есть блок цилиндров тот же 1.6-литровый, а вот шатуны и коленвал иностранного производства и естественно другого размера. Да и сами поршни с графитовым напылением иностранные, от компании Federal-Mogul. Надежная иностранная шатунно-поршневая группа позволила уменьшить массу деталей, что неизбежно сказалось на стабильности работы мотора объемом 1.8 литра. Пропал дикий жор масла, а моторесурс оказался не меньше, чем у обычного 1.6 литрового агрегата. В общем удалось сделать хороший мотор с повышенной мощностью, а главное весьма неплохим крутящим моментом. Кроме того, мотор получил систему смены фаз газораспределения на впускном валу.

Далее технические характеристики нового мотора ВАЗ-21179 1.8 литра, который появился на кроссовере Lada XRay.

Двигатель Лада Х Рей 1.8 (122 л.с.), расход топлива, динамика

  • Рабочий объем — 1797 см3
  • Количество цилиндров/клапанов — 4/16
  • Привод ГРМ — ремень
  • Диаметр цилиндра — 82 мм
  • Ход поршня — 84 мм
  • Мощность л.с./кВт — 122/90 при 6050 оборотах в минуту
  • Крутящий момент — 170 Нм при 3700 оборотах в минуту
  • Максимальная скорость — 185 км/ч (с АМТ 186 км/ч)
  • Разгон до первой сотни — 10.4 секунд (с АМТ 12.3 сек.)
  • Расход топлива по городу — 9,3 литра (с АМТ 8.6 л.)
  • Расход топлива в смешанном цикле — 7,4 литра (с АМТ 6.8 л.)
  • Расход топлива по трассе — 5,8 литра (с АМТ 5.8 л.)

Мотор спокойно переваривает бензин марки АИ-92.

Lada xray какой привод — Все о Лада Гранта

LADA XRAY (ЛАДА Икс-рей) — российский автомобиль малого класса, компактный высокий хетчбэк, выполненный в стиле SUV [1] . Выпускается российской компанией АвтоВАЗ на производственной площадке в Тольятти с декабря 2015 года и позиционируется как компактный кроссовер [2] .

Содержание

История создания [ править | править код ]

В августе 2012 года на Московском международном автомобильном салоне был показан трёхдверный концепт-кар кроссовера LADA XRAY Concept [3] . Над концептом работала команда под руководством нового шеф-дизайнера Стива Маттина, который взял за основу проект «Lada C-Cross» [ источник не указан 901 день ] . За экстерьер отвечал Евгений Ткачев, за интерьер — Николай Суслов. Руководитель проекта LADA XRAY — Олег Груненков [4] . Единичный экземпляр автомобиля был создан итальянской фирмой Vercarmodel Saro S.r.l. по проекту дизайн-студии LADA. Стоимость создания этого образца обошлось приблизительно в 1 миллион долларов [5] . Концепт демонстрировал планы по развитию нового визуального стиля для автомобилей LADA, а также развитие в сегменте внедорожников, кроссоверов и SUV [6] [7] . «XRAY» — это аббревиатура, состоящая из «X» — как обозначение пересечения (англ. crossover , в значении типа кузова автомобиля, смотри кроссовер), «R» от слова «Recreation» («отдых»), «A» от слова «Activity» («активность»), «Y» от слова «Your» («твой»), или «Young» («молодой») [8] .

Через два года на том же московском автосалоне был показан второй концепт — пятидверный LADA XRAY Concept 2, уже более близкий к образцу для серийного производства [9] .

Серийное производство модели началось 15 декабря 2015 года, в полном соответствии с графиком, о котором ранее сообщалось предприятием [10] . Автомобиль выпускается на производственной площадке в Тольятти. Старт продаж состоялся 14 февраля 2016 года.

В 2016 году были представлены концепты спортивной и вседорожной версий: LADA XRAY Sport Concept и LADA XRAY Cross Concept. Спортивная версия получила заниженный клиренс, «спортивную» настройку двигателя и подвески, а вседорожная версия наоборот получила увеличенный клиренс, а также обвес — накладки на нижнюю часть дверей, пороги, колёсные арки, бамперы, защищающие эмаль кузова на лёгком бездорожье [11] [12] .

Технические характеристики [ править | править код ]

Дизайн автомобиля разработан стилистами АВТОВАЗа. Конструкция автомобиля создана совместно специалистами Renault и АВТОВАЗа на базе платформы В0. Длина серийного кроссовера LADA XRAY составляет 4164 миллиметра, ширина 1764 мм, высота — 1570 миллиметра. Колесная база — 2592 миллиметра. Объём багажника — от 361 до 1207 литров (при сложенных спинках задних сидений) [13] [14] .

На выбор доступно два бензиновых двигателя: модели объёмом 1,6 литров мощностью 106 л. с. (ВАЗ-21129) и модель объёмом 1,8 литров на 122 л. с. (ВАЗ-21179) [14] [15] [16] . Вариант LADA XRAY с двигателем 1,8 л и мощностью 122 л. с. получил трансмиссию АМТ (автоматизированную механическую коробку передач) [17] [18] [16] .

Lada XRAY Cross [ править | править код ]

В ноябре 2018 года начались продажи версии Lada XRAY Cross [19] . Такой автомобиль отличается от стандартной модели увеличенным дорожным просветом, декоративным обвесом кузова и новыми сиденьями, а также модернизированной передней подвеской, дисковыми тормозами сзади, изменённой конструкцией рулевого механизма. В списке опций появились обогрев руля, обогрев заднего дивана и система управления настройками системы стабилизации Lada Ride Select.

Габариты

Ходовая часть

Топливо

Двигатель

Автомобиль Лада Х-рей комплектуется следующими типами привода: Передний (FF). Разберёмся, какой тип привода лучше для автомобиля.

Существует только три типа привода. Передний привод (FF) — когда крутящий момент от двигателя передаётся только передним колёсам. Полный привод (4WD) — когда момент раздаётся на колёса и передней и задней оси. А также Задний (FR) привод, в его случае вся сила мотора безраздельно отдана двум задним колёсам.

Передний привод более «безопасен», переднеприводные машины легче управляются и более предсказуемы в движении, с ними может справиться даже новичок. Поэтому большинство современных авто укомплектованы именно передним типом привода. К тому же он недорого стоит и требует меньше внимания в обслуживании.

Полный привод можно назвать достоинством любого автомобиля. 4WD увеличивает проходимость машины и позволяет её владельцу уверенно чувствовать себе как зимой на снегу и льду, так и летом на песке и грязи. Однако за удовольствие придётся заплатить, как повышенным расходом топлива, так и ценой самой машины — автомобили с типом привода 4WD стоят дороже чем другие варианты.

Что касается заднего привода, то в современном автомобилестроении им комплектуются либо спортивные автомобили, либо бюджетные внедорожники.

Российский автопроизводитель решил своеобразным образом прекратить споры по поводу принадлежности Лады Хрей (LADA XRAY) к сегменту кроссоверов или хетчбэков, поставив в названии и заодно на этих спорах большой X.

Полноприводная Лада Хрей Х

Новинку решили максимально приблизить, и внешне и по ТХ, к SUV классу: в основе платформа от модели с полным приводом, и, собственно, сам полный привод в «базе». Если нынешний XRAY создавался на базе экономичного городского хетчбэка Sandero, то некст генерация с приставкой X (его уже прозвали X в квадрате) будет создаваться на платформе реального внедорожника, доказавшего свою практичность и проходимость — Duster .
Что касается новой приводной системы, то в данный момент её «творят» лучшие инженеры Японии, разумеется, делают они это не для Лады, но именно их полный привод ляжет в основу XRAY X с некоторыми доработками от Nissan.

LADA XRAY Х — на выставке

Что же ещё изменится в новом отечественном кроссовере, кроме полного привода и платформы от настоящего внедорожника? По словам разработчиков, изменениям подверглась и габаритная составляющая — длина автомобиля увеличена на 15 сантиметров, подтянули и высоту сантиметров на пять.
В экстерьере производители обещают так любимые ими же самими, в виду лёгкости сокрытия изъянов, и некоторыми поклонниками марки, пластиковые обвесы. Декоративные «нахлобучки» будут по всему кузову, от порогов, до арок. Разумеется, это будет среднего качества накрашенный пластик.

LADA XRAY Х — салон

Подкапотное пространство производитель решил заполнить лучшим двигателем, имеющимся в его распоряжении. На сегодняшний день это бензиновая силовая установка объёмом 1.8 литра и мощностью 122 лошадиные силы.

особенности конструкции,  характеристики,  сильные и слабые стороны

Модели Lada Vesta и Lada Хray являются  давно ожидаемыми новинками от концерна АвтоВАЗ. Благодаря современному дизайну, удачному сочетанию оснащения и технических характеристик, а также приемлемой цены, такие автомобили стали быстро набирать популярность. Лада Веста появилась в продаже первой и с ней уже успели познакомиться многие автолюбители.

Что касается Лада Х Рей, модель увидела свет не так давно. Вполне очевидно, максимум внимания прикован к двигателю на данной модели, так как опытные автомобилисты на территории СНГ всегда делают ставку на надежность и ресурс силового агрегата.

О некторых особенностях двигателя на Лада Веста мы уже говорили в нашей отдельной статье. Также рассмотрен вопрос подбора масла для Лада Веста. Далее мы  рассмотрим Лада Икс Рей, двигатель на данной модели, какие варианты ДВС для Lada Xray предлагает АвтоВАЗ, а также какой из них лучше выбрать.

Содержание статьи

Двигатели Лада X-Рей

Как известно, выпуск новых моделей Веста и Икс Рей являются важным шагом на пути развития АвтоВАЗ. По этой причине разработчики подошли к вопросу технической составляющей со всей ответственностью, при этом моторы для инженеров компании стояли на первом месте. Итак, давайте заглянем под капот Xray.

Прежде всего, данный автомобиль получил не один и даже не два, а целых три двигателя. Два типа агрегатов являются отечественной разработкой (ВАЗ-21129 и ВАЗ-21179), также автомобиль может быть укомплектован силовой установкой HR16DE, которую производит компания Nissan. При этом каждый тип ДВС является современным и  полностью соответствует рекомендуемым нормам и стандартам.

  • Начнем с ВАЗ-21129. Данный тип установки представляет собой  проверенный временем бензиновый двигатель, который АвтоВАЗ устанавливает на разные свои модели достаточно давно. Мотор рядный, 4-х цилиндровый, 16-клапанный, имеет рабочий объем 1.6 литра и расположен поперечно.

Двигатель получил систему распределенного впрыска с электронным управлением, привод ГРМ ременной. Мощность составляет 106 л.с., крутящий момент 148 Нм. С таким ДВС автомобиль разгоняется до «сотни» за 11.4 сек, максимальная скорость составляет 176 км/ч.

Силовой агрегат соответствует экологическому стандарту Евро-5, по городу этот мотор расходует чуть более 9 л. топлива марки АИ-95, по  трассе можно уложиться в 7.2 л., в смешанном цикле расход составляет менее 6.0 литров.

Двигатель Lada Хray ВАЗ 21129 был создан на основе мотора ВАЗ 21127, который хорошо знаком автолюбителям по модели Priora. При этом силовая установка была существенно доработана. Стоит отметить, что во впускном коллекторе появились заслонки, что позволяет изменять длину коллектора. Результат —  двигатель работает с максимальной экономичностью и отдачей как на низких, так и на высоких оборотах.

Также инженеры избавились от ДМРВ, заменив его на датчик температуры воздуха и датчик абсолютного давления. Такой подход позволил заметно улучшить качество смесеобразования, а также исключить известную проблему, которая связана с неустойчивыми оборотами (обороты плавают).

Двигатель стал менее вибронагруженным благодаря измененным опорам и способу крепления ДВС в подкапотном пространстве. Также доработанный впуск и выпуск снизил общую шумность во время работы агрегата на разных режимах. В результате значительно повысился акустический комфорт и снизился уровень вибраций, которые передаются на кузов.

  • Мотор Nissan h5M-HR16DE является детищем партнеров  АвтоВАЗ, а именно Альянса Renault и Nissan. Двигатель хорошо известен и давно устанавливается на популярные модели Nissan Note, Tiida, Ниссан Qashqai и т.д.

Такой мотор  также имеет рабочий объем 1.6, двигатель рядный, с четырьмя цилиндрами и 16 клапанами. Данный агрегат с распределенным впрыском топлива, максимальная мощность составляет 110 л. с., моментная характеристика находится на отметке 150 Нм. Привод ГРМ цепной, что повышает надежность силовой установки.

Разгон Лада Иксрей до 100 км/ч с таким ДВС занимает 11.1 сек, максимальная скорость 181 км/ч. Двигатель соответствует стандарту Евро 4/5, может потреблять бензин марки АИ-92 или 95. Расход топлива в городском цикле зафиксирован на отметке 8.9, в смешанном цикле 6.8, при загородной езде по трассе 5.6 литра.

Отметим, что данный мотор для Росси несколько дефорсирован. В других странах этот двигатель «выдает» от 115 до 118 л.с., однако в РФ и СНГ мощность ограничили 110 «лошадками» с учетом качества топлива, налогообложения и т.д. Указанный двигатель имеет цепной привод ГРМ. Такое решение снижает риск обрыва, а также избавляет владельцев от необходимости часто менять ремень механизма газораспределения. Кстати, конструкция ГРМ не предполагает наличие гидрокомпенсаторов.

С одной стороны, из этого следует, что клапана нужно регулировать, хотя с другой несколько снижаются требования к качеству моторного масла и периодичности его замены. Еще добавим, что на новых двигателях регулировка клапанов, как правило, требуется к 70-80 тыс. км. пробега. На практике получается, что в рамках ТО на 80-100 тысячах меняется цепь, регулируются клапана и двигатель можно длительный срок эксплуатировать дальше.

Рекомендуем также прочитать статью о том, что из себя представляет новый двигатель Поло Седан. Из этой статьи вы узнаете об особенностях конструкции, а также о плюсах и минусах нового мотора на Polo Sedan.

Указанный мотор также получил систему изменения фаз газораспределения, фазовращатель закреплен на впускном распределительном валу. Также стоит отметить электронную дроссельную заслонку и две форсунки на каждый цилиндр. В результате двигатель получился тяговитым и экономичным, а также в плане экологичности удалось добиться вполне приемлемых показателей.

  • Двигатель 1.8 на Лада Икс рей с индексом ВАЗ-21179 по понятным причинам особо интересует многих автолюбителей, так как данный двигатель самый мощный в линейке агрегатов. Мотор является новой отечественной разработкой,  причем создавался отдельно для моделей Веста и Xr
При создании нового ДВС за основу инженеры взяли силовую установку ВАЗ 21126, использовав аналогичный блок цилиндров. Итак, двигатель рядный, 4-хцилиндровый, с поперечным расположением и 16-ю клапанами. Рабочий объем составляет 1774 «кубика».

Максимальная мощность 122 л. с., которая доступна на 6050 об/мин. Что касается моментной характеристики, максимальный крутящий момент составляет 170 Нм и доступен на 3 750 об/мин, что является неплохим показателем применительно к повседневной эксплуатации.

Автомобиль разгоняется до сотни за 10.9 сек, а «максималка» составляет 186 км/ч. Что касается данных по расходу горючего, в городе  указанный силовой агрегат на Икс Рей потребляет 8.6 литра на 100 км. пути, за городом расход составляет 5.8 литра, в смешанном цикле 6.8 литра 95-го бензина.

Механизм газораспределения имеет ременной привод, а также 2 распредвала, что улучшило наполнение и вентиляцию цилиндров на разных режимах работы ДВС. Примечательно то, что новый мотор для Лада Xray сильно отличается от других агрегатов производства АвтоВАЗ.

Изменения затронули сам двигатель и его детали, дроссельную заслонку, механизм клапанов и многое другое. Дроссель теперь без механического привода, использованы облегченные клапана, регулятор изменения фаз газораспределения получил отдельные каналы для подачи масла.

Увеличенный ход поршня позволил реализовать больший рабочий объем, коленвал имеет увеличенный радиус кривошипа, маслонасос имеет повышенную производительность и т.д. ЦПГ также облегченная, система питания была оснащена высокопроизводительными форсунками, которые специально дорабатывались специалистами под данный тип ДВС.

Что в итоге

Как видно, автомобиль Лада Икс Рей оснащается современными и надежными ДВС. При этом многие покупатели не спешат переплачивать за двигатель Nissan на Хray, останавливая свой выбор на отечественных разработках. Как правило, повышенным спросом пользуется самый мощный в линейке ВАЗовский 1.8.

Рекомендуем также прочитать статью о том, что такое двигатель FSI. Из этой статьи вы узнаете об особенностях конструкции силовых агрегатов данного типа, а также о преимуществах и недостатках моторов FSI.

Кстати, стоит выделить, что хотя ВАЗ-21179 производится в РФ, большое количество компонентов и деталей являются импортными. Например, распредвалы поступают из Южной Кореи, в конструкции используются клапана Mahle и т.д.

Получается, хотя двигатель и отечественный, по факту это практически «иномарочный» мотор. В результате можно смело предположить, что при надлежащем качестве сборки и обслуживания надежность данного агрегата не будет уступать импортным аналогам.

Читайте также

  • GDI двигатель: что это такое?

    Конструктивные особенности двигателей GDI с непосредственным впрыском от моторов с распределенным впрыском топлива. Режимы работы, неисправности GDI.

Собраны первые экземпляры внедорожника Tank 600, который ждут в России

В Китае стартовало производство модели Tank 600, первого внедорожника концерна Great Wall, который получит трехлитровую «турбошестерку» и электрическую надстройку в виде 48-вольтового стартер-генератора. Модель с технологией «мягкого» гибрида пока прячут под камуфляжной пленкой, ведь полноценный дебют состоится в августе на автосалоне в Чэнду. В будущем Tank 600 появится и в России, однако для нашего рынка внедорожники будут собирать в Тульской области.

В Китае стартовало производство модели Tank 600, первого внедорожника концерна Great Wall, который получит трехлитровую «турбошестерку» и электрическую надстройку в виде 48-вольтового стартер-генератора. Модель с технологией «мягкого» гибрида пока прячут под камуфляжной пленкой, ведь полноценный дебют состоится в августе на автосалоне в Чэнду. В будущем Tank 600 появится и в России, однако для нашего рынка внедорожники будут собирать в Тульской области.

Tank 600 комплектуется бензиновым двигателем V6 3.0 с двойным турбонаддувом, а ассистирует мотору электрический стартер-генератор: отдача установки составляет 354 лошадиных силы. Трансмиссия — девятидиапазонный автомат, привод только полный.

Китайский портал Autohome.com.cn публикует первые фотографии с церемонии запуска производства модели. Несколько уже собранных экземпляров, обклеенных камуфляжной пленкой, подремонтировали журналистам: серийная версия получилась менее брутальной и выразительной, чем внедорожник на опубликованных ранее скетчах. Однако массивная радиаторная решетка с толстой рамкой и вертикальной эмблемой Tank ему все же досталась.

В конкуренты будущему внедорожнику уже записали Toyota Land Cruiser, с которым он сравним по габаритам.

Great WallGreat WallGreat Wall

Внедорожник с индексом 600 станет второй моделью в линейке суббренда Tank. Первым был «младший» Tank 300, который успешно дебютировал на китайском рынке в конце 2020 года. В дальнейшем гамма пополнится внедорожниками 700 и 800, уже представленными в статусе предсерийных прототипов.

Что же касается российского рынка, то для него подтверждены модели Haval Big Dog и Wey Tank 300 — обе они были представлены на конференции в Сочи в апреле этого года. Первый построен на новой платформе L.E.M.O.N, а под капотом у него полуторалитровый турбомотор мощностью 169 лошадиных сил, который работает в паре с семиступенчатым «роботом». Второй внедорожник получил двухлитровый турбомотор мощностью 227 лошадиных сил, сочетающийся с восьмидиапазонным «автоматом» и системой полного привода

В Great Wall пока не обозначили сроки появления новинок в России. Ожидается, что все они будут производиться на мощностях завода Haval в Тульской области.

Источник: autohome.com.cn
Десять китайских автомобилей, которые любят в России

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений. Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0.2 мкм). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору акцептора без излучения за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную для той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофора разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя резонансный перенос энергии флуоресценции часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых мечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса на длине волны максимальной абсорбции будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белков-партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера. расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость передачи резонансной энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) по сравнению с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET
Донор Акцептор Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан Дансил 2.1
ИАЭДАНЫ (1) ДДПМ (2) 2,5 — 2,9
BFP DsRFP 3,1 — 3,3
Дансил FITC 3,3 — 4,1
Дансил Октадецилродамин 4.3
CFP GFP 4.7 — 4,9
CF (3) Техасский красный 5.1
Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 — 5,5
Cy3 Cy5 > 5,0
GFP YFP 5,5 — 5,7
BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6.1
FITC Эозин тиосемикарбазид 6,1 — 6,4
B-фикоэритрин Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 > 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ — в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

κ

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донор-акцептор надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Фёрстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

  • Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
  • Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
  • Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
  • Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях методом FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
  • Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
  • Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
  • Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
  • Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
  • При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
  • Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
  • Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Обнаружение FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванной гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии как с флуоресценцией донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут иметь различное время жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может изменяться множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что FRET-анализ показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка

Значение

Белки принимают неупорядоченные ансамбли ранее складывать, а иногда и как часть их функции. Моделирование и исследования FRET часто описывают неупорядоченные конформации как более компактные, чем состояния случайных клубков, наблюдаемые при высоком денатуранте, тогда как малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) указывает, что эти конформации остаются расширенными.Устранение этого несоответствия улучшает наше понимание свойств белков, например, является ли вода достаточно плохим растворителем, чтобы вызвать неспецифический коллапс. Мы достигаем согласования, показывая, что добавление флуорофоров FRET уменьшает размеры неупорядоченного белка. Подробный анализ FRET и SAXS, наряду с учетом сокращения, индуцированного флуорофором, демонстрирует, что неупорядоченные и развернутые белки часто остаются сольватированными и расширенными без денатуранта, свойства, которые минимизируют неправильную укладку и агрегацию.

Abstract

Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают в отсутствие денатуранта, остаются спорными. Мы разработали процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и использовали ее, чтобы продемонстрировать, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными в воде, как и при высоких концентрациях денатуранта. Напротив, как показано здесь, большинство измерений резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) показали, что относительно гидрофобные IDP значительно сокращаются в отсутствие денатуранта.Мы используем два независимых подхода для дальнейшего изучения этого противоречия. Во-первых, с помощью SAXS мы показываем, что флуорофоры, используемые в FRET, могут вносить вклад в наблюдаемое несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa-488 к нормально расширенному IDP вызывает сокращение еще на 15%, что вполне соответствует сокращению, о котором сообщалось в исследованиях на основе FRET. Во-вторых, используя нашу процедуру моделирования и анализа для точного извлечения радиуса инерции (R g ) и расстояния от конца до конца (R ee ) из профилей SAXS, мы проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованным, если R g и R ee «разъединены» (т.е.е., больше не просто пропорциональны), в отличие от случая гомополимеров случайного блуждания. Однако мы обнаружили, что даже для развернутых белков эти две меры измерений развернутого состояния остаются пропорциональными. Вместе эти результаты предполагают, что улучшенные процедуры анализа и коррекция значительных взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточны для согласования предыдущих исследований SAXS и FRET, обеспечивая тем самым единую картину природы развернутых полипептидных цепей в отсутствие денатурирующего агента.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, развернутые и внутренне неупорядоченные белки (IDP) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3⇓⇓⇓⇓ – 8) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить. . Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ заключают контракты в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое сокращение может иметь широкое значение для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ.Более того, понимание степени сжатия неупорядоченных ансамблей имеет большое значение для разработки реалистичных симуляций складчатости и интерпретации измерений малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и FRET (9, 10).

Наше понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, относительно компактный ансамбль или вести себя как расширенное, полностью сольватированное, самоизбегающее случайное блуждание (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных.Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями денатурирующих веществ, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях консенсус состоит в том, что белки ведут себя как SARW с показателем Флори (ν) 0,60 в соотношении R g ∝ N ν (N = длина цепи). Напротив, нет единого мнения относительно поведения ВПЛ при более низком уровне денатуранта или его отсутствии. В частности, в то время как многочисленные FRET (11⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 25) и вычислительные исследования (11, 14, 18, 23, 26⇓⇓ – 29) утверждали, что расширенный неупорядоченный ансамбль обнаруживает при высоком уровне денатуранта сжимается значительно [обычно на 25-50% при переходе на низкий денатурант или без него (ν <0.5)] (11, 14, 18, 23, 26⇓ – 28, 30⇓⇓⇓⇓ – 35), аналогичное количество исследований SAXS сообщает о небольшом сокращении или его отсутствии в тех же условиях (10, 36–35). 41).

Разнообразные недавние исследования пытались примирить это несоответствие (Fig. 1 A ), которое имеет глубокие последствия для физики сворачивания белков. Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей привело к полученным FRET расстояниям, имеющим меньшую денатурантную зависимость (Рис. 1 A , Bottom ) (40, 42⇓ – 44).Параллельно улучшены данные и анализ SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения в ν, а не в R г (что важно, поскольку добавление флуорофоров на концах цепи увеличит R г из-за их массы), также предоставили доказательства незначительного сжатия ниже 2 M Gdn (Рис. 1 A , Bottom ) (45, 46). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются в отсутствие денатуранта, даже когда для анализа одного и того же белка в идентичных условиях используются одни и те же подходы (рис.1, SI Приложение , рис. S1 и S2 и Movie S1). Недавние исследования показали, что это несоответствие может быть устранено с помощью целостного анализа (42, 43), подчеркивая разделение между обычно фиксированной, пропорциональной зависимостью между R g (определено из измерений SAXS) и R ee (определено из Измерения FRET) без необходимости вызывать возмущение из-за присутствия флуорофоров (42).

Рис. 1.

Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET.( A ) Данные R17 SAXS и FRET (из ссылки 43). ( A , Top ) Сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. ( A , Bottom ) Данные SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (45). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы. ( B ) Профили SAXS для R17 ( Левый , данные из Ref.43) и N98 ( Правый , данные из ссылки 42), согласованные с MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений ν, взятых из аналогичного анализа данных FRET. Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя подходило ~ 500 точек на кривую рассеяния (серый цвет), большинство показанных данных были объединены в интервалы только для целей презентации (черные точки). Повороты или изгибы данных при более высоких значениях qR g , скорее всего, связаны с ошибками при вычитании буфера, что является более сложным при высоком q, низкой концентрации образца и / или пониженном контрасте рассеяния (например.g., при высоком денатуранте, см. Материалы и методы ). ( C ) Тенденции гидрофобности (Кайт – Дулиттл) в зависимости от ν в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из последовательностей складываемых белков (42, 45, 67⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ № – 82). Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в исх. 20 для опубликованных данных (20, 42). Красная линия тренда для данных FRET из исх. 20. Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. ( C , Top ) Гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из исх.45). ( D ) Кумулятивные распределения ν для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных в C .

Чтобы всесторонне сравнить результаты исследований SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для различных ВПЛ (Рис. 1 C и D и SI Приложение , Таблица S3). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят ν> 0,53 (среднее = 0,55), тогда как ν, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0.50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону ν, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для уплотнения в сферу; несколько выше для несферических компактных состояний). В целом, результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей сильно расширены (ν> 0.5) и вода является хорошим растворителем, тогда как FRET предполагает иное (рис. 1 D ).

Приведенные выше и другие результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать стойкому несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (9, 29, 39, 42, 43, 47⇓⇓ – 50 ). Одна альтернатива, обозначаемая здесь как «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к вариациям во взаимосвязи между R g и R ee , взаимосвязь, которая является фиксированной (т.е.е., независимо от длины цепи) в соотношении 6,3 для гомополимера SARW. Недавнее моделирование показывает, что это соотношение не может быть зафиксировано для развернутых белков, которые более сложны, чем гомополимеры (29, 39, 42, 43). Эта «развязка» предлагает возможное объяснение несоответствия между SAXS (который чувствителен к R g ) и FRET (который чувствителен к R ee ). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофора», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (9, 45, 47, 50, 51).

Здесь мы обращаемся как к гипотезе разделения, так и к гипотезе взаимодействия флуорофора. Мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения IDP до и после добавления обычно используемого флуорофора. Мы обнаружили, что такая модификация флуорофора изменяет конформационный ансамбль в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10–20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно с этим мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сжатие этого полимера SARW (9), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (42). Кроме того, мы показываем, что SAXS может извлекать R g , ν и R ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти модели достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подансамбля конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Маркировка флуорофора вызывает коллапс.

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия флуорофора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же самого IDP, сайт-специфически модифицированного одной или двумя копиями обычно используемого флуорофора FRET Alexa-488. Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, что снижает вероятность образования взаимодействий, которые могут изменить развернутый ансамбль, по сравнению с большинством других флуорофоров FRET (43).В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (52). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали тиол-реактивный Alexa-488 для модификации остатков цистеина в положении 117 (PNtC-Alexa488) или положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa-488 снижает размеры PNt, измеренные методом SAXS, как в отсутствие Gdm, так и при промежуточных концентрациях (рис.2 A и SI Приложение , Таблица S1). В частности, при переходе от 4 к 0 M Gdn, R g и ν уменьшаются почти в два раза для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt (рис. 2 B и SI Приложение ). , Таблица S1). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa-488 приводит к сокращению конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (ν> 0,50) для немеченого белка, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта (рис.2 B , Правый ). В соответствии с общим происхождением эффекта, величина этого зависящего от денатуранта расширения качественно аналогична наблюдаемой FRET для множества других белков (Fig. 1 B ) (42, 43). Мы также наблюдали зависящее от флуорофора снижение среднего R g и ν для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 (рис. 2), что указывает на то, что, помимо предполагаемых взаимодействий флуорофор-флуорофор, взаимодействия флуорофор-белок также вносят вклад в наблюдаемое сокращение.

Рис. 2.

Добавление Alexa-488 изменяет рассеяние PNt. ( A ) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-алкилированного (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из SD, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на рис. 1 (см. Также Материалы и методы ).Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но существуют значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa-488. ( B ) R г и ν как функция концентрации Gdn. Данные серых кривых из исх. 45.

Следует отметить, что это сокращение происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 M денатуранте, соответственно ( SI Приложение , Таблица S2), ниже порогового значения, обычно рассматриваемого в качестве доказательства. свободного вращения прикрепленных к белкам флуорофоров (42, 53).Из этих результатов мы заключаем, что добавление даже одного из более мелких, более гидрофильных флуорофоров, обычно используемых для измерений FRET, может значительно уменьшить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (42, 43, 53), наблюдение, которое помогает согласовать SAXS – FRET несоответствие.

Размеры ПЭГ, полученные методом SAXS, не зависят от концентрации полимера.

В более раннем исследовании мы сообщили, что добавление Alexa-488/594 к PEG приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (9), аналогичному тому, которое наблюдается в развернутых белках.Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, маскируют то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением R g (42). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров этого высокогидрофильного полимера (рис.3). Аналогичным образом, во всех условиях мы наблюдали показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта. Эффекты флуорофора, а не сокращение цепи, таким образом, остаются простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, ранее наблюдавшихся для меченных флуорофором вариантов этого полимера (9).

Рис. 3. Профили

SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта. ( A ) Безразмерные графики Кратки 24 кДа ПЭГ при 0.5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0 до 4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали. Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на фиг. 1. ( B ) R g и ν как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров.

Взятые вместе, вышеупомянутые наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET. Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что, как утверждалось ранее (42), развязка гетерополимера (т. Е. Связь между R ee и R g , отклоняющаяся от фиксированной пропорциональности, наблюдаемой для гомополимеров) также может вносить свой вклад. к расхождению SAXS – FRET.

Чтобы исследовать, приводит ли конформационный ансамбль реалистичного гетерополимера к значительной непропорциональности между R ee и R g , мы использовали Upside, наши модели Cβ-уровня (54, 55), чтобы смоделировать рассеяние для развернутых ансамблей. 50 белков из 250–650 остатков, случайно выбранных из банка данных по белкам (PDB). В своей простейшей версии Upside представляет собой каркас полипептида с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O и Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рамачандрана, полученные из библиотеки катушек (56).Такие модели способны воспроизводить R g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам магистрали соответственно (57, 58). Для создания ансамблей гетерополимеров мы отнесли каждый Cβ как гидрофобный, так и полярный (H / P). Благоприятные профили взаимодействия (форма, показанная в ссылке 45, SI, приложение , рис. S3 A ) вводятся только между атомами Cβ гидрофобных остатков, а самопереключение накладывается на все атомы.Для каждой из 50 последовательностей мы использовали 30 различных сил взаимодействия Cβ. После создания этих 1500 ансамблей H / P конформаций скелета мы добавили явные боковые цепи (59), а затем рассчитали профили рассеяния гидратированных версий белков (60).

Для этих 1500 ансамблей мы сравнили истинные значения R g , ν и R ee , рассчитанные непосредственно из атомных координат, со значениями, полученными путем аппроксимации смоделированного рассеяния (с добавлением реалистичных случайных ошибок) с использованием нашего оригинального MFF, разработанного для гомополимеров (45).Как и в случае гомополимеров, мы находим, что значения R ee и R g , наблюдаемые в этих симуляциях, пропорциональны (т. Е. Остаются связанными) с коэффициентом корреляции R 2 = 0,99 (рис. 4 А ). Затем мы аппроксимируем смоделированные профили рассеяния, чтобы определить: R g соответствует , ν соответствует и R ee соответствует , причем последнее получено с использованием соотношения (R ee / R g ) 2 = G (ν), где G (ν) была откалибрована с использованием нашего исходного моделирования гомополимеров ( SI Приложение , рис.S1 D ). Мы обнаружили среднее абсолютное отклонение всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно, что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% для R g , ν и R ee ( SI Приложение , рис. S3). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более протяженных конформаций (ν> 0,54) ошибка составляет ∼2%. Корреляция R g соответствует и R ee соответствует осталась высокой, R 2 > 0.99.

Рис. 4.

Моделирование обнаруживает сильную связь между R g и R ee , а профили SAXS являются надежным показателем R g , ν и R ee , а также дают информацию о степени неоднородности. ( A ) Связывание между R g и R ee , полученное из смоделированных ансамблей с использованием модели H / P (черный) или нашего потенциала, используемого для сворачивания белков (красный). ( B D ) Сравнение R g , ν и R ee , рассчитанных на основе координат смоделированных ансамблей, по сравнению со значениями, полученными при подгонке с нашим MFF het (R g , ν) с SAXS профили ансамблей со случайно добавленными экспериментальными ошибками.( E ) Отклонения в ν концов наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо перемешанными паттернами H / P (полученными путем аппроксимации наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R | i — j | от разделение последовательностей, | i — j |, где | i — j |> N / 2). ( F ) Влияние Δν end при различных значениях ν. ( G ) Подбор экспериментальных данных для MFF (R g , ν, Δν конец ) демонстрирует, что мечение флуорофора и образование петли через дисульфидные связи в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF het , используя моделирование H / P, описанное выше, и ту же общую процедуру. как описано в исх. 45. Применение этого слегка модифицированного MFF het снижает ошибки в подогнанных R g , ν и R ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% среднего значения. абсолютная погрешность (рис.4 B D ). Эти результаты демонстрируют, что наша процедура анализа на основе MFF возвращает точные значения для R g и R ee , которые остаются пропорциональными (т. Е. Связанными) даже для гетерополимеров.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, чувствительны ли наши выводы к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование, используя более подробную версию алгоритма Upside, который способен сворачивать de novo белки с <100 остатками (54, 55).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена ​​многопозиционным эксцентрическим буртиком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковая цепь-боковая цепь и боковая цепь-основная цепь, аминокислотно-зависимые потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из 50, описанных выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Мы получили ансамбли, выполнив моделирование обмена репликами в диапазоне температур от 280 до 320 К, как описано ранее (54, 55). Значения ν, полученные из этих ансамблей, находились в диапазоне от 0,4 до 0,6 в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R ee , R g и ν, полученные непосредственно из этих более реалистичных ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными после подгонки с нашим MFF het , с почти такой же точностью, что и для более простого H / P-ансамбли (рис.4 A C , красные точки). Кроме того, непосредственно вычисленные значения для R g и R ee для ансамблей остаются пропорциональными с коэффициентом корреляции R 2 = 0,99. Следовательно, наш вывод, что R g и R ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям нашего моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах.

MFF het точно отражает общие размеры неупорядоченных гетерополимеров для белковоподобных последовательностей H / P и может использоваться в большинстве случаев.Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами H / P ( SI Приложение , рис. S4). Эти различия можно увидеть на графике распределения внутримолекулярных расстояний, где наклон на расстояниях разделения | i — j | > N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение ν (рис. 4 D ). Определим изменение наклона как Δν конец (рис. 4 D ). Отрицательные значения Δν конец коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности (рис.4 D и SI Приложение , Рис. S4 C ) и с отклонениями в G (ν) ( SI Приложение , Рис. S4 A ) ( R 2 ∼ 0.84). Профиль SAXS наиболее чувствителен к Δν end при низком qR g (рис. 4 E ).

Для количественной оценки неидеальности гетерополимеров на основе данных SAXS мы создали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF general (R g , ν, Δν end ) (рис.4 E и F и фильм S2). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn (рис. 4 F ). Δν конец уменьшается с ∼0 для PNt примерно до -0,1 для PNtCC-Alexa488 и примерно до -0,2 для кольцевых PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Менее резкие возмущения, такие как менее хорошо смешанные паттерны H / P и более короткие аминокислотные последовательности с более низким полезным диапазоном qR g , могут потребовать более высокого отношения сигнал / шум для измерения Δν end .Тем не менее, эти данные демонстрируют потенциал SAXS для выявления для неупорядоченных полимеров зависимых от последовательности отклонений от поведения гомополимера (рис. 4 E и F ), при этом все еще точно измеряя R g и ν (рис. 4 ). А С ).

В пределе бесконечной длины цепи масштабный показатель Флори ν имеет значения 0,33, 0,50 и 0,60, соответствующие глобулам, случайным блужданиям и SARW, соответственно. Тем не менее, мы и другие придерживаемся прагматического подхода и позволяем ν принимать промежуточные значения; е.g., как получено из наклона графиков масштабирования R g в зависимости от длины цепи или R ij в зависимости от | i — j | ( SI Приложение , рис. S6). В поддержку этого подхода можно наблюдать при увеличении силы внутрицепочечного взаимодействия уменьшение как I (q) при высоком q, так и наклона графиков масштабирования для белков из 100-1000 остатков (Fig. 4). Соответственно, мы считаем, что использование значений ν за пределами трех канонических значений обеспечивает законный и практический подход для сравнения качества растворителей для систем разного размера и классификации, является ли вода хорошим или плохим растворителем для полимеров конечной длины.

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (ν> 0,5) для развернутых полипептидов, исследования на основе FRET обычно сообщают об обратном (ν <0,5). Однако мы обнаруживаем, что сочетание улучшенных процедур анализа и более тщательного рассмотрения взаимодействий флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточно для объяснения этого несоответствия. Эти находки приводят к единой картине, в которой развернутое состояние белков представляет собой SARW при высоком денатуранте и сжимается лишь незначительно (намного меньше, чем ранее сообщалось в литературе FRET) в отсутствие денатуранта.В частности, мы обнаружили, что мечение Alexa-488, широко используемого флуорофора FRET, может изменить конформационный ансамбль IDP, уменьшая R g и ν даже при низкой анизотропии флуоресценции относительно принятых пределов для свободного вращения флуорофора ( 42, 53). В сочетании с предыдущими исследованиями (9) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (45), и улучшенные методы извлечения значений R g из данных FRET (40, 42–44), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий. между SAXS и FRET по размерам неупорядоченных белков.Фундаментальный и важный вывод полученной единой картины состоит в том, что даже в отсутствие денатуранта вода остается хорошим растворителем для большинства развернутых белков.

Наши данные об эффектах, индуцированных флуорофором, согласуются с предыдущими выводами о том, что молекулярные размеры, выведенные из FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные флуорофоры приводят к большему сокращению (43). МД-моделирование с парой флуорофоров Alexa-488/594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (61).Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы одномолекулярных FRET (smFRET) как от ДНК, так и от PEG зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (51). Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (42) провели измерения SAXS на пяти IDP с Alexa-488/594 и без них и пришли к выводу, что в среднем изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений.В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, ν без метки — ν метка = 0,08, 0,03, 0,03, -0,02 и -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02 и -0,08 при анализе с использованием наши процедуры; SI Приложение , рис. S5). Хотя Fuertes et al. (49) утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует индуцированное флуорофором сокращение, на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения в ν, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (42). величины, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (45) ( SI Приложение , рис.S5). Вместе эти данные подтверждают согласованную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R g , полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорционального отношения между R g и R ee , которое может возникнуть при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (42). В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если заново взвесить ансамбль (т.е., вычисляет R g с использованием только подмножества конформаций), многие возможные значения R ee согласуются с любым заданным R g (и наоборот). Вместо того, чтобы выбирать подансамбль конформаций для соответствия паре параметров, мы выбрали альтернативный подход (45). С самого начала мы генерируем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом. Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R g ), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры.Поскольку мы можем вычислить значения R g и R ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF. Мы обнаружили, что для реалистичных денатурированных ансамблей складываемых последовательностей моделируемые пары R g и R ee , а также их аналоги, определенные из профилей рассеяния, пропорциональны ( R 2 > 0,99). Это оставляет красители как источник остающегося несоответствия между SAXS и FRET.

Используемый нами MFF несовершенен в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R g и ν. Но погрешность этих двух параметров очень мала относительно их истинных значений (рис. 4 A C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы заключаем, что SAXS хорошо подходит для экстракции как R g , так и R ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями.Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь и ранее (45), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( SI Приложение , Таблицы S1 и S3). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям.Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (62). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS. Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF (рис. 4 D F ). Большие отклонения могут возникать у некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например.g., блок-сополимеры) и / или в условиях тесноты, которые могут выполнять определенные функции (63, 64).

Унифицированная картина, представленная здесь относительно исследований SAXS и FRET развернутого состояния в отсутствие денатуранта, усиливает мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт. То, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, управляющие сворачиванием, являются более стабилизирующими, т.е.е. преодолеть способность воды сольватировать развернутое состояние — чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (41, 65), предполагает, что нативные взаимодействия гораздо более благоприятны, чем любые другие. неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом. Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

PNtCC и PNtC были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (45, 52, 66), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Tris pH 7,2 с 50 мМ β-меркаптоэтанола (βME). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ βМЕ.

Дополнительную информацию об алкилировании белков и маркировке Alexa-488, а также об измерениях стационарной анизотропии, анализе данных SAXS и моделировании можно найти в приложении SI .

Примечание добавлено в доказательство.

Во время обзора было опубликовано исследование, в котором флуорофоры участвовали в усилении аффинности связывания между двумя IDP (83).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти и М. Чемпиона за их помощь в области SAXS и масс-спектрометрии, соответственно; и О. Бильзель, Х. С. Чан, С. Такахаши, Р. Бест, Р. Паппу, Д. Тирумалай, Ю. Бай, А. Холхаус, Э. Мартин и Б. Шулер за полезные обсуждения. Работа поддержана грантом NIH Grants GM055694 (Т.R.S.) и GM130122 (для T.R.S. и P.L.C.), Фонд W. M. Keck Foundation (P.L.C.) и Национальный научный фонд гранты GRF DGE-1144082 (для J.A.R.) и MCB 1516959 (для C.R. Matthews, который финансировал периодические встречи между нашими лабораториями). Использование Усовершенствованного источника фотонов, пользовательского объекта Управления науки, находящегося в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, поддерживалось Министерством энергетики в рамках контракта DEAC02-06Ch21357. Этот проект поддержали NIH 2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18.

Сноски

  • Вклад авторов: J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. спланированное исследование; J.A.R., M.A.B., A.M.Z., P.L.C. и T.R.S. проведенное исследование; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. проанализированные данные; и J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1813038116/-/DCSupplemental.

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка

РЕФЕРАТ

Размеры развернутых белков, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимаемые при низком уровне денатуранта или без него, остаются спорными. Недавно мы разработали инновационную процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и обнаружили, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными, как и химически денатурированный ансамбль, что делает их значительно более расширенными, чем обычно предполагается с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции ( FRET) измерения.Мы показываем здесь, что флуорофоры, типичные для используемых в FRET, могут вносить вклад в это несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa488 к обычно расширенному IDP вызывает сокращение его ансамбля. Параллельно мы также проверили недавнее предположение о том, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованы, если, в отличие от гомополимеров, радиус инерции (R g ) развернутой белковой цепи может варьироваться независимо от ее сквозного расстояния. (R ee ). Для этого мы разработали процедуру анализа, которая может точно извлечь как R g , так и R ee из профилей SAXS, даже если они разделены.Используя эту процедуру, мы обнаружили, что R g и R ee остаются прочно связанными даже для гетерополимерных IDP. Таким образом, мы пришли к выводу, что в сочетании с улучшенными процедурами анализа как для SAXS, так и для FRET взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточно, чтобы объяснить преобладание существующих данных относительно природы полипептидных цепей, развернутых в отсутствие денатуранта.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, внутренне неупорядоченные белки (IDP) и регионы (IDR) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3-9) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить.Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ подвергаются уплотнению в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое уплотнение будет иметь широкое значение для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ. Более того, понимание степени коллапса в неупорядоченных ансамблях имеет глубокие последствия для разработки реалистичного моделирования сворачивания белков и интерпретации измерений SAXS и FRET (10, 11).

Наше текущее понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли данная полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, компактный ансамбль, или вести себя как расширенное, полностью сольватированное случайное блуждание с самоизбеганием (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных. . Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями химических денатурантов, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях консенсус состоит в том, что белки ведут себя как SARW, что соответствует показателю Флори ( против ), равному 0.60 в соотношении R g N v (где R g = радиус инерции и N = длина полипептидной цепи). Напротив, отсутствует консенсус относительно поведения неупорядоченных полипептидных цепей при более низком денатуранте или без него. В частности, в то время как многочисленные FRET (12-26) и вычислительные исследования (12, 15, 19, 24, 27-30) утверждали, что расширенный, неупорядоченный ансамбль, обнаруженный при высоком денатуранте, разрушается при переходе на низкий денатурант или без него (v <0,5 ) (12, 15, 19, 24, 27-29, 31-36), почти такое же количество исследований SAXS сообщает об отсутствии или лишь незначительном сокращении при тех же условиях (11, 37-42).

Разнообразные недавние исследования пытались устранить это критическое несоответствие ( Рис. 1A ). Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей, например, приводит к полученным с помощью FRET расстояниям, имеющим меньшую денатурантную зависимость ( Рис. 1A, внизу ) (41, 43-45). Параллельно улучшен сбор и анализ данных SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения v, а не R g (который будет увеличиваться при добавлении непертурбативных флуорофоров около концов цепи из-за дополнительная масса), аналогичным образом свидетельствует о незначительном сокращении при концентрациях гидрохлорида гуанидина (Gdn) ниже 2 M ( рис.1А, низ ) (46, 47). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются в отсутствие денатуранта, даже когда для анализа одного и того же белка в идентичных условиях используются одни и те же подходы ( Фиг.1A-B , S1-S2 ; Movie S1 ). Были предприняты попытки уменьшить проявление несоответствия с помощью процедуры целостного анализа (43, 44), но эти анализы игнорируют его фундаментальное происхождение.

Рис. 1. Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET.

(A) Данные SAXS и FRET R17 (из (44)). Вверху, сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. Данные Bottom, SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (46). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы. (B) SAXS-профили для R17 (слева, из (44)) и N98 (справа, из (43)), соответствующих MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений n, взятых из аналогичного анализа данных FRET.Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя было подобрано ~ 500 точек на кривую рассеяния, показанные данные были объединены только для целей презентации. Повороты или изгибы данных при более высоких значениях qR g , скорее всего, связаны с ошибками вычитания буфера, что более сложно при высоком q, низкой концентрации образца и / или пониженном контрасте рассеяния (например, при высоком денатуранте, см. Методы). (C) Тенденции гидрофобности (Kyte-Doolittle) по сравнению с n в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из складываемых последовательностей белков (43, 46, 53-68).Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в (21) для опубликованных данных (21, 43). Красная линия тренда для результатов FRET взята из (21). Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. Вверху, гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из (46)). (D) Кумулятивные распределения n для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных на (C).

Чтобы всесторонне сравнить результаты SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для различных ВПЛ ( Рис.1С-Д ; Таблица S3 ). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят v> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как n, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0,50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону n, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для идеальной сферы; несколько выше для компактных несферических состояний).В целом, результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей расширяются, тогда как FRET предполагает иное ( Fig. 1D ).

Вышеупомянутые и другие аналогичные результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать постоянному несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (10, 30, 40, 43, 44, 48-51 ). Одна альтернатива, обозначаемая здесь «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к вариациям во взаимосвязи между R g и расстоянием от конца до конца полипептидной цепи (R ee ), соотношением это фиксированное отношение 6.3 для гомополимера, использующего SARW, независимо от длины цепи. Однако недавнее моделирование показывает, что это соотношение может значительно различаться для гетерополимеров (30, 40, 43, 44), и это «разделение» предлагает возможное объяснение расхождения между SAXS (который чувствителен к R g ) и FRET. (который чувствителен к R ee ). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофора», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (10, 46, 48, 51, 52).

Здесь мы обращаемся к гипотезам разделения и взаимодействия флуорофоров. Для достижения последнего мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения IDPs в присутствии и отсутствии модификаций флуорофора. Мы обнаружили, что мечение флуорофором, обычно используемым для исследований FRET, изменяет конформационный ансамбль, заселенный в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10-20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно с этим мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сжатие этого полимера SARW (10), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (43). Кроме того, мы показываем, что SAXS может извлекать R g , v и R ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти симуляции достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подгруппы конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Мечение флуорофором вызывает коллапс сильно расширенного ансамбля

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия фтор-фора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же IDP, сайт-специфически модифицированного одной или двумя копиями обычно используемый флуорофор FRET Alexa488.Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, и поэтому маловероятно, что он образует взаимодействия, которые могут изменить конформационный ансамбль (44). В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (69). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали реагирующий с тиолом Alexa488 для модификации остатков цистеина в положении 117 (PNtC-Alexa488) или положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa488 уменьшает измеренные с помощью SAXS размеры PNt как в неденатурантных, так и в промежуточных денатурантных условиях ( рис. 2A, таблица S1 ). В частности, R , g и v уменьшаются почти в два раза для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt ( фиг. 2B; таблица S1 ). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa488 приводит к коллапсу конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (v> 0.50) для немеченого белка, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта ( рис. 2B, справа ). Величина этого зависящего от денатуранта расширения цепи качественно подобна наблюдаемой FRET для множества других белков, что согласуется с общим происхождением ( Fig. 1B ) (43, 44). Мы также наблюдали флуорофор-зависимое снижение средних значений R , g, и v для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 ( рис.2 ), что указывает на значимость взаимодействия флуорофор-белок. Следует отметить, что этот коллапс происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 М денатуранте, соответственно (, таблица S2 ), что ниже порога, обычно рассматриваемого как свидетельство свободного вращения белка. прикрепленные флуорофоры (43, 70). Из этого мы заключаем, что добавление даже относительно небольшого гидрофильного флуорофора, обычно используемого для измерений FRET, может значительно изменить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (43, 44, 70).

Рис. 2. Добавление Alexa488 изменяет рассеяние PNt.

(A) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-Alkylated (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KC1, 2 M Gdn , и 4 млн Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из стандартного отклонения, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на Рисунке 1 (см. Также Методы). Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но существуют значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa488.(B) R g и v как функция концентрации Gdn. Серые кривые воспроизводятся из предыдущего анализа PNt дикого типа (46).

Размеры ПЭГ, полученные с помощью SAXS, не зависят от концентрации полимера

В более раннем исследовании мы сообщали, что добавление Alexa488 / 594 к ПЭГ приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (10), аналогичному тому, которое наблюдается при измерениях FRET. развернутых белков. Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов.Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, замаскировали то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением в R g (43). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров полимера (, рис. 3, ). Аналогичным образом, при всех условиях мы наблюдаем показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта.Таким образом, гипотеза взаимодействия флуорофоров остается самой простой интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, наблюдаемых для PEG, меченного флуорофором (10).

Рис. 3. Профили SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта.

(A) Безразмерные графики Кратки для PEG 24 кДа при 0,5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KC1, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0-4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали.Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на рисунке 1. (B) R g и v как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимера

В совокупности вышеприведенные наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению его конформационного ансамбля, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET.Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что разделение гетерополимера также вносит вклад в расхождение SAXS-FRET.

Чтобы выяснить, влияет ли развязка между R ee и R g на профиль SAXS, и как проверить нашу способность извлекать информацию из таких отклонений, мы использовали Upside , наш алгоритм моделирования полипептидной цепи на уровне Cβ (71 , 72), чтобы моделировать рассеяние для развернутых ансамблей из 50 белковых последовательностей из 250-650 остатков, случайно выбранных из PDB.В своей простейшей форме Upside представляет собой полипептидный остов с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O, Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рама-чандрана, полученные из библиотеки катушек (73). Такие модели способны воспроизводить R g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам позвоночника соответственно (74, 75). После создания ансамбля основных конформаций мы добавляем боковые цепи (76) и определяем профили рассеяния гидратированных версий (77).Мы назвали каждый Cβ либо гидрофобным, либо полярным (H / P), где единственные благоприятные взаимодействия происходят между атомами Cβ алифатических и / или ароматических остатков. Для каждой из 50 последовательностей использовали 30 различных сил β-взаимодействия. Это моделирование дало диапазон отклонений от G (v) = (R ee / R g ) 2 , полученных из моделирования гомополимеров (рис. S4A). Из 1500 результирующих ансамблей мы определили R g , v и R ee как непосредственно из атомных координат моделируемого ансамбля, так и путем аппроксимации гидрированного профиля SAXS (с добавленными реалистичными случайными ошибками) каждого ансамбля с использованием наш MFF.Предполагаемое расстояние от конца до конца было определено с использованием соотношения, где G (v) была получена из моделирования гомополимеров.

По сравнению с истинными значениями, рассчитанными на основе координат атомов, соответствия, полученные с использованием наших значений выхода MFF: R g , v и R ee со средним абсолютным отклонением всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно. что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% ( Fig S3 ). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более широких конформаций (v> 0.54) ошибка ~ 2%. Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF het , используя моделирование гетерополимеров, описанное выше. Применение этого слегка модифицированного MFF снижает погрешности в подогнанных R g , v и R ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% средней абсолютной ошибки ( Рис. 4A- С ). Эти результаты демонстрируют, что анализ SAXS возвращает точные значения R ee в дополнение к R g и v, что указывает на то, что R g и R ee связаны даже для неупорядоченных гетерополимеров.

Рис. 4. Подгонка смоделированных данных SAXS к реалистичным последовательностям гетерополимеров демонстрирует, что профили SAXS являются надежной мерой R g , v и R ee , а также информируют о степени неоднородности.

( AC ) Сравнение R g , v и R ee , рассчитанных на основе координат моделирования HP-модели, по сравнению с нашим MFF het (R g , v) с профилями SAXS со случайным добавлением экспериментальные ошибки. (D) Отклонения в концах v наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо смешанными паттернами HP (полученными с помощью аппроксимации наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R | i – j | от разделение последовательностей, | i – j |, где | i – j |> N / 2). (E) Эффекты Δv end при различных значениях v. (F) Экспериментальные данные, соответствующие MFF (R g , v, Δv end ), демонстрируют фторофорное мечение и образование петель с помощью дисульфида. связей в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, чувствительны ли наши выводы к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование с использованием более подробной версии алгоритма Upside , который способен сворачивать de novo белков короче 100 остатков (71, 72).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена ​​многопозиционным эксцентриком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковой цепи-боковой цепи и боковой цепи-остова, аминокислотно-зависимые потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из списка 50 выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Ансамбли были получены путем моделирования обмена репликами в диапазоне температур 280–320 К, как описано ранее (71, 72). Значения v, полученные из этих ансамблей, варьировались от 0,4 до 0,6, в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R ee , R g и v, полученные из этих ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными с помощью нашего MFF, с почти такой же точностью ( Рис. S3 ). Таким образом, наш вывод о том, что R g и R ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах

MFF het точно определяет общие размеры неупорядоченных гетерополимеров. Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами HP ( рис. S4 ). Эти различия можно увидеть на графике внутримолекулярного распределения расстояний, где наклон при разделительных расстояниях | i-j |> N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение v ( рис.4D ). Мы определяем изменение наклона как Δv конец ( Рис. 4D ). Отрицательные значения Δv end коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности ( фиг. 4D, S4C ) и с отклонениями в G (v) ( фиг. S4A ) (R 2 ). ~ 0,84). Профиль SAXS наиболее чувствителен к ΔVend при низком qR g ( рис. 4E ).

Чтобы извлечь эту дополнительную информацию из данных SAXS, мы сгенерировали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF (R g , v, Δv end ) ( Рис.4E-F ; Фильм S2 ). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркуляризованного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn ( рис. 4F ). Δv конец снижается с ~ 0 для PNt до ~ -0,1 для PNtCC-Alexa488 и PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Эти данные демонстрируют, что для неупорядоченных полимеров SAXS чувствителен к зависимым от последовательности отклонениям от поведения гомополимера ( рис.4E-F ), при этом все еще можно точно измерить R , g, и v (, рис. 4A-C ).

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (v> 0,54) для развернутых полипептидов, измерения FRET обычно показывают противоположное (v <0,50). Однако мы обнаруживаем, что улучшенные процедуры анализа и взаимодействия флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточны, чтобы объяснить это несоответствие. Таким образом, остается фундаментальный и важный вывод о том, что даже в отсутствие денатурирующего агента вода является хорошим растворителем для большинства полипептидных последовательностей.В частности, мы обнаружили, что мечение с помощью Alexa488, флуорофора, обычно используемого для измерений FRET, может изменять конформационный ансамбль неупорядоченного белка, уменьшая R g и v, даже когда анизотропия флуоресценции низка по сравнению с принятыми пределами для свободного флуорофора. вращение (43, 70). В сочетании с предыдущими исследованиями (10) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (46), и улучшенными методами извлечения значений R g из данных FRET (41, 43-45), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий между SAXS и FRET о размерах неупорядоченных белков.

В соответствии с нашими выводами об эффектах, индуцированных флуорофором, другие обнаружили, что молекулярные размеры, определяемые FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные фторофоры приводят к меньшим (более компактным) размерам (44). Полноатомное моделирование молекулярной динамики с парой флуорофоров Alexa488 / 594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (78). Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы smFRET как от ДНК, так и от PEG, которые часто называют «спектроскопическими линейками», зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей должны быть неизменными (52).

Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (43) провели измерения SAXS на пяти IDP с Alexa488 / 594 и без них и пришли к выводу, что в среднем , изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений. В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, v без метки -v с меткой = 0.08, 0,03, 0,03, -0,02, -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02, -0,08 при анализе с использованием наших процедур; рис. S5). Хотя Fuertes et al. утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует сокращение, индуцированное флуорофором (50), на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения n, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (43 ) по величине, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (46) ( рис.S5 ). Вместе эти данные подтверждают согласованную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R g , полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорциональной зависимости между R g и R ee , возникающие при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (43).В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если повторно взвесить ансамбль (т. Е. Вычислить R g , используя только подмножество конформаций), многие возможные значения R ee согласуются с любым заданным R g (и наоборот. наоборот). Вместо того, чтобы выбирать суб-ансамбль конформаций, чтобы соответствовать паре параметров, мы приняли альтернативный подход (46). С самого начала мы генерируем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом.Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R g ), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры. Поскольку мы можем вычислить значения R g и R ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF.

Этот MFF несовершенный в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R , g, и v.Но ошибка для этих двух параметров очень мала по сравнению с их истинными значениями ( Рис. 4A-C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы заключаем, что SAXS хорошо подходит для экстракции как R g , так и R ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями. Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь, и ранее (46), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( таблицы S1, S3 ). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям. Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (79). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS.Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF ( рис. 4D-F ). Большие отклонения могут возникать для некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например, блок-сополимеры) и / или в условиях скопления, которые могут выполнять определенные функции (80, 81).

Наши результаты подтверждают мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт.Тот факт, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, которые управляют сворачиванием, являются более стабилизирующими, то есть легче преодолевают способность воды сольватировать развернутое состояние, чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (42, 82), предполагает, что нативные взаимодействия гораздо более благоприятны, чем любые другие. неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом.Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их предпочтительная способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

Очистка белка

PNtCC и PNtC были экспрессированы в E. coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (46, 69, 83), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Трис, pH 7.2 с 50 мМ ß-меркаптоэтанолом (ßME). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ ßME.

Алкилирование

Очищенный PNtCC или PNtC (70 мкМ) в 50 мМ Трис, pH 8, 5 мМ EDTA восстанавливали 5 мМ TCEP в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании. Алкилирование инициировали добавлением 10 мМ йодацетамида в воде. Конструкции PNt инкубировали 30 мин при комнатной температуре при перемешивании в темноте. Реакцию алкилирования гасили добавлением 20 мМ свежего DTT.Избыток реагентов удаляли с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 16/60 S200). Эффективность алкилирования (100%) определяли масс-спектрометрией (МС).

Мечение Alexa488

конструкций PNt были сокращены, как указано выше. Малеимид Alexa488 C5 (ThermoFisher Scientific) ресуспендировали в ДМСО до 5 мг / мл и добавляли к восстановленному белку по каплям при перемешивании до конечного соотношения флуорофор: цистеин 5: 1. Реакция протекала в течение ночи при 4 ° C при перемешивании в темноте. Свободный флуорофор отделяли от меченого флуорофором белка с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 16/60 S200), постоянно защищая от света.Эффективность маркировки (100% для PNtCC;> 50% для PNtC) определялась масс-спектрометрией.

Стационарная анизотропия

Измерения стационарной анизотропии проводили на флуорометре QM-6 T-формата (Horiba) при комнатной температуре в 50 мМ Tris pH 7,5 и 2 M Gdn, где указано. Образцы, содержащие 1 мкМ Alexa-488, возбуждали вертикально поляризованным светом с длиной волны 494 нм. Анизотропия (r) рассчитывалась с использованием излучения на длине волны 516 нм по формуле

Где G — поправочный коэффициент прибора.G рассчитывали по испусканию free-Alexa488 на длине волны 516 нм после возбуждения горизонтально поляризованным светом 494 нм по уравнению

SAXS

Данные были собраны на канале BioCAT в Advanced Photon Source (Аргоннская национальная лаборатория) с использованием колонки GE Lifesciences Superdex 200 SEC с рассеянием, представленным как q = 4π sinθ / γ, где 2θ — угол рассеяния, а γ — длина волны рентгеновского излучения (1 Å). Планки погрешностей для экспериментальных точек данных основаны на статистике подсчета (Пуассона), где стандартное отклонение определяется как σ = √ (фотоны), поскольку детектор рентгеновского излучения считает отдельные фотоны (84).На этапах усреднения и вычитания из буфера ошибка распространяется в квадратуре (например, для X = aU + bV, σX 2 = (aσU) 2 + (bσV) 2 , где a и b — константы). При нанесении на график I (q) шкала погрешности представляет собой значение стандартного отклонения, масштабированное для инструментальных факторов, таких как поток рентгеновского излучения, телесный угол детектора и т. Д., В зависимости от распространения ошибок (для x = au, σ x = aσ U , когда a — постоянная величина). Аналогичным образом, когда данные представлены на безразмерном графике Кратки, значение σ масштабируется на значение qR g 2 / I o , полученное в результате подгонки данных.Для каждой кривой рассеяния собирается примерно 1000 точек данных. Только для целей презентации после процедуры аппроксимации (см. Ниже) точки данных объединяются для сохранения ясности и облегчения сравнения кривых рассеяния. Стандартное отклонение для данных с разбиением на интервалы было получено путем добавления ошибок в квадратуре (84).

Подбор данных

Вычитание буфера является более сложной задачей при высоких значениях q (из-за эффектов гидратации) и при высоких концентрациях денатуранта (из-за пониженного контраста рассеяния).По этим причинам и для поддержания согласованности критериев с нашим предыдущим исследованием (46) мы подгоняли все данные только к q = 0,15 или 0,10 Å -1 , в воде или поднятом денатуранте (выше 3 M), соответственно. Сплошные линии обозначают область, используемую при подборе, а пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. R g и v были получены путем подгонки данных I (q) к q с использованием стандартной нелинейной процедуры наименьших квадратов ( χ 2 минимизация с данными, взвешенными по 1 / σ 2 в Mathemat-ica) к указанному MFF.Эта процедура является подходящей, поскольку ошибка представляет собой ожидаемое стандартное отклонение измерения (84), полученное на основе статистики подсчета с σ 2 = количество отсчетов. Эта процедура подгонки привела к уменьшению χ 2 около 1,0, как и ожидалось для высококачественной подгонки с надлежащим анализом ошибок.

Моделирование и генерация MFF

Расчеты были выполнены в Исследовательском вычислительном центре Чикагского университета с использованием версии нашей программы молекулярной динамики Upside (71, 72), модифицированной для взаимодействий на уровне Cβ, как это было сделано ранее (46).После создания ансамбля каркасных конформаций мы добавляем полные боковые цепи с помощью алгоритма TreePack (76) и определяем профили рассеяния гидратированных версий с помощью программы FOXS (77). Для расчета эффективности FRET мы использовали наш MFF и ранее опубликованные модели (46) для определения безразмерной функции FRET, E ( ee 2 > 0,5 / R 0 , v), где R 0 — радиус Ферстера, и использовалась ожидаемая зависимость между R g , R ee , v и N.Сравнение наших методов SAXS / FRET и других показано на рис. S1-2.

Код для моделирования и анализа

Код и связанные файлы, необходимые для создания моделирования, а также весь анализ данных SAXS и FRET, описанный здесь, можно найти по адресу http: // www. (Будет добавлено перед публикацией). Кроме того, доступен наш веб-сервер http://sosnick.uchicago.edu/SAXSonIDPs для согласования данных SAXS с нашим MFF (v, R g ).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти за помощь в измерениях МУРР и Мэтью Чэмпиона за помощь в масс-спектрометрических экспериментах.Эта работа была поддержана грантом R01 GM055694 (TRS) Национального института здравоохранения (NIH), Фондом У. М. Кека (PLC) и грантами NSF GRF DGE-1144082 (JAR) и MCB 1516959 (CR Matthews). Использование Усовершенствованного источника фотонов, учреждение научного пользователя, находящееся в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, было поддержано Министерством энергетики в рамках контракта № DEAC02-06Ch21357. Этот проект был поддержан NIH (2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18).

Сноски

  • 1 Показанная ошибка — это SEM трех измерений.

  • 2 q выражено в обратных ангстремах. Когда (59) включен в столбец цитирования, он предоставляет данные, полученные из других исследований.

Ссылки

  1. 1.↵
  2. 2.
  3. 3.↵
  4. 4.↵
  5. 5.

    Ripaud L, et al. (2014) Сверхэкспрессия Q-богатых прионоподобных белков подавляет цитотоксичность polyQ и изменяет взаимодействие polyQ.Proc Natl Acad Sci U S A 111 (51): 18219–18224.

  6. 6.
  7. 7.
  8. 8.
  9. 9.
  10. 10.↵

    Watkins HM, et al. (2015) Отрицательный контроль со случайной спиралью воспроизводит несоответствие между измерениями рассеяния и FRET размеров денатурированного белка. Proc Natl Acad Sci U S A 112 (21): 6631–6636.

  11. 11.↵
  12. 12.↵

    Merchant KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, & Eaton WA (2007) Характеристика развернутых состояний белков с помощью спектроскопии FRET одномолекул и молекулярного моделирования.Proc Natl Acad Sci U S A 104 (5): 1528–1533.

  13. 13.

    Chung HS, Louis JM, & Eaton WA (2009) Экспериментальное определение верхней границы времени перехода при сворачивании белка из траекторий фотон за фотоном одной молекулы. Proc Natl Acad Sci U S A 106 (29): 11837–11844.

  14. 14.

    Неттелс Д., Гопич И.В., Хоффманн А. и Шулер Б. (2007) Сверхбыстрая динамика коллапса белка на основе статистики одиночных фотонов.Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 (8): 2655–2660.

  15. 15.↵

    Nettels D, et al. (2009) Одномолекулярная спектроскопия коллапса развернутых белков, вызванного температурой. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106 (49): 20740–20745.

  16. 16.

    Sherman E & Haran G (2006) Переход клубок-глобула в денатурированном состоянии небольшого белка. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103 (31): 11539–11543.

  17. 17.
  18. 18.
  19. 19.↵

    O’Brien EP, Ziv G, Haran G, Brooks BR, & Thirumalai D. (2008) Действие денатурантов и осмолитов на белки точно предсказывается моделью молекулярного переноса. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 (36): 13403–13408.

  20. 20.
  21. 21.↵

    Hofmann H, et al. (2012) Законы масштабирования полимеров развернутых и внутренне неупорядоченных белков, количественно оцененные с помощью спектроскопии одиночных молекул. Proc. Natl. Акад. Sci. США 109 (40): 1615516160.

  22. 22.
  23. 23.

    Waldauer SA, Bakajin O, & Lapidus LJ (2010) Чрезвычайно медленная внутримолекулярная диффузия в развернутом протеине L. Proc Natl Acad Sci U S. A 107 (31): 13713–13717.

  24. 24.↵
  25. 25.
  26. 26.↵
  27. 27.↵

    Bowman GR & Pande VS (2010) Сложенные белковые состояния являются кинетическими центрами. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (24): 10890–10895.

  28. 28.
  29. 29.↵
  30. 30.↵
  31. 31.↵

    Sadqi M, Lapidus LJ, & Munoz V (2003) Насколько быстро происходит гидрофобный коллапс белков? Proc.Natl. Акад. Sci. США 100 (21): 12117–12122.

  32. 32.
  33. 33.
  34. 34.
  35. 35.
  36. 36.↵
  37. 37.↵
  38. 38.
  39. 39.
  40. 40.↵
  41. 41.↵
  42. 41.↵
  43. Скиннер Дж. Дж. И др. (2014) Сравнительный анализ моделирования всех атомов с использованием водородного обмена. Proc Natl Acad Sci U S A 111 (45): 15975–15980.

  44. 43.↵

    Fuertes G, et al. (2017) Разделение флуктуаций размера и формы в гетерополимерных последовательностях устраняет расхождения в SAXS vs.Измерения FRET. Proc Natl Acad Sci US A.

  45. 44.↵
  46. 45.↵
  47. 46.↵
  48. 47.↵
  49. 48.↵
  50. 49.
  51. 50.↵
  52. 51.↵
  53. 52.↵
  54. 53.↵

    Gates ZP, et al. (2017) Затрудняет кооперативное сворачивание и стабильность белка полипролина 2 с низкой последовательностью и отсутствием гидрофобного ядра. Proc Natl Acad Sci U S A 114 (9): 2241–2246.

  55. 54.
  56. 55.
  57. 56.
  58. 57.
  59. 58.
  60. 59.↵
  61. 60.
  62. 61.
  63. 62.
  64. 63.
  65. 64.
  66. 65.
  67. 66.
  68. 67.

    M, колодцы и другие. (2008) Структура опухолевого супрессора p53 и его внутренне неупорядоченный N-концевой домен трансактивации. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (15): 5762–5767.

  69. 68.↵
  70. 69.↵
  71. 70.↵

    Азнаурян М и др. (2016) Комплексное структурное и динамическое представление развернутого белка из комбинации одномолекулярных FRET, ЯМР и SAXS.Proc Natl Acad Sci U S A 113 (37): E5389–5398.

  72. 71.↵
  73. 72.↵
  74. 73.↵
  75. 74.↵

    Jha AK, Colubri A, Freed KF, & Sosnick TR (2005) Статистическая модель катушки развернутого состояния: разрешение согласования проблема. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102 (37): 13099–13104.

  76. 75.↵

    Bernado P, et al. (2005) Структурная модель развернутых белков от остаточных диполярных связей и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.Proc Natl Acad Sci U S A 102 (47): 17002–17007.

  77. 76.↵
  78. 77.↵
  79. 78.↵
  80. 79.↵
  81. 80.↵
  82. 81.↵
  83. 82.↵
  84. 83.↵

    Junker M, et al. (2006) Механизм сворачивания бета-спирали пертактина предполагает общие темы для секреции и сворачивания белков-аутотранспортеров. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (13): 4918–4923.

  85. 84.↵

FRET Визуализация диатомовых водорослей, экспрессирующих локализованный биокремнезем датчик рибозы

Abstract

Предусматривается, что материалы будущего будут включать биоорганизованные, гибридные, трехмерные наносистемы, которые включают функциональные белки.Диатомовые водоросли поддаются генетической модификации для локализации рекомбинантных белков в клеточной стенке биокремнезема. Однако полный спектр функциональных возможностей белка, которые могут быть реализованы в модифицированном пористом биокремнеземе, еще предстоит описать. Наша цель состояла в том, чтобы функционализировать диатомовый биокремнезем с помощью безреагентного сенсора, зависящего от связывания лиганда и конформационных изменений, чтобы управлять возможностями передачи сигналов на основе FRET. Слитый белок, разработанный для придания таких свойств, включал бактериальный периплазматический связывающий рибозу белок (R), фланкированный CyPet (C) и YPet (Y), голубыми и желтыми флуоресцентными белками, которые действуют как пара FRET.Структура и функция рекомбинантного химерного белка CRY была подтверждена экспрессией в E. coli до трансформации диатомовой водоросли Thalassiosira pseudonana . Масс-спектрометрия рекомбинантного CRY показала 97% идентичность с рассчитанной аминокислотной последовательностью. CRY с N-концевой меткой Sil3 и без нее для локализации биокремнезема обнаруживал характерные рибозозависимые изменения FRET с аналогичными константами диссоциации 123,3 мкМ и 142,8 мкМ, соответственно.Добавление тега Sil3 не изменяет сродство CRY к субстрату рибозы. Последующая трансформация T. pseudonana вектором, кодирующим Sil3-CRY , привела к локализации флуоресценции в биокремнеземе и изменениям FRET как в живых клетках, так и в изолированных панцирях в ответ на рибозу. Эта работа продемонстрировала, что наноархитектура генетически модифицированной клеточной стенки биокремнезема способна поддерживать функциональность относительно сложного слитого белка Sil3-CyPet-RBP-YPet с его потребностью в связывании лиганда и конформационных изменениях для генерации сигнала FRET.

Образец цитирования: Marshall KE, Robinson EW, Hengel SM, Paša-Tolić L, Roesijadi G (2012) FRET-визуализация диатомовых водорослей, экспрессирующих датчик рибозы, локализованный в биокреме. PLoS ONE 7 (3): e33771. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771

Редактор: Анна Митраки, Университет Крита, Греция

Поступила: 16 ноября 2011 г .; Принято: 21 февраля 2012 г .; Опубликовано: 21 марта 2012 г.

Авторские права: © 2012 Marshall et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было частично поддержано Управлением военно-морских исследований, номер награды N0001409IP20071 (http://www.onr.navy.mil/). Исследования с использованием масс-спектроскопии были частично поддержаны Законом США о реинвестировании и восстановлении от 2009 г. и U.S. Отдел биологических и экологических исследований Министерства энергетики США. Участие студентов частично финансировалось программой стажировки в лаборатории естественных наук Министерства энергетики США. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить о них.

Введение

Ожидается, что создание трехмерных материалов будущего с многомасштабной архитектурой будет включать биосборку [1].Самосборка посредством биосинтеза в живых организмах может заменить химический синтез гибридных структур с функциональными элементами, иммобилизованными в высокоупорядоченных биоминеральных структурах, подобных тем, которые встречаются в природе. Клеточные стенки биокремнезема диатомовых в течение некоторого времени были признаны иерархически упорядоченными, мезопористыми структурами от микро до нанометров, которые могут служить основой для разработки современных материалов [2]. Попытки создать кремнеземные материалы, вдохновленные пониманием биологии диатомовых водорослей, включали 1) конденсацию кремнезема из кремниевой кислоты in vitro с использованием силлафинов или пептидов, полученных из силлафина [3] — [7] и 2) манипуляции с живыми клетками для добавлять функциональные элементы путем метаболической вставки [8], [9] или генетической модификации структуры клеточной стенки [10], [11].Последние подходы на основе клеток позволяют сборку в физических и химических условиях окружающей среды, присущих культуре клеток диатомовых водорослей.

Недавние успехи в разработке систем трансформации диатомовых водорослей позволили сконструировать векторы экспрессии, которые могут нацеливать локализацию рекомбинантных белков на клеточную стенку биокремнезема [10]. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и ферменты с мультимерной структурой и / или требующимися кофакторами были успешно иммобилизованы в биокремнеземе Thalassiosira pseudonana , помечая их силаффином Sil3, который нацелен на локализацию в клеточной стенке биокремнезема [10], [10], [10] 12].Наша цель состояла в том, чтобы проверить способность биокремнезема диатомовых водорослей служить в качестве каркаса для сложных химерных слитых белков, требующих крупномасштабных движений, связанных с лиганд-зависимыми конформационными изменениями, чтобы функционировать.

Для этого мы построили датчик рибозы, который использует сигнальную систему, основанную на изменениях в передаче энергии резонанса Фёрстера (FRET) для локализации в биокремнезе диатомовых водорослей. Сенсорная конструкция включала бактериальный периплазматический связывающий рибозу белок (RBP; [13]), фланкированный флуоресцентной парой FRET CyPet и YPet [14] — [16], создавая сенсорную кассету CyPet-RBP-YPet (CRY), для которой требуется рибоза. связывание и конформационное изменение RBP, чтобы управлять изменениями в FRET.Вставка последовательности силаффина Sil3 перед CRY нацелена на химерный белок для локализации в биокремнеземе диатомовых водорослей. Здесь мы сообщаем об успешной функционализации T. pseudonana с помощью сложного безреагентного сенсора, иммобилизованного в клеточной стенке биокремнезема. Это исследование демонстрирует потенциал диатомовой системы для размещения сложных белков в трехмерном гибридном материале посредством биосборки в условиях окружающей среды.

Результаты

Конструкция и характеристики датчика CRY

Конструкция рекомбинантного сенсора CRY была основана на конструкции FLIPrbs-F15A (мутантная форма F15A; [13]), кодирующей RBP, фланкированную усиленными голубыми и желтыми флуоресцентными белками, ECFP и EYFP, соответственно.Мы заменили пару ECFP-EYFP FRET последовательностями, кодирующими флуоресцентные белки CyPet и YPet [16], и клонировали полученную последовательность CyPet-RBP-YPet в вектор pRSET для бактериальной экспрессии, управляемой промотором T7 . Две последовательности His 6 фланкировали рекомбинантную кассету CyPet-RBP-YPet для получения белка «His 6 -CyPet-RBP-YPet-His 6 » (CRY) массой приблизительно 87,6 кДа.

Идентификатор E.coli -экспрессируемый рекомбинантный белок CRY и его функциональность FRET проверяли с помощью ЖХ-МС / МС и экспериментов по связыванию лиганда, соответственно. Масс-спектрометрия химерной конструкции подтвердила 97% аминокислотной последовательности слитого белка CRY (рис. 1). В части последовательности RBP (L341M) произошла точечная мутация лейцина в метионин, что подчеркивает возможности масс-спектрометрии в обнаружении небольших различий в выведенных и проанализированных аминокислотных последовательностях. Неидентифицированные остатки находились в 21 положении внутри CyPet и в одном положении в части RBP химерного белка.Ион-предшественник для первого наблюдался в нескольких сканированиях МС, однако спектры МС / МС не были достаточно высокого качества, чтобы дать положительную идентификацию с нашими строгими критериями фильтрации. Эти несоответствия не были локализованы в кармане связывания рибозы или функциональном домене шарнирного поворота RBP [17], и не ожидалось, что они повлияют на общую производительность сенсорной кассеты.

Рисунок 1. Масс-спектрометрия для проверки аминокислотной последовательности выведенного белка CRY.

Образцы белка переваривали отдельно протеазами глюкозы и трипсина и анализировали с использованием ЖХ-МС / МС с высоким разрешением.Масс-спектрометрия подтвердила 97% выведенной рекомбинантной последовательности CRY. Остальные 3% были либо неидентифицированными, либо представляли несоответствие в 1 аминокислоте (*). Синяя заливка = последовательность CyPet; Красная заливка = последовательность RBP; Желтая заливка = последовательность YPet; Серый = линкерные последовательности; Черные линии = His 6 тегов и Xpress ™.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g001

Перед экспрессией в диатомовых водорослях мы проверили функциональность FRET рекомбинантных CRY и Sil3-CRY, экспрессируемых E. coli , путем тестирования чувствительности сенсор строится на добавленную рибозу.Связывание рибозы с рецептором сдвигает амино- и карбоксильные концы RBP дальше друг от друга и увеличивает расстояние между CyPet и YPet, что приводит к снижению FRET (рис. 2). Связывание рибозы с RBP привело бы к уменьшению отношения относительной интенсивности флуоресценции желтый / голубой (530/485 нм), связанного с уменьшением FRET.

Рис. 2. Модель индуцированного рибозой конформационного изменения CRY и связанного с ним снижения FRET.

Несвязанный: в отсутствие рибозы рибозосвязывающий белок (RBP) находится в открытой конфигурации с C и Y, которые присоединены к амино- и карбоксильным концам RBP, соответственно, в непосредственной близости друг от друга.Когда CRY возбуждается на длине волны 435 нм, излучение C возбуждает Y, что приводит к высокому отношению интенсивностей излучения 530/485. Связано: связывание рибозы (R) с помощью RBP вызывает конформационные изменения в RBP, которые разделяют амино- и карбоксильные концы RBP, тем самым увеличивая расстояние между C и Y. Это увеличение расстояния снижает передачу энергии между двумя флуоресцентными белками, тем самым уменьшая соотношение интенсивности излучения 530/485. Таким образом, увеличение концентрации рибозы приводит к снижению FRET.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g002

В соответствии с этим поведением, снижение эффективности FRET в зависимости от увеличения концентрации рибозы было очевидно из кривых насыщения (рис. 3). Соответствующие константы диссоциации ( K d ) 123,3 мкМ для CRY и 142,8 мкМ для Sil3-CRY существенно не отличались друг от друга или от ранее опубликованных K d 119 мкМ для ECFP-RBP. Конструкция -EYFP, кодируемая FLIPrbs- F15A [13] (p> 0.1 для всех сравнений). Таким образом, замена CyPet и YPet на ECFP и EYFP, соответственно, и добавление тега Sil3 к CRY не показали значительного изменения сродства рецептора к рибозе.

Рисунок 3. Зависимый от рибозы FRET в рекомбинантном CRY и Sil3-CRY, экспрессируемый в E. coli .

Образцы выделенных белков CRY и Sil3-CRY обрабатывали различными концентрациями рибозы в диапазоне от 1 мкМ до 10 мМ. K d для CRY и Sil3-CRY существенно не отличаются друг от друга (см. «Материалы и методы» для получения подробной информации о расчетах и ​​статистическом анализе K d ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g003

Экспрессия CRY у диатомовых водорослей

Определив, что кассета Sil3-CRY функционирует, как ожидалось in vitro , диатомовую водоросль T. pseudonana трансформировали pTpfcp / Sil3-CRY: fcp / nat , вектор экспрессии Sil3-CRY для диатомовых водорослей. бомбардировкой микрочастицами под высоким давлением [11]. В этом векторе кодировались как кассета экспрессии Sil3-CRY , так и ген nat , придающий устойчивость к нурсеотрицину.

ПЦР-амплификация

геномной ДНК, выделенной из трансформированных диатомовых водорослей, давала электрофоретические полосы, соответствующие как генам CRY , так и nat , которые отсутствовали у нетрансформированных диатомовых водорослей. ОТ-ПЦР библиотек кДНК первой цепи привела к появлению полос, соответствующих генам CRY и nat в трансформированных образцах, но не в нетрансформированных образцах (данные не показаны). Эти результаты означают успешную трансформацию и экспрессию генов у трансформированных диатомовых водорослей.

Мы подтвердили наличие рекомбинантного CRY в трансформированных диатомовых водорослях и их изолированных клеточных стенках из биокремнезема с помощью флуоресцентной микроскопии и визуализации проточной цитометрии (рис. 4A и 4B, соответственно). Мы использовали флуоресцентную микроскопию для изображения как трансформированных живых клеток, так и изолированных панцирей. Это выявило отчетливый периметр голубой флуоресценции, согласующийся с локализацией Sil3-CRY в биокремнеземе как в трансформированных клетках, так и в изолированных оболочках биокремнезема (Fig. 4A). Эта флуоресценция перекрывалась периметром диатомовых водорослей на изображениях в светлом поле и соответствовала локализации CRY в клеточной стенке биокремнезема.Очевидная совместная локализация CRY в хлоропласте была приписана просачиванию интенсивной красной автофлуоресценции хлорофилла в голубой и желтый каналы. Это наблюдение было рассмотрено с помощью визуализации проточной цитометрии.

Рис. 4. Флуоресцентные изображения трансформированных и нетрансформированных живых диатомовых водорослей и изолированного биокремнезема.

(A) Флуоресцентная микроскопия: живые трансформированные клетки и изолированные створки биокремнезема были визуализированы в ярком поле для отображения клеточной структуры и для голубой флуоресценции CyPet и красной автофлуоресценции, чтобы показать их соответствующую локализацию в биокремнеземе и хлоропластах.Отсутствие красной автофлуоресценции в изолированном биокремнеземе подчеркивает отсутствие хлоропластов и, следовательно, отсутствие клеточного материала в клеточной стенке биокремнезема. (B) Визуализация проточной цитометрии: pTpfcp / Sil3-CRY: трансформированные (TR) и нетрансформированные (WT) клетки fcp / nat- визуализировали для светлого поля, голубой флуоресценции CyPet, желтой флуоресценции YPet из FRET и автохлоропластов. флуоресценция. Голубые, желтые и красные изображения были объединены, чтобы выделить флуоресценцию CyPet и YPet, фланкирующих хлоропласты.В клетках WT обнаруживалась только красная аутофлуоресценция хлоропластов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g004

Изображения эпифлуоресценции, полученные с помощью проточной цитометрии, были выбраны для дальнейшего анализа с использованием следующих критериев: 1) были получены изображения только отдельных клеток в фокусе, а не скоплений в поле зрения, 2) изображения были положительными в отношении автофлуоресценции красного хлорофилла, и 3) изображения были положительными в отношении полученной из FRET желтой флуоресценции.Эти критерии позволили нам рассмотреть отдельные живые клетки, обозначенные наличием хлорофилла, и проанализировать интенсивность флуоресценции и структуру внутри клетки. Вытекание автофлуоресценции красного хлоропласта было компенсировано в каналах CyPet и YPet.

Путем стробирования каждой популяции, как указано выше, мы проанализировали 21,3% трансформированной популяции и 2,9% нетрансформированной популяции дикого типа для дальнейшего анализа. В трансформированной субпопуляции локализацию голубой и желтой флуоресценции, связанной с CRY, можно было отличить от красной аутофлуоресценции хлорофилла.Преобладали клетки с голубой и желтой флуоресценцией, смежные с красной флуоресценцией хлоропласта, а не одновременно в одном и том же клеточном местоположении (объединенное изображение на фиг. 4B TR). Интенсивность голубой и желтой флуоресценции в клетках дикого типа обычно была слабой или неопределяемой (рис. 4B WT).

FRET в живых диатомовых водорослях и изолированных клеточных стенках биокремнезема

Хотя изначально было неясно, будут ли конформационные изменения RBP, необходимые для управления изменениями FRET, ограничиваться доступностью субстрата или стерическими препятствиями, связанными с иммобилизацией Sil3-CRY в нанопористой архитектуре клеточной стенки биокремнезема, изменения FRET, вызванные рибозой, были наблюдается как в живых трансформированных клетках, так и в изолированных клеточных стенках биокремнезема (ответ репрезентативной клетки показан на рис.5A и 5B). При уровне насыщения рибозы 300 мМ соотношение FRET (530/485 нм относительные флуоресцентные единицы [RFU]) снизилось в среднем на 0,19 ± 0,01 (1 SE, n = 10) и 0,43 ± 0,04 (1 SE, n = 4) в трансформированных живых клетках и изолированных клеточных стенках биокремнезема соответственно. Это различие между трансформированными клетками и изолированным биокремнезем было очень значимым (p <0,001), как и разница между этими значениями и соответствующими фоновыми изменениями в нетрансформированных контрольных структурах дикого типа (рис.5A и 5B) (p <0,05). Кривая "концентрация-ответ" для внешних концентраций рибозы у живых трансформированных диатомовых водорослей показала ЕС 50 , равное 23,3 мМ (фиг. 6). Сравнение этого значения с субстратным сродством CRY E. coli (рис. 3) и значительно большее снижение FRET в изолированном биокремнеземе по сравнению с живой клеткой позволяет предположить, что клеточный матрикс препятствует доступу рибозы к клеткам. датчик с иммобилизованным кремнеземом.

Рисунок 5.Рибозозависимая визуализация FRET у живых, трансформированных диатомовых водорослей и изолированного биокремнезема.

(A) Для получения изображения флуоресценции CyPet и YPet до и после добавления 300 мМ рибозы использовали покадровую визуализацию живых клеток. Флуоресцентные изображения регистрировались одновременно в обоих флуоресцентных каналах каждую минуту в течение 40 минут. Рибозу добавляли к клеткам через 20 мин после первоначальной визуализации. Соотношение FRET (соотношение RFU 530/485 нм) уменьшается при добавлении рибозы. (B) Аналогичным образом, покадровую визуализацию клеточных стенок биокремнезема проводили в течение 10 минут с добавлением 300 мМ рибозы через 5 минут.Соотношение FRET уменьшается в ответ на добавление рибозы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g005

Рис. 6. Концентрация-реакция pTpfcp / Sil3-CRY: fcp / nat- трансформированных диатомовых водорослей, подвергшихся воздействию рибозы.

Нормализованные значения ΔFRET (ΔF n ) для отдельных клеток, обработанных рибозой. ЕС 50 23,3 ± 4,7 мМ (среднее ± стандартное отклонение) соответствует концентрации рибозы, дающей 50% от максимального значения ΔF n .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g006

Обсуждение

Наноразмерная иерархическая организация диатомового кремнезема представляет интерес как модель для синтеза материалов, особенно в контексте силицификации при умеренном pH и температуре окружающей среды [18]. Первоначальные исследования в этой области были сосредоточены на использовании поликатионных пептидов диатомовых водорослей, силафинов [5], [19], в химическом синтезе гибридных комплексов силаффин-кремнезем из кремниевой кислоты.Эта работа была распространена на создание реакторов с иммобилизованными ферментами путем добавления в реакцию таких ферментов, как каталаза, пероксидаза хрена и бутирилхолинэстераза, а также на конъюгацию полиаминов с лизинами для имитации взаимодействия между силафинами и полиаминами при осаждении кремнезема из кремниевой кислоты [ 20] — [22]. В обоих случаях белки нацелены на локализацию в матрице кремнезема.

Разработка системы трансформации диатомовых водорослей открыла возможность генетических манипуляций со структурой биокремнезема посредством экспрессии рекомбинантных химерных белков, которые включают силуффин или, в последнее время, цингулин как часть химерной гибридной конструкции [23].Оба последних белка могут закрепить конструкцию в биокремнеземе и связаны с функциональными белками, которые локализуются в биокремнеземе и сохраняют функцию, когда биокремнезем изолирован от клетки [10], [12]. К протестированным на сегодняшний день белкам относятся белки с мультимерной структурой субъединиц и требованиями к кофакторам [12]. Было интересно определить, могут ли сложные химерные слитые белки, которые включают несколько белковых модулей и имеют требования к связыванию лигандов и крупномасштабным движениям, функционировать в рамках пространственных ограничений биокремнезема диатомовых водорослей.

Поскольку не было известно, будет ли метка Sil3 препятствовать связыванию рибозы с помощью RBP, конформационному изменению RBP в ответ на рибозу или пространственным взаимодействиям CyPet и YPet, в первоначальных экспериментах исследовали FRET в очищенном рекомбинантном образце , экспрессируемом E. coli CRY и Sil3-CRY. FRET как для CRY, так и для Sil3-CRY функционировали, как ожидалось, демонстрируя сходство K d друг с другом и с конструкцией ECFP-RBP-EYFP, кодируемой FLIPrbs-F15A [13].Мы также продемонстрировали функциональность датчика на живых диатомовых водорослях и изолированном биокремнезе. Наше исследование показало, что сенсорная кассета, образовавшаяся в результате слияния четырех белков с меткой, нацеленной на биокремнезем, была локализована в клеточной стенке диатомовых водорослей T. pseudonana и могла претерпевать необходимые пространственные перестройки, необходимые для функционирования в качестве сенсора FRET.

Иммобилизация функциональных рекомбинантных белков в biosilica диатомовых водорослей посредством in vivo биосборок теперь продемонстрирована для GFP и HabB [10]; β-глюкуронидаза, глюкозооксидаза, галактозоксидаза и пероксидаза хрена [12]; и CRY (наше текущее исследование).Их точная локализация и плотность в биокремнеземе, которые представляют интерес с прикладной точки зрения, связанной с характеристиками гибридных кремнеземных материалов, еще не сообщены. Судя по наблюдениям, опубликованным на сегодняшний день, они, вероятно, будут связаны с внешней и внутренней поверхностями биокремнезема и / или внутри пор биокремнезема. Минимальные радиусы для этих белков, оцененные по молекулярной массе от 16900 до 272000, варьируются от 1,69 до 4,27 нм [24] и соответствуют требованиям к видимому размеру для включения в поры Тл.pseudonana (средний диаметр пор клапана 18,2 нм [25]). Таким образом, за исключением других факторов, несколько молекул CRY (расчетная молекулярная масса 87 600 и минимальный радиус 2,79 нм) могут быть размещены в архитектуре единой пористой структуры. T. pseudonana с диаметром створки от 3 до 4 мкм [25] — относительно небольшая диатомовая водоросль. Родственные виды Thalassiosira , такие как T. eccentrica , T. punctigera и T. weissflogii , крупнее и имеют значительно большие размеры пор [26], [27].Более того, пористость панциря T. eccentrica составляет 37% [26]. Эти виды, по-видимому, обладают потенциалом для размещения большего количества иммобилизованного белка и могут быть кандидатами для генетических манипуляций для биотехнологических применений с использованием подходов, разработанных для T. pseudonana .

В связи с достижениями, достигнутыми в настоящее время в технологиях инженерии и генетики диатомовых водорослей, функции диатомей, такие как катализ, хелатирование и биочувствительность, становятся потенциальными приложениями при условии, что желаемые функции могут быть закодированы в виде белков.Иммобилизация белков в поддерживающих матрицах из мезопористого диоксида кремния выгодна для широкого круга применений в медицинской диагностике и терапии, биочувствительности, катализе и взаимодействии / ингибировании субстрата. Лучшее понимание принципов конструкции, лежащих в основе сборки клеточных стенок биокремнезема диатомовыми водорослями, должно способствовать будущей биосборке in vivo генетически модифицированных структур биокремнезема в трансформированных диатомовых водорослях [10], [11] и информировать о биологически вдохновленной химической сборке. белковых структур с иммобилизованным кремнеземом in vitro [3], [4], [28] — [30].

Материалы и методы

Конструирование конструкции экспрессии бактерий и диатомовых водорослей

Стандартные методы клонирования использовали для вставки в рамку рамки генов CyPet, периплазматического белка, связывающего рибозу (RBP) и YPet , в сайт множественного клонирования, кодируемый в векторе бактериальной экспрессии pRSET . CyPet и YPet составляют пару FRET флуоресцентного белка [16]. Вектор pRSET содержит промотор T7 , управляющий экспрессией CRY .Вектор pRSET разработан для кодирования двух N-концевых меток, полигистидиновой (His 6 ) метки для очистки на Ni-колонке и эпитопа Xpress ™ для обнаружения с помощью антитела Anti-Express ™, а также сайта расщепления энтерокиназой выше по течению. стартового сайта для CRY. Мы включили дополнительную метку His 6 на С-конце YPet для увеличения сродства к никелю. Флуоресцентные белки были присоединены к RBP посредством вставки полилинкерной последовательности, кодирующей Gly-Gly-Ser.После подтверждения последовательности экспрессионная последовательность CyPet-RBP-YPet (CRY) была вставлена ​​ниже кДНК, кодирующей Silaffin 3 (Sil3) , выделенной с помощью ОТ-ПЦР из диатомовых водорослей T. pseudonana (штамм CCMP 1335, Национальный центр морских водорослей и микробиоты Провасоли-Гийярда, Вест-Бут-Харбор, Массачусетс). В результате были получены две конструкции для бактериальной экспрессии: pRSET: CRY и pRSET: Sil3-CRY . Сообщается, что конформационные изменения, связанные со связыванием рибозы с RBP, приводят к увеличению пространственного разделения пары FRET флуоресцентного белка и снижению FRET [13].

Геномная последовательность Sil3 была использована в векторе экспрессии диатомовых водорослей, нацеленного на биокремнезем, pTpfcp / Sil3nt [10]. Для создания единой системы трансформации вектора для экспрессии CRY , нацеленной на клеточную стенку биокремнезема у диатомовых водорослей, последовательность CRY была клонирована в pTpfcp / Sil3nt между геномными последовательностями терминатора Sil3 и fcp . Ген отбора антибиотиков nat был вставлен ниже второго промотора fcp , придающего антибиотикорезистентность нурсеотрицину, в результате чего был получен вектор экспрессии диатомовых водорослей pTpfcp / Sil3-CRY: fcp / nat .

Векторы CyPet и YPet были предоставлены Патриком Догерти, Калифорнийский университет, Санта-Барбара; последовательность RBP была клонирована из FLIPrbs-F15A , предоставленного Вольфом Фроммером, Научный институт Карнеги, Стэнфордский университет; и pTpfcp / Sil3nt и pTpfcp / nat были предоставлены Николь Поулсен и Нильс Крегер, Технологический институт Джорджии.

Экспрессия и выделение

E.coli -экспрессированные рекомбинантные белки

TurboCells BL21 (DE3), компетентный E. coli (Genlantis, Inc., Сан-Диего, Калифорния), трансформированный бактериальными экспрессирующими конструкциями, выращивали в течение ночи при 37 ° C. OD 600 Измерения проводились и культуры снова разбавлялись до OD 600 0,5. Клетки выращивали при 37 ° C до достижения OD 600 1,0. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG (изопропил B-D-тиогалактозид) в концентрации 100 мкМ; культуры переносили при 26 ° C и выращивали в течение ночи в темноте.Экспрессированный белок выделяли с помощью Ni-аффинной хроматографии (смола His-Bind, Novagen, Inc.). Клетки лизировали ультразвуком, центрифугировали и лизат стерилизовали фильтрованием перед нанесением на колонку. Колонки, связанные с белками, промывали возрастающими концентрациями имидазола в диапазоне от 5 мМ до 500 мМ. Селективные промывки объединяли и концентрировали в системе фильтрации Amicon 50 кДа (EMD MilliPore). Очистку белка контролировали с помощью SDS-PAGE с использованием 10% полиакриламидного геля (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Масс-спектрометрия

E. coli -экспрессированный рекомбинантный белок

образцов белка CRY, выделенных, как описано выше, заменяли буфером на 200 мМ бикарбоната аммония, отдельно расщепляли протеазами глюкозы и трипсина и анализировали с помощью ЖХ-МС / МС высокого разрешения на платформах LTQ Velos Orbitrap (Thermo Scientific, Waltham, MA). Первоначальная идентификация пептидов была произведена с помощью SEQUEST с использованием базы данных E. coli , содержащей последовательность белка CRY.Точечная мутация лейцина в метионин, L341M, была идентифицирована с использованием собственных инструментов секвенирования de novo [31], а также может быть идентифицирована с помощью SEQUEST при использовании последовательности CRY, включая точечную мутацию. Другие пептидные последовательности, идентифицированные с помощью SEQUEST, также были проверены с помощью собственных инструментов секвенирования de novo .

In vitro Анализ FRET в E. coli -экспрессированных рекомбинантных белков

Кривые титрования субстрата для очищенных рекомбинантных белков были получены на спектрофлуориметре Synergy-HT с длиной волны возбуждения, установленной на 430 нм (возбуждение CyPet), и эмиссией, установленной на 485 нм (эмиссия CyPet) и 530 нм (эмиссия YPet).Выделенные образцы белка разбавляли 20 мМ натрий-фосфатным буфером, pH 7,0, и определяли FRET как соотношение интенсивностей эмиссии 530/485 нм.

Константу диссоциации ( K d ) для каждого белка определяли путем построения графика зависимости насыщения (S) от концентрации [s] рибозы в диапазоне от 1 мкМ до 10 мМ с использованием метода, модифицированного из Lager et al [13]. . Насыщение рассчитывали как где r — отношение флуоресценции 530/485 нм для данной концентрации рибозы, r min — отношение 530/485 при насыщении, а r max — отношение 530/485 без добавления рибозы.Увеличение S соответствует снижению эффективности FRET. K d каждого рецептора оценивали по следующей зависимости: где n — количество сайтов связывания, а [s] — концентрация рибозы.

Статистические данные были выполнены с использованием программного обеспечения Prism v4 GraphPad, 2003. Наборы данных сравнивались друг с другом и опубликованные значения с использованием нелинейной регрессии с количеством сайтов связывания, ограниченным до n = 1. Для проверки общего K d параметр для CRY и Sil3-CRY. K d каждого из них также тестировали в сравнении с ECFP-RBP-EYFP, кодируемым FLIPrbs-F15A [13].

Культура и трансформация диатомовых водорослей. T. pseudonana (штамм CCMP 1335) выращивали в среде f / 2 (Национальный центр морских водорослей и микробиоты Provasoli-Guillard, Вест-Бут-Харбор, Массачусетс), снабжаемой аэрацией и постоянным освещением при 18–20 ° C. Регулярное барботирование культур CO 2 поддерживало pH между 8 и 8,5, и в культуры еженедельно добавляли 100 мкг / мл пенициллина и стрептомицина.

Трансформацию диатомовых водорослей бомбардировкой микрочастицами с использованием системы доставки частиц PDS-1000 / He (Bio-Rad, Hercules, CA) проводили, как описано ранее [11]. Клетки, устойчивые к норсеотрицину, использовали для анализа локализации флуоресценции и ответа FRET.

Анализ экспрессии гена

Выделение геномной ДНК из T. pseudonana выполняли с использованием модифицированной версии протокола Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI).Приблизительно 2 × 10 8 клеток диатомей собирали центрифугированием и ресуспендировали в 600 мкл раствора для лизиса ядер. Клетки лизировали взбиванием шариками с последующей инкубацией при 65 ° C в течение 15 минут. Клетки обрабатывали РНКазой А, и белок осаждали с использованием раствора для осаждения белка. ДНК выделяли осаждением изопропанолом с последующей экстракцией фенол-хлороформом для удаления остаточных белков. Образцы ДНК ресуспендировали в ТЕ. Успех трансформации определяли с помощью ПЦР для вставок CRY и nat с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Экстракцию

тотальной РНК из T. pseudonana проводили с использованием модифицированной версии набора RNeasy Plant Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Образцы лизировали в буфере RLT путем взбивания шариков в течение 3 мин с последующим осаждением этанолом и очисткой колонки в соответствии с протоколом производителя. RT-PCR с использованием праймеров oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, CA) выполняли в соответствии с протоколом производителя для обратной транскриптазы SSIII (Invitrogen, Carlsbad, CA) с использованием 1 мкг РНК. Анализ экспрессии генов определяли с помощью ПЦР и электрофореза в агарозном геле.

Изоляция створок

Frustules выделяли с использованием процедуры, описанной Poulsen et al. 2007 [10], модифицированный для достижения удовлетворительного анализа FRET. Детергенты и EDTA не добавляли в буфер. Клетки обрабатывали ультразвуком с использованием пяти последовательных импульсов по 30 с (звуковой дисмембратор Fisher Scientific, модель 500, амплитуда 10%) и позволяли осесть в микроцентрифуге, вращающейся только со скоростью 0,8 об / мин. Собранные таким образом створки затем визуализировали и анализировали на FRET, как описано ниже для живых клеток.

Флуоресцентная визуализация с локализацией

Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра высокого разрешения ImageStream X ® (Amnis, Co., Сиэтл, Вашингтон). Приблизительно 10 000 образцов клеток были возбуждены с использованием лазера с длиной волны 405 нм, и было получено по пять изображений на ячейку в каналах голубого, желтого, красного, светлого поля и бокового рассеяния. В лазерную линию вставляли фильтр 66SP, чтобы минимизировать аутофлуоресценцию хлоропластов. Голубые и желтые флуоресцентные изображения были компенсированы просвечиванием красной флуоресценции.После захвата изображения проточной цитометрии образцы были заблокированы для получения популяций захваченных изображений одиночных клеток, которые были в фокусе и отображали стереотипную красную автофлуоресценцию, указывающую на живые клетки. Яркость и контраст интенсивностей голубой и желтой флуоресценции были отрегулированы одинаково для каждого канала в образцах TR и WT.

Флуоресценцию, локализованную в биокреме

, получали на инвертированном световом микроскопе DM IRB (Leica, Inc.) с использованием камеры SPOT и программного обеспечения для анализа изображений (SPOT, Inc.)). Живые клетки и клеточные стенки биокремнезема, собранные из клеточных культур, визуализировали на наличие голубой и красной флуоресценции. Соответственно были отрегулированы яркость и контраст.

Визуализация и анализ FRET

Клетки

исследовали с использованием инвертированного светового микроскопа DM IRB (Leica, Inc.), и изображения получали с помощью камеры Photometrics CoolSNAP EZ, присоединенной к разделителю изображений DV2 с голубыми и желтыми фильтрами излучения. Изображения клеток подвергали последующей обработке путем псевдоокрашивания каждого изображения соответствующим образом с использованием программного обеспечения MetaMorph® и перекрытия изображений для локализации белков с помощью программного обеспечения Photoshop (Adobe, Inc.). Яркость и контрастность были отрегулированы одинаково для каждого изображения.

Для анализа FRET клетки или створки были иммобилизованы на покрытых коллагеном чашках Петри диаметром 35 мм (MatTek, Ashland, MA), фотообесцвечены в течение пяти минут при 430 нм, чтобы минимизировать просачивание красной автофлуоресценции хлоропластов в CyPet и каналы YPet, затем возбуждаемые на длине волны 430 нм импульсами с интервалом в одну минуту до 40 мин. Изображения для эмиссионных спектров 485 нм и 530 нм обрабатывали с использованием программного обеспечения MetaMorph®.FRET измеряли как отношение RFU при 530 нм и 485 нм с поправкой на фоновую флуоресценцию каждой длины волны в нейтральном месте на планшете. FRET вычислялся попиксельно, а кривые FRET строились путем построения графика зависимости отношения 530/485 нм от времени.

Для построения кривой «концентрация-ответ» для диатомовых водорослей, подвергшихся воздействию рибозы, ΔF сначала нормализовали до ΔF max , после корректировки каждого значения на ΔF min , чтобы получить ΔF n :

ЕС 50 для клеточного FRET (концентрация, при которой наблюдается 50% от максимального ΔF n ) определяли путем построения графика зависимости ΔF n от концентрации рибозы [s]:

Благодарности

Николь Поулсен и Нильс Крегер, Технологический институт Джорджии, дали рекомендации по системе трансформации диатомовых водорослей.Бен Алдерете, Amnis Corporation, Сиэтл, Вашингтон, организовал доступ к проточному цитометру ImageStream X ® для визуализации, а д-р Брайан Холл оказал неоценимую поддержку в работе с прибором и анализе данных. Техническую поддержку оказали Елена Билявская, Ханна Миллер и Карли Фэрбенкс, стажеры по программе студенческих исследовательских стажировок Министерства энергетики США. Никола Толич и Сэм Пурвин оказали поддержку в обработке данных MS. Доктор Валери Куллинан поддержала статистический анализ.Часть исследований была проведена в Лаборатории молекулярных наук об окружающей среде W. R. Wiley, национальном научном учреждении, спонсируемом Управлением биологических и экологических исследований Министерства энергетики и находящемся в Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории (PNNL).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: KEM GR. Проведены эксперименты: KEM EWR SMH. Проанализированы данные: KEM EWR SMH LPT GR. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: KEM EWR LPT GR.Написал статью: КЕМ ГР. Рецензировано и отредактировано рукопись: EWR LPT.

Ссылки

  1. 1. Чен Дж., Думамидис Х., Лайонс К., Мердей Дж., Роко М.С. (2007) Производство в наномасштабе. Отчет семинара Национальной инициативы в области нанотехнологий.
  2. 2. Гордон Р., Паркинсон Дж. (2005) Возможные роли диатомов в нанотехнологиях. Журнал нанонауки и нанотехнологий 5: 35–40.
  3. 3. Чанг Ч., Ван В., Гуцу Т., Гейл Д.К., Цзяо Дж. И др.(2009) Самосборка наноструктурированных диатомовых микрооболочек в узорчатые массивы с помощью многослойного осаждения полиэлектролита и струйной печати. Журнал Американского химического общества 131: 4178.
  4. 4. Кент М.С., Муртон Дж.К., Сатия С., Кузьменко И., Симмонс Б.А. (2009) Образование нанокремнезема на липидных мембранах, индуцированное силлафиновыми пептидами. Отношения структура-свойство в биоминерализованных и биомиметических композитах 1187: 95–100.
  5. 5. Kröger N, Deutzmann R, Sumper M (1999) Поликатионные пептиды из биокремнезема диатомовых водорослей, которые направляют формирование наносферы кремнезема.Наука 286: 1129–1132.
  6. 6. Крегер Н., Сандхаге К.Х. (2010) От биомолекул диатомовых водорослей до биовдохновленных синтезов материалов на основе диоксида кремния и диоксида титана. Миссис Бюллетень 35: 122–126.
  7. 7. Sandhage KH, Bao ZH, Weatherspoon MR, Shian S, Cai Y и др. (2007) Химическое восстановление трехмерных микросборок кремнезема до микропористых кремниевых копий. Природа 446: 172–175.
  8. 8. Rorrer GL, Jeffryes C, Gutu T, Jiao J (2008) Метаболическая вставка наноструктурированного TiO 2 в узорчатый биокремнезем диатомовых водорослей Pinnularia sp с помощью двухэтапного процесса культивирования в биореакторе.Acs Nano 2: 2103–2112.
  9. 9. Rorrer GL, Jeffryes C, Gutu T, Jiao J (2008) Двухэтапный фотобиореакторный процесс для метаболической вставки наноструктурированного германия в микроструктуру кремнезема диатомовых водорослей Pinnularia sp. Материаловедение и инженерия С-биомиметические и супрамолекулярные системы 28: 107–118.
  10. 10. Поульсен Н., Берн С., Испания Дж., Крегер Н. (2007) Иммобилизация фермента кремнеземом посредством генной инженерии диатомовых водорослей Thalassiosira pseudonana .Angewandte Chemie-International Edition 46: 1843–1846.
  11. 11. Поульсен Н., Чесли П.М., Крегер Н. (2006) Молекулярно-генетические манипуляции с диатомовыми водорослями Thalassiosira pseudonana (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 42: 1059–1065.
  12. 12. Шеппард В., Шеффель А., Поулсен Н., Крегер Н. (2012) Иммобилизация мультимерных и окислительно-восстановительных ферментов живым диатомовым кремнеземом. Appl Environ Microbiol 78: 211–218.
  13. 13. Lager I, Fehr M, Frommer WB, Lalonde SW (2003) Разработка флуоресцентного наносенсора для рибозы.Febs Letters 553: 85–89.
  14. 14. Кэмпбелл Р. Э., Карлсон Х. Дж. (2009) Биосенсоры на основе генетически закодированных FRET для многопараметрической флуоресцентной визуализации. Текущее мнение в области биотехнологии 20: 19–27.
  15. 15. Newman RH, Fosbrink MD, Zhang J (2011) Генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры для отслеживания динамики сигналов в живых клетках. Химические обзоры 111: 3614–3666.
  16. 16. Нгуен А.В., Догерти П.С. (2005) Эволюционная оптимизация флуоресцентных белков для внутриклеточного FRET.Природная биотехнология 23: 355–360.
  17. 17. Mowbray SL, Cole LB (1992) Рентгеновская структура периплазматического рибозного рецептора на 1,7 Ангстрема из Escherichia coli . Журнал молекулярной биологии 225: 155–175.
  18. 18. Патвардхан С.В. (2011) Биомиметический и биоинспирированный диоксид кремния: последние разработки и применения. Химические коммуникации 47: 7567–7582.
  19. 19. Крегер Н., Поульсен Н. (2008) Диатомовые водоросли — от биогенеза клеточной стенки до нанотехнологий.Ежегодный обзор генетики 42: 83–107.
  20. 20. Luckarift HR, Johnson GR, Испания JC (2006) Ферментные реакторы с иммобилизованным диоксидом кремния; применение в исследованиях ингибирования холинэстеразы. Журнал хроматографии B-аналитических технологий в биомедицине и науках о жизни 843: 310–316.
  21. 21. Naik RR, Tomczak MM, Luckarift HR, Spain JC, Stone MO (2004) Улавливание ферментов и наночастиц с использованием биомиметически синтезированного диоксида кремния. Химические коммуникации 1684–1685.
  22. 22. Винеке Р., Бернекер А., Ридель Р., Сампер М., Стейнем С. и др. (2011) Осаждение кремнезема синтетическими силафиновыми пептидами. Органическая и биомолекулярная химия 9: 5482–5486.
  23. 23. Scheffel A, Poulsen N, Shian S, Kröger N (2011) Микрокольца с нанопаттерном белка из диатомовых водорослей, которые управляют морфогенезом кремнезема. Слушания Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 108: 3175–3180.
  24. 24. Эриксон HP (2009) Размер и форма белковых молекул на нанометрическом уровне, определяемом с помощью седиментации, гель-фильтрации и электронной микроскопии.Биологические процедуры онлайн 32–51.
  25. 25. Hildebrand M, York E, Kelz JI, Davis AK, Frigeri LG, et al. (2006) Наноразмерный контроль морфологии и трехмерной структуры кремнезема во время формирования клеточной стенки диатомовых водорослей. Журнал материаловедения 21: 2689–2698.
  26. 26. Losic D, Rosengarten G, Mitchell JG, Voelcker NH (2006) Архитектура пор диатомовых панцирей: потенциальные наноструктурированные мембраны для разделения молекул и частиц. Журнал нанонауки и нанотехнологий 6: 982–989.
  27. 27. Врилинг EG, Beelen TPM, van Santen RA, Gieskes WWC (2000) Наноразмерная однородность структуры пор в диатомовом кремнеземе: комбинированное исследование малоуглового и широкоугольного рассеяния рентгеновских лучей. Journal of Phycology 36: 146–159.
  28. 28. Li L, Jiang ZY, Wu H, Feng YN, Li J (2009) Биокремнезем, индуцированный протамином, как эффективный носитель для иммобилизации ферментов с высокой загрузкой и улучшенной стабильностью. Материаловедение и инженерия C-материалы для биологических приложений 29: 2029–2035.
  29. 29. Марнер В.Д., Шейх А.С., Мюллер С.Дж., Кислинг Д.Д. (2009) Иммобилизация ферментов через аутоинкапсуляцию с помощью силлаффина в подложке из биокремнезема. Прогресс биотехнологии 25: 417–423.
  30. 30. Spain JC, Luckarift HR, Naik RR, Stone MO (2004) Иммобилизация ферментов в биомиметической подложке из диоксида кремния. Природная биотехнология 22: 211–213.
  31. 31. Шен Ю.Ф., Толик Н., Хиксон К.К., Пурвин С.О., Андерсон Г.А. и др. (2008) De novo секвенирование уникальных последовательностей тегов для обнаружения посттрансляционных модификаций белков.Аналитическая химия 80: 7742–7754.

Это странное состояние языка не вызывает беспокойства из-за этого

Если вас заинтриговало странное и причудливое, вот одно, которое вызовет ваш интерес: географический язык . Это редкое заболевание, вызывающее появление красных пятен на поверхности языка, окруженных серовато-белыми границами, которые очень похожи на континенты на карте (отсюда и название). Но хотя это может показаться странным, географический язык не навредит вашему здоровью.

Состояние также известно как доброкачественный мигрирующий глоссит , названный так потому, что он не злокачественный, и пятна, кажется, перемещаются или «мигрируют» по поверхности языка. Считается, что наиболее частыми причинами являются стресс или гормональные сбои у предрасположенных к этому заболеванию. Многие исследователи считают, что дефицит цинка или витамина B в организме способствует его возникновению. Это также кажется более распространенным среди некурящих и беременных женщин, а также является семейной чертой.

Красные пятна образуются в результате временного исчезновения некоторых сосочков, крошечных бугорков на верхней поверхности языка. Пятна могут внезапно появиться во время обострения, а затем так же внезапно исчезнуть. Но какими бы «злыми» ни казались пятна, географический язык не считается опасным для здоровья. Обычно это не болезненно, хотя люди могут испытывать ощущение покалывания или онемения, исходящие от пятен, что может быть слегка неудобным.

Поскольку это тоже редкость, вы вряд ли столкнетесь с ним лично.Но если вы или ваш любимый человек все же начинаете замечать красные пятна на языке, вы можете сделать несколько вещей, чтобы уменьшить сопутствующее раздражение. Во-первых, откажитесь от таких продуктов, как помидоры, цитрусовые, баклажаны, мята, а также очень острые или кислые продукты, которые, как известно, усиливают дискомфорт. Вы также можете избегать вяжущих средств, таких как спирт или жидкости для полоскания рта, которые также раздражают пятна, когда они появляются.

Хотя географический язык не излечим, ваш стоматолог может помочь вам справиться с симптомами, когда они возникают, с помощью предписанных анестетиков для полоскания рта, антигистаминных препаратов или стероидных леденцов.Это не только может помочь уменьшить дискомфорт или раздражение, но и уменьшить продолжительность обострения.

По большей части географический язык обычно вызывает больше затруднений, чем физический дискомфорт. Но с небольшой помощью стоматолога вы можете свести ее к минимуму. Географический язык может показаться странным, но это не повод для беспокойства.

Если вам нужна дополнительная информация о географическом языке, свяжитесь с нами или назначьте встречу для консультации. Вы также можете узнать больше об этой теме, прочитав статью журнала Dear Doctor «Географический язык: нет причин для тревоги.”

Не нужно беспокоиться о хирургии имплантата

Вы заинтересованы в зубных имплантатах, но немного сомневаетесь насчет операции? Нет — эта процедура по установке титанового штифта имплантата в челюстную кость относительно несложна и для большинства пациентов практически не вызывает дискомфорта.

Однако незадолго до этого нам нужно будет заранее спланировать операцию, чтобы определить наилучшее место для имплантата, что имеет решающее значение для достижения надежной фиксации и естественного внешнего вида. Во время этих первых посещений мы часто создаем хирургический шаблон — устройство, вставляемое в рот во время операции, которое определяет точное место отверстия (или канала , ) в кости, которую мы просверлим, чтобы вставить имплант.

В день операции мы подготовим вас к безболезненному и расслабляющему отдыху. Если вы обычно беспокоитесь о стоматологической работе, мы можем прописать вам успокаивающее средство, которое вы должны принять заранее. Вначале мы тщательно обезболиваем пораженную область с помощью местной анестезии, чтобы вы не почувствовали боли.

Операция начинается с разреза ткани десны для доступа к подлежащей кости. Как только он обнажится, мы вставим хирургический шаблон и начнем последовательность сверления, чтобы постепенно увеличивать размер канала.Это требует времени, потому что мы хотим избежать повреждения кости от перегрева, вызванного трением.

После того, как мы создали канал, который точно соответствует размеру и форме имплантата, мы извлекаем имплантат из стерильной упаковки, немедленно устанавливаем и закрепляем его в канале. Затем мы сделаем рентген, чтобы убедиться, что он находится в наилучшем возможном положении.

Убедившись, что мы правильно расположили и закрепили имплант, мы зашиваем ткань десны на место, чтобы защитить имплант с прикреплением к нему заживляющего абатмента или без него, поскольку он полностью интегрируется с челюстной костью в течение следующих нескольких месяцев (после к которой вы вернетесь, чтобы получить свою постоянную корону).После непродолжительного восстановления вы вернетесь к полной активности. Большинство пациентов испытывают дискомфорт от легкого до умеренного, который обычно устраняется безрецептурными обезболивающими, такими как аспирин или ибупрофен.

Хотя имплантация — это длительный процесс, вы получите то, что большинство стоматологов и их пациенты считают наиболее прочным и реалистичным заменителем зубов. Ваша новая привлекательная улыбка того стоит.

Если вам нужна дополнительная информация о зубных имплантатах, свяжитесь с нами или назначьте встречу для консультации.Вы также можете узнать больше об этой теме, прочитав статью журнала Dear Doctor «Операция по имплантации зубов: чего ожидать до, во время и после».

Биомолекул | Бесплатный полнотекстовый | Отдельная молекула FRET: мощный инструмент для изучения внутренне неупорядоченных белков

1. Введение

Внутренне неупорядоченные белки (IDP) и белки, содержащие внутренне неупорядоченные области (IDR), все чаще признаются критическими компонентами клеточных сигнальных путей и регуляторных сетей [1,2 , 3,4,5,6].В отличие от точно сложенных статических структур, которые обычно ассоциируются с красочными изображениями ферментов, воспроизводимых в учебниках и на обложках журналов, ВПЛ не складываются в стабильную структуру. Скорее, пептидная цепь IDP непрерывно колеблется в большом конформационном пространстве (рис. 1). Эта конформационная гибкость, вдохновляющая конфигурационные пространства IDP, которые иногда называют плеоморфными ансамблями или «нечеткими» структурами, является ключом к способности IDP служить концентраторами в сигнальных сетях.Широкий диапазон взаимозаменяемых конформаций позволяет IDP взаимодействовать с множеством партнеров для координации множества возможных путей передачи сигналов. Центральная роль IDP в таких клеточных транзакциях отражена в недавних открытиях, что в сотовых сетях разработаны переключатели (т.е. фосфорилирование) для управления диапазоном конфигураций IDP с целью регулирования сигнальных путей [7,8,9,10]. Т.о., выяснение конформационной динамики IDP, вероятно, откроет механизмы, с помощью которых конформационная динамика IDP может модулировать передачу сигналов в клетках.

Быстрая и непредсказуемая конформационная динамика IDPs представляет проблемы для экспериментальных подходов к характеристике их структур. Средний размер IDP, отраженных сопротивлением при движении в жидкости (гидродинамический радиус), можно измерить несколькими методами, такими как аналитическое ультрацентрифугирование (AUC), динамическое рассеяние света (DLS) и гель-фильтрация. Гидродинамический радиус отражает подвижность частицы в растворе, позволяя моделировать оценку пространственной протяженности и, в некоторых случаях, информацию о простых параметрах формы (т.е., круглые против продолговатых). Заимствуя идеи из физики полимеров, гидродинамический радиус может быть связан с физическими определениями пространства состояний IDP, такими как среднеквадратичное расстояние от конца до конца или радиус вращения цепи, хотя важно подчеркнуть, что отношения для преобразования между гидродинамическим радиусом и радиусом вращения в большинстве случаев весьма нетривиальны. Другие биофизические методы, такие как статическое рассеяние света, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и малоугловое рентгеновское или нейтронное рассеяние (SAXS и SANS соответственно), могут обеспечить доступ к этим параметрам и позволить экспериментальное сравнение с эффективным гидродинамическим радиусом.Однако важно отметить, что эти методы предоставляют информацию только о среднем значении ансамбля конфигураций и не дают представления о молекулярной гетерогенности.

Тем не менее, эксперименты ЯМР могут предоставить более подробную информацию о контактах в цепи и ансамблях флуктуаций, но они отнимают много времени и утомительны [11,12,13]. Напротив, методы, основанные на флуоресценции, такие как флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), наносекундная FCS (nsFCS), nsFCS-FRET и методы контактного гашения, обеспечивают доступ к быстрым временным шкалам (близкие к временам жизни флуоресценции, которые могут быть в наносекундном диапазоне) и могут дать важные результаты. информация о локальных флуктуациях, нелокальных контактах и ​​кинетике реконфигурации цепей [14,15,16,17,18,19].В этом мини-обзоре основное внимание будет уделено резонансному переносу энергии флуоресценции (или Фёрстера) одиночных молекул (FRET) (или smFRET) [20,21] и показано, как этот метод может предоставлять информацию в реальном времени о динамических изменениях в ансамбле IDP с чувствительностью к индивидуальным флуктуациям или субпопуляции.

Одномолекулярный FRET имеет несколько уникальных преимуществ перед другими методами, обычно используемыми для изучения IDP. smFRET имеет временное разрешение от 0,1 мс до более 1000 с. Способность следить за отдельной молекулой в течение продолжительного времени дает инструмент, позволяющий выявить переключение ансамбля во временных масштабах, которые длиннее по сравнению с молекулярными флуктуациями.Масштабы длины, исследуемые с помощью smFRET, находятся в диапазоне 2-8 нм, что является более длинным масштабом, чем методы контактного тушения, выявляя конформации, при которых точки на белковой цепи, исследуемые на тушение, могут никогда не вступить в тесный контакт. Наконец, по сравнению с другими методами, такими как SAXS или NMR, которые требуют обширного оборудования, smFRET относительно недороги и просты в реализации. Таким образом, smFRET предоставляет инструмент быстрого скрининга для характеристики эффектов посттрансляционной модификации, вариации последовательности или влияния изменений окружающей среды на глобальный конформационный ансамбль IDP.

Одномолекулярный FRET набирает популярность для изучения ВПЛ, и несколько отличных обзоров предоставили проницательные перспективы [21,22,23]. В этом мини-обзоре мы представляем практическую точку зрения и сосредотачиваемся на соображениях по разработке, выполнению и интерпретации экспериментов по измерению smFRET от IDP. В заключение мы выделим отдельные исследования, которые иллюстрируют использование smFRET для распознавания структурных / функциональных связей IDP.

2. Как применять FRET одиночной молекулы для исследования белков с внутренними нарушениями

FRET — это зависимая от расстояния связь между двумя флуорофорами с разными спектральными диапазонами поглощения и излучения.Один из флуорофоров, обычно называемый донором, поглощает возбуждающий свет. Изолированные возбужденные доноры излучают свой характерный спектр посредством обычных процессов флуоресценции. Если донор находится достаточно близко к другому флуорофору, называемому акцептором, а не возбужденный донор, излучающий свой собственный спектр, возбуждение донора может передаваться акцептору, что приводит к излучению акцептора. Соотношение интенсивностей излучения акцептора и донора дает информацию о разделении флуорофоров (рис. 2А).Конкретный выбор флуорофоров влияет на шкалу длины, для которой полезен FRET. Таким образом, первоначальные соображения в любом эксперименте FRET заключаются в том, какие флуоресцентные зонды использовать и как прикрепить их к исследуемой молекуле. Флуорофоры для исследований FRET одиночных молекул должны быть яркими (высокий квантовый выход), а также иметь длительное время жизни излучения до фотообесцвечивания. Подходящие флуорофоры подробно рассмотрены в другом месте [24], но обычно включают коммерчески доступные цианин (Cy3, Cy5), серии Alexa и Atto.Эти флуорофоры доступны с несколькими химическими модификациями, которые позволяют прикрепляться к IDP. Поскольку цистеин не является обычным в большинстве белков, реактивные с цистеином флуорофоры часто используются для присоединения флуорофоров к специфическим остаткам цистеина, встречающимся в природе или введенным посредством сайт-специфической мутации в мутант IDP, не содержащий цистеина. Как и в случае любой модификации флуоресценции, важно убедиться, что меченые и немеченые белки ведут себя одинаково во всех доступных функциональных анализах (например,g., связывание лиганда, активность АТФазы и т. д.). Независимо от того, доступны ли функциональные анализы для сравнения меченых и немеченых образцов, рекомендуется провести дополнительные эксперименты для оценки возможного воздействия маркировки. Например, сравнение измерений smFRET для данных сайтов прикрепления метки с использованием разных пар флуорофоров может быть использовано для исследования того, какое влияние конкретные свойства красителей (размер, заряд, гидрофобность и т. Д.) Могут иметь на конфигурации изучаемого белка.Кроме того, согласованность между экспериментами с использованием различных мест прикрепления меток для любой данной пары флуорофоров создает уверенность в том, что мечение принципиально не изменяет молекулярную функцию. IDP, содержащий два цистеина, подвергшихся воздействию смеси реактивных донорных и акцепторных флуорофоров, приведет к случайной маркировке, что обычно не является проблемой для приложений smFRET для IDP. Измеряя эмиссию флуоресценции на уровне одной молекулы, популяции белков, меченных двумя донорами или двумя акцепторами, можно игнорировать, и только смешанную популяцию доноров / акцепторов переносить в анализ.Возможные экологические эффекты на поведение флуорофора из-за специфического контекста каждого цистеина обычно незначительны для большинства приложений, которые ищут конформационное переключение или не полагаются на абсолютную калибровку расстояния между зондами. При необходимости возможно сайт-специфическое мечение каждого флуорофора с использованием нескольких подходов, включая включение неприродных аминокислот или ферментативное мечение коротких целевых аминокислотных последовательностей [25]. Мечение более чем двумя флуорофорами может позволить одновременное измерение более чем одного расстояния вдоль пептидной цепи, хотя это передовые методы [26,27,28,29,30,31].Приборы для измерения сигналов smFRET от меченных красителем IDP возбуждают флуоресценцию с помощью лазерных источников и собирают излучение с помощью объективов микроскопов с высокой числовой апертурой. Фоновая флуоресценция должна быть минимизирована, чтобы можно было обнаруживать тусклые сигналы одиночных молекул. Две различные конфигурации оптического освещения обычно используются для минимизации фоновой флуоресценции, освещения с полным внутренним отражением (TIR) ​​и конфокальной микроскопии [22,23,32,33]. TIR применяется с IDP, иммобилизованными на поверхности проточной ячейки.Обычно молекулы, которые модифицированы биотином, 6-гистидиновыми метками или другими аффинными метками, привязаны непосредственно к своим партнерам по связыванию, которые прикреплены к пассивированной поверхности (авидин / стрептавидин для биотина, антитела для 6-гистидиновых меток и т. Д.). IDP, которые лишены взаимодействия с липидными бислоями, могут быть инкапсулированы внутри липидных пузырьков, которые привязаны к поверхности (Figure 2B) [34]. Для любого подхода с привязкой к поверхности иммобилизация имеет то преимущество, что позволяет наблюдать за одним белком в течение длительного периода времени, но имеет недостаток, заключающийся в потенциально деструктивных взаимодействиях с поверхностью.Поверхностных взаимодействий можно избежать, сфокусировав луч конфокального микроскопа в объеме раствора, но молекулы обнаруживаются только на время в миллисекундном диапазоне, поскольку они свободно диффундируют через фокус лазера. Стратегии, основанные на сопоставлении повторных посещений объема изображений, могут расширить полезную информацию, извлеченную в конфокальных экспериментах [35]. В обеих схемах освещения флуоресцентное излучение улавливается линзой объектива микроскопа, спектрально разделяется дихроичной оптикой, фильтруется для выделения диапазонов длин волн излучения донора и акцептора и передается на детекторы.Сигналы от одиночных молекул невысоки и требуют обнаружения с помощью наиболее чувствительных устройств, включая ПЗС-матрицы с электронным умножением (emCCD) и научные КМОП-камеры (sCMOS; или научные дополнительные металлооксидно-полупроводниковые) камеры, лавинные фотодиоды (APD) или фотоэлектронные умножители (PMT). . Если освещение представляет собой импульсный источник света, измерения времени жизни флуоресценции могут быть получены и преобразованы в эффективности FRET, которые относятся к разделению донор-акцептор. При непрерывном освещении детекторы обеспечивают зависимость интенсивности от времени для донорного и акцепторного каналов (I D и I A соответственно), из чего эффективность FRET E может быть рассчитана как E = I A / ( I A + I D ), который связан с мгновенным разделением донор-акцептор d как E = 1 / (1 + (d / R 0 ) 6 ) (рис. 2A).Параметр R 0 , называемый радиусом Ферстера, определяет масштаб длины соединения FRET и представляет собой значение, при котором эффективность передачи составляет 50%. R 0 определяется свойствами донорных и акцепторных флуоресцентных красителей и чаще всего находится в диапазоне 4–7 нм. Этот диапазон радиусов Ферстера делает FRET полезным для разделения доноров и акцепторов между 3 и 8 нм. В некоторых случаях эффективность FRET может быть скорректирована с учетом инструментальных факторов и факторов окружающей среды, чтобы предоставить количественную информацию о расстоянии между донорными и акцепторными флуорофорами и, таким образом, может быть ценным инструментом для структурных исследований биологических молекул [36,37,38,39].Внутренне неупорядоченные белки по определению не существуют в единой, четко определенной конформации, которая дала бы единственное разделительное расстояние для присоединенных донорных и акцепторных красителей. Скорее они существуют как ансамбли быстро взаимопревращающихся конформеров. Эти динамические изменения конфигурации происходят быстро по сравнению с экспериментальным интервалом измерения, в результате чего эффективность smFRET усредняется по диапазону расстояний [40]. Хотя этот быстрый конформационный обмен усиливает сильно усредненную интерпретацию относительного фактора ориентации диполей донора-акцептора в FRET (фактор каппа-квадрата, более подробно описанный в [41,42]), нелинейность фундаментальной связи между эффективностью FRET и отделение красителя может привести к значительной неопределенности при оценке этого среднего значения.Модель распределения вероятностей расстояний между донором и акцептором P (r) требуется, чтобы связать измеренную усредненную эффективность FRET с лежащим в основе разделением донора и акцептора, но соответствующая модель не всегда ясна. Усредненная эффективность FRET E> может быть рассчитана с учетом распределения вероятностей (P (r)) и зависимости эффективности FRET от расстояния, E (r) = 1 / (1 + (r / R 0 ) 6 ) в виде

〈E〉 = ∫ P (r) E (r) dr

Распределение Гаусса для P (r) обычно используется, но иногда включаются и другие распределения вероятностей для учета качества растворителя, самопроизвольного избегания, внутреннего трения или других явлений физики полимеров [40,43,44,45,46,47].Не строго естественное неупорядоченное состояние, разворачивание белков с помощью сильных денатурантов генерирует конформацию расширенного клубка, которая широко изучена с помощью smFRET [14,15,20,41,48]. Денатуранты разворачивают белки за счет уменьшения цепно-цепных взаимодействий и делая взаимодействия цепь-растворитель более благоприятными, упрощая энергетический ландшафт денатурированного состояния по сравнению с тем, что управляет конформационными ансамблями естественно развернутых белков. Из-за более простого энергетического ландшафта в денатурирующих условиях ожидается, что конфигурация белка будет более точно соответствовать предсказаниям простых теорий гомополимеров, чем естественное состояние, с возможными поправками на исключенный объем, внутреннее трение или глобальные поправки на качество растворителя.В большинстве исследований денатурации разворачивания белка используется конфокальный экспериментальный подход диффундирующего белка, потому что схемы поверхностной иммобилизации часто основываются на аффинности свернутых белков, таких как антитела или стрептавидин, а также стабильных липидных везикул.

3. Согласуются ли FRET одиночной молекулы и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей о размере белков с внутренними нарушениями?

Измерения размера молекул для белков в высоких концентрациях денатуранта с использованием smFRET и методов рассеяния, таких как SAXS или SANS, хорошо согласуются, но smFRET обычно сообщает об уплотнении денатурированных белков при удалении денатуранта, что часто не наблюдается с помощью подходов SAXS / SANS [49,50 , 51,52].В одном известном эксперименте, пытающемся решить эту проблему, были применены как smFRET, так и SANS к молекуле полиэтиленгликоля с двойной меткой (PEG) [53]. Исследование PEG обнаружило такое же отклонение сигналов smFRET и SANS, наблюдаемое у большинства белков. Авторы охарактеризовали это исследование как отрицательный контроль, поскольку они предположили, что уплотнение ПЭГ при удалении денатуранта не ожидается, хотя установлено, что и мочевина, и хлорид гуанидиния имеют благоприятные взаимодействия с ПЭГ [54] и могут влиять на конфигурацию ПЭГ в водном растворе [ 55].Таким образом, исследование PEG не дает результатов в качестве отрицательного контроля, если конфигурация PEG изменена денатурирующим средством. Несколько исследований белков в денатурирующих веществах исключили влияние денатуранта на показатель преломления растворителя, влияние на квантовый выход красителя, влияние вязкости на вращение красителя или спектральный сдвиг меток красителя [53,56]. Исследования малоуглового рентгеновского излучения или рассеяния нейтронов с мечеными и немечеными белками исключили уплотнение из-за наличия модификации красителя для отдельных случаев тестовых белков [57].Источник несоответствия при низкой концентрации денатуранта или естественных условиях для внутреннего беспорядка остается спорным. Разрешение несоответствия было предложено вывести из того факта, что оба метода требуют существенного моделирования, чтобы связать измеренные данные с оценкой характеристического параметра полимера. как радиус вращения [41,48,57,58]. smFRET требует предположения о модели ансамбля молекулярных конформаций (P (r)), тогда как SAXS / SANS требует моделей рассеяния.В частности, ряд групп пришли к различным выводам об источнике несоответствия между методами, применяемыми к денатурированным белкам или IDP, включая лежащую в основе гетерогенность в ансамблях за пределами случайных полимеров [57], недостаточность этих моделей [59,60, 61,62], или тонкое разделение точных величин, усредненных в двух методах измерения [41,48,57,58]. Тем не менее, эта тема остается предметом оживленных дискуссий, поскольку все более сложные подходы к моделированию и анализу данных сокращают наблюдаемые расхождения [63,64,65].Несмотря на систематическую разницу, определенную для размеров IDP в естественном состоянии, когда эти более сложные поправки не используются, как SAXS / SANS, так и smFRET могут быть очень эффективными в качестве инструментов для сообщения об относительных сдвигах в размере естественного состояния из-за биологически значимых изменений, таких как воздействие двухвалентные соли или посттрансляционные модификации белков. Для IDP PAGE4, ​​который играет важную роль в раке простаты, радиус инерции (R gyr ) нефосфорилированного белка был определен равным 36.2 Å по SAXS и 34 Å по smFRET [66]. При фосфорилировании киназой CLK2 R gyr увеличивался до 49,8 Å с помощью SAXS и до 43 Å с помощью smFRET [66]. Хотя smFRET дал систематически меньшую оценку R gyr , тенденции изменения при фосфорилировании такие же и могут быть полезны для качественной оценки воздействия на ансамбль IDP посттрансляционных модификаций. Способность SAXS и smFRET обнаруживать это изменение в PAGE4 иллюстрирует одно из самых мощных приложений smFRET, которое позволяет быстро сообщать об изменениях в поведении IDP при изучении их функций в сетях сигнализации.

5. Будущие направления

Наше понимание «нечеткой логики», с помощью которой ВПЛ регулируют биологические функции, быстро растет. Одним из наиболее интригующих открытий является способность IDP конденсироваться в разделенные по фазе домены внутри клеток и служить временными органеллами, лишенными структурных границ (также называемых безбелковыми безмембранными органеллами или PMLO), такими как ядрышки, обнаруженные в ядре [ 87,88,89,90]. Склонность ВПЛ к агрегации хорошо известна (в некоторых классических случаях способствует формированию патологических структур нитей, характерных для болезни Паркинсона или болезни Альцгеймера), но еще предстоит определить, как эти свойства ВПЛ могут быть использованы для фазового разделения и генерации этих безмембранные структуры органелл [90,91,92,93,94].Наше обсуждение здесь сосредоточено на роли IDP в клеточных сигнальных путях и уникальных возможностях, которые они предоставляют для взаимодействия с множеством партнеров для координации передачи сигнала. Объединение результатов, полученных с помощью различных методов, обеспечивает более полную картину молекулярной функции и перекрестную проверку smFRET с другими методами, включая ЯМР, EPR-DEER (электронный параметрический резонанс — двойной электронно-электронный резонанс), PRE (усиление парамагнитной релаксации) и SAXS позволит глубже понять феномен ВПЛ.Из-за различных диапазонов концентраций этих методов и разнообразия моделирования, необходимого для интерпретации экспериментальных результатов, становится все более очевидным, что моделирование молекулярной динамики (МД) будет иметь важное значение для полного понимания поведения и функции IDP в будущем. IDP представляют собой уникальные проблемы для моделирования МД, поскольку они чрезвычайно чувствительны к деталям используемого силового поля, а также требуют обширной выборки для характеристики ансамбля [95,96]. Недавние результаты показывают, что методы быстро развиваются, чтобы позволить моделирование MD предоставить понимание конформационной динамики IDP, совокупностей и функций ансамбля [41,46,52,57,86,97,98,99].Измерения FRET одной молекулы и ансамбля в сочетании с другими методами, включая методы ЯМР и ЭПР, предоставят ценные эталоны для тестирования и ограничения таких симуляций [41,100,101,102,103]. Понимание механистических деталей, которые влияют на пластичность IDP, и точная настройка связывания этих ансамблей с мишенью молекулы (некоторые даже остаются неупорядоченными, когда находятся в связанном состоянии [104]) потребуются прежде, чем систематические подходы к модуляции этих конформаций для инженерных результатов станут практическими.Тем не менее, уже есть некоторые намеки на успех терапевтического воздействия на IDPs в сигнальных путях с помощью небольших молекул для взаимодействия с неупорядоченными областями белков [2,105,106].

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *