Что входит в комплектацию норма лада гранта: Лада Гранта Норма — цена, фото, отзывы Lada Granta в комплектации Норма

Содержание

Комплектация норма Лада Гранта что в неё входит

Отечественный автопром все время очень много внимания уделял процессу сборки автомобилей, подчеркивая, тем самым, уровень качества и надежности машины. При этом, каждая модификация могла отличатся как по двигателю, так и по обустройству интерьера и наличию целесообразных модулей, с кондиционером или без него.

Так, пользующаяся спросом на рынке Lada Granta и ее комплектация Норма, является неплохим примером правильного сочетания потраченных средств и приобретенных в результате возможностей. Она выступает в качестве золотой середины между дорогой люксовой версией и базовой моделью этой линейки. И многим потенциальным покупателям интересно узнать про комплектацию и характеристики, а так же что входит и что собой представляет наиболее популярная комплектация Норма непосредственно на авто Лада Гранта.

Возможности мотора Лада Гранта комплектации Норма

Основная разница заключается в количестве лошадей под капотом и конструктивных особенностях мотора.

На вариант Норма от Лада Гранта устанавливается два вида ДВС, работающих на бензине с объемов в 1,6 л и 4-мя или 8-ю цилиндрами соответственно.

Первый мотор выдает 87 лошадок, а второй – 106 л.с. В обоих силовых агрегатах реализованы уникальные конструктивные решения, в частности, в механизме поршневой группы. Поэтому повысилась слаженность и точность работы всей системы в целом. Вдобавок, уменьшилась и масса механизма. Какая комплектация, характеристики зависят от этого. Что входит в одну комплектацию, в другой может отсутствовать.

Присущи и отличительные моменты для автомобилей от АвтоВАЗа. Так, Лада Гранта востребованная комплектация Норма и Норма версии Приора различаются по мощности. Вторая развивает 98 конских сил, что превосходит показатель первой. На Lada Granta может быть установлена как механическая трансмиссия, так и автомат. Версия может включать в себя кондиционер, а может и не включать.
Восьмицилиндровый двигатель лады работает только с автоматом. Последние модификации оснащены уже трансмиссией роботом.

Набор до сотни на четырех цилиндрах машина производит за 11,8 секунды. Наличие подобного разгона позволяет уверенно себя чувствовать и в условиях городских улиц, и на загородных трассах. Крейсерская скорость может достигать 167 км/ч. Это и объясняет столь высокий интерес к Лада Гранта у автомобилистов, которым по нраву надежный и качественный автомобиль. И самое интересное, что входит в комплектацию Норма.

Оборудование салона Лада Гранта

При покупке Lada Granta непосредственно в комплектации Норма от АвтоВАЗа потребитель обращает внимание на оснащение и присутствие элементов комфорта салона. Эта комплектация характеристики, которой могут отличаться, в зависимости от пожелания клиента идет или с кондиционером, или без него. Наличие впереди модернизированных подъемников стекол при помощи нажатия кнопки отличает версию Норма от Стандарта.

Рулевое колесо использует усилитель. Что дает возможность изменять положение рулевой колонки, меняя угол наклона. Такое оснащение позволяет улучшить эргономические показатели для водителя, путем настройки основных устройств управления машиной, согласно индивидуальным параметрам.

Лада Гранта лифтбек комплектация Норма

Апгрейденная модель Лады Гранта оснащена также хорошей сплит-системой салона. Что создает комфортные условия даже в знойные дни. Функциональны по своим параметрам замок багажника и центральный замок.

При покупке комплектация Норма может быть дополнена по запросу системой подогрева лобового стекла и наружных зеркал, может поставляться с кондиционером или без него.

Также необходимо не забывать и о мелких деталях. Поэтому, приобретая Ладу линейки Гранта Норма, многие покупатели акцентируют на этом внимание, чтобы сопоставить размер выплачиваемой суммы с получаемым функционалом. В комплектацию модели входят: боковые, дверные подлокотники для удобства пассажиров, пепельница, автомобильный прикуриватель.

Установленная система фильтрации, что входит в комплектацию, предотвращает попадание вовнутрь машины запыленного воздуха. Бортовой компьютер полностью контролирует параметры работы основных систем авто.

Тюнинговые решения

Лада Гранта выделяется не только внутренним обустройством, но и тюнинговыми решениями, обуславливающими ее внешний вид. Стиль и оригинальный экстерьер седана достигается за счет выполнения кузова машины и бамперов в единой цветовой гамме.

Солидному виду автомобиль обязан, установленным литым колесам из стали. Они обеспечивают устойчивость машины на неровной поверхности, а также гарантируют большую безопасность пассажиров.

Решетка радиатора обрамляется дополнительной накладкой из хрома, которая ярко выделяет логотип АвтоВАЗа. Проведенная фотосессия Лады Гранта позволяет удостовериться каждому автолюбителю в положительных изменениях, которые коснулись внешнего дизайна автомобиля.

Спектр цветовых решений кузова Гранты достаточно широк, это то, что вошло в представленную комплектацию. В салонах автомобиль реализуется, как в обычных оттенках светлого и темного, так и в ярко-вишнёвом и тёмно-синем окрасе.

В общем, транспортное средство привлекает внимание и не отпугивает агрессивными внешними чертами, что расширяет возможный контингент покупателей. А наличие хорошего мотора с достаточной мощностью и неплохим обустройством салона выводят модель в ведущие позиции по популярности. Это зависит от того, что вошло в обновленную версию. По стоимости подходит для автолюбителей, начиная с обычного размера кошелька.

Лада Гранта: комплектация, обзор, характеристики

В автомобиле Лада Гранта комплектация играет весьма существенную роль, ведь именно благодаря ее качественным характеристикам удалось вывести отечественную автомобильную промышленность на новый конкурентоспособный уровень.

Виды комплектаций

По своей комплектации Лада Гранта делится на три основных вида:

  • Стандарт;
  • Норма;
  • Люкс.

Стандарт — базовая комплектация автомобиля, имеющая всего одну версию. В данной модели необходимо обратить внимание на тот факт, что цена полностью соответствует качеству. Единственным плюсом данной версии является механическая коробка передач на 5 скоростей. Эту модель в заводской комплектации очень просто отличить от остальных по наличии в ее составе некрашеных бамперов. Диски у нее достигают всего 14 дюймов, что достаточно мало, в сравнении с топовой версией Люкса.

Норма — усовершенствованная модель Лада Гранты. Здесь под капотом стоит инновационный двигатель с облегченным шатунно-поршневым механизмом мощностью 98 л.с. Поэтому авто в комплектации Норма подойдет не только для дачников, но и для молодых водителей, которые в качестве первого автомобиля решили приобрести Ладу Гранту. В этом варианте Гранта оснащена литыми дисками, передними электростеклоподъемниками, электроусилителем руля, бортовым компьютером. Комплектация немного схожа с Приорой.

Люкс — получит в дополнение особую, полностью модернизированную подвеску. Кроме того, в автомобиле теперь будет значительно более качественная звукоизоляция. На задних стеклах тоже установлены электрические подъемники. Пассажирские кресла укомплектованы подушками безопасности, что дополнительно улучшает базовую комплектацию безопасности автомобиля. Электроприводы установлены на дверных замках, задней части ДУ и полностью управляемы из салона автомобиля. На сегодняшний день существует только три люксовых версии автомобиля от Лада Гранта.

Кроме того, необходимо обратить непосредственное внимание на то, что последние две комплектации будут по оснащению несколько отличаться. В дальнейшем производитель собирается неоднократно модернизировать данные комплектации.

Обзор комплектации 219010

Атермальные стекла сохраняют комфорт пребывания в салоне

Комплектация, получившая название 219010, была первой ступенью в начале производства автомобиля Лада Гранта Норма. В отличие от стандартной версии на ней уже установлена модернизированная разновидность подвески с передним углом кастора и задним развалом колес. Необходимо обратить внимание на усовершенствование системы безопасности, благодаря которому 219010 в дополнение к базовой комплектации получила подголовники на креслах, установленных сзади.

Функции электропакета, установленного на 219010, тоже были существенно расширены. В комплектации Норма от Лада Гранта можно добавить к положительным характеристикам электроусилитель руля. Кроме того, туда входит установка центрального замка, электростеклоподъемники, установленные непосредственно в передних дверях Лады Гранта, электрический привод крышки багажника. К неоспоримым качествам элитной отделки 219010 можно отнести кондиционер и подготовительную систему под большинство аудиовыходов.

В данном автомобиле можно при необходимости регулировать угол наклона рулевой колонки. Также автомобиль оснастили специальными атермальными стеклами и пепельницей, что является немаловажной деталью для поддержания оптимальной чистоты не только салона, но и городских улиц.

Данная версия автомобиля набрала наибольшее количество положительных отзывов от покупателей. По достаточно невысокой цене владельцу достается автомобиль с хорошей комплектацией и качественными характеристиками.

Если рассматривать Лада Гранта в версии 219001-41 011 учитывайте, что этот автомобиль идет в кузове седан в комплектации Норма. Следовательно, включает в себя все характеристики седана с преимуществами данной комплектации.

Топовая версия Лада Гранта

Для того чтобы детально разобрать, что представляет из себя наиболее рейтинговая версия Лада Гранта, стоит более внимательно разобраться с комплектацией Люкс (см. фото). В ней были установлены противотуманные фары, центральный замок с ДУ и модернизированные зеркала с электроприводом.

Кроме того, Лада Гранта Люкс включает в себя указатели поворотов, располагающиеся по бокам автомобиля, а также климатическую и мультимедийную систему, позволяющие наиболее комфортно наслаждаться ездой.

При покупке учитывайте, что экран мультимедийной системы 7-дюймовый сенсорный. При желании владельца к нему можно будет свободно подключать USB и SD карты с музыкой и видео. Единственное ограничение заключается в том, что видео необходимо просматривать на низком разрешении, так как если выбрать наилучшее качество, видеофайл постоянно будет зависать, либо при воспроизведении звук будет существенно отставать от видео.

Неоспоримым преимуществом Лада Гранта Люкс, является наличие Bluetooth, по которому можно проигрывать на аудиопроигрывателе свои музыкальные файлы. Тут тоже необходимо помнить, что лучше, если в качестве передатчика постоянно будет служить одно и то же устройство. Это необходимо для того, чтобы при создании списков не возникало неисправностей.

На некоторые модели Лада Гранта в дальнейшем будут устанавливаться навигаторы, которые ранее автомобилистам приходилось приобретать как опцию. Другие же получат в свою комплектацию системы, обеспечивающие курсовую устойчивость, парктроники и датчики, реагирующие на погодные условия.

Немаловажным станет еще и тот факт, что топовые версии получат в свою комплектацию колеса с 15 дюймами, что даже в сравнении с максимально установленными на различные Лада Гранта вариантами больше на целый дюйм.

Лада Гранта комплектация Норма

Среди нюансов оснащения отечественных авто одним из главных показателей качества и комфорта является сборка. Отличие разных вариантов, как в силовых агрегатах, так и в оснащении салона, установке полезных модулей.

Например, популярная комплектация Норма Лада Гранта выбирается многими покупателями благодаря привлекательному соотношению цены и получаемого функционала. Она значительно превосходит стандартную модификацию и чуточку хуже люксовой версии.

Усовершенствованная Лада Гранта комплектация Норма: особенности двигателей

Важным отличием является показатель мощности и конструкция двигателя. Популярная Лада Гранта Норма комплектация включает два типа силовых бензиновых агрегатов: 1,6 литровые моторы с 8-ю или 16-ю клапанами.

Первый двигатель обладает мощностью 87 л.с., а второй имеет мощность 106 л.с. Обе установки имеют уникальную конструкцию с шатунно-поршневым механизмом нового типа. Он обладает меньшим весом, за счет чего система работает слаженно и точно.

Существуют и отличия среди моделей АвтоВАЗа: для Гранта комплектация Норма и норма Приоры выдают разную мощность. В частности последняя имеет более высокий показатель 98 л.с. Что касается Гранты, то оснащается модель как механическими, так и автоматическими коробками.

АКПП устанавливается исключительно на 16-ти клапанную модель, но в новых сериях она заменяется роботизированной трансмиссией.

Приблизительный разгон до 100 км/ч для мотора с 8-ю клапанами осуществляется за 11,8 с. Такая динамика довольно хороша и поэтому авто подходит для поездок и по городским дорогам, и по открытым трассам. Максимальная скорость передвижения составляет 167 км/ч. Именно поэтому Гранта Норма комплектация привлекает многих ценителей качественных и проверенных временем автомобилей.

Комплектация Норма Лады Гранты: оснащение салона

Покупателей отечественных авто интересует для Лада Гранта комплектация Норма что входит в обустройство салона для повышения комфортабельности. А отличие от версий Стандарт, усовершенствованные модели имеют элекростеклоподъемники для передних дверей.

Рулевое колесо оснащено усилением, а рулевая колонка может изменять угол наклона. Обустройство позволяет не только грамотно и удобно управлять транспортом, но и настраивать систему индивидуально под каждого водителя.

Обновленная комплектация Норма Гранта получила и неплохой кондиционер. Он позволяет даже в самые жаркие дни проводить поездки с максимальным комфортом. Удобны в эксплуатации и центральный замок, и электропривод крышки багажника. Заказать в салоне можно некоторые дополнительные системы: обогрев переднего стекла и боковых зеркал.

Не менее важны и мелочи, которые незаменимы в любом автомобиле. И покупатели желают в точности знать, что входит в комплектацию Лада Гранта Норма за выплачиваемую сумму. Модель оснащается прикуривателем и пепельницей, а для гарантии удобства пассажиров устанавливаются боковые поручни над дверьми.

Очистка воздуха, поступающего в салон, проводится при помощи вмонтированного фильтра, также имеется практичный бортовой компьютер для изучения показателей работы авто.

Внешние особенности комплектации Норма Лады Гранты

Привлекательным в Гранте является не только внутренние системы и расширенный функционал, но и полученный экстерьер. Бампера авто окрашиваются в тот же цвет, что и сам кузов, поэтому сочетание оттенков позволяет покупателю получить стильный и оригинальный седан.

На модель устанавливаются литые стальные колеса, обеспечивающие не только безопасность езды по неровному дорожному полотну, но и придающие транспорту более солидный вид.

На решетке дополнительно монтируется хромированная накладка, подчеркивающая шильд. Оригинальные фото Лада Гранта комплектация Норма позволят каждому автомобилисту удостовериться в действительно практичном улучшении внешнего оформления модели.

Цвета кузова, которыми обладает комплектация Норма Гранты, довольно разнообразны. Приобрести авто можно как в стандартных светлых или черных тонах, так и в насыщенных оттенках вишневого или синего цвета.

Сам по себе транспорт смотрится привлекательно и аккуратно, что позволяет его использовать всем желающим. А улучшенные силовые данные в сочетании с хорошим качеством оснащения делают комплектацию одной из самых популярных. Ценовая категория автомобиля доступна не только представителям бизнеса, но и рядовым сотрудникам.

Вам также может быть интересно

Гранта — комплектация Норма 033. Запускаем штатную охранную систему.

14.07.2015 Ответы на вопросы, Протестировано нами  

Автомобиль Гранта. Комплектация по спецификации дилера — Норма 033. Графа — Центральный замок с дистанционным управлением. Прочерк, то есть отсутствует. Несколько раз приезжали такие автомобили на установку сигнализации. Основное требование клиентов — хочу лентяйку, двери открывать — закрывать. Все не было возможности и времени изучить автомобиль хорошо. Наконец-то время появилось, да и автомобиль этой комплектации подвернулся.

Что нас смутило, почему возник вопрос с изучением электрики автомобиля. Самое основное, что бросается в глаза — модуль водительской двери для управления стеклоподъемниками. Он не силовой, а значит на автомобиле установлен блок кузовной электроники. Тогда почему же нет пультов управления?

Начинаем разбираться, ведь если блок такой же, как на автомобилях в люксовом исполнении, то что мешает нам прописать туда штатный пульт управления? Вскрываем модуль и проверяем есть ли в нем схема радиоканала. Да, есть. Да и вряд ли производитель будет заморачиваться с изготовлением нескольких вариантов блоков электроники. Приобретаем пульт и проводим процедуру обучения. Процедура прошла штатно, правда не было звукового сигнала при завершении программирования. Но пульт заработал, двери открывает и закрывает.

Проверяем охранные возможности. Вскрываем закрытый пультом автомобиль личинкой замка двери и наблюдаем мигание поворотниками, но опять же без звукового тревожного сигнала. Проверяем колодку блока кузовной электроники и видим, что провод на тревожный сигнал из нее выходит. А вот самого сигнала то и нет. Странная экономия производителя, вернее странный подход к конфигурации комплектаций. Не думаю, что исключив пульт управления, звуковой сигнал и 4 концевика, производитель выпустил на рынок намного более дешевую комплектацию, тем более пучок проводов остался полноценный. А вот для пользователя эта конфигурация вылилась в заботы по доводке до ума своего автомобиля. Да и вообще, зачем нужны такие комплектации, непонятно совершенно.

Проводка на концевые кнопки тоже присутствует, правда самих концевиков не наблюдаем, что и не удивительно. Провод на концевик капота так же есть в пучке панели приборов, но под капот он не выходит. Придется его протянуть самостоятельно. 

Копаем дальше. Опция открывания багажника с пульта — работает. Последнее, что осталось проверить — доводка стекол при постановке на охрану. Нажимаем и удерживаем кнопку постановки на охрану. Стекла закрылись. Нажимаем кнопку снятия с охраны и удерживаем — стекла открылись.

Устанавливаем концевики дверей, капота, устанавливаем звуковой сигнал, подключаем дополнительно датчик удара и готово. Автомобиль получил штатную охранную систему с опцией контроля ударов по кузову.

Обзваниваю несколько знакомых установочных центров и задаю вопрос: А не пытались ли Вы доукомплектовать автомобили этой комплектации штатной охранной системой, ведь блок электроники установлен. Получил ожидаемый ответ: А зачем пытаться? На этом много не заработаешь …

Как работает Black Fret — Black Fret

Black Fret основан на простой предпосылке, что вместе мы можем изменить мир к лучшему. Меломаны и те, кто любит свое сообщество, присоединяются к Black Fret, чтобы стать «Покровителями местной музыки. Их ежегодные членские взносы используются для финансирования наших грантов и мероприятий каждый сезон. Взносы составляют всего 750 долларов на человека за год членства с любой даты, когда вы присоединитесь. Взносы могут оплачиваться ежегодно или ежемесячно (с применением 20% премии) в рамках годового обязательства.

Эти членские взносы в сочетании с нашими ценными спонсорами, гражданскими грантами и другими источниками финансирования позволили Black Fret выплатить более 2,1 миллиона долларов в виде прямых выплат и грантов артистам и еще 1,5 миллиона долларов в виде платежей местным музыкальным компаниям с 2013 года. В Остине ежегодно отбиралось двадцать групп в течение 8 сезонов, с 2013 по 2021 год, всего 160 групп. Сиэтл был запущен в разгар глобальной пандемии COVID-19 в 2020 году, но все же получил гранты в размере 50 000 долларов США для десяти групп в Сиэтле.На сегодняшний день Black Fret положительно повлиял на жизнь сотен отдельных музыкантов.

Каждый артист, номинированный главой Black Fret, получит грант. После получения награды группы могут использовать эти средства для подпитки своей музыкальной карьеры тем способом, который они считают наиболее необходимым и эффективным. Мы предоставляем наставничество со стороны местных и национальных профессионалов музыкальной индустрии, чтобы помочь нашим артистам убедиться, что получаемые ими гранты оказывают максимально возможное влияние.

Гранты Black Fret присуждаются на основе художественного мастерства.Каждый сезон музыканты и группы номинируются на рассмотрение членов Black Fret, консультативного совета музыкальной индустрии, прошлых получателей грантов и избранных медиа-партнеров.

Рассмотрение гранта от Black Fret возможно только после получения номинации от избирательных округов Black Fret, как указано выше. Не существует процесса подачи незапрошенных заявок, с помощью которого группа могла бы получить грант Black Fret. Скорее, это сообщество Black Fret, которое признает этих артистов и выбирает их в каждой главе каждого сезона.

В каждом отделении Black Fret проводится полный сезон мероприятий для наших участников, создавая захватывающий опыт, который делает всех наших участников частью музыкальной сцены их отделения. Узнайте больше о том, каково быть участником Black Fret.

BLACK FRET SEATTLE ОБЪЯВЛЯЕТ ПОЛУЧАТЕЛЕЙ ГРАНТА 2020

[fusion_builder_container type = »flex» 100_percent = «no» 100_percent_height = »no» min_height = »« 100_percent_height_scroll = »no» align_content = «stretch» ​​flex_align_items = «flex-start» flex_justify_content = «flex-start» = «flex-start» 100_percent_height_center_content = «да» equal_height_columns = «no» container_tag = «div» menu_anchor = «» hide_on_mobile = «малой видимости, средней видимости, большой видимости» status = «опубликовано» publish_date = «» class = «» id = » ”Link_color =” ”link_hover_color =” ”border_sizes =” ”border_sizes_top =” ”border_sizes_right =” ”border_sizes_bottom =” ”border_sizes_left =” ”border_color =” ”border_style =” solid ”spacing_medium =” ”margin_top_medium =” ”margin_bottom =” ”margin_bottom spacing_small = ”” margin_top_small = ”” margin_bottom_small = ”” margin_top = »” margin_bottom = ”” padding_dimensions_medium = ”” padding_top_medium = ”” padding_right_medium = ”” padding_bottom_medium = ””_ padding_medium =” ”padding_bottom_medium =” ”_ padding_leimens ””sport_medium =” ”_ padding_leimens ” «» п add_bottom_small = ”” padding_left_small = ”” padding_top = ”” padding_right = ”” padding_bottom = ”” padding_left = ”” box_shadow = ”no” box_shadow_vertical = ”” box_shadow_horizontal = ”” box_shadow_small = ”” box_shadow_horizontal = ”” box_shadow_blur = ” ”Box_shadow_style =” ”z_index =” ”overflow =” ”gradient_start_color =” ”gradient_end_color =” ”gradient_start_position =” 0 ″ gradient_end_position = ”100 ″ gradient_type =» linear «radial_direction =» center center «linear_angle =» 180 ″ background_color = » ”Background_image =” ”background_position =” center center ”background_repeat =“ no-repeat ”fade =” no ”background_parallax =« none »enable_mobile =« no »parallax_speed =» 0.3 ″ background_blend_mode = ”none” video_mp4 = ”” video_webm = ”” video_ogv = ”” video_url = ”” video_aspect_ratio = ”16: 9 ″ video_loop =” yes ”video_mute =” yes ”video_preview_image =” ”absolute =” off ”absolute_devices = ”Small, medium, large” sticky = ”off” sticky_devices = ”small-visibility, medium-visibility, large-visibility” sticky_background_color = ”” sticky_height = ”” sticky_offset = ”” sticky_transition_offset = ”0 ″ scroll_offset =” 0 ″ animation_type = ”” animation_direction = ”left” animation_speed = ”0,3 ″ animation_offset =” ”filter_hue =” 0 ″ filter_saturation = ”100 ″ filter_brightness =” 100 ″ filter_contrast = ”100 ″ filter_invert =” 0 ″ filter_sepia = ”0 ″ filter_opacity = ”100 ″ filter_blur =” 0 ″ filter_hue_hover = ”0 ″ filter_saturation_hover =” 100 ″ filter_brightness_hover = ”100 ″ filter_contrast_hover =” 100 ″ filter_invert_hover = ”0 ″ filter_sepia_hover =” 0 ″ filter_opacity_hover = ”0 ″ filter_opacity_hover] fusion_builder_row] [fusion_builder_column type = «1_1 ″ layout =» 1_1 ″ align_self = «auto» content_layout = «column» align_content = «flex-start» продолжение ent_wrap = «wrap» spacing = «» center_content = «no» link = «» target = «_ self» min_height = «» hide_on_mobile = «малой видимости, средней видимости, большой видимости» sticky_display = «нормальный, липкий» класс = ”” Id = ”” type_medium = ”” type_small = ”” order_medium = ”0 ″ order_small =” 0 ″ Dimension_spacing_medium = ”” Dimension_spacing_small = ”” Dimension_spacing = ”” Dimension_margin_medium = ”” dimension_margin_small = ”” margin_btop = ”” = ”” Padding_medium = ”” padding_small = ”” padding_top = ”” padding_right = ”” padding_bottom = ”” padding_left = ”” hover_type = ”none” border_sizes = ”” border_color = ”” border_style = ”solid” border_radius = ”” box_shadow = ”Нет” Dimension_box_shadow = ”” box_shadow_blur = ”0 ″ box_shadow_spread =” 0 ″ box_shadow_color = ”” box_shadow_style = ”” background_type = ”single” gradient_start_color = ”” gradient_end_color = ”” gradient_start_ gradient ‘= ”0 ″ = ”Linear” radial_direction = ”center center” linear_angle = ”180 ″ background_color =” ”background_image =” ”background_image_id =” ”bac kground_position = «левый верх» background_repeat = «no-repeat» background_blend_mode = «none» animation_type = «» animation_direction = «left» animation_speed = «0.3 ″ animation_offset = ”” filter_type = «normal» filter_hue = »0 ″ filter_saturation =» 100 ″ filter_brightness = »100 ″ filter_contrast =» 100 ″ filter_invert = »0 ″ filter_sepia =» 0 ″ filter_opacity = »100 ″ filter_blur =» 0 ″ Filter_hue_hover = ”0 ″ filter_saturation_hover =” 100 ″ filter_brightness_hover = ”100 ″ filter_contrast_hover =” 100 ″ filter_invert_hover = ”0 ″ filter_sepia_hover =” 0 ″ filter_opacity_hover = ”100 ″ filter_” ”″ ″ границы_позиции ”Type =” 1_1 ″ first = ”true”] [fusion_text columns = ”” column_min_width = ”” column_spacing = ”” rule_style = ”default” rule_size = ”” rule_color = ”” content_alignment_medium = ”” content_alignment_small = ”” content_alignment = ” ”Hide_on_mobile =” малая видимость, средняя видимость, большая видимость ”sticky_display =” нормальный, липкий ”class =” ”id =” ”font_size =” ”fusion_font_family_text_font =” ”fusion_font_variant_text_font =” ”line_height =” ”letter_spacing =” «Text_color =» «animation_type =» «animation_direction =» left «animation_speed =» 0.3 ″ animation_offset = ””]

НЕКОММЕРЧЕСКАЯ МУЗЫКА ДЛЯ ВЫДАЧИ ГРАНТОВ НА $ 50 000 МУЗЫКАНТАМ Сиэтлского района

После распределения более 1,75 миллиона долларов среди музыкантов в Остине, штат Техас, с 2013 года, отделение в Сиэтле официально открылось в феврале 2020 года, что стало первым шагом на пути к превращению в национальную организацию.

25 АВГУСТА 2020 г. СИЭТЛ, ВАШИНГТОН — Black Fret с гордостью объявляет о распределении 50 000 долларов среди десяти музыкантов и групп региона Сиэтла, выполняющих свою миссию по поддержке создания и исполнения местной музыки с помощью этого инаугурационного гранта.

Black Fret — это общественная благотворительная организация 501 (c) 3, основанная в Остине, штат Техас, в 2013 году, которая распределила более 1,75 миллиона долларов в виде грантов и гонораров за выступления музыкантам Остина. Black Fret предоставляет участникам серию уникальных музыкальных впечатлений, где они могут стать свидетелями лучшей и яркой новой местной музыки и поддержать развитие местных музыкантов. Сиэтл — это первое из новых отделений за пределами Остина, и он уверен, что эти первые 50 000 долларов в виде грантов станут началом многих лет поддержки.

Black Fret Seattle официально запущен 29 февраля 2020 года, как и COVID-19, как раз в тот момент, когда пандемия начала публично проявляться в Сиэтле. Масштабы последствий этого события невозможно было предвидеть, и государственный приют в порядке остановил все мероприятия и большие собрания, поставив под угрозу миссию Black Fret.

«Мы знали, что музыканты нашего города не могут дождаться улучшения ситуации. Вся отрасль остановлена ​​как вкопанная, поэтому мы ускорили процесс предоставления грантов, чтобы попытаться оказать помощь там, где мы могли бы », — сказал исполнительный директор Black Fret Seattle Бен Лондон .«Хотя пандемия очень сильно ударила по нам как по организации, она еще сильнее ударила по нашим музыкантам. Мы просто не могли оправдать приостановку нашей программы до окончания пандемии ».

Имея это в виду, Black Fret в июле начал процесс выдвижения кандидатур и голосования, чтобы определить, кто будет десятью получателями грантов 2020 года. Восемьдесят один артист и группа из Сиэтла были номинированы на рассмотрение членов и консультантов Black Fret, десять из которых стали нашими артистами Black Fret 2020 года.

Получатели гранта Black Fret Seattle 2020:

Беараксе, Кочевник Чонг, Уитни Монге, Голые гиганты, Сера Кахун, Смоки Брайтс, Стефани Энн Джонсон и Hidogs, Черные тона, Томо Накаяма и Трес Личес

Каждый артист / группа получит грант в размере 5000 долларов, который они могут использовать по своему усмотрению для поддержки своего карьерного роста.Художники из Сиэтла из Black Fret 2020 поделились своими мыслями о влиянии этого гранта:

«Как музыканту в наше время вы оказываете нам поистине невероятную поддержку», — сказала Сера Кахоун .

Алайя Д’Алессандро из Tres Leches отметил: «Мы потеряли много концертов из-за COVID. Эти 5000 долларов позволят нам вернуться в студию звукозаписи, чтобы закончить наш второй альбом и быть готовыми отправиться в тур, когда это будет безопасно ».

«Мы действительно намерены использовать эти деньги для развития группы.У нас в работе есть несколько новых синглов, и это дает возможность фактически записать и выпустить их », — сказали Райан Девлин и Ким Уэст из Smokey Brights.

«Мы начали Black Fret, чтобы помочь поддержать и преумножить музыкантов Остина с мечтой перенести эту программу в другие города», — сказал основатель Black Fret. Колин Кендрик «Я не могу передать вам, как приятно видеть, как сбылась наша мечта. к жизни. Отделение в Сиэтле — это первый шаг к расширению нашей программы по всей стране и помощи музыкантам по всей стране.”

ЧЕРНЫЙ FRET SEATTLE CONCERT SERIES

Музыканты 2020 года будут представлены в 10-недельной серии концертов, которые будут транслироваться в прямом эфире из Nectar, начиная со среды 9 сентября в 20:00 по тихоокеанскому стандартному времени с участием Chong the Nomad. Каждое шоу будет приносить пользу другой местной некоммерческой организации. Первые четыре концерта пройдут в течение четырех сред сентября с дополнительными датами.

Среда 9/9 Чонг Кочевник (Проект Окра)
Среда 16 сентября Обнаженные гиганты (Ферма выращивания корней)
Среда 23 сентября Стефани Энн Джонсон и Hidogs (корм 253) Среда 30 сентября Смоки Брайтс (Фонд округа Кинг) Сейчас)

АУДИО И ВИДЕО ПЛЕЙЛИСТЫ

Видео | Аудио

СООБЩЕСТВА: Black Fret Seattle благодарит тех, кто помог запустить эту революционную главу Black Fret: City of Shoreline, Port of Seattle, Tito’s Vodka, KEXP, The Stranger, Visit Seattle, The Recording Academy, Nectar, The Collective, evo , и Deloitte

О ЧЕРНОМ FRET

Основанная в 2013 году, Black Fret — это общественная благотворительная организация 501 (c) 3 со штаб-квартирой в Остине, штат Техас, миссия которой — дать возможность местным музыкантам создавать и исполнять отличную новую музыку.Организация представляет собой новаторское развитие старой модели патронажа симфонических оркестров, ориентированной на поддержку популярной местной музыки. Ежегодные членские взносы Black Fret составляют 1500 долларов в год, которые могут выплачиваться единовременно или ежемесячно. Членство не подлежит налогообложению в размере 80% и дает право на участие в благотворительных программах для сотрудников. В обмен на ежегодные взносы участники будут вознаграждены выступлениями некоторых из лучших артистов города в рамках широкого спектра частных мероприятий, включая ежемесячные шоу в уютных местах и ​​ежегодное гала-мероприятие под названием Black Fret Ball.Те, кто желает стать участником Black Fret Seattle, могут зарегистрироваться на https://blackfretorg.stage.site/SEATTLE. Все членства обеспечивают вход для участника и гостя на до десяти предстоящих событий Black Fret 2020 года, включая Black Fret Ball. По вопросам обращайтесь по электронной почте [email protected]

О BEN LONDON

Бен Лондон — музыкальный профессионал / исполнитель из Сиэтла, который в настоящее время является исполнительным директором Black Fret Seattle. До этого Лондон занимал руководящие должности в Experience Music Project (MoPop), GRAMMYS (Академия звукозаписи), Hewlett Packard и Northwest Polite Society.Лондон был первым председателем Музыкальной комиссии Сиэтла и входил в правления, включая KEXP и Vera Project. Музыка Лондона была показана в самых разных фильмах и телепрограммах. Среди предыдущих лондонских коллективов — Alcohol Funnycar, St. Bushmills Choir и Sanford Arms. В настоящее время он выступает в составе сиэтлской группы STAG.

[/ fusion_text] [/ fusion_builder_column] [/ fusion_builder_row] [/ fusion_builder_container]

американских экспертов обеспокоены обработкой Ираном аварийного зонда авиалайнера

AP — Американские и канадские следователи происшествий не уверены, какой доступ они получат к доказательствам, которые могли бы доказать, сбил ли Иран украинский пассажирский самолет, и в пятницу высказывались опасения, что зонд уже может быть скомпрометирован удалением обломков авиакатастрофы. сайт.

Подсказки о том, был ли Boeing 737 сбит иранской зенитной ракетой, как утверждают США и их союзники, можно извлечь из его регистраторов черного ящика, которые могли фиксировать звук взрыва, и из исследования его детали для таких вещей, как отверстия от шрапнели, следы ожогов или остатки взрывчатых веществ.

Все 176 человек на борту погибли, когда построенный американцами лайнер загорелся на окраине Тегерана во время взлета рано в среду, через несколько часов после того, как Иран запустил ракетный огонь по американским войскам.Среди погибших 57 канадцев.

Иран в пятницу отрицал, что одна из его ракет сбила авиалайнер, и потребовал от Запада предоставить доказательства.

Телевизионные репортажи в пятницу показали, что с места крушения были расчищены обломки, оставив место наедине с мусорщиками. Если бы обломки действительно были перемещены, некоторые подсказки могли быть потеряны, если иранцы не предприняли осторожных шагов для сохранения доказательств.

Получите ежедневное издание The Times of Israel по электронной почте и никогда не пропустите наши главные новости

Регистрируясь, вы соглашаетесь с условиями

«Обычно вы должны очень тщательно нанести на карту поле обломков.Если в самолет попала ракета, можно было бы ожидать найти некоторые ее части и остатки взрывчатки », — сказал Стивен Уоллес, бывший руководитель отдела расследования авиационных происшествий Федерального управления гражданской авиации.

Джефф Гузетти, бывший следователь по расследованию авиационных происшествий и официальный представитель Федерального агентства гражданской авиации (FAA), сказал, что его не беспокоит очистка, если иранцы сначала задокументируют точное местонахождение каждой крупной детали, хранят их должным образом и согласились позволить следователям из США и других стран осмотреть их. .

«Если бы они этого не делали, значит, они просто некомпетентны, и вы можете в конечном итоге разрушить или, по крайней мере, существенно затруднить расследование, изменив доказательства и заразив их», — сказал он. «Если они действительно верят, что это не ракетный удар, то они должны убедиться, что точно знают, что не удалось первым, когда они разлетелись на части в воздухе».

Бульдозер во время поисков спасателей на месте крушения украинского самолета в Шахедшехре, к юго-западу от столицы Тегерана, Иран, среда, январь.8 августа 2020 г. (AP Photo / Ebrahim Noroozi)

Поля обломков могут дать ценные подсказки. Маленький указывает на то, что самолет не был поврежден, когда упал на землю, как это произошло, когда самолет Boeing 737 Max авиакомпании Ethiopian Airlines разбился носом в марте прошлого года. Широко разбросанные обломки предполагают, что самолет развалился в воздухе, как самолет рейса TWA 800, взорвавшийся над Атлантикой в ​​1996 году. Следователи обвинили во взрыве топливного бака.

Отслеживание обломков и выяснение того, какие части упали первыми, может помочь следователям установить причину аварии.Сломанные куски тщательно исследуются на предмет усталости металла.

Детали можно протереть тампоном на предмет остатков химикатов и исследовать на предмет дырок или засыпки, которые могут указывать на взрыв. Так голландские следователи установили, что самолет Malaysian Airlines, разбившийся в Украине в 2014 году, был сбит в результате нападения, в котором виноваты пророссийские повстанцы.

Даже не исследуя обломки, следователи могли бы определить, был ли самолет сбит ракетой или бомбой, проанализировав самописец полетных данных и диктофон кабины.

Официальные лица США не сообщили, какие у них были разведывательные данные, указывающие на иранскую ракету, но признали наличие спутников и других датчиков в регионе, а также вероятность перехвата связи. Видео, проверенные Associated Press, по-видимому, показывают последние секунды злополучного авиалайнера, очевидно, горящего, когда он упал на землю.

Поздно вечером в четверг Национальный совет по безопасности на транспорте США сообщил, что иранские власти пригласили его принять участие в расследовании.Этот шаг свидетельствует о том, что Иран намерен следовать международным стандартам расследования авиационных происшествий, установленным авиационной группой Организации Объединенных Наций. В этих правилах говорится, что к расследованию должны быть привлечены следственные органы страны, где был построен самолет, и производитель.

Однако в пятницу было неясно, когда NTSB может отправить кого-либо в Иран из-за санкций США против ведения бизнеса с Ираном и из-за опасности для американцев. Представитель NTSB от комментариев отказался.

Министр иностранных дел Канады Франсуа-Филипп Шампань заявил в пятницу, что Канада хочет принять участие в расследовании и помочь в идентификации жертв, но Иран пока выдал только две визы.

Вскоре после авиакатастрофы высшее должностное лицо Ирана заявило, что Иран не передаст «черные ящики» властям США или компании «Боинг». Американские эксперты по безопасности говорят, что это не проблема, если ящики отправляются экспертам в другой стране, которые способны их проанализировать, например, в Бюро расследований и анализа гражданской авиации Франции.

Скорбящие присутствуют на бдении в Торонто в четверг, 9 января 2020 года, в память о жертвах гражданского украинского авиалайнера, разбившегося недалеко от Тегерана поздно вечером во вторник, в результате чего погибли все 176 человек на борту. (Крис Янг / Канадская пресса через AP)

Хасан Резаифар, глава иранской следственной группы, заявил в пятницу, что восстановление данных с бортовых самописцев черного ящика может занять больше месяца и что все расследование может растянуться на следующий год. Он также сказал, что Иран может запросить помощь у международных экспертов, если он не сможет извлечь записи полета.

Эксперты в области авиации считают, что Ирану не хватает опыта и средств для анализа ящиков, и страна находится под давлением, чтобы передать их сторонним исследователям с передовыми лабораториями. Но почти все они находятся в США или их союзниках, таких как Франция.

«Если они собираются попытаться извлечь данные из сломанных, размятых бортовых самописцев, они могут очень легко в конечном итоге стереть самописцы или испортить данные», — сказал Гуззетти об иранцах.

Если иранцы пойдут в одиночку, не обращаясь за технической помощью извне, «доверие к расследованию в мировом авиационном сообществе будет нулевым», — сказал Уоллес.«Но это очень напряженная политическая ситуация».

Климатический кризис и ответственная журналистика

Как обозреватель The Times of Israel по вопросам окружающей среды, я пытаюсь передать факты и научные данные, лежащие в основе изменения климата и деградации окружающей среды, объяснить и критиковать официальную политику, влияющую на наше будущее, и описать израильские технологии, которые могут стать частью решения.

Я увлечен миром природы и разочарован мрачным неосведомленностью об экологических проблемах, продемонстрированной большинством общественности и политиков в Израиле.

Я горжусь тем, что делаю свой вклад в то, чтобы читатели Times of Israel должным образом информировались об этом жизненно важном предмете, который может повлиять и действительно влияет на изменение политики.

Ваша поддержка через членство в The Times of Israel Community позволяет нам продолжать нашу важную работу. Вы бы присоединились к нашему Сообществу сегодня?

Спасибо,

Сью Суркс , репортер по окружающей среде

Присоединяйтесь к сообществу Times of Israel Присоединяйтесь к нашему сообществу Уже вступил? Войдите, чтобы больше не видеть это

Ты серьезный.Мы ценим это!

Нам очень приятно, что вы прочитали статей X Times of Israel за последний месяц.

Вот почему мы приходим на работу каждый день — чтобы предоставить таким взыскательным читателям, как вы, обязательные к прочтению материалы об Израиле и еврейском мире.

Итак, теперь у нас есть запрос . В отличие от других новостных агентств, у нас нет платного доступа. Но поскольку журналистика, которую мы делаем, стоит дорого, мы приглашаем читателей, для которых The Times of Israel стала важной, поддержать нашу работу, присоединившись к The Times of Israel Community .

Всего за 6 долларов в месяц вы можете поддержать нашу качественную журналистику, наслаждаясь The Times of Israel AD-FREE , а также получая доступ к эксклюзивному контенту, доступному только для членов сообщества Times of Israel.

Присоединяйтесь к нашему сообществу Присоединяйтесь к нашему сообществу Уже вступил? Войдите, чтобы больше не видеть это

Малые города обеспокоены тем, что федералы пересмотрят определение городских районов

Более 140 малых городов по всей Америке обеспокоены тем, что федеральное Управление управления и бюджета собирается понизить их в должности.

Их беспокойство вызвано тем, что группа технических консультантов предложила офису изменить стандарт, по которому он измеряет то, что квалифицируется как столичная статистическая зона.

Комиссия рекомендовала поднять порог для определения столицы с 50 000 жителей до 100 000 жителей, что является первым серьезным изменением в статистическом показателе с 1950 года. Советники говорят, что текущий маркер устарел в стране, население которой увеличилось вдвое с момента определения. был принят.

В их предложении есть мэры, руководители торговых палат и должностные лица по развитию бизнеса в 144 городах в 45 штатах, которые находятся между текущим и предложенным пороговыми значениями, опасаясь, что их назовут микрополитической зоной.

«Наша торговая палата, генеральный директор очень обеспокоены», — сказал Джон Хайла, мэр Эймса, штат Айова, с населением 66 023 человека. «Это не могло произойти в худшее время, поскольку мы начинаем оправляться от пандемии».

Согласно нынешнему определению, в Соединенных Штатах есть 384 столичных статистических района, от Нью-Йорка до Ньюарка-Джерси-Сити, население 19 человек.2 миллиона человек в Карсон-Сити с населением 55 916 человек, столице штата Невада.

Среди городов, которые сейчас квалифицируются как мегаполисы, но не подпадают под предлагаемые правила: Санта-Фе, Нью-Мексико; Флагстафф и Прескотт, Аризона; Бенд, руда .; Шебойган, Джейнсвилл и Ошкош, Висконсин; Шарлоттсвилль, Блэксбург и Винчестер, Вирджиния; и столицы штатов Миссури, Северная Дакота и Вайоминг.

Только в Колорадо, Вермонте, Нью-Гэмпшире, Коннектикуте и Род-Айленде нет метро с населением от 50 000 до 100 000 жителей.

«Для тех, кому не все равно, это большое дело», — сказал Уильям Фрей, старший демограф Института Брукингса, который написал в Управление управления и бюджета (OMB) письмо с протестом против изменения. «Есть политики, привязанные к этим определениям».

Представитель OMB отказался от комментариев перед окончанием периода общественного обсуждения, который закончился в пятницу, и последующим пересмотром.

Новое определение OMB не окажет немедленного влияния на города, рейтинг которых был понижен.Финансирование большинства программ, субсидируемых на федеральном уровне, зависит от численности населения, а не от категории, в которую попадает территория.

Но городские руководители говорят, что другие федеральные ведомства относятся к категориям мегаполисов и микрополитенов очень по-разному, и что изменение определения может непредвиденным образом повлиять на финансируемые государством программы, от Блочных Грантов Развития Сообщества Департамента жилищного строительства и городского развития (HUD) ( CDBG) на финансирование шоссе Департамента транспорта.

«Это будет значительный объем финансирования со стороны федерального правительства, особенно в части финансирования HUD и CDBG», — сказал Сэнди Роберсон, мэр Роки-Маунт, Северная Каролина, с населением 54 548 человек. «Программы, которые мы можем себе позволить, потому что мы относимся к статистической зоне мегаполиса, очень важны».

Шон Хершбергер, директор службы развития в Винчестере, штат Вирджиния, с населением 69 644 человека, сказал, что потоки финансирования, которые окажутся под угрозой, непропорционально упадут на тех, кто в них больше всего нуждается.

«Наибольшее воздействие, которое это окажет на уровень сообщества, в первую очередь касается людей с низким или умеренным доходом», — сказал Хершбергер. «Очевидно, они самые уязвимые в нашем и других сообществах».

Есть также гордость и опасение, что недавно получившие название микрополитических городов могут не заметить компании, ищущие новое сообщество для размещения завода или офиса.

«В то время как компании, использующие более сложный процесс выбора места, не будут убеждены статусом OMB или переписи сообщества, многие решения о местонахождении принимаются высшим руководством малых и средних фирм», — сказала Кэти Калп, президент и главный исполнительный директор компании KSM Location Advisors, консалтинговая компания по выбору площадок.«Кроме того, некоторые потоки федерального финансирования доступны только для определенных категорий сообществ».

Консультанты по выбору участков часто анализируют данные Бюро переписи населения, которые обновляются для мегаполисов более регулярно, чем для микрополитенов.

«Не имея точных и актуальных данных о вашем сообществе, вы действительно находитесь в невыгодном положении», — сказал Хершбергер.

Для таких сообществ, как Эймс, Роки-Маунт и Винчестер, исключение из списка мегаполисов может быть забыто.

«Мы опасаемся, что это снизит нашу способность привлекать новый бизнес в наше сообщество, будь то розничная, коммерческая или промышленная. Мы просто больше не попадаем в поле зрения консультантов по выбору площадок », — сказала Хайла. «Если они будут использовать в качестве критерия [обозначение MSA], вы вдруг просто удалите из этого 140 с лишним сообществ, это окажет глубокое влияние не только на Эймса, но и на другие сообщества, чтобы даже попытаться стать считается.»

Изменение определения того, что представляет собой статистическая зона метрополии, сразу же повлияет на ситуацию: изменится баланс населения между городской и сельской Америкой.Фрей подсчитал, что согласно нынешнему определению 13,8% американцев живут за пределами мегаполисов. Согласно предложенному определению, это число подскочит до 19,7 процента.

В письме Робу Фэйрвезеру, исполняющему обязанности директора OMB, двухпартийная группа законодателей призвала администрацию Байдена сохранить текущий порог.

«Мы настоятельно рекомендуем вам отвергать любое увеличение минимальной численности населения урбанизированных территорий, необходимое для получения статуса MSA», — написал сенатор Джон Тьюн Джон Рэндольф Тьюн Рассказ о двух палатах: власть Трампа сохраняется в Палате представителей, ослабевает в сенате The Hill’s Morning Report — Представлено AT&T — Сенат принимает закон об инфраструктуре, резолюцию о бюджете; Куомо уходит в отставку 46 сенаторов-республиканцев предупреждают, что они не будут голосовать за повышение потолка долга БОЛЬШЕ (R-S.D.), Майк Раунс, Майк Раундс, 19 сенаторов Республиканской партии, проголосовавших за законопроект об инфраструктуре Т. Сенат принимает двухпартийный законопроект об инфраструктуре, что является крупной победой: Сенат Байдена голосует за прекращение дебатов по законопроекту об инфраструктуре Т. БОЛЬШЕ (RS.D.), Кевин Крамер Кевин Джон Крамер : Байден снова побеждает Трампа — на этот раз в Сенате 19 сенаторов Республиканской партии, проголосовавших за законопроект об инфраструктуре Т. Республиканцы представили законопроект о запрете федерального финансирования критической теории расы БОЛЬШЕ (RN.D.), Джон ХовенДжон Генри Хувен для законопроекта об инфраструктуре T The Hill’s 12:30 Report — Представлено Facebook — Американская гимнастка выигрывает абсолютное золото, когда Симона Байлз приветствует с трибун Утренний отчет Hill’s — Представлено Facebook — Огромная победа Байдена, сенаторов-центристов БОЛЬШЕ (RN .D.), Синтия Ламмис Синтия Мари ЛаммисКриптоиндустрия стремится набрать обороты после проигрыша в битве с Сенатом Хилликонская долина: поправка о криптовалюте заблокирована в Сенате | Демс настаивает на приостановлении доступа к учетным записям исследователей в Facebook | Тысячи людей выступают против плана Apple по сканированию iPhone в США на предмет изображений сексуального насилия над детьми Поправка о криптовалюте заблокирована в Сенате БОЛЬШЕ (R-Wyo.), Марк Келли Марк Келли Хаус, демократы, руководители прессы, чтобы включить дополнительные средства на электромобили в план расходов Сенатор штата Аризона уходит в отставку после ареста за сексуальные проступки с несовершеннолетними Фото недели: респ.Кори Буш, Бейрутское столкновение и утиное дерби БОЛЬШЕ (Демократическая Республика Аризона), Кирстен Синема Кирстен Синема Семья Джона Льюиса присоединяется к митингу, настаивая на том, чтобы Байден помог покончить с флибустьером Сената Шумер одержал большие победы — но головные боли вырисовываются Берни Сандерс говорит, что он планирует убедить прогрессистов помочь пройти Пакет расходов .5T БОЛЬШЕ (округ Колумбия) и Деб Фишер Дебра (Деб) Стробель Фишер Хаус Демократы настаивают на том, чтобы лидеры демократов включили больше средств на электромобили в план расходов Сенатские демократы пытаются разрядить драму о бюджете Республиканской партии 19 сенаторов Республиканской партии, проголосовавших за инфраструктуру Т. счет БОЛЬШЕ (R-Neb.) и представители Дасти Джонсон (R-S.D.) и Адриан Смит, Адриан Майкл Смит, республиканцы сосредоточивают внимание на противодействии повышению налогов на изменении прироста капитала О деньгах: Сенат подтверждает, что Генслер возглавит SEC | Сенатская Республиканская партия на следующей неделе столкнется с проблемой из-за целевых показателей | Ведущий республиканец на налоговой панели Палаты представителей уйдет в отставку. Представитель Республиканской партии Кевин Брэди не будет добиваться переизбрания БОЛЬШЕ (R-Neb.).

«Соблюдение этой рекомендации может нанести вред общинам по всей стране».

Роберсон, мэр Роки-Маунт, сказал, что он ожидал, что делегация Северной Каролины выступит против предложенного изменения, которое также отправит Нью-Берн и Голдсборо в список микрополитенов.

«Мы, как правило, ценим небольшие города и сельские районы», — сказал он в интервью. «У нас много возможностей для роста, и в наших парусах много ветра».

«Поразительное» решение TRO в Сиэтле может переделать войны смартфонов

(Рейтер) — Одним постановлением на этой неделе окружной судья США Джеймс Робарт из федерального суда Сиэтла, возможно, коренным образом изменил баланс сил между Motorola Mobility и ведущими противниками Google, Microsoft и Apple, которые вскоре станут материнскими компаниями Motorola.

Продавщица позирует с копиями смартфонов HTC, Samsung и Apple в магазине мобильных телефонов 6 апреля 2012 г. REUTERS / Shengfa Lin

Еще одним признаком того, что война за смартфоны отходит от индивидуальных исков о нарушении прав, Робарт удовлетворил ходатайство Microsoft для временного запретительного судебного приказа, который фактически запрещает Motorola предпринимать какие-либо действия для принудительного исполнения любых судебных решений, предоставленных в рамках текущего патентного дела в Германии.

В этом деле в суде в Мангейме Motorola заявила, что продукты Microsoft Windows и Xbox нарушают немецкие патенты, которые являются частью стандартного портфеля Motorola.Судья Сиэтла, согласно этой записи приказа, который он вынес в открытом судебном заседании, согласился с Microsoft в том, что немецкие патенты уже являются предметом спора в рассматриваемом им деле Microsoft, которое обвиняет Motorola в нарушении своего обязательства предлагать стандартные патенты на справедливой и справедливой основе. разумные условия лицензирования.

Робарт выдал временный запретительный судебный приказ в соответствии с Законом о запрещении судебных исков, который предназначен для ограничения судебных разбирательств, связанных с покупками на форуме и преследованием. Так Microsoft и ее советник в Sidley Austin описали иск Motorola в Германии.По данным Microsoft, Motorola сначала попыталась получить непомерные лицензионные сборы за портфель из около 100 патентов, важных для мировых стандартов. Затем, после того как Microsoft подала иск в федеральный суд Сиэтла, утверждая, что лицензионное требование Motorola является нарушением ее контракта с европейским органом по стандартизации, Motorola подала в суд на Microsoft в Германии за нарушение немецких патентов, которые были частью рассматриваемого портфеля в Сиэтле.

Судья согласился с тем, что Motorola, по всей видимости, сбежала в Германию, чтобы получить судебный запрет, прежде чем он сможет принять решение по существу контрактного дела Microsoft.По его словам, иск Microsoft в США включает те же патенты, которые Motorola заявляла в Германии, потому что эти немецкие патенты были частью портфеля, за который Motorola потребовала якобы неправомерные лицензионные сборы. Робарт пришел к выводу, что в соответствии с Законом о запрещении судебных исков он имеет право заблокировать Motorola от применения любых средств защиты в Германии до тех пор, пока он не вынесет решение по более широкому вопросу о разумных лицензионных сборах для патентов, важных для стандартов.

«Поле битвы в этом… заключается в том, будут ли действия Соединенных Штатов или их решение диспозиционировать иностранные действия, которые будут запрещены», — заявил судья на слушаниях в среду.«И я добавлю, в назидание Апелляционному суду, чтобы он знал, откуда я, что я считаю сохранение моей способности разрешать этот спор чем-то, что необходимо тщательно охранять, иначе мы бежим на возможность конфликтующих резолюций, дублирования судебных разбирательств и неудачных результатов, которые не соответствуют соответствующему закону ».

Почему постановление так важно? Судебные судебные запреты на патент трудно получить в США, поэтому патентообладатели за последние пять лет или около того воспользовались преимуществами более простых стандартов судебных запретов в Германии и других странах, чтобы получить рычаги влияния в глобальных патентных спорах.Постановление Робарта гласит, что, по крайней мере, в делах, касающихся портфелей, устанавливающих международные стандарты, судебные разбирательства в США важнее дел в других странах. Это потенциально значительный сдвиг в балансе сил между патентообладателями и лицензиатами.

Ожидайте, что Apple, например, укажет на решение в своей собственной судебной тяжбе с Motorola, которая имеет важное значение. Apple подала в суд на Motorola в федеральном суде Сан-Диего в феврале, приведя, по сути, тот же аргумент, что и Microsoft. Заявление Motorola о выдвижении компанией Motorola патентов, устанавливающих стандарты, в Германии нарушает договор Motorola с организацией, устанавливающей стандарты.Параллели с делом Microsoft предполагают, что Apple также сможет использовать постановление Робарта, чтобы заблокировать Motorola от принудительного исполнения любых судебных запретов Германии, которые она получает.

Ведущий специалист по установлению стандартов в области патентов Хорхе Контрерас из Вашингтонского юридического колледжа Американского университета сказал агентству Рейтер, что решение Робарта «довольно поразительно». Он сказал, что никогда раньше не видел, чтобы контрактный случай, связанный с патентами, имеющими стандартное значение, служил основанием для судебного запрета, и сказал, что U.Заявление С. судьи о его полномочиях блокировать иностранные патентные иски «очень удивительно». По его словам, Motorola должна предложить лицензиатам базовых технологий по всему миру портфель патентов. Таким образом, вывод о том, что такое предложение исключает судебное разбирательство по патентам в портфеле за пределами США, «кажется значительным достижением … Я вижу, что это действительно важное решение».

Заместитель генерального юрисконсульта Microsoft Дэвид Ховард заявил агентству Reuters, что решение означает: «Motorola не может препятствовать продаже продуктов Microsoft до тех пор, пока суд не примет решение, выполнила ли Motorola свое обещание.Motorola, указывая на облигацию на 100 миллионов долларов, которую Робарт приказал Microsoft опубликовать, заявила, что решение означает, что Microsoft намерена лицензировать свои патенты, важные для стандартов. Патентный поверенный Motorola К. Макнил Тейлор и внешний адвокат Стивен Пепе из Ropes & Gray не были доступны для комментариев.

Motorola не сообщила, намерена ли она обжаловать временный запретительный судебный приказ, который будет действовать только до 7 мая слушания по ходатайству Microsoft о вынесении решения в упрощенном порядке. Между тем, как ожидается, 2 мая суд Мангейма вынесет решение по иску Motorola о судебном запрете в Германии.

Отчетность Элисон Франкель

Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry как приемников FRET для mNeonGreen

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) стал чрезвычайно мощным инструментом для профилирования внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Благодаря слиянию генетически кодируемых флуоресцентных белков (FP) исследователи смогли обнаружить олигомеризацию белков, активацию рецепторов и транслокацию белков среди других биофизических явлений.Недавно были разработаны два ярких мономерных красных флуоресцентных белка, mRuby3 и mScarlet-I. Эти белки обладают значительно улучшенными физическими свойствами по сравнению с предыдущими поколениями мономерных красных FP, что должно способствовать более широкому распространению зеленого / красного FRET. Здесь мы оцениваем способность этих двух белков, наряду с mCherry, действовать в качестве акцептора FRET для яркого, мономерного, зелено-желтого FP mNeonGreen, используя методы интенсивной FRET и 2-фотонной флуоресцентной микроскопии с визуализацией времени жизни (FLIM) FRET.Сначала мы определили, что mNeonGreen является стабильным донором для 2-фотонных экспериментов FLIM в различных условиях визуализации. Затем мы проверили способность красных FP действовать как акцепторы FRET, используя тандемную конструкцию mNeonGreen-Red FP. С помощью этих конструкций мы обнаружили, что mScarlet-I и mCherry способны эффективно использовать FRET с mNeonGreen в спектроскопии и FLIM FRET. Напротив, mNeonGreen и mRuby3 FRET с гораздо меньшей эффективностью, чем предсказано в тех же анализах. Мы исследуем возможные объяснения этой низкой производительности и определяем, что свойства созревания белка mRuby3 являются основным фактором.В целом, мы обнаружили, что mNeonGreen является отличным донором FRET, и mCherry и mScarlet-I, но не mRuby3, действуют как практические приемники FRET, причем более яркий mScarlet-I выполняет mCherry в интенсиометрических исследованиях, а mCherry выполняет mScarlet-I. в случаях, когда постоянная эффективность в популяции имеет решающее значение.

Образец цитирования: McCullock TW, MacLean DM, Kammermeier PJ (2020) Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry в качестве акцепторов FRET для mNeonGreen.PLoS ONE 15 (2): e0219886. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886

Редактор: Вадим Э. Дегтяр, Калифорнийский университет в Беркли, США

Поступила: 3 июля 2019 г .; Одобрена: 23 января 2020 г .; Опубликован: 5 февраля 2020 г.

Авторские права: © 2020 McCullock et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Этот проект поддержан Национальным институтом здравоохранения (https://www.nih.gov/), финансирующим R00NS094761, и премией Фонда молодых исследователей NARSAD (https://www.bbrfoundation.org/). гранты-призы / нарсад-молодой-исследователь-гранты) DMM и Университет Рочестера (https://www.rochester.edu/) за промежуточное финансирование П.J.K .. T.W.M. была частично поддержана Фондом Джона Р. Мерлина Рочестерского университета. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Генетически кодируемые флуоресцентные белки (FP) обладают огромным прогрессом в базовой и трансляционной биологии. Начиная с клонирования Aequorea victoria green FP [1], начались масштабные и постоянные усилия по увеличению количества доступных FP с различными физическими и спектральными свойствами.В настоящее время существует огромное разнообразие FP во всех частях видимого спектра и даже в некоторых частях ультрафиолетового и инфракрасного спектров. Эти новые белки были либо клонированы из других организмов [2–4], либо разработаны путем эволюции уже идентифицированных FP [4–11]. Этот постоянно расширяющийся каталог FP был рассмотрен другими [12–14], и были созданы новые усилия и архивы для организации этой информации, такие как база данных FPbase [15].

По мере расширения каталога FP увеличиваются и потенциальные применения.Особо следует отметить использование FP в качестве биосенсоров, которые могут измерять сигнальные события, клеточные метаболиты, pH, напряжение и многое другое [16]. Многие из этих биосенсоров используют Förster Resonance Energy Transfer (FRET) как часть своего механизма отчетности, производя изменение эмиссии акцептора при возбуждении донора, когда изменяется интересующее количество. FRET также зависит от ориентации и расстояния [17], что означает, что величина передачи энергии (описываемая как эффективность FRET) может использоваться для изучения либо устойчивого состояния, либо динамических изменений во взаимодействиях с белками.Большая часть работы с использованием FP для FRET была выполнена с использованием пар Cyan / Yellow FP из-за их яркости, но эти белки страдают от большого перекрытия в их спектрах излучения, что делает интерпретацию результатов излишне сложной, среди других усложняющих факторов. Пары зеленого / красного FP предлагают большее разделение их спектров излучения, сохраняя при этом высокую степень спектрального перекрытия между излучением донора и поглощением акцептора, что обеспечивает эффективную передачу энергии. Зеленые / красные FP также имеют больший радиус Ферстера, чем большинство пар белков Cyan / Yellow, что позволяет использовать FRET на больших расстояниях.Возможность обнаружения FRET на больших расстояниях часто приводит к большему динамическому диапазону и чувствительности. Кроме того, клеточная токсичность для синего света была хорошо документирована в различных системах [18–22], что подчеркивает необходимость в лучших парах FRET с зеленым и красным смещением. Исторически сложилось так, что использование зеленого / красного FRET было ограничено из-за неблагоприятных флуоресцентных свойств красного белка [23–26], но сообщается, что несколько недавно разработанных мономерных красных флуоресцентных белков обладают улучшенным поглощением, яркостью и стабильностью, что указывает на то, что они могут действовать как высококачественный FRET. акцепторы для зеленых ФП.

Цель данного исследования — охарактеризовать эти недавно выпущенные красные FP как приемники FRET в надежде помочь более широкому распространению зеленого / красного FRET. Здесь мы исследуем способность красных FP следующего поколения, mRuby3 и mScarlet-I, а также mCherry действовать в качестве акцептора FRET для зелено-желтого донора FP mNeonGreen. mRuby3 [10] — это новейшая итерация серии красных FP на Ruby [8, 9], первоначально разработанная на основе eqFP611 [3]. Серия красных FP mScarlet [11] была разработана из синтетической генной матрицы, основанной на нескольких встречающихся в природе красных FP.В результате этой стратегии были получены три мономерных красных FP: яркий вариант mScarlet, быстро созревающий вариант mScarlet-I и вариант с быстрым временем жизни mScarlet-H. Для этого исследования мы используем mScarlet-I из-за его быстрого созревания, поскольку более медленное созревание менее идеально для исследований слитых белков. mCherry [6], широко используемый мономерный красный FP, разработанный из DsRed [2], включен в это исследование в качестве стандарта. В качестве донорной молекулы мы выбрали mNeonGreen [4], невероятно яркий и стабильный зелено-желтый FP, полученный в результате мономеризации тетрамерного желтого флуоресцентного белка LanYFP [4].

Материалы и методы

Культура клеток и трансфекция

клеток HEK293A (ATCC; Манассас, Вирджиния) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 1X GlutaMAX TM , 100 единиц / мл пенициллия, 100 мкг / мл стрептомицина (ThermoFisher Scientific; Waltham, MA) и 10 % термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Atlas Biologicals; Fort Collins, CO). Чтобы вызвать экспрессию флуоресцентных белков, клетки временно трансфицировали с использованием трансфекции полиэтиенимином (PEI).Для всех трансфекций указанные количества ДНК и PEI смешивали вместе в среде DMEM, не содержащей добавок, в течение 30 минут перед добавлением к клеткам в указанный момент времени. Для экспериментов FLIM клетки высевали на покровные стекла номер 1 (Warner Instruments; Hamden, CT) в 12-луночные планшеты (Nest Scientific USA; Rahway, NJ) за 48 часов до экспериментов. Затем клетки трансфицировали за 24 часа до начала экспериментов с использованием 0,6 мкг кДНК для указанной конструкции и 1,6 мкг PEI в 1 мл среды.Для конфокальных экспериментов клетки высевали в пластиковые культуральные чашки диаметром 35 мм (Corning; Corning, NY) за 48–72 часа до экспериментов с последующей трансфекцией 1 мкг кДНК с использованием 2,4 мкг PEI в 2 мл среды за 24–36 часов. до начала визуализации. Для спектральных экспериментов по FRET и иммуноблоттингу клетки помещали в пластиковые чашки для культивирования 10 см и позволяли расти до 70% конфлюэнтности. Затем клетки трансфицировали 4 мкг кДНК с использованием 7,8 мкг PEI за 24 часа до начала экспериментов.

Плазмиды и клонирование

Все конструкции, используемые в этой рукописи, получены из плазмиды pKanCMV-mClover3-mRuby3 (плазмида № 74252), доступной на Addgene.org (Addgene; Уотертаун, Массачусетс). NG-mRuby3 был создан путем удаления mClover3 и всех, кроме последних 5 аминокислот линкера, из pKanCMV-mClover3-mRuby3 с помощью обратной ПЦР, и на его место была вставлена ​​полная кодирующая последовательность mNeonGreen с помощью клонирования In-Fusion (Takara Bio; Mountain Вью, Калифорния). NG-mScarlet-I, NG-mScarlet и NG-mCherry были созданы путем удаления mRuby3 из NG-mRuby3 с помощью обратной ПЦР и вставки mScarlet-I, mScarlet или mCherry с использованием клонирования In-Fusion (Takara Bio). NG-Stop был создан с использованием того же продукта обратной ПЦР, что и NG-mScarlet-I и NG-mCherry, путем лигирования тупых концов с использованием NEBs KLD Mix (New England Biolabs; Ipswich, MA).NG-P2A-mRuby3 был получен из NG-mRuby3 с использованием обратной ПЦР и лигирования тупым концом для вставки последовательности P2A между линкером и mRuby3. Конструкцию mRuby3-GGSGG-NG получали с использованием мультифрагментной реакции In-Fusion с использованием продуктов ПЦР mRuby3 и mNeonGreen, где линкер GGSGG был присоединен к 3’-концу mRuby3 и 5’-концу продукта mNeonGreen с помощью ПЦР. mClover3-Stop получали удалением mRuby3 из вектора pKanCMV-mClover3-mRuby3 с помощью обратной ПЦР и последующего лигирования тупых концов.Аминокислотные последовательности для всех описанных здесь конструкций доступны в таблице S1. Ген mNeonGreen был получен из плазмиды pmNeonGreen-NT (Allele Biotechnology; Сан-Диего, Калифорния), ген mScarlet-I был получен из плазмиды Lck-mScarlet-I (Addgene, плазмида № 98821), и был получен ген mCherry. из плазмиды pmCherry-N1 (Takara Bio). Продукты реакции трансформировали, подвергали скринингу и амплифицировали в XL10-Gold Ultracompetent E . coli клеток (Agilent Technologies; Санта-Клара, Калифорния).Плазмиды выделяли с использованием набора E.Z.N.A Plasmid MiniPrep Kit (Omega Bio-teck; Norcross, Джорджия) или набора ZymoPure II Plasmid Midiprep Kit (Zymo Research; Ирвин, Калифорния) в соответствии с рекомендациями производителя. Все конструкции проверяли секвенированием по Сэнгеру (Eurofins Genomics; Louisville, KY) и хранили при концентрации 1 мкг / мкл в морозильной камере -20 ° C. Все плазмиды и конструкции, созданные для этой рукописи, доступны по запросу бесплатно.

Spectral FRET

Для спектральных экспериментов FRET клетки использовали через 24–36 часов после трансфекции.Единичную 10-сантиметровую чашку с клетками, экспрессирующими интересующую конструкцию, промывали буфером для визуализации (136 мМ NaCl, 560 мкМ MgCl 2 , 4,7 мМ KCl, 1 мМ Na 2 HPO 4 , 1,2 мМ CaCl 2 , 10 мМ HEPES, 5,5 мМ глюкозы) несколько раз и осаждали. Осадки клеток затем ресуспендировали в 500 мкл буфера для визуализации и переносили в одноразовые акрилатные кюветы (Spectrocell Inc; Ореланд, Пенсильвания). Сканирование излучения проводилось при длине волны 490–750 нм с использованием длины волны возбуждения 470 нм с использованием флуоресцентного спектрофотометра Cary Eclipse (Agilent Technologies).Клетки ресуспендировали энергичным пипетированием непосредственно перед сканированием. Данные были собраны в программном пакете Cary Eclipse Scan Application (Agilent Technologies) и экспортированы в Microsoft Excel (Microsoft Corporation) для анализа. Чтобы оценить эффективность FRET по сканированию выбросов, линейное размешивание было выполнено в Igor Pro (WaveMetrics Inc; Lake Oswego, штат Орегон) с использованием сканирования только доноров и только акцепторов для определения вкладов донора и акцептора. Из-за высокого уровня согласованности между NG-Stop и зарегистрированным спектром для очищенного mNeonGreen (S1 Фиг.), Очищенный спектр mNeonGreen использовался только в качестве сканирования донора для линейного несмешивания.Для каждого из акцепторов были созданы индивидуальные сканирования только акцепторов на основе экспериментально собранных данных и их сообщенного очищенного спектра (как обсуждается на S1 Fig). Все необработанные сканы, используемые для спектрального FRET, доступны на S1 Fig. После определения веса донора и акцептора эффективность FRET была оценена с использованием следующего уравнения [27]: (1) где E — эффективность FRET, W A и W D — веса компонентов излучения только донора и только акцептора, рассчитанные посредством линейного несмешивания, а QY A и QY D — квантовый выход акцептора. и донор соответственно.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на всю жизнь (FLIM)

Для экспериментов FLIM клетки использовали через 1 день после трансфекции, если не указано иное. За 30 минут до начала экспериментов среду заменяли буфером для визуализации и давали нагреться до комнатной температуры. Покровные стекла переносили в специально изготовленную камеру и устанавливали на предметный столик многофотонного сканирующего конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000-MP (Olympus; Токио, Япония). Возбуждение образцов достигалось с помощью фемтосекундного импульсного лазера Mai Tai Ti: Sapphire (Spectra-Physics; Санта-Клара, Калифорния), настроенного на 950 нм.Флуоресцентные затухания собирали с использованием водно-иммерсионного объектива XLPlan N 25x (NA 1,05) (Olympus) с разрешением 256×256 и временем задержки пикселей 20 мкс. Данные передавались с помощью микроскопа на установку FLIM, состоящую из двух детекторов H7422P Hamamatsu (Hamamatsu; Hamamatsu City, Япония) и карты счета одиночных фотонов с временной корреляцией (Becker and Hickl; Берлин, Германия). Для разделения донорной и акцепторной эмиссии использовали дихроик BrightLine FF552-Bi02-25×36 (Semrock; Rochester, NY). Излучение света в детектор донора дополнительно фильтровали с помощью фильтра BrightLine FF01-510 / 42-25, а излучение в детектор акцептора фильтровали с помощью фильтра BrightLine FF01-609 / 54-25 (Semrock).Микроскоп управлялся с помощью программного пакета FV10-ASW (Olympus), а система FLIM контролировалась с помощью программного обеспечения VistaVision с помощью программного пакета ISS (ISS Inc; Шампейн, Иллинойс). Анализ уменьшения времени жизни отдельных ячеек был выполнен с помощью VistaVision на ISS, а последующие времена жизни были проанализированы в Microsoft Excel (Microsoft Corporation; Редмонд, Вашингтон). Вкратце, клетки были изолированы в отдельные интересующие области (ROI), и данные о распаде для каждого пикселя в области выше порога суммировались для создания кривой затухания флуоресценции клеток.Затем эти кривые затухания были подогнаны, и времена жизни были извлечены с использованием нелинейной регрессии в режиме подгонки хвоста. Почти все кривые затухания были хорошо описаны с помощью одной экспоненциальной аппроксимации (как было определено с помощью анализа хи-квадрат, а также на глаз). Срок службы был извлечен из этих подгонок и использован для расчета эффективности FRET с использованием следующего уравнения [28]: (2)

Где E — эффективность FRET, 𝜏 DA — время жизни донора в присутствии акцептора, а 𝜏 D — время жизни только частиц донора (в данном случае среднее время жизни NG-Stop). .Для экспериментов, в которых было предварительно проведено фотообесцвечивание акцептора, клетки отбеливали сканированием лазером с длиной волны 559 нм при 100% мощности в течение 15 минут при тех же параметрах, что и данные о времени жизни.

Конфокальная микроскопия

Для экспериментов с конфокальной микроскопией клетки использовали через 1 день после трансфекции. За 30 минут до начала экспериментов среду заменяли буфером для визуализации и давали нагреться до комнатной температуры. Затем изображения были собраны на том же микроскопе, что и данные FLIM, с использованием сканера SIM и обычных лазерных линий 488 нм и 559 нм.Конфокальные изображения с широким полем зрения были получены с помощью водно-иммерсионного объектива XLUMPlanFl 20X (NA 0,95) (Olympus) с разрешением 2048×2048. Образец возбуждали, и излучение собиралось в каждом канале индивидуально, чтобы предотвратить просачивание. Зеленое излучение собирали через фильтр 505–540 нм, а красное излучение собирали через фильтр 575–675 нм. Все параметры визуализации были согласованы во всех экспериментах, чтобы облегчить сравнение. Данные были собраны в программном пакете FV10-ASW (Olympus) и экспортированы в программный пакет Fiji [29] для анализа, как описано в основном тексте и S3 Fig, с использованием плагина Coloc2.

Иммуноблоттинг

Образцы для иммуноблоттинга собирали через 24 часа после трансфекции. Клетки удаляли из чашки для культивирования и дважды промывали DPBS, не содержащим кальция и магния (Corning). После клеточного лизиса в присутствии ингибиторов протеазы концентрацию белка оценивали с использованием набора Pierce TM BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific), и 10 мкг общего белка загружали в 16% гель SDS-PAGE. После электрофореза белки переводили в 0.Нитроцеллюлозная мембрана 2 мкм (BioRad; Hercules, CA). Присутствие белка mNeonGreen проверяли с помощью моноклонального мышиного антитела против mNeonGreen [32F6] (Chromotek; Planegg-Martinsried, Германия) в разведении 1: 1000 и визуализировали с использованием вторичного антитела осла против мышиного IgG DyLight 680 (ThermoFisher Scientific). при разведении 1: 5000. Эту же мембрану дополнительно исследовали на наличие mClover3 с использованием кроличьих антител против GFP (ThermoFisher Scientific, A11122) в разведении 1: 1000 и визуализировали с помощью вторичных антител козьего анти-кроличьего IgG DyLight 800 (ThermoFisher Scientific) при 1 : 10000 разведение.Обнаружение было выполнено с использованием системы визуализации Odyssey 3 (Li-cor Biosciences; Lincoln, NE).

Статистика

Чтобы избежать предположений относительно распределения данных, вся статистическая значимость в этой рукописи была определена с помощью теста перестановок, реализованного с помощью специального скрипта Python, использующего библиотеку MLxtend [30], с использованием метода аппроксимации с 1 000 000 перестановок. Для случаев, когда между двумя сравниваемыми наборами данных было меньше 10 точек данных, использовался точный метод.

Результаты

Физические свойства и спектр белков в этом исследовании

Для этого исследования мы использовали мономерный желто-зеленый флуоресцентный белок mNeonGreen, чтобы проверить способность двух новых красных флуоресцентных белков, mRuby3 и mScarlet-I, а также mCherry действовать как акцепторы FRET. Флуоресцентные и физические свойства этих белков перечислены в таблице 1. mNeonGreen — один из самых ярких флуоресцентных белков на сегодняшний день с высоким квантовым выходом и коэффициентом экстинкции, благодаря чему его сигналы легко наблюдать.Кроме того, mNeonGreen также обладает высокой фотостабильностью [4] и быстро созревает, что делает его идеальным донором FRET. И mRuby3, и mScarlet-I имеют высокие коэффициенты экстинкции, что делает их отличными приемниками FRET. По сравнению с mCherry, эти белки также предлагают значительно более высокий квантовый выход, что указывает на то, что будет легче обнаруживать события передачи энергии, используя испускание одного из этих двух белков. Спектр поглощения и излучения mNeonGreen накладывается на спектр mRuby3, mScarlet-I и mCherry на рис. 1A – 1C.Для каждого красного флуоресцентного белка значения интеграла перекрытия (J (λ)) и радиуса Ферстера (R 0 ) с mNeonGreen перечислены в таблице 1. На основе этих фотофизических свойств ожидается, что все три красных FP будут FRET с mNeonGreen. Предполагая идентичное расположение между донором и акцептором, ожидается, что mRuby3 обеспечит наивысшую эффективность FRET, а mCherry — самую низкую эффективность FRET с mNeonGreen.

Рис. 1. Спектр mNeonGreen, mRuby3, mScarlet-I и mCherry.

Абсорбция (пунктирные линии) и спектр излучения (сплошные линии) очищенного mNeonGreen (зеленые линии), наложенные на спектр очищенного mRuby3 (A) , mScarlet-I (B) и mCherry (C) .Спектры были получены из эталона, указанного в таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g001

Тандемные конструкции mNeonGreen-RFP показывают низкую производительность mRuby3

Чтобы проверить способность красных FP действовать как акцепторы FRET, мы сконструировали тандемные конструкции FP, состоящие из полной кодирующей последовательности mNeonGreen (NG), за которой следует короткий аминокислотный линкер (SGLSKGEE), а затем полная кодирующая последовательность красного FP (рис. 2A с аминокислотными последовательностями, доступными в таблице S1 в дополнительной информации).Хотя линкер из 8 аминокислот относительно короткий, включение полного c-конца mNeonGreen (который кажется неструктурированным или отсутствует в структуре mNeonGreen [31]) создает эффективный линкер из 17 аминокислот. Также была создана конструкция mNeonGreen-Stop, которая содержит полную кодирующую последовательность mNeonGreen, линкер из 8 аминокислот, а затем стоп-кодон, действующий как донорская контрольная конструкция. Чтобы определить, будет ли mNeonGreen FRET с красными FP в этих конструкциях, мы временно трансфицировали каждую конструкцию в клетки HEK293 и измерили эмиссию акцепторного FP при возбуждении с длиной волны, которая будет возбуждать только донора.Когда клетки, экспрессирующие конструкции NG-Stop, возбуждались светом с длиной волны 470 нм, был получен спектр, сравнимый с тем, что сообщалось для очищенного mNeonGreen (рис. 2В, рис. S1 в дополнительной информации). При анализе тандемных конструкций NG-красный FP появляется второй пик, соответствующий красному FP. Примерный спектр для конструкций NG-mRuby3, NG-mScarlet-I и NG-mCherry показан на рис. 2C, 2D и 2E, соответственно, розовым цветом, вместе с рассчитанными донорными (зеленый) и акцепторными компонентами (красный), определенными посредством линейного несмешивания, а также соответствие (черная пунктирная линия), полученное при добавлении рассчитанных донорных и акцепторных компонентов.Обратите внимание, что во всех случаях подгонка без микширования точно воспроизводила следы необработанных данных. Используя донорные и акцепторные компоненты, эффективность FRET каждой конструкции можно оценить с помощью уравнения. 1 (Рис. 2F, с необработанными кривыми, доступными на S1 Рис.). При трех независимых трансфекциях для каждой конструкции конструкция NG-mScarlet-I и NG-mCherry продемонстрировала эффективность FRET 29 ± 0,5% и 22 ± 0,8% соответственно. Удивительно, но конструкция NG-mRuby3 показала оценочную эффективность FRET в 16 ± 0,1%.Эта низкая производительность по сравнению с NG-mScarlet-I или NG-mCherry была весьма неожиданной, учитывая физические и спектральные свойства, указанные для mRuby3 [10], которые предсказывали, что он будет лучшим акцептором FRET из трех красных FP для mNeonGreen.

Рис. 2. Спектральный FRET каждой тандемной конструкции mNeonGreen-Red FP.

(A) Мультяшная схема тандемных конструкций mNeonGreen-Red FP, используемых для экспериментов FRET. (B) Сканирование среднего излучения клеток, экспрессирующих NG-Stop (черный), при возбуждении при 470 нм, наложенное на представленный спектр для очищенного mNeonGreen зеленого цвета (n = 3 независимых трансфекции).Пример необработанного спектра излучения (розовый) тандема (C) NG-mRuby3, (D) NG-mScarlet-I и (E) NG-mCherry при возбуждении на длине волны 470 нм. Пунктирная черная линия показывает сумму донорного (зеленого) и акцепторного (красный) компонентов, вычисленную путем линейного несмешивания. (F) Эффективности FRET, рассчитанные из спектра для каждой конструкции (n = 3). *** = P <0,0005 между указанными условиями.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g002

mNeonGreen — подходящий донор для двухфотонного FLIM

Чтобы подтвердить наши спектральные результаты FRET, мы обратились к более точному методу 2-Photon Fluorescent Lifetime Imaging (FLIM). Сначала мы попытались определить, является ли mNeonGreen подходящим донором для экспериментов с 2-Photon FLIM. Донор FRET с хорошим поведением мог бы легко возбуждаться двухфотонным лазером, быть стабильным при различных мощностях двухфотонного лазера и демонстрировать стабильное моноэкспоненциальное время жизни [32]. Насколько нам известно, существует только один отчет о производительности mNeonGreen с использованием двухфотонного освещения [33].Это исследование продемонстрировало, что флуоресцентные белки с синим смещением имеют тенденцию работать лучше при двухфотонном возбуждении, чем более желтые флуоресцентные белки со смещением, но не исключили возможность использования mNeonGreen в двухфотонных исследованиях. Используя свет с длиной волны 950 нм и конструкцию NG-Stop, мы оценили эффективность mNeonGreen в 2-фотонном FLIM в различных условиях, используя коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов. При различных мощностях лазера mNeonGreen обеспечивает стабильный срок службы 3,05 ± 0,01 нс в течение 50 кадров сбора данных (рис. 3A).Этот срок службы был стабильным до 300 кадров сбора данных для всех, кроме самой высокой протестированной мощности лазера, 25 Вт / см 2 , в которой время жизни линейно уменьшалось до 87 ± 4,5% от своего начального значения после 300 кадров (рис. 3B). Напротив, значительное фотообесцвечивание наблюдалось при мощности лазера выше 15 Вт / см 2 (рис. 3C) с обесцвечиванием 20 Вт / см 2 и 25 Вт / см 2 примерно 48 ± 14% и 94 ± 3% интенсивность образца соответственно через 300 кадров. Примеры следов распада одной ячейки, собранные в последовательных интервалах из 50 кадров, показаны при 15 Вт / см 2 (рис. 3D) и 25 Вт / см 2 (рис. 3E).Нормализация следов затухания к пиковой интенсивности для примера 25 Вт / см 2 демонстрирует сокращение срока службы и ухудшение качества данных в процессе сбора данных на этой мощности (рис. 2F). Чтобы служить в качестве сравнения, мы повторили эти эксперименты с использованием EGFP (S2 рис). EGFP обеспечивает стабильный срок службы 2,63 ± 0,01 нс при различных мощностях лазера. Подобно mNeonGreen, этот срок службы был стабильным для 300 кадров захвата для каждой мощности лазера, отличной от 25 Вт / см 2 .Кроме того, уровни мощности выше 15 Вт / см 2 также вызывали значительное фотообесцвечивание более 300 кадров, хотя и в меньшей степени, чем то, что наблюдалось с mNeonGreen (S2 Рис). Учитывая эти данные, мы пришли к выводу, что mNeonGreen является подходящим донором для двухфотонных экспериментов FLIM, когда время жизни достигается при мощности лазера 15 Вт / см 2 или меньше. Для всех дальнейших экспериментов FLIM данные собирались при мощности лазера 5–10 Вт / см 2 для 100–150 кадров в зависимости от яркости кюветы.

Рис. 3. mNeonGreen хорошо работает при различных мощностях лазера для двухфотонной съемки FLIM во временной области.

(A) Данные о продолжительности жизни, собранные для отдельных клеток HEK293, экспрессирующих цитозольный mNeonGreen при различной мощности лазера до 25 Вт / см 2 после 50 кадров. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Время жизни и интенсивность (C) образцов, снятых на протяжении 300 кадров при различной мощности лазера. * = P <0,05, ** = P <0.005, и *** = P <0,0005 по сравнению с набором данных 5 Вт / см 2 , сопоставленным с кадром. N для каждого образца составляет 5 Вт / см 2 : 11 ячеек, 10 Вт / см 2 : 10 ячеек, 15 Вт / см 2 : 14 ячеек, 20 Вт / см 2 : 9 ячеек, 25 Вт / см 2 : 11 ячеек. (D) Пример кривых уменьшения срока службы, полученных при 15 Вт / см 2 на 300 кадрах. (E) Пример спада времени жизни и нормализованного спада (F) , полученного при 25 Вт / см 2 на 300 кадрах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g003

Измерения FLIM-FRET подтверждают плохую работу mRuby3

При использовании FLIM FRET определяется как уменьшение времени жизни донора в присутствии акцептора [28]. Этот метод имеет преимущество определения состояния FRET между mNeonGreen и красным FP независимо от излучения красных FP, что позволяет нам определять эффективность FRET для каждой конструкции без необходимости учитывать различия между каждым красным FP.В ходе нескольких независимых трансфекций конструкция mNG-Stop давала только донорское время жизни 3,05 ± 0,02 нс (фиг. 4A). Когда mScarlet-I или mCherry присутствуют в тандемах, время жизни mNeonGreen сокращается до 2,22 ± 0,06 нс и 2,23 ± 0,03 нс соответственно (рис. 4A). Это приводит к эффективности FRET конструкции NG-mScarlet-I 27 ± 2% и эффективности 27 ± 1% для конструкции NG-mCherry (рис. 4B). Анализ конструкции NG-mRuby3 показывает даже худшую производительность mRuby3, чем то, что было оценено с помощью спектрального FRET (рис. 2F).Среднее время жизни конструкции NG-mRuby3 составляло 2,92 ± 0,03 нс (рис. 4A), в результате чего эффективность FRET составляла всего 4 ± 0,9% (рис. 4B). Действительно, 35 клеток после 3 независимых трансфекций (более половины всех взятых образцов клеток) продемонстрировали время жизни в диапазоне от того, что было собрано для конструкции NG-Stop, тогда как никакие клетки, экспрессирующие NG-mScarlet-I или NG-mCherry, не имели времени жизни в этом диапазоне. (Рис. 4A). Примерные кривые распада, представляющие среднее значение для каждой конструкции, показаны на фиг. 4C, а примерные карты времени жизни клеток HEK293, экспрессирующих каждую конструкцию, показаны на фиг. 4D.

Рис. 4. Время жизни тандемных конструкций mNeonGreen-Red FP.

(A) Время жизни mNeonGreen в индивидуальных клетках, экспрессирующих тандемную конструкцию слияния mNeonGreen-Red Protein. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Расчеты эффективности FRET для каждой тандемной конструкции. *** = P <0,0005 по сравнению с NG-Stop, а # означает P <0,0005 по сравнению с NG-Stop и P <0,0005 по сравнению с NG-mRuby3. NG-mScarlet-I и NG-mCherry статистически не различаются (P = 0.75) (C) Пример кривых распада для каждого тандема, представляющий среднее время жизни всех клеток для каждой конструкции. (D) Пример тепловой карты срока службы для одного кадра для каждой конструкции. N для каждой конструкции имеет следующий вид: NG-Stop: 68 клеток, NG-mRuby3: 63 клетки, NG-mScarlet-I: 64 клетки и NG-mCherry: 64 клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g004

Конфокальная визуализация демонстрирует более низкую, чем ожидалось, красную флуоресценцию для конструкции mNeonGreen-mRuby3

Для дальнейшего исследования плохой работы mRuby3 как акцептора FRET мы обратились к конфокальной микроскопии для анализа поведения каждой тандемной конструкции.Присутствие mNeonGreen и красных FP было независимо исследовано путем последовательного возбуждения лазерами 488 нм и 559 нм, при этом излучения каждого канала собирались отдельно для предотвращения просачивания. Примеры изображений с широким полем клеток, экспрессирующих каждую конструкцию, показаны на фиг. 5A. Качественно на объединенном изображении зеленого и красного каналов можно увидеть, что клетки, экспрессирующие конструкцию NG-mRuby3, имели широко варьирующуюся интенсивность зеленой и красной флуоресценции. Интересно, что регулярно наблюдались клетки, которые, по-видимому, содержат высокие уровни mNeonGreen и низкие уровни mRuby3 или наоборот, наряду с клетками, которые, по-видимому, содержат оба белка.Эта неоднородность также была отмечена в конструкциях NG-mScarlet-I и NG-mCherry, но с гораздо меньшей частотой (рис. 5A). Этот результат был довольно неожиданным, учитывая, что конструкции были разработаны для экспрессии mNeonGreen и красного FP стехиометрически и в тандеме. Теоретически можно ожидать, что выражение таких тандемных конструкций приведет к фиксированному отношению интенсивности зеленого к красному, где интенсивность красного изменяется в зависимости от яркости красного FP, а интенсивность зеленого изменяется из-за изменений в степени FRET.Чтобы проверить это предсказание и количественно оценить неоднородность для каждой конструкции, мы исследовали интересующие области (ROI), содержащие одну ячейку, извлекли интенсивность зеленого и красного для этой ячейки после вычитания фона и построили полученные интенсивности на уровне пикселей. Затем полученные зелено-красные графики интенсивности для каждой ячейки были подогнаны с помощью линейной регрессии. Пример этого рабочего процесса показан на рис. S3. Хотя абсолютное значение этого наклона будет различным для каждой пары флуорофоров и для разных условий визуализации, изменения этого наклона от клетки к клетке в одних и тех же условиях визуализации будут указывать на неоднородность каждая конструкция.Как и ожидалось от тандемной конструкции и на основе качественных оценок изображений (рис. 5A), гистограммы наклонов для отдельных клеток, экспрессирующих конструкции NG-mCherry и NG-mScarlet-I, показали разумное распределение и узкий разброс наклонов (рис. 5C и 5D). Это указывает на то, что большинство клеток, экспрессирующих эти конструкции, содержат фиксированное соотношение mNeonGreen к красному FP. Напротив, гистограмма наклонов для клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, не была столь равномерно распределена (фиг. 5B). Действительно, большинство клеток, экспрессирующих эту конструкцию, имеют наклон, близкий к 0, предполагая, что эти клетки содержат измеримые уровни mNeonGreen, но низкие уровни флуоресцентного mRuby3.Интересно, что это отсутствие обильной красной флуоресценции не происходит из-за недостатка белка mRuby3, поскольку вестерн-блоттинг клеток, трансфицированных NG-mRuby3, дает такую ​​же картину полос, как и клетки, трансфицированные NG-mScarlet-I и NG-mCherry (S4 Фиг.). Важно отметить, что в клетках, трансфицированных NG-mRuby3, нет полосы меньшего размера мономера, что указывает на то, что наши тандемные конструкции, как правило, не повреждены и исключает возможность производства mNeonGreen без mRuby3. Взятые вместе, эти данные обеспечивают механистическое объяснение наших данных FLIM, в которых все клетки, экспрессирующие конструкции NG-mScarlet-I и NG-mCherry, демонстрируют устойчивый FRET, тогда как подавляющее большинство конструкций NG-mRuby3 — нет.Кроме того, они предполагают, что низкая производительность NG-mRuby3 может быть связана с плохим созреванием акцептора по сравнению с NG-mScarlet-I и даже NG-mCherry.

Рис. 5. Конфокальная микроскопия тандемных конструкций.

(A) Примеры изображений конструкций NG-Red FP при прямом возбуждении лазерами с длиной волны 499 нм или 559 нм. Гистограммы наклонов корреляций интенсивности красного / зеленого для отдельных клеток, экспрессирующих (B), NG-mRuby3 (n = 1077 клеток), (C), NG-mScarlet-I (n = 1745 клеток) и ( D) NG-mCherry (n = 1557 клеток).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g005

mRuby3 демонстрирует аналогичное поведение в нескольких конфигурациях и поведение, подобное медленно созревающему варианту mScarlet

Чтобы лучше определить, является ли поведение mRuby3 специфическим для нашей системы или присуще самому mRuby3, мы разработали несколько дополнительных тандемных конструкций. Во-первых, мы поменяли ориентацию тандема, чтобы увидеть, является ли mRuby3 более толерантным к с-концевому слиянию, и заменили линкер на глицин-сериновый линкер немного меньшего размера (GGSGG).Эта конструкция mRuby3-GGSGG-NG преформирована аналогично исходной конструкции NG-mRuby3, давая среднее время жизни 2,96 ± 0,02 нс (фиг. 6A), что соответствует эффективности FRET 4 ± 1% (фиг. 6B). Конфокальный анализ этой конструкции (рис. 6C и 6D) также выявляет фенотип, аналогичный NG-mRuby3, где большинство клеток имеют наклон, близкий к 0, что указывает на то, что большинство клеток имеют детектируемую флуоресценцию mNeonGreen, но не имеют флуоресценции mRuby3. Затем мы вставили оптимизированную пептидную последовательность самосплайсинга (пептид P2A) [34] между NG и mRuby3 в конструкции NG-Ruby3.Эта последовательность вызывает событие пропуска рибосомы во время трансляции, что приведет к высвобождению полипептида NG из рибосомы во время трансляции, прежде чем повторно инициировать трансляцию части конструкции mRuby3, в результате чего два отдельных белка транслируются с одного и того же транскрипта. Примечательно, что мы сконструировали конструкцию так, что большая часть дополнительной пептидной последовательности P2A будет присоединена к NG, с единственным добавлением к mRuby3, являющимся N-концевым пролином после успешного расщепления. Клетки, экспрессирующие NG-P2A-mRuby3, имели среднее время жизни 3.09 ± 0,01 нс (фиг. 6A), и время жизни было статистически неотличимо от времени жизни клеток, экспрессирующих NG-Stop, собранных в тот же день. Этот результат ожидался, поскольку NG и mRuby3 в этих клетках больше не должны быть связаны друг с другом, и действительно, вестерн-блот-анализ этой конструкции подтверждает, что пептид P2A расщепляется с высокой эффективностью (S4 фиг.). К сожалению, хотя эта конструкция показывает только незначительные улучшения в поведении mRuby3, как определено конфокальным анализом (рис. 6C и 6E), который все еще показывает высокую долю клеток с почти нулевым наклоном, но также показывает вторичный, ненулевой пик.

Рис. 6. Поведение отдельных тандемных конструкций, содержащих mRuby3 и mScarlet.

(A) Время жизни отдельного набора экспрессирующих NG-Stop клеток со временем жизни 2 новых тандемных конструкций, содержащих mRuby3, и конструкции, содержащей mScarlet. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. *** = P <0,0005 по сравнению с NG-Stop. NG-Stop и NG-P2A-mRuby3 статистически не различаются (P = 0,65). N для измерения времени жизни каждой конструкции имеет следующий вид: NG-Stop: 64 клетки, mRuby3-GGSGG-NG: 66 клеток, NG-P2A-mRuby3: 69 клеток и NG-mScarlet: 77 клеток. (B) Средняя эффективность FRET для каждой из новых тандемных конструкций. (C) Пример объединения конфокальных изображений клеток HEK293, экспрессирующих каждую из новых тандемных конструкций. Объединенные гистограммы наклонов клеток, экспрессирующих (D), mRuby3-GGSGG-NG, (E), NG-P2A-mRuby3 и (F) NG-mScarlet. N для конфокальных измерений каждой конструкции имеет следующий вид: mRuby3-GGSGG-NG: 2302 клеток, NG-P2A-mRuby3: 1548 клеток и NG-mScarlet: 1150 клеток.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0219886.g006

В то время как mScarlet-I и mCherry созревают с периодом полураспада 36 и 15 минут соответственно, mRuby3, как сообщается, имеет полупериод созревания 136,5 минут. Чтобы проверить, может ли большая разница во времени созревания привести к фенотипу, который мы видим для mRuby3, мы мутировали mScarlet-I в тандеме NG-Scarlet-I в яркий, но медленно созревающий вариант Scarlet, mScarlet, введя мутацию I74T. Сообщается, что этот медленно созревающий вариант имеет период полувыведения 132.4 минуты в тех же условиях, что и измерения созревания mRuby3. Клетки, экспрессирующие NG-mScarlet, характеризовались сильно изменяющимся временем жизни, составляющим в среднем 2,67 ± 0,05 нс, что приводило к средней эффективности FRET 13 ± 2% (фиг. 6A и 6B). В конфокальном режиме клетки, экспрессирующие этот NG-Scarlet, также демонстрируют гетерогенный фенотип (рис. 6C), но большинство клеток демонстрируют ненулевой наклон, указывающий на то, что большинство клеток демонстрируют как зеленую, так и красную флуоресценцию (рис. 6F).

Наконец, мы обратились к анализу поведения mRuby3 с эволюционно отличным зеленым FP, mClover3.Используя тандемную конструкцию mClover3-mRuby3, доступную от Addgene, мы создали конструкцию mClover3-Stop, которая служит только контролем донора, и проанализировали способность mRuby3 действовать как акцептор для mClover3 с помощью FLIM. В дополнение к использованию другого зеленого FP, эта конструкция также использует линкер из 12 аминокислот, а не эффективные линкеры из 17 или 15 аминокислот, которые мы использовали до сих пор (таблица S1). Клетки, экспрессирующие mClover3-Stop, демонстрируют стабильное моноэкспоненциальное время жизни 3,11 ± 0,01 нс (S5 фиг.).Когда mRuby3 присутствует в конструкции, чтобы действовать как акцептор, это время жизни сокращается в среднем до 2,81 ± 0,05 нс (S5 Рис.). Это приводит к средней эффективности FRET 10 ± 2%. Также стоит отметить, что, как и NG-mScarlet, mClover3-mRuby3 имеет большой диапазон времени жизни. Учитывая, что спектральные и физические свойства mClover3 очень похожи на mNeonGreen, это, по-видимому, указывает на небольшое улучшение производительности mRuby3, либо из-за линкера сортировщика, либо из-за включения mClover3 вместо mNeonGreen.Несмотря на это, по-прежнему наблюдается высокая гетерогенность в выражении этого тандема (S5 Fig), что указывает на то, что основные проблемы с mRuby3 все еще присутствуют.

Экспрессия mNeonGreen-mRuby3 в течение более длительных периодов времени улучшает его производительность

Наши предыдущие данные показали, что плохие акцепторные свойства mRuby3 частично могут быть связаны с неэффективным созреванием. Чтобы проверить это в дальнейшем, мы провели эксперименты FLIM в течение пяти дней после временной трансфекции конструкцией NG-mRuby3.Как видно на фиг. 7A, среднее время жизни mNeonGreen в конструкции NG-mRuby3 снижается с 2,92 ± 0,03 нс через 1 день после трансфекции (DPT) до 2,41 ± 0,09 нс 5 DPT. Это приводит к изменению средней эффективности FRET с 4 ± 0,9% 1 DPT до эффективности 21 ± 3% эффективности 5 DPT трансфекции (рис. 7B). Примеры карт продолжительности жизни отдельных клеток, экспрессирующих NG-mRuby3 2–5 DPT, показаны на фиг. 7C, а примерная карта продолжительности жизни для 1 DPT показана на фиг. 4D. Примеры флуоресцентных кривых затухания для каждой DPT доступны на S6 Рис.С течением времени количество ячеек, показывающих время жизни в пределах диапазона NG-Stop, также уменьшалось. Однако можно было наблюдать даже 5 клеток DPT, у которых время жизни донора было примерно таким же, как у них. Это указывает на то, что хотя неэффективное созревание в клетках млекопитающих может быть частью причины плохой работы mRuby3 в предыдущих экспериментах, это, вероятно, не единственный способствующий фактор. Чтобы гарантировать, что изменения, наблюдаемые с течением времени для конструкции NG-mRuby3, были вызваны изменениями, происходящими с белком mRuby3, а не с mNeonGreen, время жизни mNeonGreen конструкций NG-mRuby3 определяли до и после фотообесцвечивания акцептора на 5 DPT (рис. 7D). .Независимо от продолжительности жизни каждой клетки до фотообесцвечивания акцептора, все клетки показали время жизни, аналогичное времени жизни конструкции NG-Stop после фотообесцвечивания акцептора. Фиг. 7F показывает примерные карты продолжительности жизни двух клеток, экспрессирующих NG-mRuby3 через 5 дней после трансфекции до и после фотообесцвечивания акцептора, а примерные следы флуоресцентного распада можно найти на S6 Фиг. это указывает на то, что изменения, которые претерпела конструкция NG-mRuby3, были вызваны изменениями, происходящими с белком mRuby3.

Рис. 7. FRET NG-mRuby3 через 1–5 дней после трансфекции.

(A) Время жизни клеток, экспрессирующих конструкцию NG-mRuby3, через 1–5 дней после трансфекции (DPT) 1 DPT реплицируется из фиг. 3A для справки. Черные полосы указывают средний срок службы ± 95% доверительный интервал. Зеленая заливка указывает диапазон продолжительности жизни, наблюдаемый для конструкции NG-Stop. *** = P <0,0005 по сравнению с 1 DPT, и # = P <0,0005 по сравнению с 1 DPT и P <0,0005 по сравнению с днем ​​ранее.N для каждого условия выглядит следующим образом: 2 DPT: 30 ячеек, 3 DPT: 34 ячейки, 4 DPT: 35 ячеек и 5 DPT: 31 ячейка. (B) Средняя эффективность FRET для NG-mRuby3 1–5 DPT. (C) Примеры карт продолжительности жизни, собранные каждый день тестирования. (D) Данные о времени жизни клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, через 5 дней после трансфекции до и после фотообесцвечивания акцептора (n = 15). *** = P <0,0005 после фотообесцвечивания по сравнению с до фотообесцвечивания. (E) Примеры карт продолжительности жизни одних и тех же клеток до и после фотообесцвечивания акцептора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g007

Обсуждение

Разработка и проверка ярких мономерных пар зеленый / красный FP значительно увеличит общее распространение зеленого / красного FRET. Яркие флуорофоры упрощают обнаружение и повышают соотношение сигнал / шум. Использование зеленого и красного флуорофоров имеет несколько явных преимуществ, включая снижение токсичности для источника возбуждения, большее спектральное разделение, большие радиусы Ферстера и лучшую проницаемость тканей для длин волн возбуждения и излучения.Эти преимущества позволяют проводить более новые, более точные и точные исследования с меньшим количеством вмешивающихся факторов, чем то, что можно было бы сделать с парами FRET голубой / желтый. mNeonGreen — идеальный донор для экспериментов Green / Red FRET. Его спектр возбуждения и излучения со смещением в желтый цвет допускает высокую степень перекрытия с красными FP, а также может возбуждаться синим светом с меньшей энергией, чем голубой, или более смещенным в синий цвет зеленым FP. Кроме того, mNeonGreen необычайно яркий при однофотонном освещении, что делает его сигналы удобными для наблюдения.Сообщается, что как mScarlet-I, так и mRuby3 имеют одни из самых высоких коэффициентов экстинкции среди любых красных FP, а также являются одними из самых ярких мономерных красных FP на сегодняшний день. Эти факты указывают на то, что из них должны получиться отличные акцепторы FRET, что сделает зеленый / красный FRET более доступным для исследователей. В этом исследовании мы стремились проверить это предсказание с помощью различных оптических методов.

Мы проверили способность этих двух новых красных FP — mRuby3 и mScarlet-I — вместе с mCherry действовать как акцепторы FRET для mNeonGreen, используя подход тандемных белков.Первоначально мы использовали интенсиометрический спектральный FRET для оценки эффективности FRET между mNeonGreen и красными FP (рис. 2). В этом анализе NG-mScarlet-I продемонстрировал самую высокую эффективность FRET, за ним следовали NG-mCherry, а затем NG-mRuby3 (рис. 2F). Это было удивительно, учитывая, что сообщаемые свойства mRuby3 предсказывают, что он будет лучшим акцептором для mNeonGreen. В частности, mRuby3 имел самую высокую степень перекрытия между его спектром возбуждения и спектром излучения mNeonGreen, и он имеет самый высокий коэффициент экстинкции из трех красных FP в этом исследовании (таблица 1).Эти эксперименты также продемонстрировали преимущества этих новых белков по сравнению с mCherry, поскольку mScarlet-I производил почти в 3 раза больше интенсивности, чем mCherry, несмотря только на 7% -ную разницу в расчетной эффективности, а mRuby3 производил почти в 1,5 раза интенсивность mCherry, несмотря на NG- mRuby3 демонстрирует более низкую эффективность FRET, чем NG-mCherry. Это отражает разницу в коэффициенте экстинкции и квантовом выходе между этими двумя белками и mCherry и демонстрирует, как mScarlet-I является лучшим общим акцептором, который обеспечит больший сигнал и больший динамический диапазон для интенсивных экспериментов FRET на основе зеленого-красного.

Чтобы подтвердить эти результаты, мы обратились к более точной методике FLIM. Преимущество FLIM состоит в том, что необходимо наблюдать только за донором, что устраняет необходимость корректировать наши данные с учетом различий в физических свойствах акцепторов, о которых сообщают другие. Кроме того, наша установка FLIM позволяет анализировать отдельные клетки, чтобы получить более подробный профиль поведения тандемной конструкции. После определения mNeonGreen в качестве подходящего донора для экспериментов 2-Photon FLIM (рис. 3), мы использовали этот метод для измерения эффективности FRET каждого тандема в исследовании (рис. 4).Мы обнаружили, что как mScarlet-I, так и mCherry были способны эффективно обрабатывать FRET с помощью mNeonGreen почти в одинаковой степени, но mRuby3 не мог вызвать значительную FRET (рис. 4A и 4B). Было несколько удивительно видеть, что mCherry предварительно сформирован так же хорошо, как mScarlet-I в качестве акцептора FRET в наших экспериментах с FLIM, несмотря на значительно более низкий коэффициент экстинкции. Это может быть демонстрацией быстрого созревания mCherry, что может позволить получить максимально возможное количество полностью развитых тандемов.Для дальнейшего исследования плохой работы mRuby3s мы использовали конфокальную микроскопию, чтобы выявить большую гетерогенность в способе экспрессии тандема NG-mRuby3 (рис. 5A и 5B), при этом многие клетки демонстрируют либо красную, либо зеленую флуоресценцию без другой. Это было несмотря на анализ вестерн-блоттинга, предполагающий, что большинство клеток должно экспрессировать полноразмерный тандемный белок (S4 фиг.). Такое поведение было постоянным для трех дополнительных конструкций mRuby3 (рис. 6). Изменение ориентации конструкций и укорочение линкера между ними (Ruby3-GGSGG-NG), по-видимому, практически не повлияло на работу mRuby3 как акцептора или наблюдаемую гетерогенность в конфокальном режиме (рис. 6).Лишь незначительные улучшения наблюдались в конфокальной конструкции с конструкцией NG-P2A-mRuby3, которая позволила бы mRuby3 созревать без ковалентной связи с NG (конформация, которая препятствовала FRET, но позволяла нам оценить поведение mRuby3 как независимого белка). Примечательно, что это поведение было похоже на то, что наблюдалось с медленно созревающим вариантом Scarlet, mScarlet (рис. 6), предполагая, что низкая производительность mRuby3 может быть связана с его более длительным временем созревания. Учитывая эти результаты, были проведены эксперименты с конструкцией NG-mRuby3 через несколько дней после трансфекции, и действительно было обнаружено, что предоставление конструкции NG-mRuby3 большего времени для созревания улучшает ее характеристики в качестве акцептора FRET (фиг. 7).

Теоретически более высокий коэффициент экстинкции и квантовый выход mRuby3 предсказывает, что он должен превзойти mCherry и mScarlet-I. Однако, что шокирует, мы обнаружили противоположный результат (Рис. 2 и Рис. 4). Даже в самых идеальных испытанных условиях (через 4 или 5 дней после трансфекции) тандем NG-mRuby3 все еще не достиг эффективности FRET тандемов NG-mScarlet-I и NG-mCherry (рис. 7). Это контрастирует с предыдущим сообщением об очень хорошем преформировании аналогичной конструкции mNeonGreen-mRuby3, достигающей почти 40% эффективности как в клетках HEK293, так и в клетках Hela [10].На данный момент причины этого несоответствия неясны, хотя сходство в длине и составе линкера, времени трансфекции и типах клеток предполагает, что это не связано с различием в составе используемых тандемных конструкций или различиями в условиях, в которых были проведены эксперименты (для каких условий сообщалось). Это несоответствие также сохраняется для конструкции mClover3-mRuby3 (S5 Рис), опять же, по неизвестным причинам. Кроме того, в ходе наших экспериментов мы обнаружили, что спектр излучения mRuby3 в этом тандеме был немного смещен влево на 6 нм по сравнению с тем, что сообщается очищенным mRuby3 [10] (S1 Рис).Об этом открытии ранее не сообщалось, и, хотя этот сдвиг был незначительным, его необходимо было скорректировать, чтобы должным образом соответствовать нашим данным. Причина этого спектрального сдвига остается неясной, но может быть просто результатом того, что mRuby3 имеет несколько иное поведение в клетках по сравнению с очищенной системой. Это также может быть связано с фотохромным поведением, о котором ранее сообщалось для mRuby3 [11]. Какой бы ни была причина, непредсказуемые изменения в спектре очень важны для экспериментов FRET, поскольку они могут привести к изменениям интенсивности флуоресценции, которые могут быть ошибочно интерпретированы как изменения в состоянии FRET.Возможно, что это поведение также повлияло на наши спектральные эксперименты с FRET (рис. 2) и могло объяснить несоответствие между вычисленными эффективностями FRET для конструкции NG-mRuby3 в спектральных анализах FRET и FLIM.

Хотя к настоящему времени опубликовано несколько исследований с использованием mRuby3, исследования, в которых использовался его предшественник, mRuby2, в целом показали положительные результаты [4, 9–11, 35, 36]. Хотя в исследовании, аналогичном нашему, с использованием зеленого FP mClover в качестве донора сообщается о гораздо более низкой, чем ожидалось, эффективности при использовании mRuby2 в качестве акцептора [37].Общность между нашим и их исследованиями заключается в использовании линий клеток млекопитающих. Это вместе с нашими данными, представленными здесь, предполагают, что низкая или медленная эффективность созревания серии Ruby является основным фактором низкой производительности mRuby3 через 1-3 дня после трансфекции. Проблемы созревания также могут сочетаться с вариабельностью скорости оборота белка от клетки к клетке или проблемами стабильности белка, и комбинация этих факторов, вероятно, объясняет высокую степень гетерогенности, которую мы наблюдаем в конфокальном режиме с нашими конструкциями mRuby3, а также с вариантом с медленным созреванием. mScarlet (Рис. 5 и Рис. 6).

В целом мы обнаружили, что и mCherry, и mScarlet-I действуют как отличные акцепторы для mNeonGreen в нашей модельной системе, причем каждый белок предлагает определенные преимущества в зависимости от используемых систем обнаружения. Кроме того, мы продемонстрировали, как факторы, выходящие за рамки классически рассматриваемых параметров FRET (квантовый выход донора, спектральное перекрытие и коэффициент экстинкции акцептора), могут непредсказуемо влиять на системы FRET. Именно один из этих «неклассических» факторов, время созревания, заставляет нас сделать вывод, что использование mRuby3 (и, возможно, медленно созревающего mScarlet) следует проводить с особой осторожностью там, где мы столкнулись с недостатками (гетерогенная экспрессия и низкая производительность). вскоре после начала экспрессии) будут смягчены или перевешены потенциальными преимуществами mRuby3.Также важно учитывать, что каждый из этих белков может вести себя по-разному в разных системах. Это остается возможным объяснением различий между нашими данными и данными, сообщенными другими, а наши противоречивые данные подчеркивают важность хорошо продуманного тестирования и контроля, особенно при разработке более сложной системы FRET.

Заключение

В этом исследовании мы проверяем жизнеспособность mNeonGreen как донора FRET и mRuby3, mScarlet-I и mCherry как акцепторов FRET с тандемной модельной системой FP.Мы обнаружили, что mNeonGreen хорошо работает в качестве донора FRET как в интенсиометрических, так и в 2-фотонных экспериментах FLIM. При тестировании красных FP в качестве акцепторов для mNeonGreen мы обнаружили, что и mScarlet-I, и mCherry легко могут выполнять FRET с помощью mNeonGreen. Эти белки преобразуются одинаково хорошо в экспериментах FLIM, но mScarlet-I превосходит mCherry в интенсиометрическом исследовании из-за своего более высокого квантового выхода. Однако, когда обнаружение FRET измеряется независимо от интенсивности излучения акцептора, например, в нашей системе FLIM, mCherry демонстрирует равную эффективность FRET, но более последовательное выражение, что делает его лучшим выбором по сравнению с mScarlet-I в этом сценарии.Напротив, мы обнаружили, что mRuby3 плохо работает как акцептор FRET в нашей модельной системе, несмотря на то, что, по прогнозам, он является лучшим акцептором FRET из трех белков. Основным фактором этой плохой производительности является медленное созревание mRuby3, хотя стабильность белка и межклеточная гетерогенность в обмене белка также могут способствовать или усугублять эту проблему.

В целом, мы обнаружили, что mNeonGreen является отличным желто-зеленым донором, а mScarlet-I является одним из лучших универсальных акцепторов для экспериментов с зеленовато-красным FRET с использованием флуоресцентных белков.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Построение сканирования излучения, используемого для спектральной FRET.

(A) Сканирование излучения нескольких независимых трансфекций NG-Stop при возбуждении на длине волны 470 нм, наложенное на зарегистрированное излучение чистого mNeonGreen. Среднее значение этих сканирований показано на рис. 2В. Из-за согласованности NG-Stop с чистым спектром mNeonGreen чистый спектр mNeonGreen использовался в качестве донорного спектра для линейного несмешивания. Сканирование эмиссии акцептора от нескольких независимых трансфекций (B), NG-mRuby3, (D), NG-mScarlet-I и (F), NG-mCherry, полученное путем возбуждения акцептора непосредственно с использованием света 530 и 540 нм, с наложенным чистым спектром красного FP в каждом состоянии.Среднее значение каждого состояния показано рядом с сообщенным чистым спектром для каждого акцептора, показанным в (C) , (E) и (G) соответственно. Сканирование как mScarlet-I, так и mCherry в конструкциях NG-mScarlet-I и NG-mCherry точно воспроизводило восходящий ход и пик очищенных mScarlet-I и mCherry, при этом основное различие между наблюдаемым и чистым спектром белка заключалось в более быстром распаде хвост спектра на высоких длинах волн. Напротив, сканирование mRuby3 в конструкции NG-mRuby3 выявило спектр излучения, который был на 6 нм смещен по сравнению с тем, что сообщалось для очищенного mRuby3.Из-за различий, наблюдаемых для каждого из красных акцепторных белков и различных уровней фона, были созданы индивидуальные акцепторные эмиссионные спектры, которые служат в качестве акцепторной эмиссии для линейного смешивания, показанного в (C), , (E), и ( G) как черная пунктирная линия. Необработанные кривые, использованные для определения эффективности (H), NG-mRuby3, (I), NG-mScarlet-I и (J), NG-mCherry, показаны, что соответствует графику эффективности на рис. 2F.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s001

(TIF)

S2 Рис. Характеристики EGFP при 2-фотонной визуализации FLIM.

(A) Данные о продолжительности жизни, собранные для отдельных клеток HEK293, экспрессирующих цитозольный EGFP, при различной мощности лазера до 25 Вт / см 2 после 50 кадров. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Время жизни и интенсивность (C) образцов, снятых на протяжении 300 кадров при различной мощности лазера.* = P <0,05, ** = P <0,005 и *** = P <0,0005 по сравнению с набором данных 5 Вт / см 2 , согласованным с кадром. N для каждого образца составляет 5 Вт / см 2 : 10 ячеек, 10 Вт / см 2 : 10 ячеек, 15 Вт / см 2 : 10 ячеек, 20 Вт / см 2 : 9 ячеек, 25 Вт / см 2 : 10 ячеек.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s002

(TIF)

S4 Рис. Иммуноблот тандемных конструкций NG-Stop и NG-Red FP.

10 мкг общего белка, полученного из клетки, временно трансфицированной данной конструкцией, через один день после трансфекции загружали в 16% гель SDS-PAGE, и mNeonGreen визуализировали с использованием антитела против mNeonGreen (A) и (B) анти-GFP (для обнаружения конструкций, содержащих mClover3).NG-Stop имеет полосу, близкую к расчетной молекулярной массе 27 кДа. Каждый из тандемов, кроме NG-P2A-mRuby3, показывает яркую полосу при полном прогнозируемом весе тандемных конструкций, 54 кДА. Важно отметить, что только NG-Stop и NG-P2A-mRuby3 показывают полосы, соответствующие мономерному mNeonGreen. NG-mCherry, NG-mScarlet-I, NG-mScarlet и mClover3-mRuby3 демонстрируют продукты между ожидаемым полным тандемом и мономером mNeonGreen, которые, вероятно, связаны с гидролизом основной цепи красных FP во время лизиса клеток и последующей денатурации белка, который ранее сообщалось о DsRed-подобных красных FP [38].Обратите внимание, что полоса, которая появляется между 75 и 100 кДа в (A) , присутствует на всех дорожках, указывая на то, что это неспецифическая мишень для антитела mNeonGreen.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s004

(TIF)

S5 Рис. Характеристики mRuby3 в качестве акцептора FRET для GFP, такого как зелено-желтый FP mClover3.

(A) Конфокальное изображение слияния клеток HEK293, экспрессирующих mClover3-mRuby3, демонстрирует, что mClover3-mRuby3 также демонстрирует высокую гетерогенность экспрессии, аналогичную той, что наблюдалась с другими конструкциями mRuby3.(B) Время жизни клеток HEK293, экспрессирующих mClover3-Stop (условие только для донора) и mClover3-mRuby3. Каждый символ представляет собой измерение одной ячейки. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. N для каждого образца имеет следующий вид: mClover3-Stop: 65 клеток и mClover3-mRuby3: 71 клетка. *** = P <0,0005 по сравнению с mClover3-Stop. (C) Средняя эффективность FRET mClover3-mRuby3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s005

(TIF)

S6 Фиг.Пример кривых затухания из временного ряда NG-mRuby3.

(A) Пример кривых затухания флуоресценции отдельных клеток, экспрессирующих NG-mRuby3 через 2–5 дней после трансфекции (DPT), представляющий среднее значение для каждого состояния. Кривая NG-Stop и кривые NG-mRuby3 1 DPT с рис. 3C также показаны для справки. (B) Пример кривых затухания флуоресценции для отдельной клетки, экспрессирующей NG-mRuby3 5 DPT, до и после фотообесцвечивания акцептора. Кривая NG-Stop с рис. 3C повторяется здесь для справки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s006

(TIF)

S1 Таблица. Аминокислотные последовательности конструкций, использованных в этой рукописи.

Цветные аминокислотные последовательности для каждой конструкции показаны выше. Для NG-P2A-mRuby3 сайт расщепления находится между остатками глицина и пролина, обнаруженными непосредственно перед последовательностью mRuby3, и обозначен знаком |.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s008

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Юла и Эндрю Войтовича за полезные комментарии в ходе исследования, а также за щедрый обмен оборудованием.

Ссылки

  1. 1. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ. Первичная структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria. Ген. 1992. 111 (2): 229–33. pmid: 1347277
  2. 2. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г., Маркелов М.Л. и др. Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Биотехнология природы. 1999. 17 (10): 969–73. pmid: 10504696
  3. 3. Wiedenmann J, Schenk A, Rocker C, Girod A, Spindler KD, Nienhaus GU.Ярко-красный флуоресцентный белок с быстрым созреванием и пониженной тенденцией к олигомеризации из Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99 (18): 11646–51. Epub 2002/08/20. pmid: 12185250; PubMed Central PMCID: PMC129323.
  4. 4. Shaner NC, Lambert GG, Chammas A, Ni Y, Cranfill PJ, Baird MA и др. Яркий мономерный зеленый флуоресцентный белок, полученный из Branchiostoma lanceolatum. Природные методы. 2013; 10 (5): 407–409. Epub 2013/03/26. pmid: 23524392; PubMed Central PMCID: PMC3811051.
  5. 5. Алие Н., Фаббретти А., Лупиди Г., Цекоа Т., Спурио Р. Разработка вариантов цвета зеленого флуоресцентного белка (GFP) для термостабильности, чувствительности к pH и улучшения кинетики складывания. Прикладная микробиология и биотехнология. 2015; 99 (3): 1205–16. Epub 2014/08/13. pmid: 25112226.
  6. 6. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из Discosoma sp. красный флуоресцентный белок.Биотехнология природы. 2004. 22 (12): 1567–72. Epub 2004/11/24. pmid: 15558047.
  7. 7. Bayle V, Nussaume L, Bhat RA. Комбинация нового мутанта зеленого флуоресцентного белка TSapphire и варианта DsRed mOrange для создания универсального анализа FRET-FLIM in planta. Физиология растений. 2008. 148 (1): 51–60. Epub 2008/07/16. pmid: 18621983; PubMed Central PMCID: PMC2528103.
  8. 8. Кредель С., Освальд Ф., Ниенхаус К., Дойшл К., Рокер С., Вольф М. и др. mRuby, яркий мономерный красный флуоресцентный белок для мечения субклеточных структур.PLoS One. 2009; 4 (2): e4391. Epub 2009/02/06. pmid: 19194514; PubMed Central PMCID: PMC2633614.
  9. 9. Лам AJ, St-Pierre F, Gong Y, Marshall JD, Cranfill PJ, Baird MA и др. Улучшение динамического диапазона FRET с помощью ярко-зеленых и красных флуоресцентных белков. Природные методы. 2012; 9: 1005. https://www.nature.com/articles/nmeth.2171#supplementary-information. pmid: 22961245
  10. 10. Баджар Б.Т., Ван Э.С., Лам А.Дж., Ким Б.Б., Джейкобс С.Л., Хау Е.С. и др. Повышение яркости и фотостабильности зеленых и красных флуоресцентных белков для визуализации живых клеток и отчетов FRET.Научные отчеты. 2016; 6: 20889. https://www.nature.com/articles/srep20889#supplementary-information. pmid: 26879144
  11. 11. Биндельс Д.С., Хаарбош Л., ван Верен Л., Постма М., Визе К.Э., Мастоп М. и др. mScarlet: яркий мономерный красный флуоресцентный белок для визуализации клеток. Природные методы. 2017; 14 (1): 53–6. Epub 2016/11/22. pmid: 27869816.
  12. 12. Rodriguez EA, Campbell RE, Lin JY, Lin MZ, Miyawaki A, Palmer AE и др. Набор инструментов для выращивания и свечения флуоресцентных и фотоактивных белков.Направления биохимических наук. 2017; 42 (2): 111–29. Epub 2016/11/07. pmid: 27814948; PubMed Central PMCID: PMC5272834.
  13. 13. Кремерс Дж. Дж., Гилберт С. Г., Крэнфилл П. Дж., Дэвидсон М. В., Поршневой DW. Краткий обзор флуоресцентных белков. Журнал клеточной науки. 2011; 124 (2): 157–60. pmid: 21187342
  14. 14. Чудаков Д.М., Мац М.В., Лукьянов С, Лукьянов К.А. Флуоресцентные белки и их применение в визуализации живых клеток и тканей. Физиологические обзоры. 2010. 90 (3): 1103–63.pmid: 20664080.
  15. 15. Lambert TJ. FPbase: база данных флуоресцентных белков, редактируемая сообществом. Природные методы. 2019; 16 (4): 277–8. pmid: 30886412
  16. 16. Greenwald EC, Mehta S, Zhang J. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры освещают пространственно-временную регуляцию сигнальных сетей. Химические обзоры. 2018; 118 (24): 11707–94. pmid: 30550275
  17. 17. Фогель С.С., Талер С., Кушик С.В. Причудливый FRET. STKE науки: среда знаний о трансдукции сигналов.2006; 2006 (331): re2. Epub 2006/04/20. pmid: 16622184.
  18. 18. Wall AC, Джиус Дж. П., Буглевич DJ, Бэнкс AB, Като Т.А. Окислительный стресс и эндоредупликация, вызванные воздействием синего света на клетки CHO. Мутационные исследования. 2019; 841: 31–5. Epub 2019/05/30. pmid: 31138408.
  19. 19. Сибуя К., Онодера С., Хори М. Длина токсичной волны синего света меняется по мере роста насекомых. PLoS One. 2018; 13 (6): e0199266. Epub 2018/06/20. pmid: 29920536; PubMed Central PMCID: PMC6007831.
  20. 20.Arthaut LD, Jourdan N, Mteyrek A, Procopio M, El-Esawi M, d’Harlingue A и др. Накопление активных форм кислорода, вызванное синим светом, является следствием фотоцикла криптохрома дрозофилы. PLoS One. 2017; 12 (3): e0171836. Epub 2017/03/16. pmid: 28296892; PubMed Central PMCID: PMC5351967.
  21. 21. Наканиши-Уэда Т., Мадзима Х.Дж., Ватанабе К., Уэда Т., Индо ХП, Суэнага С. и др. Воздействие синего светодиода приводит к развитию внутриклеточных активных форм кислорода, перекисному окислению липидов и последующим клеточным повреждениям в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки крупного рогатого скота.Свободно-радикальные исследования. 2013. 47 (10): 774–80. pmid: 23898883
  22. 22. Джоу MJ, Jou SB, Guo MJ, Wu HY, Peng TI. Генерация активных форм кислорода в митохондриях и увеличение кальция в астроцитах под действием видимого света. Ann N Y Acad Sci. 2004; 1011: 45–56. Epub 2004/05/06. pmid: 15126282.
  23. 23. Сигел А.П., Бэрд М.А., Дэвидсон М.В., Дэй Р.Н. Сильные и слабые стороны недавно созданных красных флуоресцентных белков, оцененных на живых клетках с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии.Международный журнал молекулярных наук. 2013. 14 (10): 20340–58. Epub 2013/10/17. pmid: 24129172; PubMed Central PMCID: PMC3821618.
  24. 24. Шемякина И.И., Ермакова Г.В., Крэнфилл П.Дж., Бэрд М.А., Эванс Р.А., Суслова Е.А. и др. Мономерный красный флуоресцентный белок с низкой цитотоксичностью. Связь природы. 2012; 3: 1204. https://www.nature.com/articles/ncomms2208#supplementary-information. pmid: 23149748
  25. 25. Hoffman RM. Глава одиннадцатая — Визуализация живых клеток у живых животных с помощью флуоресцентных белков.В: Conn PM, редактор. Методы в энзимологии. 506: Academic Press; 2012. с. 197–224. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-391856-7.00035-4 pmid: 22341226
  26. 26. Кэмпбелл Р. Э., Тур О, Палмер А. Э., Штейнбах П. А., Бэрд Г. С., Захариас Д. А. и др. Мономерный красный флуоресцентный белок. Труды Национальной академии наук. 2002. 99 (12): 7877–82. pmid: 12060735
  27. 27. Lin F, Zhang C, Du M, Wang L, Mai Z, Chen T. Превосходная надежность метода ExEm-spFRET по сравнению с методом IIem-spFRET при измерении FRET живых клеток.Журнал микроскопии. 2018; 272 (2): 145–50. Epub 2018/10/20. pmid: 30338530.
  28. 28. Кушик С.В., Чен Х., Талер С., Пуль Х.Л., 3-й, Фогель С.С. Эталонные стандарты FRET Cerulean, Venus и VenusY67C. Biophys J. 2006; 91 (12): L99 – l101. Epub 2006/10/17. pmid: 17040988; PubMed Central PMCID: PMC1779932.
  29. 29. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T. и др. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Природные методы.2012. 9 (7): 676–82. Epub 2012/06/30. pmid: 22743772; PubMed Central PMCID: PMC3855844.
  30. 30. Рашка С. MLxtend: предоставление утилит и расширений машинного обучения и обработки данных для стека научных вычислений Python. Журнал открытого программного обеспечения. 2018; 3 (24).
  31. 31. Клавель Д., Готтхард Дж., Фон Стеттен Д., Де Санктис Д., Паскье Х., Ламберт Г. Г. и др. Структурный анализ яркого мономерного желто-зеленого флуоресцентного белка mNeonGreen, полученного путем направленной эволюции.Acta crystallographica Раздел D, Структурная биология. 2016; 72 (Pt 12): 1298–307. Epub 2016/12/06. pmid: 27917830; PubMed Central PMCID: PMC5137226.
  32. 32. Padilla-Parra S, Auduge N, Lalucque H, Mevel JC, Coppey-Moisan M, Tramier M. Количественное сравнение различных пар флуоресцентных белков для быстрого получения FRET-FLIM. Biophys J. 2009; 97 (8): 2368–76. Epub 22.10.2009. pmid: 19843469; PubMed Central PMCID: PMC2764072.
  33. 33. Molina RS, Tran TM, Campbell RE, Lambert GG, Salih A, Shaner NC и др.Гомологи зеленого флуоресцентного белка со смещением синего цвета ярче, чем усиленный зеленый флуоресцентный белок при двухфотонном возбуждении. Журнал писем по физической химии. 2017; 8 (12): 2548–54. pmid: 28530831
  34. 34. Ким Дж. Х., Ли С. Р., Ли Л. Х., Пак Х. Дж., Пак Дж. Х., Ли К. Я. и др. Высокая эффективность расщепления пептида 2А, полученного из тешовируса-1 свиньи, в линиях клеток человека, рыбок данио и мышей. PLoS One. 2011; 6 (4): e18556. Epub 2011/05/24. pmid: 21602908; PubMed Central PMCID: PMC3084703.
  35. 35. Mastop M, Bindels DS, Shaner NC, Postma M, Gadella TWJ Jr., Goedhart J. Характеристика спектрально разнообразного набора флуоресцентных белков как акцепторов FRET для mTurquoise2. Научный доклад 2017; 7 (1): 11999. Epub 2017/09/22. pmid: 28931898; PubMed Central PMCID: PMC5607329.
  36. 36. Джордж Абрахам Б., Саркисян К.С., Мишин А.С., Сантала В., Ткаченко Н.В., Карп М. Пары FRET на основе флуоресцентного белка с улучшенным динамическим диапазоном для измерения времени жизни флуоресценции.PLoS One. 2015; 10 (8): e0134436. Epub 2015/08/04. pmid: 26237400; PubMed Central PMCID: PMC4523203.
  37. 37. Мартин К.Дж., МакГи Э.Дж., Шварц Дж.П., Дрисдейл М., Брахманн С.М., Штук В. и др. Прием от лучшего донора; анализ пар долгоживущих донорских флуоресцентных белков для оптимизации динамических экспериментов FRET на основе FLIM. PLoS One. 2018; 13 (1): e0183585. Epub 2018/01/03. pmid: 29293509; PubMed Central PMCID: PMC5749721.
  38. 38. Гросс Л.А., Бэрд Г.С., Хоффман Р.С., Болдридж К.К., Цзянь Р.Ю.Структура хромофора в DsRed, красном флуоресцентном белке коралла. Труды Национальной академии наук. 2000. 97 (22): 11990–5. pmid: 11050230

Винная промышленность обеспокоена дополнительными китайскими тарифами

Последний 10-процентный тариф, который Китай наложил на импорт американского вина, начиная с этой недели, довел общую налоговую и тарифную ставку до 79 процентов, добавив беспокойства виноделам по поводу доступа на все более важный рынок.

Тарифы «ставят нашу продукцию в невыгодное положение по цене», — говорит Роберт Кох, президент и главный исполнительный директор Винного института в Сан-Франциско. «Мы продолжим нашу полную рекламную деятельность, чтобы привлечь китайских потребителей, которых все больше привлекают калифорнийские вина. Мы уверены, что популярность калифорнийских вин будет расти ».

Тарифы, которые являются ответом на новые тарифы США на китайские товары — часть спора по поводу интеллектуальной собственности и других вопросов — появились в то время, когда калифорнийские виноделы пережили в последние годы своего рода бум в азиатской стране.

Экспорт вина из США в Китай и Гонконг вырос на 450 процентов за последнее десятилетие и вырос на 10 процентов в 2017 году до 197 миллионов долларов и на 34 процента до 118 миллионов долларов за семь месяцев по июль 2018 года, согласно данным пресс-релиз института. В институте отмечают, что вскоре Китай будет вторым после США по объему продаж вин.

НЕПРЕРЫВНЫЙ РОСТ ЭКСПОРТА

Экспорт вина США на все зарубежные рынки в 2017 году, более 90 процентов которого приходится на Калифорнию, достиг 1 доллара.53 миллиарда выручки винодельни и 42,2 миллиона ящиков.

Даже при надвигающейся угрозе тарифов экспорт вина из США в Китай вырос на 14 процентов, до 38,4 миллиона долларов, за первые шесть месяцев 2018 года по сравнению с тем же периодом прошлого года, сообщил институт в прошлом месяце.

У института есть команда в Китае, продвигающая калифорнийские вина, включая «мастер-классы» в городах по всей стране. В октябре организация проведет винодельческий тур с остановками в Гонконге, Макао, Гуанчжоу, Шанхае, Ухане, Тайбэе и Токио.Кроме того, команда планирует активное присутствие на торговой выставке ProWine China в Шанхае 13-15 ноября и на торговой выставке Tang Jia Hui в Чэнду 26-28 марта 2019 года.

«Калифорнийские виноделы имеют долгосрочную приверженность китайскому рынку, и Wine Institute продолжает проводить там полную рекламную деятельность для поддержки нашего винного экспорта», — говорит Линси Галлахер, вице-президент организации по международному маркетингу. «Хотя повышение тарифов является сложной задачей, китайских потребителей явно привлекают калифорнийские вина, и они ценят высокое качество и большое разнообразие вин из Золотого штата.”

ТУР ДЛЯ ПОСЕТИТЕЛЕЙ

Китай пригрозил ввести еще 25 процентов пошлины на экспорт вина из США в начале августа в ответ на угрозу США ввести тарифы на импорт китайских товаров, связанных с интеллектуальной собственностью. Уже в апреле в качестве реакции на американские тарифы на экспорт стали и алюминия из Китая был введен 15-процентный тариф.

Чтобы расширить другие рынки, Институт вина объединится с лондонским Институтом мастеров вина, чтобы принять 50 посетителей из 16 стран в рамках турне по Золотому штату. Октябрь.18-27. Среди гостей будут сомелье, винные магазины, рестораторы, винные писатели и другие лидеры индустрии гостеприимства.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *