Х коде лада: фото новая цена Х Код Concept, АвтоВаз опубликовал тизер кроссовера

Содержание

485200410R Наконечник рулевой тяги ЛАДА X-Ray правый АвтоВАЗ — 485200410R

485200410R Наконечник рулевой тяги ЛАДА X-Ray правый АвтоВАЗ — 485200410R — фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru Распечатать

1

1

Применяется: ВАЗ, DACIA, RENAULT

Артикул: 485200410R

Код для заказа: 541636

Есть в наличии Доступно для заказа1 шт.Сейчас в 3 магазинах — 3 шт.Цены в магазинах могут отличатьсяДанные обновлены: 18.09.2021 в 05:30 Доставка на таксиДоставка курьером — 300 ₽

Сможем доставить: Завтра (к 19 Сентября)

Доставка курьером ПЭК — EasyWay — 300 ₽

Сможем доставить: Сегодня (к 18 Сентября)

Пункты самовывоза СДЭК 
Пункты самовывоза Boxberry Постаматы PickPoint Магазины-салоны Евросеть и Связной Отделения Почты РФ Терминалы ТК ПЭК — EasyWay Самовывоз со склада интернет-магазина на Кетчерской — бесплатно

Возможен: сегодня c 10:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Люберцах (Красная Горка) — бесплатно

Возможен: сегодня c 19:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в поселке Октябрьский — бесплатно

Возможен: сегодня c 19:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Сабурово — бесплатно

Возможен: сегодня c 19:00

Самовывоз со склада интернет-магазина на Братиславской — бесплатно

Возможен: сегодня c 19:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Перово — бесплатно

Возможен: сегодня c 19:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Кожухово — бесплатно

Возможен: завтра c 12:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Вешняков — бесплатно

Возможен: завтра c 12:00

Самовывоз со склада интернет-магазина из МКАД 6км (внутр) — бесплатно

Возможен: завтра c 12:00

Самовывоз со склада интернет-магазина в Подольске — бесплатно

Возможен: завтра c 12:00

Код для заказа 541636 Артикулы 485200410R Производитель АвтоВАЗ Каталожная группа: ..Управление рулевое
Механизмы управления

Отзывы о товаре

Где применяется

Обзоры

Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на
18.09.2021 05:30
.

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Интернет-цена — действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону 8-800-600-69-66. При условии достаточного количества товара в момент заказа.

Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

a9b8f42853e672b902110cac5f2a7c91

Добавление в корзину

Код для заказа:

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Добавить

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Закрыть

Оформить заказ

Где находиться и Как узнать дату выпуска аккумулятора?

Дата изготовления аккумулятора существенно влияет на работоспособность и продолжительность работы батареи, именно поэтому опытные автовладельцы при покупке аккумуляторной батареи подбирают ее не только по техническим данным, но и по дате изготовления АКБ.

Единых стандартов маркировок даты выпуска аккумулятора нет, на батареях разных производителей дата ставиться в зашифрованном виде и не каждые сможет понять, когда именно аккумулятор был выпущен.

На данной странице вы можете ознакомиться с наиболее популярными батареями, представленными в нашем интернет магазине!

 

Аккумулятор Forse, FB, FireBall, Uno, Dominator и Курский аккумулятор

Код маркировки наносится на крышку аккумуляторных батарей и включает в себя:

дату производства аккумуляторных батарей,
сведения о батарее и условиях производства.
Код состоит из двух групп цифр: в первой группе четыре цифры, во второй группе — шесть цифр: 1234 567890.

Схема маркировки:

1 – номер производственной линии
2, 3, 4 – индивидуальный код партии
5 – последняя цифра года
6 – полугодие

7 – порядковый номер месяца в полугодии

8,9 — день (число месяца)
0 — номер бригады (возможны 2 цифры)

Пример маркировки:
2260 311321
Расшифровка:

Аккумуляторная батарея была произведена на производственной линии №2, 260 — индивидуальный код партии. Дата изготовления: 2013 год, 1-е полугодие, 1 месяц, 21 число (21 января 2013 года). Бригада №1
Тяжелая группа аккумуляторов маркируется несколько иначе.
Пример маркировки тяжелой группы аккумуляторных батарей:
14010243
Расшифровка:

Батарея имеет ёмкость 140 А/ч, произведена в 2010 году, 2-ое полугодие, 4 месяц второго полугодия (октябрь), бригадой №3.

 

Аккумуляторы Тюменский медведь, Tyumen Batbear, Arctic Batbear, Ямал

Код маркировки наносится на корпус батареи с противоположной стороны от центральной этикетки при помощи лазерной перфорации. Шесть цифр на задней стенке батареи расшифровываются как ММ.ГГГГ.

Пример маркировки:

102011
Расшифровка:
Дата изготовления — октябрь 2011 года.

Пример маркировки тяжелой группы аккумуляторных батарей:
1112
Расшифровка:
Выпущена в 11 месяце 2012 года.

 

Аккумуляторы Зверь, Актех, Орион

Код маркировки нанесен на верхней крышке. Аккумуляторные батареи завода Актех маркируют по принципу ММ.ГГ.

Пример маркировки:

0511
Расшифровка:
Дата изготовления — май 2011 года.

 

 

Аккумуляторы VARTA и BOSCH

Код маркировки расположен на верхней крышке в производственном коде. Код состоит из 24-х символов, четвертая позиция обозначает год, пятая-шестая – месяц.

Пример маркировки:

G2С1050520991 536528 82E 09

Расшифровка:

1 – 2011 год

05 – май.

Дата изготовления – май 2011 года.

На аккумуляторах «BOSCH» дата выпуска продублирована в центральной части лицевой наклейки, она содержит три цифры, говорящие о годе и месяце выпуска. Например, 105 – май 2011 года.

Кроме того, дату производства аккумулятора VARTA можно определить по цветному кружку, нанесенному на этикетку или крышку аккумулятора. Цвет кружка соответствует определенному кварталу.

 

Аккумулятор Mutlu

Дата производства аккумулятора нанесена посредством лазерной перфорации на верхней части корпуса АКБ. Код состоит из шести цифр, первая из которых – номер линии, вторая – год, третья, четвертая – месяц, пятая, шестая – число.

Пример маркировки:

410819
Расшифровка:
Батарея произведена на второй линии 19 августа 2011 года.

 

Аккумуляторы Topla, Moratti

На аккумуляторах Topla код нанесен на верхнюю часть корпуса при помощи лазера. Из четырнадцати символов третий, четвертый обозначают год, а пятый, шестой – неделю.

Пример маркировки:

F1110600941864

Расшифровка маркировки:

Батарея изготовлена в шестую неделю 2011 года (т.е. в феврале).

 

Аккумулятор Banner

Дата выпуска расшифровывается по первым 4 буквам английского алфавита выжженным на крышки АКБ

пример:

DEBC- расшифровывается как порядковый номер каждой буквы в англ. алфавите

1я и 2я буква означают неделю года

3я и 4я буква последние 2 цифры года

порядковый счет идет от 0, т.е.

A-0 B-1 C-2 D-3 E-4 F-5 G-6 H-7 I-8 J-9 K-10 L-11 M-12

маркировка DEBC-34 нед. 12 год.

 

Аккумулятор Rocket

Например: KJ9I03

KJ — расположение завода (Kwangju, Korea)

9 — год

I — месяц (A, B, C,D…)

03 — дата.

Аккумулятор Atlas


Расшифровка кода:
по первым 2м символам в маркиравке на крышке (под ручкой): 2KJD24
 

2- последняя цифра года (2012год)
K- порядковая буква латинского алфавит  (октябрь)       
 

А — январь
В — февраль.
С — март
D — апрель
Е — май
F — июнь
G — июль
H — август
J — сентябрь
K — октябрь
L — ноябрь
M — декабрь
буква «I» — в маркировке отсутствует
 

Panasonic, Furukawa Battery (SuperNova)


Производственный код расположен на этикетке сверху (на крышке). Притом, на батареях Panasonic код нанесен краской, а на батареях Furukawa Battery – выдавлен. Маркируются по принципу ЧЧ.ММ.ГГ
 

Пример маркировки:
181011А
Расшифровка:
Аккумулятор произведен 18 октября 2011 года.

Cobat, Titan (Standart, Euro Silver, Arctic Silver, Asia Silver, Vaiper)


С августа 2011 г. дата изготовления наносится на аккумуляторы завода TUBOR при помощи принтера и специальной цифро-буквенной комбинации. Размещение – на крышке АКБ, по центру.
 

Код содержит 5 символов: 12345
1 – день недели
2, 3 – порядковый номер недели в году (от 01 до 53)
4 – год (латинская буква)
 

Год Буква
2011 H
2012 V
2013 N
2014 Z
2015 P
2016 A
2017 S
2018 T
2019 X
2020 L
 

5 – номер смены.
 

Пример маркировки:
208Н1
 

Расшифровка:
2- вторник
08- восьмая неделя
Н- 2011 год
1- первая смена.
АКБ выпущен 22 февраля 2011 года в первую смену.
В настоящее время аккумуляторы завода TUBOR поступают в продажу как в прежнем варианте маркировки, так и в новом – приведенном выше.

Работа в Челябинске, поиск персонала и публикация вакансий

Поиск работы в Челябинске — это выбор между большим количеством вакансий в различных отраслях деятельности: от сотрудников сферы обслуживания до руководства крупных компаний. Используйте нашу обширную информационную базу — и вы быстро найдете подходящую работу в Челябинске.

Поиск работы с помощью hh.ru — простое и понятное занятие. Вам нужно лишь один раз заполнить форму резюме и разместить его. Затем вы можете откликаться на вакансии интересных компаний и получать приглашения от работодателей. Если вам некогда следить за появлением новых предложений на сайте — используйте сервис рассылки и уведомлений. Система будет сама присылать информацию о подходящих вакансиях и работе в Челябинске на вашу электронную почту.

Показать полностью

Составляя резюме на hh.ru, помните, что оно должно отвечать следующим требованиям:

• Объем — не более двух страниц в формате А4. Причем самую важную информацию разместите на первой странице. Не получается вместить все на один-два листа? Уменьшите количество страниц, убрав из резюме лишнее или хотя бы уменьшив размер шрифта.

• При наличии двух страниц обязательно укажите на первой, что продолжение текста содержится на следующей странице. Если у вас недостаточно опыта работы и резюме занимает меньше листа — растяните информацию таким образом, чтобы ее все-таки хватило на формат А4. Так ваша презентация будет выглядеть более представительно.

• Работодатели отдают предпочтение соискателям с высокими профессиональными качествами. Не менее важной чертой является «стабильность» соискателя. Частая смена мест работы, напротив, не вызовет у рекрутера энтузиазма. Хорошим критерием может являться стабильная динамика в резюме соискателя.

Сайт hh.ru ежедневно пополняется огромным количеством новых данных. По популярным запросам кадровых отделов предприятий в Челябинске соискатель может договориться о собеседовании в первый же день поиска. Даже если вас интересует узкоспециальный рабочий профиль — вакансии по нему появятся. Если не прямо сейчас, то в самое ближайшее время.

Большинство услуг для соискателя абсолютно бесплатны. Обновления происходят регулярно, превращая поиск работы в увлекательное времяпровождение.

АккордыДиаграммы »Расширения

Создание хордовых диаграмм для ладовых инструментов.
аккордовых диаграмм вставляются как сгруппированные элементы рисования и, таким образом, впоследствии могут быть отредактированы.
Поддерживает любое количество струн и ладов.

Обратите внимание: Что-то не работает со всеми версиями LibreOffice до 5.4.3 и всеми версиями OpenOffice, которые я тестировал на Linux Mint и Ubuntu , что также нарушает некоторые интересные функции (импорт и применение стилей, редактирование существующих аккорды с кнопкой редактирования, экспорт изображений).
Вот отчет об ошибке:
https://bugs.documentfoundation.org/show_bug.cgi?id=113615

Ошибка исправлена ​​в LO5.4.4! (Но SVG-экспорт не работает в упомянутых системах Linux)

Панель инструментов имеет 4 кнопки:
1. Chordinput
Эта кнопка позволяет вставлять новые или заменять выбранные аккорды путем ввода. (LibreOffice: если у вас выделен отрывок текста, все слова станут ChordDiagrams. OpenOffice выйдет из строя).
Введите название аккорда e.g .: c или cm
Типы по умолчанию, помимо основных: 5,7, m, m7, m7b5, maj7, sus4,7sus4, dim7
Эти типы по умолчанию можно транспонировать с помощью расширения «ChordTransposer» https: //extensions.libreoffice .org / extension / chordtransposer

Другие типы: -scale и -scalefull.
Для создания горизонтальных диаграмм введите «-«, например,
-c-scalefull создаст горизонтальную диаграмму, показанную на скриншоте

В качестве альтернативы вы также можете ввести код аккорда, например C: x / 3/2/0/1/0
Будет создан нормальный аккорд до.Строки разделяются символом /. Итак, для 6 строк требуется 5/
. MainSyntax: Имя: Точки: Barrees: FretLabels
Возможны 3 вида точек: По умолчанию — круг. Для квадрата добавьте s после числа, для ромба добавьте d после числа, например: C: x / 3d / 2s / 0/1/0

Чтобы добавить текст в Dots, Barrees или FretLabels, введите:, text so: C: x / 3,3 / 2,2 / 0 / 1,1 / 0 добавляет текст в точки.
Barrees добавляются с: B и Fretnumber, например: F: / 3/3/2 //: B1 — стандартный F-аккорд
Partial Barrees можно ввести, задав начальное и конечное значения Пример: Dm7: x / x / 0 / 2 //: B1 (2-1)
Вы можете добавить FretLabels на любой лад с помощью: Lfretnumber, text e.грамм. : L1, yourtext
Когда вы добавляете FretLabel к первому ладу, Nut будет удален. Таким образом, F-аккорд можно превратить в G-аккорд на 3-м ладу, только добавив FretLabel к первому ладу: G: / 3/3/2 //: B1: L1, III
Больше точек на той же струне (для гамм) можно ввести с помощью — так будет создана сетка с 1 строкой и 3 точками:
ScaleExample: 1-3-5
Просто посмотрите на код, сгенерированный Chord-Editor

2.Edit
Эта кнопка позволяет вставлять или заменять выбранные аккорды путем редактирования в редакторе аккордов.Редактор поддерживает от 1 до 6 струн и от 1 до 12 ладов.
Левая кнопка мыши добавит точки.
Shift + щелчок удалит точки.
Ctrl + Click изменит стиль точки: черный = круг, серый = квадрат, синий = ромб.
Диаграмма результатов будет включать только заполненные лады или метки. Итак, если вы хотите показать 12 ладов, но есть только точки до 10-го лада, добавьте текст в 12-й лад, например, пустое место.
Здесь вы также можете посмотреть автоматически сгенерированный аккордовый код. Код Аккорда — это то, что создаст диаграмму.Вы можете отключить автоматический режим и добавить больше строк, если хотите.
3.Style
Эта кнопка позволяет вам установить предпочтения для новых хордовых диаграмм и изменить стиль выбранных хордовых диаграмм. (Настройка будет сохранена в пользовательских свойствах документа вашего документа). Для сброса просто удалите это свойство в Файл-> Документ-> Свойства-> Пользовательские свойства)
Вы можете импортировать стили из выбранных аккордов и применять их к выделенным фрагментам. Также доступен режим реального времени.

Если вы хотите использовать музыкальные символы ♯ и ♭ вместо # и b, вы можете установить флажок «использовать ♯, ♭ в текстах».
Кнопка вверху, называемая «Rebuild selection», предназначена для случаев, когда вы хотите применить другую структуру к уже существующим аккордам, например, минимальное количество показываемых ладов или ориентацию макета.
4.Export
Позволяет экспортировать выбранные аккорды в формат SVG или .png. (Или вы можете скопировать и вставить аккорд в Draw и экспортировать оттуда)

Некоторые подсказки:
— Для изменения масштаба диаграмм лучше всего использовать кнопку «Стиль». (Вы также можете напрямую изменить размер, перетаскивая углы вручную, а затем исправить размеры текста, импортировав, отредактировав и применив стиль.)
— Привязка «AS Character» возможна, но не рекомендуется. («Символ AS» не позволяет редактировать элементы вручную, как описано ниже 🙂
— Каждую часть диаграммы также можно редактировать напрямую, введя группу или щелкнув ctrl-кнопкой. Чтобы отредактировать текст, дважды щелкните по нему. Для изменения цвета используйте навигатор. Для перемещения частей используйте клавиши со стрелками на клавиатуре, для небольших перемещений используйте клавиши alt + стрелки. В Windows несколько частей можно выбрать с помощью shift + ctrl-click
— если вы хотите выбрать или изменить сразу несколько диаграмм аккордов, вы можете выбрать их, дважды щелкнув имя аккорда в навигаторе или выбрав одну диаграмму аккорда в документе. и сдвигайте, нажимая на больше.Или выберите одну хордовую диаграмму, а затем нажмите Shift + щелкните и перетащите, чтобы создать прямоугольник выделения. Вы также можете просто выбрать обычный текстовый диапазон. Тогда на все диаграммы аккордов, закрепленные в этом диапазоне выбора, будет применен стиль.

То же расширение для OpenOffice4:
https://extensions.openoffice.org/de/node/18755

ChordDiagrams является частью моего бесплатного проекта для LibreOffice и OpenOffice:
LibreOfficeSongbookArchitect (LOSA)
http: // strikekai.blogspot.de/2015/04/libreofficesongbookarchitect.html

Одномолекулярный FRET и конформационный анализ бета-аррестина-1 посредством расширения генетического кода и реакции Se-click

Chem Sci. 2021 7 июля; 12 (26): 9114–9123.

, , , , , , , , , , , , , , , , и

Мин-Цзе Хан

Тяньцзиньский институт промышленной биотехнологии Китайской академии наук, Экономический район аэропорта Тяньцзинь, Тяньцзинь 300308 Китай,

Цин-тао Хэ

Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Медицинский колледж Челоо, Университет Шаньдун, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань 250012 Шаньдун Китай, [email protected]

Кафедра физиологии и патофизиологии Школы фундаментальных медицинских наук Пекинского университета, Ключевая лаборатория молекулярно-сердечно-сосудистых исследований Министерства образования, Хайдяньский район, Пекин 100191 Китай,

Институт биофизики Китайской академии наук, Чаоянский район, Пекин 100101 Китай,

Менги Ян

Школа наук о жизни, Цинхуа-Пекинский объединенный центр наук о жизни, Пекинский инновационный центр структурной биологии, Университет Цинхуа, Хайдяньский район, Пекин 100084 Китай, [email protected]

Чао Чен

Тяньцзиньский институт промышленной биотехнологии Китайской академии наук, Экономический район аэропорта Тяньцзинь, Тяньцзинь 300308 Китай,

Университет Китайской академии наук (UCAS), Шицзиншань район, Пекин 100049 Китай,

Иронг Яо

Школа наук о жизни, Цинхуа-Пекинский объединенный центр наук о жизни, Пекинский инновационный центр структурной биологии, Университет Цинхуа, Хайдяньский район, Пекин 100084 Китай, [email protected]

Сяохун Лю

Институт биофизики Китайской академии наук, Чаоянский район, Пекин 100101 Китай,

Ючуань Ван

Шэньчжэньский институт трансфузионной медицины, Шэньчжэньский центр крови, Футяньский район, Шэньчжэнь 518052 Китай,

Чжун-лян Чжу

Школа наук о жизни, Университет науки и технологий Китая, Район Баохэ, Аньхой 230026 Китай,

Конг-кай Чжу

Школа биологических наук и технологий Университета Цзинань, Цзинань Шаньдун 250022 Китай,

Чансю Цюй

Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Медицинский колледж Челоо, Университет Шаньдун, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань 250012 Шаньдун Китай, [email protected]

Вентилятор Ян

Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Медицинский колледж Челоо, Университет Шаньдун, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань 250012 Шаньдун Китай, [email protected]

Ченг Ху

Институт биофизики Китайской академии наук, Чаоянский район, Пекин 100101 Китай,

Сюйчжэнь Го

Институт биофизики Китайской академии наук, Чаоянский район, Пекин 100101 Китай,

Давэй Чжан

Тяньцзиньский институт промышленной биотехнологии Китайской академии наук, Экономический район аэропорта Тяньцзинь, Тяньцзинь 300308 Китай,

Чунлай Чен

Школа наук о жизни, Цинхуа-Пекинский объединенный центр наук о жизни, Пекинский инновационный центр структурной биологии, Университет Цинхуа, Хайдяньский район, Пекин 100084 Китай, [email protected]

Цзинь-пэн Сунь

Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Медицинский колледж Челоо, Университет Шаньдун, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань 250012 Шаньдун Китай, [email protected]

Кафедра физиологии и патофизиологии Школы фундаментальных медицинских наук Пекинского университета, Ключевая лаборатория молекулярно-сердечно-сосудистых исследований Министерства образования, Хайдяньский район, Пекин 100191 Китай,

Цзяньюнь Ван

Институт биофизики Китайской академии наук, Чаоянский район, Пекин 100101 Китай,

Университет Китайской академии наук (UCAS), Шицзиншань район, Пекин 100049 Китай,

Шэньчжэньский институт трансфузионной медицины, Шэньчжэньский центр крови, Футяньский район, Шэньчжэнь 518052 Китай,

Тяньцзиньский институт промышленной биотехнологии Китайской академии наук, Экономический район аэропорта Тяньцзинь, Тяньцзинь 300308 Китай,

Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Медицинский колледж Челоо, Университет Шаньдун, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань 250012 Шаньдун Китай, [email protected] Школа наук о жизни, Цинхуа-Пекинский объединенный центр наук о жизни, Пекинский инновационный центр структурной биологии, Университет Цинхуа, Хайдяньский район, Пекин 100084 Китай, [email protected]

Кафедра физиологии и патофизиологии Школы фундаментальных медицинских наук Пекинского университета, Ключевая лаборатория молекулярно-сердечно-сосудистых исследований Министерства образования, Хайдяньский район, Пекин 100191 Китай,

Институт биофизики Китайской академии наук, Чаоянский район, Пекин 100101 Китай,

Университет Китайской академии наук (UCAS), Шицзиншань район, Пекин 100049 Китай,

Шэньчжэньский институт трансфузионной медицины, Шэньчжэньский центр крови, Футяньский район, Шэньчжэнь 518052 Китай,

Школа наук о жизни, Университет науки и технологий Китая, Район Баохэ, Аньхой 230026 Китай,

Школа биологических наук и технологий Университета Цзинань, Цзинань Шаньдун 250022 Китай,

Автор, ответственный за переписку.

Эти авторы внесли одинаковый вклад.

Поступила 14 мая 2021 г .; Пересмотрено 2 июля 2021 г .; Принята к печати 27 мая 2021 г.

Авторское право © Королевское химическое общество
Дополнительные материалы

SC-012-D1SC02653D-s001.

GUID: 8C49E417-8400-480D-8AA9-A0E09CF62220

Заявление о доступности данных

Наборы данных, поддерживающие эту статью, были загружены как часть дополнительной информации.Кристаллографические данные для SeFRS депонированы в PBD под номером 7C5C.

Abstract

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) — мощный инструмент для исследования динамических свойств биомакромолекул. Однако успех белка smFRET зависит от точного и эффективного мечения двух или более флуорофоров на интересующем белке (POI), что остается очень сложной задачей, особенно для больших мембранных белковых комплексов. Здесь мы демонстрируем сайт-селективное включение новой неприродной аминокислоты (2-амино-3- (4-гидроселенофенил) пропановой кислоты, SeF) посредством генетической экспансии с последующей реакцией Se-click для конъюгирования флуорофора Bodipy593 с кальмодулином ( CaM) и β-аррестин-1 (βarr1).Используя эту стратегию, мы впервые наблюдали тонкие, но функционально важные конформационные изменения βarr1 при активации рецептором, связанным с G-белком (GPCR) через smFRET. Наш новый метод имеет широкое применение для сайт-специфической маркировки и измерения smFRET комплексов мембранных белков, а также для выяснения их динамических свойств, таких как выбор белка-преобразователя.

Введение

Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) является ключевым инструментом для исследования динамических свойств биомакромолекул, 1,2 , обеспечивая важное понимание многих фундаментальных биологических процессов, включая транскрипцию, 3 перевод, 4 Сворачивание белка , передача сигнала 5 и ферментные механизмы. 6 По сравнению с другими методами, такими как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия, smFRET имеет преимущество захвата множественных и второстепенных населенных конформационных состояний макромолекул в условиях, близких к физиологическим, без необходимость ансамблевого усреднения. 2,7 Точное мечение белков двумя или более флуорофорами в желаемых местах является важным условием измерения smFRET. 8,9 Идеальная стратегия маркировки белков, позволяющая использовать smFRET, требует, чтобы (1) уникальные функциональные группы вводились сайт-специфично в белки, без введения дополнительных мутаций и потери функций; (2) сайт-специфически меченый белок должен реагировать с высокой скоростью и избирательно с флуоресцентными красителями в физиологических условиях.

В настоящее время цистеин-малеимидная реакция является наиболее популярным подходом к биоконъюгации белков для исследования smFRET, который позволил раскрыть динамические механизмы мембранных белков, включая рецепторы, связанные с G-белками (GPCR). 10 Ферментативные стратегии мечения с тегами SNAP / CLIP, сульфатазой и биотинлигазой 11 были применены для обнаружения конформационных изменений рецептора ВИЧ-1 (ссылка 12) и mGluR2 с использованием smFRET. 13 Эти исследования значительно продвинули наше понимание передачи сигналов трансмембранных белков. 14 Являясь семейством рецепторов с наибольшим числом мишеней для лекарственных средств, GPCR преобразуют внеклеточные сигналы во внутриклеточные сигнальные каскады через как G-белок, так и аррестины. Важно отметить, что лиганды GPCR с предвзятым отношением к G-белку или аррестину могут проявлять более высокую эффективность и более низкие побочные эффекты в качестве фармакологических агентов. 15 Недавние исследования комплексов GPCR-аррестин с помощью дифракции рентгеновских лучей или крио-электронной микроскопии (Cryo-EM) предоставили важную структурную информацию о том, как рецепторы взаимодействуют с аррестинами и как смещенный лиганд вызывает специфические конформационные изменения рецептора. 16,17 Однако одномолекулярная перспектива передачи сигналов рецептор-аррестин с помощью smFRET не установлена.

Примечательно, что семь открытых остатков цистеина на аррестине представляют собой серьезную проблему для изучения передачи сигналов рецептор-аррестин с использованием метода smFRET с реакцией цистеин-малеимид, поскольку мутации всех семи цистеинов в аррестине могут существенно влиять на его функцию. Более того, большая молекулярная масса тегов SNAP / CLIP может значительно нарушить функцию целевого белка 18 (Таблица S1 ).

В отличие от этих методов включение неприродных аминокислот посредством расширения генетического кода 19,20 имеет уникальное преимущество введения сайт-специфичных модификаций белка без введения дополнительных мутаций. 21 Таким образом, этот метод имеет уникальное преимущество для мечения комплексов мембранных белков, таких как GPCR-аррестины, и изучения их динамических свойств. 22 Более того, биоортогональные реакции были широко разработаны, включая Cu (i) -опосредованную азидно-алкиновую щелочную реакцию, 23 активируемую штаммом азид-алкиновую щелочную реакцию, 24 реакции Дильса-Альдера, 25,26 обратное электронное циклоприсоединение Дильса-Альдера, 25,27 реакция кетон / альдегид и гидразин / гидроксиламин, 28 реакция «π-зажима», 29 реакция метионин-оксазиридина ReACT, 30 биоортогональная реакция, катализируемая палладием, 31 реакция фото-щелчка 32 и другие (Таблица S2 ).Хотя эти биоортогональные реакции чрезвычайно ценны, более удобный для пользователя метод маркировки белков, генерирующий гомогенные продукты с высокой скоростью реакции и без использования кислотного pH и металлического катализа, будет способствовать дальнейшему применению smFRET в исследовании мембранных белковых комплексов. Кроме того, довольно длинный гидрофобный линкер (обычно с более чем 10 ковалентными связями) обычно находится между флуорофором и основной цепью белка. Гидрофобный линкер и флуорофор могут взаимодействовать с липидной мембраной, 33,34 , что затрудняет анализ данных.Следовательно, метод маркировки с помощью короткого линкера обогатит набор инструментов маркировки и может принести пользу измерению smFRET при определенных обстоятельствах. 35

В этой работе мы демонстрируем высокоэффективное и специфическое генетическое включение новой неприродной аминокислоты, 2-амино-3- (4-гидроселенофенил) пропановой кислоты или селенофенилаланина (SeF) (), посредством генетического расширение кода с последующей реакцией Se-click для конъюгирования флуорофора Bodipy593 с белками (и S2 ).По сравнению с другими методами конъюгации белков, реакция Se-click обладает рядом преимуществ, которые делают ее уникальной для smFRET: (1) SeF отличается только одним атомом от тирозина () и, следовательно, вносит минимальные возмущения в целевой белок; (2) константа скорости второго порядка реакции Se-click составляет 26,3 ± 0,4 M -1 с -1 , что в 3500 раз выше, чем у скорости реакции N -ацетилцистеин / Bodipy593, что позволяет быстрое и селективное мечение белков в присутствии нескольких открытых остатков цистеина; (3) после реакции Se-click Bodipy593 претерпевает батохромный сдвиг на 47 нм, что значительно снижает фоновый сигнал флуоресценции от непрореагировавшего флуоресцентного красителя; и (4) SeF-Bodipy593 имеет короткий линкер между белковым каркасом и хромофором, который может уменьшать взаимодействия между флуорофором и липидными бислоями и способствовать измерениям мембранных белков с помощью smFRET.Мы демонстрируем полезность реакции Se-click в измерении smFRET, помечая SeF-Bodipy593 и FlAsH как пару FRET для βarr1. Измерение smFRET с использованием этого точно дважды помеченного мутанта βarr1 показывает, что сайт связывания JNK3 βarr1, цепь β-1, претерпел конформационные изменения, связанные с C-краевым доменом, в ответ на активное участие фосфо-β2AR.

Характеристика реакции Se-click. (A) Реакция Se-click, применяемая для сайт-специфической маркировки белков.(B) Поглощение Bodipy593 показывает батохромный сдвиг на 47 нм после реакции Se-click. (C) Кинетическое измерение скорости реакции между SeF и Bodipy593. Во время реакции поглощение при 518 нм уменьшалось, а при 565 нм увеличивалось. Коэффициент экстинкции SeF-Bodipy593 больше, чем у Bodipy593, поэтому увеличение поглощения при 565 нм больше, чем уменьшение при 518 нм. Константа скорости второго порядка составляла 26,3 ± 0,4 M -1 с -1 , полученная путем подбора оптической плотности при 570 нм.Условия реакции: 20 мкМ Bodipy593 и 500 мкМ SeF (уменьшено на 1 мМ TCEP). (D) Кинетическое измерение скорости реакции между N -ацетилцистеином (NAC) и Bodipy593. Константа скорости составляла 0,0075 ± 0,0009 M -1 с -1 , полученная путем подбора оптической плотности при 560 нм (условия реакции: 20 мкМ Bodipy593 и 100 мМ NAC). Все эксперименты проводили в буфере HEPES (pH = 7,4, 200 мМ) с 10% CH 3 CN в качестве сорастворителя при комнатной температуре. Данные представлены как среднее ± s.Эм. (C) и (D) показывают репрезентативные данные трех независимых экспериментов.

Сайт-специфическое включение SeF в белок. (A) Схема сайт-специфического включения SeF в βarr1 посредством расширения генетического кода. Очищенный белок βarr1-T6SeF анализировали с помощью SDS-PAGE и LC-MS / MS спектроскопии (b-ионы относятся к N-концевым фрагментам пептида, а y-ионы представляют собой C-концевые фрагменты). (B) Дифракция рентгеновских лучей выявляет карман связывания субстрата в SeFRS для SeF.Гидрофобные остатки показаны желтыми полосками. Три ключевые мутации (Leu65Ser, Ile159Ser и Val164Ser) обозначены серыми полосками. (C) Структурные детерминанты для селективного распознавания анионов Se остатками кармана SeFRS. Соответствующие взаимодействия внутри Tyr-aaR показаны для сравнения. Зарядно-зарядовые взаимодействия и водородные связи, образующиеся между h42 и N158 в SeFRS с анионами Se, выделены синими и красными пунктирными линиями. (D) Селективность реакции Se-click на конъюгацию белков.Bodipy593 реагировал только с SeF, а FlAsH реагировал только с мотивом CCPGCC. (E) Период полураспада 150 мкМ Bodipy593 в присутствии βarr1-T6SeF (вверху) и βarr1-T6Cys (внизу) (pH = 7,4). (F) Флуоресцентное изображение в геле (внизу) и SDS-PAGE (вверху) βarr1 T6SeF после инкубации со 150 мкМ Bodipy593 в Трис-буфере (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH = 7,4) в течение 0-60 мин. (G) Химические структуры неприродной аминокислоты SeF и тирозина.

Результаты и обсуждение

Характеристика реакции Se-click

Мы решили синтезировать и генетически включить 2-амино-3- (4-гидроселенофенил) пропановую кислоту (SeF) из-за значительно пониженного p К a (5.9) и повышенная нуклеофильность боковой цепи бензолселенола 36 по сравнению с фенольной (p K a = 10,2) боковой цепи в тирозине. Кроме того, селен можно использовать для определения белковых структур с помощью метода фазирования с многоволновой аномальной дифракцией. 37 Затем мы исследовали константу скорости реакции второго порядка между SeF и Bodipy593 в 200 мМ буфере HEPES (pH = 7,4) с 10% CH 3 CN в качестве сорастворителя при комнатной температуре с использованием жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. (ЖХ-МС) и УФ-видимая спектроскопия.К нашему удовольствию, реакция протекала быстро и приводила к мгновенному изменению цвета за счет селеноатного замещения хлора в Bodipy593 (). Реакция нуклеофильного замещения между монохлорированными производными Bodipy и нуклеофилами основана на электронодонорной способности замещающих групп. Мы разработали зонд Bodipy593, тщательно выбрав амидный фрагмент, чья электронодонорная способность снижает электрофильность Bodipy593, так что алифатические тиолы реагируют с Bodipy593 с очень медленной скоростью.Однако из-за гораздо более высокой нуклеофильности фенилселенольной группы и ее более низкого pKa (5,9), чем у цистеина (8,5), SeF реагирует с Bodipy в 3500 раз быстрее, чем N -ацетил-цистеин в физиологических условиях ().

Следующим шагом было сравнение скорости реакции между SeF и N -ацетилцистеином. SeF реагировал с Bodipy593 очень быстро, с константой скорости второго порядка 26,3 ± 0,4 M −1 с −1 (), что сравнимо с реакцией щелчка азида-алкина, катализируемой Cu (i) (Таблица S2 ).Напротив, N -ацетилцистеин очень медленно реагировал с Bodipy593 (скорость реакции составляет 0,0075 ± 0,0009 M -1 с -1 ,), в 3500 раз медленнее, чем SeF. Более низкое значение p K a селенола и гораздо более высокая нуклеофильность селеноата по сравнению с тиолом в нейтральных условиях 38 могут объяснить это резкое преимущество скорости реакции. Эти результаты показывают, что если реакцию мечения белка проводят в буфере с pH 7,4, где представляющий интерес белок, меченный SeF (POI), и краситель Bodipy593 присутствуют в концентрациях 30 мкМ и 150 мкМ, соответственно, более 90% SeF- помеченные точки интереса маркируются в течение 15 мин, а менее 0.Обозначен 1% остатка цистеина (). Поскольку эта реакция проводится при нейтральном pH, не требуя какого-либо катализатора, и как белок, так и флуоресцентный краситель присутствуют только в низких концентрациях, эту реакцию биоконъюгации можно удобно применять для сайт-специфического мечения различных белковых комплексов, не беспокоясь ни о каком из белков. денатурация / осаждение в кислотном буфере или в присутствии медь / палладиевых катализаторов. Важно отметить, что максимумы возбуждения и испускания SeF-Bodipy593 были определены как 565 нм и 585 нм соответственно, что дает батохромный сдвиг примерно на 50 нм по сравнению с Bodipy593 (и S3 ).Поскольку фон флуоресценции, создаваемый неконъюгированным флуорофором (который обычно является гидрофобным и прилипает к гидрофобной поверхности белков или мембран), часто является большой проблемой для визуализации флуоресценции и измерения FRET, 7 этот резкий батохромный сдвиг представляет собой эффективный подход для различение свободного красителя Bodipy593 и меченого белка.

Включение SeF в белок посредством расширения генетического кода

Для избирательного включения SeF в определенные сайты в белках в E.coli , мутант Methanococcus jannaschii тРНК супрессора тирозиламбера ( Mj тРНК Tyr CUA ) / тирозил-тРНК синтетаза ( Mj TyrRS) пара эволюционировала в виде уникальной неприродной аминокислоты, в ответе к кондону TAG, но не к любой природной аминокислоте в ответ на кодон TAG. Библиотека Mj TyrRS, pBK-lib-jw1, была использована для скрининга активных и селективных мутантов на SeF, как сообщалось ранее. 22 Один клон Mj TyrRS возник после трех раундов положительной селекции и двух раундов отрицательной селекции, который вырос на 120 мкг / мл -1 хлорамфеникола в присутствии 1 мМ SeF, но только на 20 мкг / мл -1 левомицетина в его отсутствие. 39 Этот клон был назван SeFRS, и секвенирование выявило следующие мутации: Tyr32His, Leu65Ser, His70Asn и Asp158Asn. Структура SeFRS была решена с разрешением 1,7 Å для выяснения молекулярного механизма селективного распознавания SeF с помощью SeFRS (и таблица S3 ). Сложная структура SeF / SeFRS была смоделирована с помощью программы GLIDE 5.5 (стыковка лигандов с энергетикой на основе сетки) 40 (рис. S4 ). По сравнению с природной аминокислотой Tyr, атом Se в SeF имеет больший атомный радиус и несет отрицательный заряд при нейтральном pH.Чтобы вместить увеличенный объем SeF, три гидрофобных остатка (L65, I159 и V164) в связывающем кармане Mj -Tyr-aaRS дикого типа были заменены серинами в SeFRS, меньшая боковая цепь которых обеспечивает достаточное пространство. для размещения SeF (). Мутации D158N и Y32H способствовали взаимодействию между положительно заряженной боковой цепью аминокислоты и анионной боковой цепью в SeF (). Эти наблюдения обеспечили структурную основу для конкретного и эффективного включения SeF в SeFRS.Селективное распознавание SeF с помощью SeFRS является замечательной демонстрацией силы направленной эволюции, поскольку SeF является изостерой тирозина с заменой одного атома селена на атом кислорода тирозина ().

Двойное мечение βarr1 с помощью SeF-Bodipy593 и FlAsH

Затем мы использовали развитую SeFRS для включения SeF в βarr1. В присутствии SeFRS полноразмерный белок βarr1-T6SeF получали после очистки на колонке с аффинной меткой His-tag с выходом 1 мг / л -1 .Напротив, βarr1 дикого типа был получен с выходом 2 мг / л -1 (). Масс-спектрометрический анализ показал успешное включение SeF в желаемое положение Т6 в βarr1 с примерно 100% эффективностью после очистки (). Затем мы оценили реакцию Se-click на сайт-специфичную модификацию белков. К 30 мкМ βarr1-T6SeF в реакционном буфере (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH = 7,4) добавляли 150 мкМ Bodipy593, а затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.Выход модификации Se-click затем можно было контролировать с помощью флуоресцентной визуализации в геле (). Чтобы добиться специфического включения донора FRET для βarr1-T6SeF-Bodipy593, мы использовали технологию FlAsH для введения флуоресцентного красителя FlAsH-EDT 2 в мотив CCPGCC 41 , вставленный между сайтами βarr1 Leu191 / Met192. Включение FlAsH и Biodipy593 было подтверждено флуоресцентной эмиссией при 460 и 620 нм соответственно (). В отсутствие мотива CCPGCC не наблюдали эмиссии 460 нм, а в отсутствие включения SeF не наблюдали эмиссии 620 нм.Только в присутствии как мотива CCPGCC, так и включения SeF наблюдались эмиссии как 460, так и 620 нм. Эти результаты показывают, что FlAsH-EDT 2 избирательно связывается с сайтом CCPGCC, а Biodipy593 избирательно реагирует на SeF, демонстрируя взаимную ортогональность системы мечения белков FlAsH-EDT 2 / CCPGCC и Biodipy593 / SeF. Поскольку метод маркировки FlAsH-EDT 2 / CCPGCC уже хорошо зарекомендовал себя и широко применяется в исследованиях клеточной визуализации, 41 комбинация системы маркировки FlAsH-EDT 2 / CCPGCC и Biodipy593 / SeF должна обеспечить широко применимый инструментарий для исследований smFRET.

Характеристика SeF-Bodipy593 для smFRET

Затем мы сравнили фотохимические свойства SeF-Bodipy593 со свойствами Cy3, который является одним из самых популярных флуоресцентных красителей, используемых в smFRET. Наши результаты показывают, что SeF-Bodipy593 и Cy3 имеют сходные спектры поглощения и излучения и фотостабильность (, Таблица S4 ). Хотя SeF-Bodipy593 имеет гораздо более короткий линкер (3,4 Å, рис. S5 ), чем Cy3 (15 Å), анизотропия флуоресценции 42 указывает на то, что ориентационная свобода SeF-Bodipy593 и FlAsH аналогична таковой для Cy3 и Cy5, когда они маркируют белки (таблицы S5 и S6 ).Вместе мы покажем, что SeF-Bodipy593 подходит для приложений smFRET.

Применение smFRET на основе Se-click для регистрации конформационных изменений кальмодулина. (A) Сравнение скорости фотообесцвечивания между SeF-Bodipy593 и Cy3. Bodipy593 был помечен в положении F66SeF СаМ, а Cy3 был помечен в рибосомном белке L11. 42 (B) Наложение структуры СаМ без Ca 2+ (голубой, расширенная конформация, код PDB 1cfd) и структуры СаМ, связанной с Са 2+ (зеленая, компактная конформация, код PDB 1prw).(C) FRET-распределение CaM, свободного от Ca 2+ (вверху, номер следа FRET: 662) и СаМ 2+, связанного с (внизу, номер следа FRET: 1022). Эффективность FRET для СаМ, связанного с Ca 2+ , составляет 0,99 ± 0,01, но для СаМ, не содержащего Са 2+ , имеется два распределения FRET: E 1 = 0,59 ± 0,02 и E 2 = 0,99 ± 0,01. На верхней правой панели донор фотообесцвечивается при ∼7 с, что приводит к потере сигналов как донора, так и акцептора. На нижней правой панели акцептор фотообесцвечивается через ~ 6 с, что приводит к потере сигнала FRET и соответствующему увеличению донорного сигнала.Оба события перехода являются сигнатурами, подтверждающими, что происходит FRET.

Затем мы выбрали кальмодулин (CaM), 43 , конформация которого модулируется связыванием Ca 2+ , чтобы оценить применение реакции Se-click в smFRET. CaM был помечен путем экспрессии двойного мутанта CaM-F66SeF / M110C с последующей реакцией Se-click и реакцией цистеин-малеимид, чтобы получить дважды меченый белок CaM-66SeF-Bodipy593 / 110C-Cy5 44 (). Поскольку существует значительное перекрытие между спектром излучения флуоресценции SeF-Bodipy593 и спектром поглощения Cy5, SeF-Bodipy593 и Cy5 образуют хорошую пару FRET со значением R0, равным 43 Å (рис.S6 ). В эксперименте smFRET CaM-66SeF-Bodipy593 / 110C-Cy5 показывает единственную популяцию с высоким FRET (эффективность FRET: 0,99 ± 0,01) в присутствии 0,1 мМ Ca 2+ , но популяцию с низким FRET (эффективность FRET : 0,59 ± 0,02) появился, когда Ca 2+ был удален путем добавления EDTA (). Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями, 45 и демонстрируют полезность Se-click в измерениях smFRET.

Мониторинг конформационных изменений βarr1, активируемых V2Rpp посредством smFRET

Затем мы генетически включили SeF в функционально важные структурные мотивы βarr1, важного сигнального компонента, расположенного ниже по течению от большинства активаций рецепторов, связанных с G-белком. 46,47 Хотя недавние кристаллографические и ЯМР исследования раскрыли критические знания о структуре и функции аррестина, 16,48,49 одномолекулярная перспектива активации аррестина не была установлена. Одной из технических трудностей в изучении аррестина с помощью smFRET является наличие множества цистеинов, содержащихся в нативных аррестинах (7 для βarr1 и 8 для β-аррестина-2). Мутации этих цистеинов в Ala могут облегчить сайт-специфическое химическое мечение, но также значительно нарушают структурные и функциональные свойства аррестина.Поэтому, чтобы облегчить исследование активации βarr1 с помощью smFRET, мы использовали стратегию Se-click для введения SeF-Bodipy593 в конкретный сайт βarr1 в качестве акцептора FRET и уникального связывающего мотива (CCPGCC) для шпильки мышьяка флуоресцеина (FlAsH-EDT). 2 ) на βarr1 на С-конце (R418) в качестве донора FRET 50 (). Мы выбрали два функционально важных участка для инкорпорации SeF. Одним из сайтов был K157SeF, который является предполагаемым сайтом связывания NFκB, расположенным в N-концевой половине (N-домене) βarr1 и опосредующим регуляторную роль аррестина в воспалительных функциях ().Другим сайтом был T6SeF, который является предполагаемым сайтом связывания JNK3 в N-домене и играет важную роль во многих физиологических и патологических процессах, таких как клеточный цикл, репродукция, апоптоз и клеточный стресс (). 51 Правильность включения SeF была подтверждена с помощью SDS-PAGE, а мечение Bodipy593 было легко обнаружено с помощью визуализации геля (). Чтобы подтвердить, что генетическое включение SeF или меченых красителей в βarr1 не влияет на функциональную целостность βarr1, мы провели функциональное тестирование набора клатрина.Клатрин является ключевой сигнальной молекулой для интернализации рецептора и распознает активную конформацию аррестина. 52,53 Мы использовали полностью фосфорилированный карбоксиконцевой пептид из 29 аминокислот, полученный из рецептора вазопрессина V2 человека (V2Rpp), 52 , общий и широко используемый инструмент для стимуляции активной конформации аррестина, чтобы способствовать взаимодействию между клатрин и аррестин дикого типа или мутанты. Результаты показали, что мутации или меченые красители в βarr1 не влияли на активацию βarr1, индуцированную V2Rpp, в анализе связывания клатрина, что указывает на его функциональную целостность (рис.S7 ).

Применение реакции Se-click для мониторинга конформационных изменений βarr1, активируемых V2Rpp. (A) Схема сайтов мечения на βarr1. FlAsH является донором FRET, а Se-Bodipy593 является акцептором FRET. Двойной мутант K157SeF-Bodipy593 / R418-FlAsH исследует конформационные изменения между N-доменом и C-хвостом. Двойной мутант T6SeF-Bodipy593 / L191-FlAsH исследует конформационные изменения между N- и C-доменами. (B) Схема анализа smFRET βarr1, активированного V2Rpp.(C) Конформационный сдвиг популяции при добавлении V2Rpp, выявленный с помощью smFRET. Номера следов FRET для гистограмм эффективности smFRET сверху вниз: 909, 949, 1188, 1273 и 1167.

Два основных набора внутримолекулярных взаимодействий, включая трехэлементные (β-цепь I, α-спираль I и C конец аррестина) и взаимодействие полярного ядра (пять взаимодействующих заряженных остатков: D26, R169, D290, D297 и R393), как предполагалось, ограничивают аррестин в неактивной конформации.Существенная конформационная перестройка происходит, когда V2Rpp связывается с βarr1. В структурах βarr1, связанных с V2Rpp, N- и C-домены βarr1 претерпевают существенный поворот относительно друг друга с поворотом на 20 ° вокруг центральной оси, что сопровождается конформационными изменениями петли пальца, средней петли и петли лариата, проявляющих активную активность. состояние βarr1. 17,52 V2Rpp-индуцированная активация аррестина наблюдалась как в кристаллических структурах, так и в крио-ЭМ структурах. 48 Чтобы установить одномолекулярную перспективу активации аррестина, активацию арр1-K157SeF-Bodipy593 / R418-FlAsH, иммобилизованную конъюгированными с биотином His-антителами, исследовали с помощью визуализации арр1-K157SeF-Bodipy593 / R418-FlAsH (2).Активированный βarr1 был создан путем инкубации βarr1 и V2Rpp при комнатной температуре в течение 30 минут, и образец был проанализирован через smFRET (рис. S8A и B ). 17 В отсутствие V2Rpp с помощью smFRET были идентифицированы две популяции βarr1, которые включали состояние S1 с низким FRET (популяция 70%) с центром 0,42 ± 0,01 и состояние S2 с высоким FRET (популяция 30%) с центром в 0,68 ± 0,01 (). При увеличении концентрации V2Rpp максимальный объем S1 постепенно уменьшался, а максимальный объем S2 увеличивался ().Чтобы лучше стабилизировать состояние S2 и из-за трудности улавливания активной конформации βarr1 из-за значительной конформационной гибкости активного аррестина, использовали активное антитело Fab30, селективное по конформации аррестина. Fab30 широко используется в функциональных и структурных исследованиях аррестинов. 17 Образование активного комплекса V2Rpp-аррестин-Fab30 было подтверждено эксклюзионной хроматографией по размеру флуоресценции (FSEC) (рис. S9 ). Добавление Fab30 привело к дальнейшему увеличению популяции состояния с высоким FRET с центром в 0.68 ± 0,01 (рис. S10 ). Вместе эти результаты показывают, что состояние S2 с высоким FRET является активным состоянием арретина, тогда как состояние S1 с низким FRET является состоянием неактивного арретина.

Мониторинг тонких конформационных изменений комплекса βarr1 / GPCR

Наши недавние результаты показали, что цепь β-1 является одним из функциональных мотивов, опосредующих активацию JNK3 ниже β-аррестинов. 51 Таким образом, мы выбрали T6 в β-1 цепи аррестина и включили Bodipy593 в этот сайт, чтобы изучить, как связывание рецептора запускает конформационные изменения аррестина.Мы выбрали два сайта мечения для smFRET, сайт T6 и положение L191, относительное расстояние которых изменяется на 7 Å (с 63 Å до 70 Å) (таблица S7 ) во время процесса активации аррестина. 17 Чтобы провести прямое сравнение между нашей парой SeF-Bodipy593 / FlAsH FRET и широко используемой парой Cy3 / Cy5, два белка с двойной меткой, βarr1-T6SeF-Bodipy593 / L191FlAsH и βarr1-T6C / L191C- (Cy3 / Cy5), были созданы и подвергнуты измерению smFRET в присутствии и в отсутствие активированных GPCR.Чтобы отслеживать тонкие конформационные изменения комплекса βarr1 / GPCR, 54 мы использовали модель pp-β2V2R, который представляет собой химерный рецептор, образованный путем лигирования синтетического фосфорилированного пептида (V2Rpp) на карбоксильный конец молекулы на основе сортазы. β2AR, названный «pp-β2V2R» в ранее опубликованных исследованиях. 55 β2V2R сохраняет фармакологические свойства, идентичные таковым β2AR, но связывает βarr1 с более высоким сродством, чем β2AR дикого типа. Фосфорилированный C-концевой хвост V2R необходим для обеспечения взаимодействия и улучшения сродства между pp-β2V2R и βarr1 для структурных и функциональных исследований.Недавние исследования Cryo-EM с использованием этих химерных рецепторов с конъюгированным хвостом ppV2R предоставили важные структурные сведения об активных конформациях βarr1. 16,48 Меченый аррестин (1 нМ) инкубировали с pp-β2V2R (1 мкМ) и Fab30 (20 нМ), стимулированными ISO (изопретеренол, 100 мкМ) при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем образец был проанализирован через smFRET.

Интересно, что структурные изменения βarr1-T6C / L191C- (Cy3 / Cy5) не могут быть обнаружены до или после добавления ISO / pp-β 2 V2R / Fab30 (рис.S8C и D ), который в обоих случаях отображал только одно конформационное состояние (эффективность FRET E = 0,34 ± 0,02,), соответствующее расстоянию Cy3 / Cy5 67 ± 2 Å. Напротив, в то время как βarr1-T6SeF-Bodipy593 / L191FlAsH представлял одну популяцию с высоким FRET в неактивном состоянии, при добавлении ISO / pp-β 2 V2R / Fab30 возникли две популяции FRET, в том числе с высоким FRET, центрированным в состоянии S1. при 0,66 ± 0,02 (54 ± 1 Å между SeF-Bodipy593 и FlAsH) с коэффициентом заселенности 51% и полной шириной при значениях полувысоты 0.59 ± 0,05. Важно отметить, что мы наблюдали новое состояние S2 с низким FRET с центром при 0,25 ± 0,01 (72 ± 1 Å между SeF-Bodipy593 и FlAsH), с коэффициентом заселенности 49% и полной шириной на полувысоте (FWHM). 0,19 ± 0,01 (и S8E – G ). Таким образом, эти результаты показывают, что примерно половина сайта связывания JNK3 βarr1, цепь β-1, претерпела конформационные изменения по отношению к C-краевому домену (положение L191) в ответ на активное участие фосфо-β 2 AR. Наши результаты показывают, что пара SeF-Bodipy593 / FlAsH FRET имеет значительные преимущества перед популярной парой Cy3 / Cy5.Все семь цистеинов, экспонируемых на поверхности, должны быть мутированы для мечения пар Cy3 / Cy5 в βarr1-T6C / L191C- (Cy3 / Cy5), что может вносить значительные возмущения в βarr1 и ухудшать его способность претерпевать изменения конформации. Из-за внутреннего ограничения химии цистеина и малеимида βarr1-T6C / L191C- (Cy3 / Cy5) представляет собой смесь четырех компонентов: βarr1-T6C-Cy3 / L191C-Cy5, βarr1-T6C-Cy5 / L191C-Cy3, βarr1-T6C-Cy3 / L191C-Cy3 и βarr1-T6C-Cy5 / L191C-Cy5. Напротив, для получения дважды меченого βarr1-T6SeF-Bodpy593 / L191-FlAsH не требуется мутации эндогенного цистеинового остатка, и каждый флуоресцентный краситель был уникально помечен в определенном положении.Кроме того, короткий линкер между скелетом белка и красителем SeF-Bodipy593 / FlAsH, вероятно, уменьшит их АВ (и Таблица S8 ) и сузит распределение их относительных расстояний, 56 , что снижает их пространственные неопределенности и делает они более точные репортеры, чтобы указать небольшие дистанционные изменения в βarr1, чем пара красителей Cy3 / Cy5. Кроме того, короткий линкер может минимизировать взаимодействия между флуорофором и молекулами детергента в растворе. Вместе эти свойства могут объяснить наше наблюдение, что только двойной мутант βarr1-T6SeF-Bodpy593 / L191-FlAsH может успешно контролировать тонкие конформационные изменения βarr1 после активации.Вместе мы демонстрируем мощь реакции Se-click для точной и эффективной маркировки белков и ее применение в измерениях smFRET для фиксации незначительных изменений конформации.

Незначительные конформационные изменения, зафиксированные с помощью пары SeF-Bodipy593 / FlAsH FRET. (A) Доступные объемы (AV) различных красителей (Cy3, Cy5, SeF-Bodipy593 и FlAsH) 56 , созданные с использованием программного обеспечения для позиционирования и скрининга с ограничением FRET (FPS). (B) Распределения конформации βarr1-T6C / L191C- (Cy3 / Cy5), пунктирные линии r1 (черный) указывают средние значения FRET.(C) βarr1-T6SeF-Bodpy593 / L191-FlAsH до (верхняя панель) и после (нижняя панель) pp-β 2 добавления V2R, измеренное с помощью smFRET. Пунктирными линиями выделены средние значения FRET βarr1-T6SeF-Bodpy593 / L191-FlAsH до (R1, зеленый) и после (R2, синий) pp-β 2 V2R активации. R 0 Cy3 / Cy5 составляет 60 Å, а R 0 SeF-Bodipy593 / FlAsH составляет 60 Å. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. (B) и (C) показывают репрезентативные данные трех независимых экспериментов.Номера следов FRET для гистограмм эффективности smFRET: B (вверху): 1487, B (внизу): 1187, C (вверху): 3018, C (внизу): 2920.

Заключение

В заключение, мы разработали простой Реакция Se-click для сайт-специфической маркировки белков, которая особенно подходит для исследований smFRET. Генетически кодируемая неприродная аминокислота SeF отличается от тирозина только на один атом и должна иметь минимальное влияние на целевой белок. По сравнению с другими биоортогональными реакциями (Таблица S2 ), реакция Se-click генерирует гомогенно меченый белок, особенно важный для измерения smFRET, не требующий катализатора, кислого pH или светового облучения.Тем не менее, если должны были использоваться другие подходящие красители, электрофильность красителей должна быть точно отрегулирована, если интересующий белок содержит цистеины, чтобы гарантировать сайт-специфическую модификацию белка. После реакции SeF-Bodipy593 претерпевает батохромный сдвиг на 47 нм по сравнению с непрореагировавшим Bodipy593, что является преимуществом для разделения сигналов непрореагировавшего флуоресцентного красителя. По сравнению с популярным флуоресцентным красителем Cy3, SeF-Bodipy593 обладает аналогичными спектрами поглощения / излучения и сопоставимыми фотофизическими характеристиками.Вместе реакция Se-click служит удобным для пользователя методом сайт-специфической маркировки белков, что значительно облегчит применение smFRET к богатым цистеином белкам.

Используя реакцию Se-click, мы исследовали, как специфическая функциональная конформация аррестина распределялась во время задействования активного фосфорилированного GPCR. Стоит отметить, что аррестины и G-белки являются двумя важными нижестоящими эффекторами суперсемейства GPCR и составляют более 34% прямых мишеней клинически используемых лекарств. 57 Хотя недавние исследования использовали smFRET для обеспечения динамики GPCRs и их взаимодействий с G белками, 10,58 конформационная перспектива взаимодействия аррестина с GPCRs не была достигнута. При взаимодействии с GPCR, несущим фосфорилированный C-хвост и конформационно-селективное антитело Fab30, только половина сайта связывания JNK3 аррестина приобрела активную конформацию. Вероятно, что этой небольшой части активной конформации аррестина в этом специфическом сайте было достаточно для направления специфической нисходящей передачи сигналов конкретного GPCR, учитывая относительно высокую внутриклеточную концентрацию аррестина по сравнению с другими сигнальными белками в клетках.Эти наблюдения также согласуются с многофункциональными и быстрыми динамическими характеристиками аррестина. 10,58 В совокупности наши исследования показывают, что измерение smFRET, облегченное реакцией Se-click и расширением генетического кода, может представлять собой общий и легкий подход к исследованию динамического изменения конформации сигнальных комплексов мембранных белков. Здесь мы предоставили представление об одномолекулярном уровне активации определенного функционального сайта аррестина, мотива взаимодействия JNK3, в ответ на взаимодействие с фосфо-рецептором.Дополнительная информация о кинетике взаимодействия рецептор-аррестин, конформационном распределении комплексов рецептор-аррестин и других важных функциональных сайтах внутри аррестина будет исследована в будущем с использованием измерений smFRET с помощью реакции Se-click.

Доступность данных

Наборы данных, поддерживающие эту статью, были загружены как часть дополнительной информации. Кристаллографические данные для SeFRS депонированы в PBD под номером 7C5C.

Вклад авторов

J.-Y. W. разработал реакцию Se-click и ее применение в smFRET. Ж.-Й. W., J.-P. С. и К.-Л. К. задумал все измерения smFRET. М.-Дж. H. проводил эксперименты, включая синтез SeF и Boidpy593; характеристика динамики реакции Se-click и фотофизических свойств флуорофора, очистка и конъюгация СаМ и мутанта βarr1; очистка pp-β2V2R; smFRET измерение; и обработка данных. Q.-T. Н. выполнил кристаллизацию РНК-синтазы SeF и дифракцию рентгеновских лучей, мутант βarr1, очистку pp-β2V2R и Fab30, детекцию вестерн-блоттингом и измерение smFRET.К. С. и А.-П. Х. синтезировал соединение SeF. К.-Л. К. и М.-Ю. Y. выполнил измерение smFRET активации арретина 157SeF-Bodipy593 / 418FlAsH с помощью обработки данных V2Rpp и CaM. К.-Л. К. и Я.-Р. Y. выполнил обработку данных об активации мутанта βarr1 с помощью pp-β2V2R. X.-H. Л. и Ф. Ю. участвовали в разработке эксперимента. З.-Л. З. и К.-К. З. выполнил анализ кристаллов SeFRS и стыковку. К. Х. и Х.-З. Г. участвовал в динамическом анализе данных и вычислении R0. Ж.-Й. W., J.-П. С. и К.-Л. C. контролировал разработку и выполнение всего проекта. Ж.-Й. W., J.-P. С., К.-Л. К., М.-Дж. Х. и К.-Т. Х. написал рукопись.

Конфликты интересов

Конфликты отсутствуют.

Благодарности

Мы благодарим S. S. Zang и X.-H. Л. за помощь в определении спектров ЯМР; X. Ding и Z. Xie для измерения масс-спектрометрии белков; и Ж.-Х. L. для измерения анизотропии. Мы благодарим персонал лазерных линий BL19U1 в Национальном центре белковых наук в Шанхае и Шанхайском центре синхротронного излучения за помощь во время сбора данных.Мы благодарны за финансовую поддержку Национальной программе ключевых исследований и разработок Китая (2016YFA0501502, 2019YFA0

0), Национальному фонду естественных наук Китая (21750003 — JYW, 21503268 — M.-JH, 21922704 и 21877069 — CC, 31800716). , Медицинский проект Саньмин в Шэньчжэне (№ SZSM201811092), Грант Национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (81825022, J.-PS), Пекинский фонд естественных наук (Z200019, J.-PS) и провинциальный фонд Шаньдун. Фонд естественных наук (ZR2020ZD39 — J.-П. С.).

Примечания

Доступна дополнительная электронная информация (ESI). См. DOI: 10.1039 / d1sc02653d

Ссылки

  • Hill F. R. Monachino E. van Oijen A. M. Biochem. Soc. Пер. 2017; 45: 759–769. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ха Т. Эндерле Т. Оглетри Д. Ф. Чемла Д. С. Селвин П. Р. Вайс С. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1996; 93: 6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Робинсон А. ван Ойен А. М.Nat. Rev. Microbiol. 2013; 11: 303–315. [PubMed] [Google Scholar]
  • Манро Дж. Б. Вайана А. Санбонмацу К. Й. Бланшар С. С. Биополимеры. 2008. 89: 565–577. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Gambin Y. Deniz A. A. Mol. BioSyst. 2010; 6: 1540–1547. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Чжуанг X. Бартли Л. Э. Бэбкок Х. П. Рассел Р. Ха Т. Хершлаг Д. Чу С. Наука. 2000; 288: 2048–2051. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лернер Э. Кордес Т. Ингаргиола А.Альхадид Й. Чунг С. Мишале Х. Вайс С. Наука. 2018; 359: 288. [Google Scholar]
  • Алгар В. Р. Хильдебрандт Н. Фогель С. С. Мединц И. Л. Нат. Методы. 2019; 16: 815–829. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хелленкамп Б. Шмид С. Дорошенко О. Опанасюк О. Кухнемут Р. Адариани С. Р. Амброз Б. Азнаурян М. Барт А. Биркедал В. Боуэн ME Чен HT Кордес Т. Эйлерт Т. Фиджен C . Гебхардт К. Гоц М. Гуридис Г. Граттон Э. Ха Т. Хао П.Ю. Ханке К.А. Хартманн А. Хендрикс Дж. Хильдебрандт Л.Л. Хиршфельд В. Хольбейн Дж. Хуа Хубнер К. Г. Каллис Э. Капанидис А. Н. Ким Дж. Ю. Крайнер Г. Лэмб Д. ​​К. Ли Н. К. Лемке Е. А. Левеск Б. Левитус М. Макканн Дж. Дж. Нареди-Райнер Н. Неттелс Д. Нго Т. Цю Р. Ю. Робб NC Рокер К. Санабрия Х. Шлирф М. Шредер Т. Шулер Б. Зайдель Х. Штрайт Л. Турн Дж. Тиннефельд П. Тяги С. Ванденберк Н. Вера А. М. Венингер К. Р. Вунш Б. Янез-Ороско И. С. Михаэлис Дж. Зайдель CAM Craggs TD Hugel T. Nat. Методы. 2018; 15: 984. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Gregorio G.Г. Мазурил М. Хильгер Д. Терри Д. С. Джуэтт М. Чжао Х. Чжоу З. Перес-Агилар Дж. М. Хауге М. Матиасен С. Явич Дж. А. Вайнштейн Х. Кобилка Б. К. Бланшар С. С. Природа. 2017; 547: 68–73. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Каррико И. С. Карлсон Б. Л. Бертоцци К. Р. Нат. Chem. Биол. 2007; 3: 321–322. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лу М. Ма X. Кастильо-Менендес Л. Р. Горман Дж. Альсахафи Н. Эрмель У. Терри Д. С. Чемберс М. Пэн Д. Чжан Б. Чжоу Т. Рейхард Н. Ван К. Гровер Дж. .Р. Карман, Б. П. Гарднер, М. Р. Никич-Шпигель, И. Сугавара, А. Артос, Дж. Лемке, Э. А. Смит, А. Б. Фарзан, М. Абрамс, К. Манро, Дж. Б. Макдермотт, А. Б. Финци, А. Квонг, П. Д. Бланшар, С. К. Содроски, Дж. Г. Мотес, W. Nature. 2019; 568: 415–419. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Тиан Х. Фюрстенберг А. Хубер Т. Хим. Ред. 2017; 117: 186–245. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ламичхан Р. Лю Дж. Дж. Плевальчич Г. Уайт К. Л. ван дер Шанс Э. Катрич В. Стивенс Р. К. Вутрих К. Миллар Д.P. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2015; 112: 14254–14259. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Винглер Л. М. Элгети М. Хильгер Д. Латорака Н. Р. Лерх М. Т. Стаус Д. П. Дрор Р. О. Кобилка Б. К. Хаббелл В. Л. Лефковиц Р. Дж. Cell. 2019; 176: 468–478. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Хуанг В. Мазурил М. Цяньху К. Джанецко Дж. Иноуэ А. Като Х. Э. Робертсон М. Дж. Нгуен К. К. Гленн Дж. С. Скиниотис Г. Кобилка Б. К. Природа. 2020; 579: 303–308. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Шукла А.К. Манглик А. Крузе А. С. Сяо К. Х. Рейс Р. И. Ценг В. С. Стаус Д. П. Хильгер Д. Уйсал С. Хуанг Л. Ю. Падуч М. Трипати-Шукла П. Койде А. Койде С. Вайс В. И. Косякофф А. А. Кобилка Б. К. Лефковиц Р. Дж. Природа. 2013; 497: 137–141. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Milczek E. M. Chem. Ред. 2018; 118: 119–141. [PubMed] [Google Scholar]
  • Миллес С. Меркаданте Д. Арамбуру И. В. Дженсен М. Р. Бантерле Н. Кёлер К. Тьяги С. Кларк Дж. Шаммас С. Л. Блэкледж М. Тёртер Ф.Лемке Э. А. Cell. 2015; 163: 734–745. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ромей М. Г. Линь С. Ю. Мэтьюз И. И. Боксер С. Г. Наука. 2020; 367: 76–79. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Fredens J. Wang K. de la Torre D. Funke LFH Robertson WE Christova Y. Chia T. Schmied WH Dunkelmann DL Beranek V. Uttamapinant C. Llamazares AG Elliott TS Chin JW Nature. 2019; 569: 514–518. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Liu C.К. Шульц П. Г. Анну. Rev. Biochem. 2010; 79: 413–444. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ростовцев В. В. Грин Л. Г. Фокин В. В. Шарплесс К. Б. Энгью. Chem., Int. Эд. 2002; 41: 2596–2599. [PubMed] [Google Scholar]
  • Голд Б. Дадли Г. Б. Алабугин И. В. Дж. Ам. Chem. Soc. 2013; 135: 1558–1569. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лэнг К. Дэвис Л. Уоллес С. Махеш М. Кокс Д. Дж. Блэкман М. Л. Фокс Дж. М. Чин Дж. У. Дж. Ам. Chem. Soc. 2012; 134: 10317–10320. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Пласс Т.Миллес С. Келер К. Шимански Дж. Мюллер Р. Висслер М. Шульц К. Лемке Э. А. Ангью. Chem., Int. Эд. 2012; 51: 4166–4170. [PubMed] [Google Scholar]
  • Баалманн М. Нейзес Л. Битч С. Шнайдер Х. Девейд Л. Вертер П. Илькенханс Н. Вольфринг М. Циглер М. Дж. Вильгельм Дж. Колмар Х. Вомбахер Р. Ангью. Chem., Int. Эд. 2020; 59: 12885–12893. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Слеттен Э. М. Бертоцци К. Р. Энджью. Chem., Int. Эд. 2009. 48: 6974–6998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang C.Велборн М. Чжу Т. Ян Н. Дж. Сантос М. С. Ван Вурхис Т. Пентелут Б. Л. Нат. Chem. 2016; 8: 120–128. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Лин С. X. Ян X. Й. Цзя С. Уикс А. М. Хорнсби М. Ли П. С. Ничипорук Р. В. Иавароне А. Т. Уэллс Дж. А. Тосте Ф. Д. Чанг К. Дж. Наука. 2017; 355: 597–602. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Виноградова Е. В. Чжан С. Спокойны А. М. Пентелут Б. Л. Бухвальд С. Л. Природа. 2015; 526: 687–691. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Лим Р.К. В. Линь К. В соотв. Chem. Res. 2011; 44: 828–839. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Хьюз Л. Д. Роул Р. Дж. Боксер С. Г. PLoS One. 2014; 9: e87649. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Чжан З. Ф. Йомо Д. Градинару К. Биохим. Биофиз. Acta, Biomembr. 2017; 1859: 1242–1253. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лю Дж. Ченг Р. Ван Эпс Н. Ван Н. Моризуми Т. Оу В. Л. Клаузер П. К. Розовский С. Эрнст О. П. Ван Л. Дж. Ам. Chem. Soc. 2020; 142: 17057–17068. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Рейх Х.Дж. Коэн М. Л. J. Org. Chem. 1979; 44: 3148–3151. [Google Scholar]
  • Хендриксон В. А. Наука. 1991. 254: 51–58. [PubMed] [Google Scholar]
  • Муса Р. Дардашти Р. Н. Метанис Н. Энгью. Chem., Int. Эд. 2017; 56: 15818–15827. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ян Б. Ван Н. Шнир П. Д. Чжэн Ф. Чжу Х. Полицци Н. Ф. Иттуветил А. Сайкам В. ДеГрадо В. Ф. Ван К. Ван П. Г. Ван Л. Дж. Ам. Chem. Soc. 2019; 141: 7698–7703. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Friesner R.А. Бэнкс Дж. Л. Мерфи Р. Б. Халгрен Т. А. Кличич Дж. Дж. Майнц Д. Т. Репаски М. П. Нолл Э. Х. Шелли М. Перри Дж. К. Шоу Д. Э. Фрэнсис П. Шенкин П. С. Дж. Мед. Chem. 2004; 47: 1739–1749. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хоффманн К. Гайетта Г. Бунеманн М. Адамс С. Р. Обердорф-Маасс С. Бер Б. Вилардага Дж. П. Циен Р. Ю. Эйсман М. Х. Лозе М. Дж. Нат. Методы. 2005. 2: 171–176. [PubMed] [Google Scholar]
  • Чен С. Стивенс Б. Каур Дж. Кабрал Д. Лю Х. Ван Й. Чжан Х. Розенблюм Г. Смилански З.Гольдман Я. Э. Куперман Б. С. Мол. Клетка. 2011; 42: 367–377. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Девор М. С. Брейма А. Бенсон Д. Р. Джонсон К. К. Дж. Phys. Chem. Б. 2016; 120: 4357–4364. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Йилдиз А. Форки Дж. Н. Маккинни С. А. Ха Т. Гольдман Ю. Э. Селвин П. Р. Наука. 2003; 300: 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
  • Джонсон К. К. Биохимия. 2006. 45: 14233–14246. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang D.L. Sun YJ Ma ML Wang YJ Lin H. Li RR Liang ZL Gao Y. Yang Z. He DF Lin A. Mo H. Lu YJ Li MJ Kong W. Chung KY Yi F. Li JY Qin YY Li JX Thomsen ARB Kahsai AW Чен ZJ Xu ZG Лю MY Li DL Yu X. Sun JP Elife. 2018; 7: e33432. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Liu CH Gong Z. Liang ZL Liu ZX Yang F. Sun YJ Ma ML Wang YJ Ji CR Wang YH Wang MJ Cui FA Lin A. Zheng WS He DF Qu CX Xiao П. Лю С.Ю. Томсен А. Р. Б. Кэхилл Т. Дж. Кахсай А. В. Йи Ф. Сяо К. Х. Сюэ Т. Чжоу З. А. Ю. Х. Сун Дж. П. Нат. Commun. 2017; 8: 14335. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Стаус Д. П. Ху Х. Робертсон М. Дж. Кляйнхенц А. Л. В. Винглер Л. М. Капель В. Д. Латоррака Н. Р. Лефковиц Р. Дж. Скиниотис Г. Природа. 2020; 579: 297–302. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Вайнерт Т. Скопинцев П. Джеймс Д. Дворковски Ф. Панепуччи Э. Кекилли Д. Фуррер А. Брюнль С. Мус С. Озеров Д. Ногли П.Ван М. Стэндфус Дж. Наука. 2019; 365: 61–65. [PubMed] [Google Scholar]
  • Адамс С. Р. Цзянь Р. Ю. Нат. Protoc. 2008; 3: 1527–1534. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Park J. Y. Qu C. X. Li R. R. Yang F. Yu X. Tian Z. M. Shen Y. M. Cai B. Y. Yun Y. Sun J. P. Chung K. Y. Структура. 2019; 27: 1162–1170. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ян Ф. Ю X. Лю К. Цюй С. Х. Гонг З. Лю Х. Д. Ли Ф. Х. Ван Х. М. Хе Д. Ф. И Ф. Сун К. Тянь С. Л. Сяо К. Х. Ван Дж. Ю. Сун Дж.P. Nat. Commun. 2015; 6: 8202. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Латоррака Н. Р. Мазурил М. Холлингсворт С. А. Гейденрайх Ф. М. Суомивуори К. М. Бринтон К. Таунсенд Р. Дж. Л. Бувье М. Кобилка Б. К. Дрор Р. О. Cell. 2020; 183: 1813–1825. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Стаус Д. П. Винглер Л. М. Чой М. Дж. Пани Б. Манглик А. Круз А. К. Лефковиц Р. Дж. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2018; 115: 3834–3839. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ян Ф.Сяо П. Цюй C. X. Лю К. Ван Л. Ю. Лю З. Х. Он К. Т. Лю С. Сюй Дж. Ли Р. Р. Ли М. Дж. Ли К. Го X. З. Ян З. Ю. Хе Д. Ф. И Ф. Руан К. Шен Ю. М. Ю X. Сун Дж. П. Ван Дж. Ю. Нат. Chem. Биол. 2018; 14: 876–886. [PubMed] [Google Scholar]
  • Синдберт С. Калинин С. Нгуен Х. Кинцлер А. Клима Л. Баннварт В. Аппель Б. Мюллер С. Зайдель К. А. Дж. Ам. Chem. Soc. 2011; 133: 2463–2480. [PubMed] [Google Scholar]
  • Суомивуори К. М. Латоррака Н. Р. Винглер Л. М. Эйсманн С. Кинг М. К. Кляйнхенц А.Л. В. Скиба М. А. Стаус Д. П. Круз А. К. Лефковиц Р. Дж. Дрор Р. О. Наука. 2020; 367: 881–887. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Сунгкаворн Т. Джобин М. Л. Бурнеки К. Верон А. Лозе М. Дж. Калебиро Д. Природа. 2017; 550: 543–547. [PubMed] [Google Scholar]

Как читать гитарные таблицы аккордов

Как начинающий гитарист, вы в первую очередь научитесь играть аккорды. Гитарные аккорды состоят из 2 или более одновременно играемых струн.

В этом видеоуроке вы научитесь читать гитарные аккорды . Таблицы аккордов — это способ, которым вы научитесь играть аккорды на гитаре как начинающий гитарист.

Как читать схемы аккордов для гитары

(видео-урок игры на гитаре)

Этот урок о том, как читать гитарные таблицы аккордов, взят из моего курса «Мастерство ритм-гитары». Если вам нужен систематический способ пополнить свой словарный запас основных гитарных аккордов и научиться играть как профессионал… проверьте это.

Чтение таблиц гитарных аккордов

Гитарная диаграмма аккордов — это изображение части грифа и грифа, если она стоит вертикально. Вертикальные линии — это струны, а горизонтальные линии — лада.

Крайняя справа вертикальная линия — это первая струна, а крайняя слева — шестая струна. Если верхняя горизонтальная линия толще, то это гайка гитары. (см. части гитары) Затем следующая нижняя горизонтальная линия — это такта 1-го лада, а следующая нижняя — 2-я и так далее.

Точки указывают, куда положить пальцы, а числа под таблицей аккордов указывают, какие пальцы использовать. 0 означает открытую строку. X означает либо не проигрывать струну, либо отключать ее. Вскоре мы поговорим подробнее об отключении звука для строки. Если есть буква T, вы играете эту ноту большим пальцем.

  • правая вертикальная линия представляет 1-ю струну
  • левая вертикальная линия представляет шестую строку
  • горизонтальные линии представляют лады
  • пространство между горизонтальными линиями представляют лады
  • точки говорят вам, куда девать пальцы
  • цифры внизу говорят вам, какой палец использовать
  • , если есть 0, откройте эту струну
  • X означает не играть или отключить эту строку
  • T означает играть эту ноту большим пальцем

Числа пальцев в гитарной таблице аккордов

На разных инструментах используются разные системы нумерации пальцев.На гитаре указательный палец — это 1-й палец, а мизинец — 4-й. Ваш большой палец просто обозначен буквой T. Если вы также играете на пианино, это может немного сбить с толку, потому что большой палец считается вашим 1-м пальцем, а мизинец — 5-м пальцем.

Нужна помощь с аккордами для гитары? … Или вы застряли в тупике? Ознакомьтесь с моим курсом мастерства на ритм-гитаре.

Washburn Guitars

Электроника | Техническое обслуживание и техническая поддержка | Гарантия | Старые модели

ОБЩИЕ ЧАВО

Доступны ли стандартные модели Washburn с индивидуальными опциями?
Нет, стандартные модели производятся только в соответствии со спецификациями каталога, а специальные опции в настоящее время недоступны.

Могу ли я купить инструмент напрямую в Washburn?
Гитары Washburn можно приобрести только у авторизованных дилеров. Чтобы получить полный список наших официальных дилеров Washburn, посетите наш каталог дилеров.

Доступны ли инструменты Washburn в левом исполнении?
Некоторые модели выпускаются в левосторонней комплектации. Пожалуйста, свяжитесь с дилером Washburn, чтобы узнать о наличии.

Сколько стоит мой Уошберн?
Washburn не оценивает и не оценивает подержанные инструменты, так как есть много соображений в отношении ценообразования, которые мы не можем контролировать.Условия местного рынка, состояние и т. Д. Могут играть решающую роль. Поскольку Washburn не покупает бывшие в употреблении инструменты, мы не отслеживаем эту информацию и не можем ответить на этот тип запросов. Чтобы получить профессиональную оценку инструмента, мы бы порекомендовали хороших людей из Gruhn (Gruhn.com) или любого продавца, который занимается покупкой / торговлей подержанными инструментами.

Как получить каталог?
Наш веб-сайт — отличный (и экологически чистый) способ ознакомиться с нашими текущими предложениями.Если вам нужна распечатанная копия каталога, напишите нам по адресу:

U.S. Music
1649 Barclay Blvd.
Buffalo Grove, IL 60089

У меня не было руководства пользователя для своего инструмента. Как я могу его получить?
В настоящее время нет специальных руководств для инструментов Washburn. Подробную информацию о надлежащем уходе и техническом обслуживании можно найти здесь или в гарантийных документах. Учебные материалы по работе с инструментами также доступны там, где инструменты продаются, и подробно освещают более подробные сведения об уходе и техническом обслуживании.

Где я могу получить футляр для инструмента Washburn?
Washburn предлагает ящики только для некоторых инструментов, которые в настоящее время производятся. Смотрите их здесь. Их можно приобрести по специальному заказу у местного дилера Washburn. Существует также множество сторонних производителей футляров для инструментов. Мы рекомендуем принести вашу гитару в ваш любимый местный музыкальный магазин для правильной установки футляра.

Если требуются измерения размеров, мы рекомендуем измерить прибор.Washburn не может предоставить конкретные измерения размеров на старых приборах.

Как я могу датировать / идентифицировать мой прибор Washburn?
В течение многих лет Washburn использовал множество форматов серийных номеров, длина которых варьировалась от 4 до 12 символов. Год выпуска можно определить по нескольким первым цифрам в серийном номере.

Первые две цифры или первая цифра обычно используются для обозначения года выпуска.

Например, 8

7 означает, что инструмент был произведен в 1989, 1988 или 1998 годах.Вы можете подтвердить год изготовления, посетив справочные прайс-листы / каталоги наших гитарных архивов.

Инструменты с серийными номерами, состоящими из 5 или более символов, относятся к концу 1980–2000-х годов.
Инструменты с серийными номерами, состоящими из 5 или менее символов, обычно относятся к 1980-м годам.
Приборы с серийными номерами, состоящими из 4 символов, 1970-х — начала 1980-х годов.
Для приборов, произведенных после 2010 года, обычно первые 4 цифры могут указывать на год выпуска.

Нет информации о серийном номере или возможности отслеживания для моделей до 1978 года.

Если у прибора нет серийного номера, скорее всего, это заводской прототип или образец, и невозможно определить его точный возраст. Мы рекомендуем посетить наши гитарные архивы и просмотреть годовые каталоги, чтобы найти наиболее близкое к ним совпадение.

Washburn ведет ограниченные производственные записи. Washburn может идентифицировать инструменты только по электронной почте, с четкой цифровой фотографией и серийным номером.Мы не можем гарантировать, что сможем датировать ваш инструмент.

Как узнать цены на новые гитары?
Чтобы узнать цены, обратитесь к своему дилеру или международному дистрибьютору в вашей стране.

Как получить запасные части для моего инструмента?
Washburn старается использовать как можно больше стандартизированных деталей инструментов, чтобы упростить обслуживание на месте. Большинство технических специалистов, способных выполнять ремонтные работы, имеют легкий доступ к ним через различных дилеров / поставщиков запчастей.

Тем, кто занимается своими руками, мы настоятельно рекомендуем любого из следующих дилеров послепродажного обслуживания гитарных запчастей, так как они предлагают самый широкий ассортимент и широкий ассортимент.

Stewmac.com
Guitarfetish.com
Wdmusicproducts.com

Обратите внимание, что они не могут идентифицировать партию по модели гитары, а только по стилю / размеру той части, которую вы ищете. Большинство специалистов по обслуживанию на местах имеют стандартные детали, которые можно легко приобрести у вышеуказанных поставщиков. Если деталь, которую вы ищете, является специализированной и уникальной для гитар Washburn, обратитесь в службу поддержки клиентов Washburn.Нам может потребоваться фотография неисправной детали, чтобы гарантировать ее доступность.

Как я могу узнать статус моего заказа, который был размещен через авторизованного дилера Washburn?
Только авторизованный дилер Washburn может сообщить вам статус вашего заказа. Обратитесь к своему авторизованному дилеру, поскольку Washburn не может сообщить статус отдельных заказов или поставок инструментов.

Я живу в США. Как найти ближайшего дилера Washburn?
Чтобы найти ближайшего к вам авторизованного продавца, воспользуйтесь нашей системой поиска дилеров.

Я продавец приборов и хотел бы взять с собой ваш продукт!
Отлично! Отправьте нам запрос со страницы обслуживания клиентов и расскажите о своем магазине.

Как я могу получить одобрение Washburn?
Есть очень специфические требования, которые необходимо рассмотреть для одобрения. Отправьте нам электронное письмо для прессы здесь.


ЭЛЕКТРОНИКА

Я слышу жужжащий / гудящий звук, но он исчезает, когда я касаюсь громкости.Это нормально?
Да. Когда вы касаетесь струн или бриджа на электрогитаре, ваше тело действует как земля, и цепь становится тише.

Что такое пикапы Duncan USM?
Звукосниматели Duncan USM разработаны инженерами Сеймура Дункана в Санта-Барбаре в соответствии с требованиями USM и доступны только для некоторых гитар Washburn и Parker. В настоящее время звукосниматели Duncan USM доступны с двумя голосами: HB-103 и HB-102. HB-103 — это высокопроизводительный хамбакер, предназначенный для исполнителей хэви-рока, металла, трэша и панка.Это чрезвычайно агрессивный звукосниматель с мощной катушкой намотки и керамическими магнитами, но он сохранит чистоту звука от струны к струне даже при жесткой атаке тяжелых музыкантов, исполняющих свои гитары концерт за концертом. Более подробная информация доступна здесь.

Что такое V.C.C. система?
Уникальная система постукивания катушек, которая позволяет игрокам постепенно смешивать гудение и звук одиночной катушки без гула, обычно связанного с одиночными катушками, аналогично концепции диммерного переключателя, но связанного с тоном гитары.Поверните ручку VCC вверх для получения традиционного звука хамбакера; уменьшите его для характера одиночной катушки. Не требует предусилителя или батарей. Он был доступен на некоторых моделях Original Idol и доступен на новых моделях Idol.


ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБСЛУЖИВАНИЕ

Как лучше всего ухаживать за моим акустическим инструментом Washburn?
Акустические гитары чувствительны к влажности и температурным условиям.Чрезмерная сухость, жара и холод могут серьезно повредить акустический инструмент.

Чрезмерная сухость приведет к усадке / сжатию и растрескиванию инструмента. Владельцам Washburn, проживающим в сухом климате, мы рекомендуем хранить инструмент в качественном жестком футляре с небольшим увлажнителем для гитары. Увлажнители для гитары — это относительно недорогие аксессуары, которые можно приобрести в местном магазине музыкальных инструментов или в Интернете.

Идеально для хранения вашей акустической гитары в среде с постоянной относительной влажностью 45–55% и температурой 72–77 градусов по Фаренгейту.Не подвергайте инструмент резким перепадам температуры, так как это может привести к растрескиванию отделки и дерева.

Не вешайте и не храните гитару возле окон, под прямыми солнечными лучами или в машине.

Гарантия не распространяется на трещины и коробление, вызванные сухостью и чрезмерным температурным воздействием.

Какие струны вы используете на заводе?

Все инструменты Washburn поставляются с завода с тонкими струнами. Современные модели украшены струнами D’Addario.Ниже приводится руководство по калибрам струн, которые мы используем на заводе:

Электрогитара
Light Gauge
.009 High E
.011 B
.016 G
.024 D
.032 A
.042 Low E
Акустическая гитара
Light Gauge
.012 High E
.016 B
.024 G
.032 D
.042 A
.053 Low E
The Rover
Extra Light Gauge
. Высокий E
.014 B
.023 G
.030 D
.039 A
.047 Low E
Классическая гитара
Нормальное напряжение
.028 High E
.0322 B
.0403 G
.029 D
.035 A
.043 Low E
Electric Bass
Light Gauge
.045 G
.065 D
.085 A
.105 A
Acoustic Bass
Light Gauge
.045 G
.065 D
.080 A
.100 A
0003 Мандолина Light Gauge
.011 High E
.011 High E
.015 A
.015 A
.026 D
.026 D
.036 G
.036 G
Banjo
.009 D
.011 B
.013 G
.020 C
.009 G

Мне нужно общее обслуживание моей гитары. Где я могу получить информацию?
В Интернете есть множество бесплатных ресурсов, которые могут помочь вам в настройке и обслуживании ваших инструментов. Большинство гитарных магазинов также имеют под рукой техников, которые более чем способны выполнить настройку / обслуживание инструментов.

Могу ли я отправить свою гитару в Washburn для обслуживания, ремонта или модернизации?
Нет, магазин Washburn не выполняет послепродажные работы. Магазин Washburn выполняет только гарантийный ремонт (при условии, что в вашем регионе нет заводского авторизованного сервисного центра).

Где я могу отремонтировать мой инструмент Washburn?
Если ваш Washburn требует гарантийного ремонта, мы рекомендуем обратиться по месту покупки (если ваш прибор был приобретен на месте).Если на ваш инструмент не распространяется гарантия, мы рекомендуем обратиться в местную мастерскую по ремонту инструментов.

Как часто нужно менять строки?
Washburn рекомендует менять струны каждые 3-4 месяца, чтобы сохранить наилучший звук и удобство игры. Чрезмерная игра может потребовать более частой смены струны в случае ее поломки или окисления.

Могу я получить электрическую схему?
В большинстве моделей Washburn используются стандартные схемы подключения. Отличный ресурс для электрических схем можно найти на сайте guitarelectronics.com. Washburn имеет ограниченные ссылки на старые модели и, к сожалению, не может предоставить конкретные электрические схемы для некоторых старых моделей.

Как узнать, нужна ли регулировка шеи?
Обычно, если гриф не отрегулирован, гудение струны будет более заметно либо в центре грифа, либо около первых нескольких ладов. Есть много факторов, которые могут быть источником шума из-за струн, но это хорошее место, на которое стоит обратить внимание в первую очередь.

Регулировку анкерного стержня обычно рекомендуется выполнять только квалифицированным специалистом по ремонту.Минимальная настройка — ключ к настройке шейки инструмента. Разрушение анкерного стержня (приложение слишком большого усилия) и / или снятие анкерного стержня (с использованием шестигранного ключа неподходящего размера и / или приложения слишком большого усилия) не считается дефектом производителя и не покрывается какой-либо гарантией. Разрушение и / или снятие анкерного стержня ваших инструментов приведет к аннулированию гарантии.

Я сломал себе шею. Можешь починить или продать мне новую шею? Где мне это исправить?
Washburn в настоящее время не предлагает замены шейки.Если ваша шея треснула из-за негарантийной проблемы (ударное повреждение или повреждение из-за неправильной настройки и / или ненадлежащего хранения инструмента), мы рекомендуем найти квалифицированного специалиста по ремонту в вашем районе, чтобы починить существующую шею.


ГАРАНТИЯ

На что распространяется моя гарантия?
Гарантия Washburn обеспечивает покрытие производственных дефектов в течение всего срока службы первоначального покупателя. Обратите внимание, что большинство недостатков или проблем, связанных с производством вашего инструмента, обычно возникает или становится очевидным на ранней стадии.Если вы обнаружите или подозреваете какие-либо проблемы с вашим инструментом, пожалуйста, как можно скорее свяжитесь либо с дилером, у которого он был приобретен, либо с нами. Если вы являетесь международным клиентом, обратитесь к своему дилеру или дистрибьютору Washburn в вашей стране. Список наших международных дистрибьюторов см. В нашем каталоге дилеров.

На тюнинговые машины, оборудование и электронику распространяется гарантия сроком на один год с даты покупки. Washburn оставляет за собой право использовать или предлагать доступные в настоящее время запасные части во время запроса на обслуживание.

Подтверждение покупки требуется для всех гарантийных услуг. Гарантия не распространяется на повреждения, вызванные падением, царапинами, разбиванием, погружением со сцены, а также повреждение из-за неправильного хранения или ухода за инструментом.

Washburn оставляет за собой право отремонтировать или заменить прибор по нашему собственному усмотрению. Если ваша конкретная модель больше не производится, Washburn предложит доступную в настоящее время аналогичную модель в качестве варианта замены.

Где я могу получить гарантийное обслуживание?
Если ваш инструмент Washburn был приобретен на месте и находится на гарантии, мы рекомендуем обратиться к дилеру, в котором он был приобретен.Если ваш прибор не может быть отремонтирован по гарантии на месте, свяжитесь с нами со страницы обслуживания клиентов.

Номер разрешения на возврат требуется для любого ремонта, выполняемого в Washburn. Чтобы получить номер разрешения на возврат, свяжитесь с Washburn на нашей странице обслуживания клиентов.

Я не проживаю в США и нуждаюсь в обслуживании или ремонте прибора.
По всем вопросам гарантии обращайтесь к дистрибьютору Washburn в вашем регионе.

Инструменты, приобретенные не через сеть дистрибьюторов Washburn, не покрываются гарантией в вашем регионе.


СТАРЫЕ МОДЕЛИ, НЕ НАХОДЯЩИЕСЯ НА ПРОИЗВОДСТВЕ

Что такое мой прибор и сколько он стоит?
Washburn может предоставить только текущий MSRP новых инструментов, которые в настоящее время производятся. Текущая рыночная стоимость более старого инструмента зависит от различных рыночных условий. Мы не можем оценить этот тип стоимости для более старого инструмента.

Чтобы идентифицировать ваш инструмент Washburn, мы рекомендуем посетить наш гитарный архив.Если вы не найдете там свой инструмент, пришлите нам по электронной почте несколько четких цифровых фотографий вашего инструмента вместе с серийным номером. Пожалуйста, дайте 7 рабочих дней для запросов на идентификацию инструмента. Из-за ограниченного количества исторических ссылок Washburn не может гарантировать запрос идентификации инструмента.

Если у вашего прибора нет серийного номера, прибор может быть датирован или идентифицирован как , а не .

В каком году был изготовлен мой прибор?

На протяжении многих лет компания Washburn использовала множество форматов серийных номеров, длина которых варьировалась от 4 до 12 символов.Год изготовления всегда можно определить по нескольким первым цифрам в серийном номере.

Первые две цифры или первая цифра обычно используются для обозначения года выпуска.

Например, 8

7 означает, что инструмент был произведен в 1989, 1988 или 1998 годах. Вы можете подтвердить год изготовления, посетив справочные прайс-листы / каталоги наших гитарных архивов.

Инструменты с серийными номерами, состоящими из 5 или более символов, относятся к концу 1980–2000-х годов.
Инструменты с серийными номерами, состоящими из 5 или менее символов, обычно относятся к 1980-м годам.
Приборы с серийными номерами, состоящими из 4 символов, 1970-х — начала 1980-х годов.
Для приборов, произведенных после 2010 года, обычно первые 4 цифры могут указывать на год выпуска.
Нет информации о серийном номере или возможности отслеживания для моделей до 1978 года.

Если у прибора нет серийного номера, скорее всего, это заводской прототип или образец, и невозможно определить его точный возраст.Мы рекомендуем посетить наши гитарные архивы и просмотреть годовые каталоги, чтобы найти наиболее близкое к ним совпадение.

У меня винтажный Вашберн (1880-е-1978). Что вы можете мне об этом рассказать?
Нет никаких записей или упоминаний об этой ранней эпохе Washburn для нашей службы поддержки клиентов. Мы не можем идентифицировать или оценивать инструменты этой ранней эпохи.

Как я могу узнать, делаете ли вы определенную гитару?
В производстве находятся только гитары из нашего текущего каталога и веб-сайта.

Одномолекулярный FRET и конформационный анализ бета-аррестина-1 посредством расширения генетического кода и реакции Se-click

* Соответствующие авторы

а Тяньцзиньский институт промышленной биотехнологии Китайской академии наук, экономическая зона аэропорта Тяньцзинь, Тяньцзинь, Китай

б Ключевая лаборатория экспериментальной тератологии Министерства образования и Департамента биохимии и молекулярной биологии, Школа основных медицинских наук, Медицинский колледж Челоо, Университет Шаньдун, 44 Wenhua Xi Road, Цзинань, Шаньдун, Китай
Электронная почта: sunjinpeng @ sdu.edu.cn

c Школа наук о жизни, Цинхуа-Пекинский объединенный центр наук о жизни, Пекинский инновационный центр структурной биологии, Университет Цинхуа, район Хайдянь, Пекин, Китай
Электронная почта: chunlai @ tsinghua.edu.cn

г Департамент физиологии и патофизиологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Пекинский университет, Ключевая лаборатория молекулярно-сердечно-сосудистых исследований, Министерство образования, округ Хайдянь, Пекин, Китай

e Институт биофизики Китайской академии наук, район Чаоян, Пекин, Китай

f Университет Китайской академии наук (UCAS), район Шицзиншань, Пекин, Китай

г Шэньчжэньский институт трансфузионной медицины, Шэньчжэньский центр крови, район Футянь, Шэньчжэнь, Китай

ч Школа наук о жизни, Университет науки и технологий Китая, район Баохэ, Аньхой, Китай

i Школа биологических наук и технологий, Университет Цзинань, Цзинань, Шаньдун, Китай

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Табулатура | MusicXML 4.0

MusicXML 4.0> Учебник> Табулатура

Табулатурные обозначения служат прямым ориентиром для струн и ладов, используемых для воспроизведения музыки на гитаре или другом ладовом инструменте, часто за счет точной ритмической информации.В MusicXML эта ритмическая информация должна быть указана, хотя отображение, вероятно, будет скрыто на вкладке. Основные вещи, которые необходимо добавить, — это информация о ладе и струнах, подробности о том, как настраиваются струны, и методы, характерные для гитар и других связанных инструментов.

Лад и струна

Вот простой пример гитарной партии с одним тактом, который мы будем использовать для иллюстрации основных функций табулатуры MusicXML, используя стандартную настройку 6-струнной гитары:

Информация о ладах и струнах, необходимая для создания табулатур для гитары и других струнных инструментов, обрабатывается так же, как и технические указания для других инструментов, таких как аппликатуры фортепиано и смычки скрипки.Элемент содержит эти типы обозначений, а два из его составляющих элемента представляют собой и примечания. Нумерация ладов начинается с 0 для открытой струны. Струны нумеруются, начиная с 1 для самой высокой струны на инструменте.

Лад и струна для первой ноты в этом примере представлены как:

 <технический>
             3 
             5 
           

Настройка струн

Элемент может включать элемент для определения деталей персонала табуляции.Элемент определяет количество строк в нотоносце табулатуры, обычно по одной на каждую строку. Настройки персонала описываются элементами и . TAB — одно из значений, доступных для элементов . Атрибут print-object элементов и

Вкладка в нашем примере начинается со следующих атрибутов:

 <атрибуты>
         2 
        
           0 
           основной 
        
        
        
           TAB 
           5 
        
        <информация о персонале>
           6 
          
             E 
             2 
          
          
             A 
             2 
          
          
             D 
             3 
          
          
             G 
             3 
          
          
             B 
             3 
          
          
             E 
             4 
          
        
       

Отбойники и отбойники

Современная гитарная нотация содержит много элементов, идиоматических для гитары (и, в частности, для электрогитары).В то время как такие элементы, как и периодически поддерживаются в текущем программном обеспечении MusicXML, элементы и поддерживаются во многих приложениях.

Эти элементы представлены как технические указания, которые часто сопровождаются пометкой. В первой половине такта одиночный удар идет вместе с одиночным пятном:

 <примечание default-x = "82">
        
           В 
           4 
        
         2 
         1 
         квартал 
         нет 
        <заметки>
          <технический>
             H 
             3 
             5 
          
          
        
      
      <примечание default-x = "177">
        
           D 
           4 
        
         2 
         1 
         квартал 
         нет 
        <заметки>
          <технический>
             3 
             7 
            
          
          
        
       

Но во второй половине такта одно пятно сочетается с двумя отрывками:

 <примечание default-x = "272">
        
           E 
           -1 
           4 
        
         1 
         1 
         восьмой 
         нет 
        <заметки>
          <технический>
             3 
             8 
             P 
          
          
        
      
      <примечание default-x = "330">
        
           D 
           4 
        
         1 
         1 
         восьмой 
         нет 
        <заметки>
          <технический>
             3 
             7 
            
             P 
          
        
      
      <примечание default-x = "389">
        
           В 
           4 
        
         2 
         1 
         квартал 
         нет 
        <заметки>
          <технический>
            
             3 
             5 
          
          
        
       

Далее: Перкуссия

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *