10 лада характеристики: Технические характеристики автомобилей Lada (ВАЗ) 2110 / Лада (VAZ) 2110

Содержание

Технические характеристики Лада Гранта ВАЗ-2190

Автомобиль

Лада Гранта (ВАЗ-2190)

Модификация

«Стандарт»

«Норма»

«Люкс»

Тип кузова

Четырехдверный седан

Число мест

5

Длина, мм

4260

Ширина, мм

1700

Высота, мм

1500

База, мм

2470

Колея передняя, мм

1430

Колея задняя, мм

1410

Педений свес, мм

810

Задний свес, мм

980

Мин. дорожный просвет, мм

160

Объем багажника, л

500

Масса снаряженная, кг

1040

1080

1100

Распределение снаряженной массы по передней/задней осям, %

59/41

59/41

59/41

Полезная нагрузка, кг

475

Полная масса, кг

1515

1555

1575

Распределение полной массы по передней/задней осям, %

50/50

50/50

50/50

Масса прицепа с тормозами/без тормозов, кг

900/450

Коэффициент аэродинамического сопротивления

0,367

0,353

Двигатель

Бензиновый, с распределенным прыском

Обозначение двигателя

ВАЗ-11183

ВАЗ-21116

Расположение

спереди, поперечно

Число и расположение цилиндровов

4, в ряд

Рабочий объем, см

3

1597

Диаметр цилиндра/ход поршня, мм

82,0/75,6

Степень сжатия

9,8:1

10,5:1

Число клапанов

8

Максимальная мощность, л.с./кВт/об/мин

80/59/5600

90/66/5600

Максимальный крутящий момент, Нм/об/мин

132/3500

143/3500

Коробка передач

механическая, 5-ступенчатая

Привод

передний

Передняя подвеска

независимая, пружинная, McPherson

Задняя подвеска

полузависимая, пружинная

Передние тормоза

дисковые, вентилируемые

Задние тормоза

барабанные

Шины

175/70 R13

175/65 R14

Максимальная скорость, км/ч

164,5

167,0

168,5

Время разгона от 0 до 100 км/ч, с

12,5

11,8

12,0

Расход топлива, л/100км

 

— в городском режиме

9,3

8,5

8,7

— в загородном режиме

6,1

5,7

5,8

— в смешанном режиме

7,3

7,2

7,3

Выбросы CO2, г/км (смешанный цикл)

177

164

164

Емкость топливного бака, л

50

Топливо

Бензин АИ-95

Основное предназначение междугородних грузоперевозок | Газета-А.ru

Вам предстоит переезд из Москвы в Санкт-Петербург, и у вас нет возможности воспользоваться помощью друзей и знакомых, чтобы быстрее перевезти нужные вам вещи, а несколько поездок туда-обратно обойдутся слишком дорого? Чтобы перевезти все имущество как можно быстрее, вам стоит воспользоваться услугами по грузоперевозке.

В каких случаях стоит вызвать машину для перевозки грузов

В процессе переезда из Москвы в Санкт-Петербург или обратно услуги по грузоперевозке используются в следующих случаях:

  • переезд на новое место жительства. Если у вас много вещей, и вы не можете погрузить их в свою машину, но они будут нужны вам в новой квартире, стоит воспользоваться помощью компании, предоставляющей услуги по перевозке грузов;
  • перевозка офисной мебели и техники, если у вас меняется место расположения офиса;
  • необходимо перевезти одежду, мебель, другие вещи;
  • необходимо транспортировать оборудование и материалы, которые нужны для строительства;
  • есть необходимость в транспортировке оборудования, используемого в гостиницах, ресторанах, барах.
Помощь компании, предоставляющей услуги по перевозке грузов, может потребоваться в других случаях. Если такая необходимость возникнет, зайдите на страницу https://perevozki-na-gazeli.com/gruzoperevozki-moskva-sankt-peterburg — там вы можете заказать нужный вам автомобиль.

Какой груз можно перевезти между городами

Традиционно Газель используется для перевозки небольших грузов: одежды, посуды, бытовой техники, мебели небольших и средних размеров, оборудования. Для транспортировки бытовой техники, офисного, ресторанного оборудования в грузовом автомобиле устанавливаются страховочные ремни, которые обеспечивают их удержание в определенном положении все время пути. Из-за их наличия оборудование останется в сохранности, даже если машине придется проезжать по дорогам с плохим покрытием.

Стоимость перевозки зависит от следующих параметров:

  • объем и вес перевозимого груза;
  • выбранный автомобиль.
Кроме того, в стоимость перевозки включается цена проезда между городами по платным дорогам, а также время простоя транспорта в период погрузки и разгрузки груза.

Среднее время доставки груза между Москвой и Санкт-Петербургом — 1 день. В этот период времени не включается время простоя транспорта во время доставки вашего груза в пробках на автомобильных трассах.

 

Дата публикации: 12 Октября 2021

Крылатые выражения из комедии «Горе от ума»

«Горе от ума» Александра Грибоедова – самое уникальное произведение по количеству крылатых фраз. Многие стали жить отдельно. Люди, использующие их в речи, часто не догадываются, что цитируют классические строчки литературы.

Крылатые выражения из комедии «Горе от ума» можно часто услышать в речи, в каком значении их произносил герой текста. Что изменилось за эпохи?



Самые цитируемые выражения

«Счастливые часов не наблюдают». Фразу произносит Софья Павловна, объясняя горничной, как быстро проходят ночи рядом с любимым. Выражение не изменило своего толкования. Им характеризуют состояние людей, увлеченных друг другом. Для них время уходит на задний план, оставляя место только чувствам. Влюбленных переполняет восторг от общения, встреч и положительных эмоций. Следить за временем они не могут и не хотят.

«Ум с сердцем не в ладу». Фразу произносит Чацкий. Он объясняет ею свое состояние. Сердце влюбленного не слышит разум. Человек не способен анализировать происходящее вокруг, не замечает обмана и лживых поступков. Ослепленный чувствами, он не слышит в речи истины. Вводит себя в заблуждение, которое впоследствии становится роковой ошибкой. В современной жизни выражение находит место не только в эмоциональной сфере, описывающей чувства взаимной привязанности. Ум не помогает ослепленным своей удачей в бизнесе, в азартных играх.

«Герой не моего романа». Софья Павловна использовала фразу для объяснения того, что один из претендентов на ее руку не может быть ее возлюбленным. Сегодня выражение позволяет убрать из кавалеров тех, кто не может стать женихом по индивидуальному выбору и предпочтениям любого пола.

«Служить бы рад, прислуживаться тошно». В речи Чацкого слово служить имеет прямое значение. В современном мире выражение используется гораздо шире. Служить становится синонимом работать. Многим хочется найти такую профессию, в которой не придется выполнять указания верхних ступеней власти, чтобы продвинуться по карьерной лестнице. Большинству хочется, чтобы оценили их знания, умения и опыт.

«День за день, нынче, как вчера». Так описывает свою жизнь Алексей Молчалин. Так характеризуют жизнь и современники, если из нее уходят интересные события, остается одна повторяющаяся каждый день рутина. Состояние безысходности слышится за словами, тоска и уныние. Из такого состояния хочется вырваться как можно быстрее.


«Минуй нас пуще всех печалей. И барский гнев, и барская любовь». Фраза вложена в уста горничной Лизы. Девушка понимает опасность и любви, и немилости. Хочется избежать излишней заботы, злобы и неприязни. Любое чувство со стороны власть имущих, начальства и руководителя чаще заканчивается отрицательно для работника. Именно поэтому хочется, чтобы яркие проявления с их стороны обошли стороной.

«Кому назначено-с, не миновать судьбы». Мудрые слова произносит Лиза. Вера в предназначение и в судьбу не пропала и у современников. Событие, которое происходит в жизни, чаще отрицательное, невозможное для объяснения, сводят к проявлению сил свыше. За все несет ответственность судьба.

«Кто беден, тот тебе не пара». Речь отца Софии четко разграничивала возможности дочери выбирать будущего мужа. Казалось бы, век деления на бедных и богатых прошел. Но на самом деле, статусное положение не просто осталось, но считается одной из основных причин разводов и несостоявшихся браков. Выражение продолжает жить, расширив свое значение. Любое социальное положение, разделяющее влюбленных, можно объяснить крылатым выражением.

«А судьи кто?». Слова Чацкого звучат и поныне. Осуждения людей, не имеющих на это право, встречается так часто, что выражение считается одним из самых популярных. Слово судьи не используется в прямом значении, оно характеризует любого человека, пытающегося преподнести свое мнение, часто ошибочное, как эталон.



Все выражения по персонажам

Цитаты Чацкого:

Я странен, а не странен кто ж? Тот, кто на всех глупцов похож.

Чуть свет уж на ногах! и я у ваших ног.

Велите ж мне в огонь: пойду как на обед.

Числом поболее, ценою подешевле.

Вот наши строгие ценители и судьи!

Все тот же толк, и те ж стихи в альбомах.

Певец зимой погоды летней.

На лбу написано: Театр и Маскерад.

Но если так: ум с сердцем не в ладу.

И вот за подвиги награда!

Прошедшего житья подлейшие черты.

Служить бы рад, прислуживаться тошно.

Блажен, кто верует, — тепло ему на свете!

А Гильоме, француз, подбитый ветерком?

Судьба любви — играть ей в жмурки.

Цитаты Софьи:

А горе ждет из-за угла.

Счастливые часов не наблюдают.

Делить со всяким можно смех.

Мне всё равно, что за него, что в воду.

Подумаешь, как счастье своенравно!

Да эдакий ли ум семейство осчастливит?

Герой не моего романа.

Вопросы быстрые и любопытный взгляд…

Что мне молва? Кто хочет, так и судит.

Шел в комнату, попал в другую.

Цитаты Молчанина:

Ах! злые языки страшнее пистолета.

Снаружи зеркальце, и зеркальце внутри.

Свой талант у всех.

Противуречья есть, и многое не дельно.

Мы покровительство находим, где не метим.

День за день, нынче, как вчера.



Цитаты Рептилова:

Шумим, братец, шумим!

О Бейроне, ну о матерьях важных.

Не место объяснять теперь и недосуг.

Все отвергал: законы! совесть! веру!

А у меня к тебе влеченье, род недуга.

Цитаты Лизаньки:

Грех не беда, молва не хороша.

Зашла беседа ваша за ночь.

И золотой мешок, и метит в генералы.

И слышат, не хотят понять.

Кому назначено-с, не миновать судьбы.

Минуй нас пуще всех печалей. И барский гнев, и барская любовь.

К лицу ль вам эти лица.

И кто влюблен — на все готов.

Она к нему, а он ко мне, А я… одна лишь я любви до смерти трушу, А как не полюбить буфетчика Петрушу!

У девушек сон утренний так тонок.

Цитаты Анфисы Хлёстовой:

Всё врут календари.

Чай, пил не по летам.

На свете дивные бывают приключенья! В его лета с ума спрыгнул!

Нет! триста! уж чужих имений мне не знать!

Цитаты Платона Михайловича:

У нас ругают. Везде, а всюду принимают.

Я правду об тебе порасскажу такую, Что хуже всякой лжи.

Крылатые фразы и афоризмы из комедии «Горе от ума», описывающие жизнь помещиков и их слуг во времена крепостного права, находят свое место в современном мире. Причем в большинстве случаев значение крылатых фраз стало шире.

Другие материалы по комедии «Горе от ума»:

Краткое содержание

Образ и характеристика Чацкого

Образ и характеристика Молчалина

Образ и характеристика Фамусова

Образ и характеристика Софьи

История создания комедии

Какой будет зима в Казахстане, рассказали синоптики

«Казгидромет» представил прогноз погоды в республике на предстоящие пять месяцев

Пресс-служба РГП «Казгидромет» представила консультативный сезонный прогноз погоды в Казахстане на период с ноября 2021 года по март 2022 года, передает Azattyq Rýhy.

По информации синоптиков, ноябрь – последний месяц осени, сезон предзимья.

Первая половина ноября прогнозируется относительно теплой – в северной половине Казахстана, ожидается колебание температуры воздуха ночью от -3…+2 °С до -8…-13 °С, днем от +3…+10 °С до -2…+3 °С.

На севере, северо-западе, востоке и в центре республики осадки (преимущественно в виде снега) с порывистым ветром ожидаются в конце первой декады, чаще – во второй половине месяца. Гололед и туман будут наблюдаться часто в течение месяца. В самые холодные дни второй половины месяца столбики термометров опустятся в ночные часы до -17…-25 °С, днем до -8…-13 °С, а на востоке страны ночью до -30 °С, днем до -18 °С. В третьей декаде ноября ожидается ослабление морозов, в дневные часы до слабоположительных значений.

На западе, юге и юго-востоке страны ожидаются осадки в виде дождя и мокрого снега. Самые теплые дни предполагаются в первой половине месяца, днем температура воздуха может повысится до +10…+18 °С, однако во второй половине ноября прогнозируется понижение температурного фона ночью до -5…-17 °С, днем до -2…-7 °С. В третьей декаде вновь потеплеет.

Зима 2021-2022 годов в Казахстане прогнозируется близкой к климатической норме.

В декабре в северных регионах увеличивается число дней с метелями, а в южных регионах – туманы и гололедные явления. Температура воздуха в декабре предполагается в пределах климатической нормы. Количество осадков – меньше нормы на большей части республики, около нормы – в северной половине и на востоке страны, больше нормы – на крайнем севере РК.

Январь – самый холодный месяц в году, так как усиливается влияние монгольского антициклона. В ночные часы столбики термометров в северной половине РК могут опуститься до -35…-40 °С, в южной – до -22…-30 °С. Средняя за месяц температура воздуха ожидается ниже нормы на 1-2° на большей части территории республики, около нормы на крайнем западе, юго-западе, севере, юге и юго-востоке страны. Количество осадков по республике предполагается меньше многолетних норм, около нормы – на крайнем северо-западе, северо-востоке РК и на юго-востоке Алматинской области.

Февраль завершает сезон зимы, однако его климатические характеристики и циркуляционные особенности очень близки к январским. Снегопады и метели, как правило, еще сохраняются в северной половине Казахстана. Средняя за месяц температура воздуха ожидается около нормы на большей части территории РК, выше нормы на 1° на юго-востоке республики. Осадков предполагается около нормы на большей части республики, меньше нормы – в юго-западной половине, на западе Центрального Казахстана, больше нормы – в горных и предгорных районах юга и юго-востока страны.

Для юга Казахстана март уже типичный весенний месяц, а в северных областях еще продолжается зима. Погода в марте очень изменчива. Для марта характерны резкие колебания температуры воздуха и частое выпадение осадков. Согласно прогнозу, первый месяц весны ожидается холодным. Средняя за месяц температура воздуха ожидается ниже нормы на 1-2° на большей части территории Казахстана, около нормы – на крайнем западе РК. Количество осадков в марте предполагается около нормы в северной половине и на крайнем юге, юго-востоке республики, меньше нормы – в южной половине страны.

ВАЗ 2110 (десятка) — фото видео, технические характеристики, отзывы, тюнинг Лады своими руками

На момент выхода на рынок «Восьмерка» считалась по истине революционной моделью среди всей модельной линейки Волжского концерна. Именно этот переднеприводный автомобильчик смог задать новые стандарты дизайна и ездовых свойств для советских автомобилистов. Однако, шло время, и машина стала морально устаревать. В Тольятти задумались над созданием более прогрессивной модели и вскоре она появилась…

Содержание статьи:

История создания ВАЗ 2110 начинается с 1985 года. С этого момента инженеры Тольяттинского автозавода начинают разработку целых серий проектов и макетов будущей модели.

Перед создателями стояла задача создания переднеприводного автомобиля второго поколения, который станет идеологическим преемником семейства «Самары», при этом сможет по части престижа стать на уровень выше представительной на тот момент «классики». Более того, планировалось ввести в серию целый ряд новшеств, воплощением которых бы и стала «Десятка».

Над кузовом долгое время велись работы по оптимизации коэффициента аэродинамического сопротивления. С момента создания проекта и претворения его в реальность Lada 2110 претерпела множество изменений во внешнем облике, но в конечном итоге на конвейер автомобиль встал с обтекаемыми формами кузова.

Читайте также: Lada 2109 и 21099 − пополнение в семействе

Показатель аэродинамического сопротивления при этом составил 0,3 единицы. Таких цифр удалось добиться не в последнюю очередь благодаря тому, что аэродинамика дорабатывалась отечественными инженерами при взаимодействии со специалистами Porsche.

Премьера ВАЗ 2110 состоялась в 1993 году в рамках выставки в Москве. В этом же году российский седан дебютировал и в Париже. Нужно отметить, что публика встретила новинку весьма благосклонно, ведь ее дизайн на тот момент был вполне современным и привлекательным. А вот, технические характеристики на мировом модели уже устарели. На сборочный конвейер «Десятка» встала в 1995 году.

Спроектирована новая Лада на платформе 2108. Передняя схема подвески создана по типу Макферсон, тогда как сзади установлена полузависимая балка. Никаких откровений по сравнению с «Восьмеркой».

Однако, моторы теперь были переведены на электронный впрыск топлива и получили ЭБУ, кузовные детали были оцинкованы, применялась новая технология окраса кузова. Появилась возможность укомплектовать рулевое управление гидравлическим усилителем.

Читайте также: ВАЗ (Lada) 2107 − на высшей ступени иерархии

Отдельно стоит поговорить про оснащение. Отныне покупателям были доступны такие приятные опции как бортовой компьютер, электрические стеклоподъемники передних дверей, а также электрообогрев передних кресел.

Постепенно в числе оснащения появились электропривод зеркал бокового обзора с обогревом, задние электрические стеклоподъемники, корректор головной оптики с салона, евро-панель, преднатяжители передних ремней безопасности, противотуманные фонари.

Основные модификации модели:

  • 21100. Укомплектована версия карбюраторным двигателем 1.5 литра от 21083, который выдает 69 сил.
  • 211002. Под капотом установлен восьмиклапанный мотор 1.5 литра с инжекторной системой впрыска. Мощность составляет 79 лошадиных сил.
  • 211003. Отличительной особенностью данной версии является силовая установка 1.5 литра с 16 клапанами. Отдача равна 94 «лошадкам».
  • 211004. В движение машина приводится 16-ти клапанным двигателем 1.6 литра, что выдает 89 лошадиных сил.

Помимо стандартных версий были и своеобразные вариации заводского тюнинга. Они подразумевают собой мелкосерийное производство автомобилей с мощными моторами.

ВАЗовский тюнинг нашел свое воплощение в модификациях:

  • 21106 GTI. Под капотом установлен мотор 2.0 литра с 16-ю клапанами (Opel), который выдает 150 лошадиных сил.
  • 21128. В движение приводится двигателем 1.8 литра (16 клапанов) мощностью 100 сил.

Все силовые агрегаты трудились вкупе с пятиступенчатой механической трансмиссией. Впрочем, на заводе не оставляли попыток оснастить мотор 1.6 литра с 16-ю клапанами автоматической коробкой ZF, но в полномасштабное серийное производство такая машина не пошла.

В целом, стоит отметить, что в свое время на ВАЗ было множество вариантов модернизации модели. Однако, на данный момент об этом стали забывать, а найти информацию о доработках можно по немногочисленным видео и статьям в интернете.

Мнение автомобилистов

«Десятка» имеет множественные отзывы владельцев, однако не все из них положительные. Несмотря на то, что кузов был оцинкован, от проблем с коррозией избавиться не удалось. Моторы 1.6 литра (16 клапанов) страдали загибом клапанов.

Позже данная проблема была решена ВАЗовскими инженерами путем проточки днища поршня до 6,5 миллиметров.

Рыночная стоимость

АвтоЦена (рублевая)
ВАЗ 2110от 70 до 180 тысяч

Тест

Оптимизация

Несмотря на то, что кузов создавался, по большей части, инженерами, автомобиль получился вполне симпатичным и не вызывает отрицательных эмоций с точки зрения дизайна. Стоит отметить плавный контур профиля, отсутствие выраженных выштамповок на боковинах, а также лаконичные бамперы.

Оптика освещения объединена в блоки. Высокий дорожный просвет в 175 миллиметров позволяет уверенно передвигаться по проселочным дорогам, не опасаясь повредить днище либо кузовные детали.

Из недостатков нужно выделить посредственную подгонку панелей кузова. Не заметить огромные и неровные зазоры между капотом и крыльями, а также между дверьми попросту невозможно.

По пути удешевления…

Интерьер выглядит неплохо даже по прошествии многих лет. Главной его особенностью является многофункциональная центральная консоль. В богатых версиях на ней присутствовала панель бортового компьютера, на которую выводилась индикация открытых дверей, а также контрольные лампы.

Рядом с маршрутным компьютером расположились аналоговые часы. Блок климатической системы размещен в верхней части консоли. Регулировки осуществлялись посредством двух тумблеров с наглядной разметкой температуры и режимов работы вентилятора.

Приборная панель читается отлично за счет крупной оцифровки и зеленой подсветки, которая действует успокаивающе на глаза в темноте. На более поздних модификациях появились два окошка трип-компьютера, в которых отображалась температура воздуха за бортом, одометр, а также запас хода и моментальный расход топлива.

Читайте также: ВАЗ 2106 − эталон «классики»

Передние кресла слишком мягкие и не способны обеспечить телу удобного положения. При этом, регулировка водительского сиденья в продольной плоскости маловата и габаритный драйвер почувствует явный дискомфорт.

Задний же диван, наоборот, жестковат. Разместиться на нем комфортно смогут два пассажира, чей рост не превышает 170 сантиметров.

Объем багажника равен 450 литрам. Однако, несмотря на внушительные цифры, пользоваться отсеком неудобно по причине его значительной погрузочной высоты и выпуклых колесных арок.

Без намека на большее

Самым современным в моторной гамме является шестнадцатиклапанный двигатель 1.6 литра мощностью 89 сил. Он обладает неплохой тягой на низких и средних оборотах, но на высоких резко теряет свой боевой запал.

Механическая коробка с неплохо подобранными передаточными числами разочаровывает тугими и нечеткими переключениями, что крайне неудобно при городской эксплуатации.

Управляемость также далека от идеала. Руль с низкой чувствительностью и посредственной информативностью предостерегает от резких маневров. При этом, в момент прохождения виражей наблюдаются значительные крены, а также резкий снос передней оси, что опять же, не способствует высокой скорости прохождения дуги.

Длинноходная подвеска лишена высокой энергоемкости и на неровностях производит ощущение расхлябанной − она мягкая, однако не способна обеспечить высокую плавность хода из-за вибраций и неприятных покачиваний. На высокой скорости вертикальная раскачка значительна, что может укачать пассажиров.

Фото ВАЗ 2110:

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий

in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что

совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий для широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов для мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привела к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C omplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция, названный cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов на начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания природных N и C концов и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на протонировании нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 — Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 — Эффективность FRET

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на Рисунок 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 — R (0)

R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D D × Дж (λ)] 1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может повлиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Практически для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 — Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как другой канал будет доминировать с систематическим шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по взаимодействию белок-белок, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозных помех (также называемых перекрестными помехами и кроссоверами ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (а) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие ( Рисунок 5 (b) ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофоров не выровнены должным образом (например, имеют значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждая из описанных выше проблем может быть смягчена (или частично) осознанным выбором пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, производимых в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

  • Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
  • Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
  • Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
  • Spectral Imaging — возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
  • Fluorescence Polarization Imaging — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля при ферментативном расщеплении пептидного линкера. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление тушения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и чтобы акцептор фотообесцвечивался примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормализации этого значения к интенсивности донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 представляют собой примеры FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. На фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацеленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рисунке , рис. 6 (e), ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но также различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но отличные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рисунок 7 (a) — это изменения в уменьшении времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивностях на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображения поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 — Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображения, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку оно может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (a) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансный перенос энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета -ствол или бета -кан ), состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. Рисунок 9 ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9 ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Рисунок 9 — Архитектурные особенности флуоресцентного белка

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен на конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локальная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут давать сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация в белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченых клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков с помощью хромофорной световой инактивации ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов пригодны для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. Таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко отображены в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP под названием CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ) был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход MiCy придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET 905 905 2 2

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из наиболее универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации слитых тегов, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом из когда-либо созданных и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в ​​разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем внесения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, подобное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) со значительно увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самым ярким флуоресцентным белком в любом спектральном классе является тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего в красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияний, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, которые представляют собой первые генно-инженерные зонды истинного дальнего красного цвета. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рис. 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум эмиссии 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к образованию мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое возбуждение акцептора. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают намного быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скоростей созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему представляют собой наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET с использованием флуоресцентных белков должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут в дальнейшем революционизировать этот новый подход к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов.В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов. Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты.Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале. Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий для широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов для мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привела к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C omplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция, названный cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов на начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания природных N и C концов и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на протонировании нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 — Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 — Эффективность FRET

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на Рисунок 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 — R (0)

R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D D × Дж (λ)] 1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может повлиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Практически для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 — Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как другой канал будет доминировать с систематическим шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по взаимодействию белок-белок, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозных помех (также называемых перекрестными помехами и кроссоверами ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (а) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие ( Рисунок 5 (b) ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофоров не выровнены должным образом (например, имеют значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждая из описанных выше проблем может быть смягчена (или частично) осознанным выбором пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, производимых в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

  • Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
  • Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
  • Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
  • Spectral Imaging — возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
  • Fluorescence Polarization Imaging — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля при ферментативном расщеплении пептидного линкера. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление тушения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и чтобы акцептор фотообесцвечивался примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормализации этого значения к интенсивности донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 представляют собой примеры FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. На фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацеленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рисунке , рис. 6 (e), ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но также различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но отличные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рисунок 7 (a) — это изменения в уменьшении времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивностях на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображения поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 — Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображения, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку оно может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (a) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансный перенос энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета -ствол или бета -кан ), состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. Рисунок 9 ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9 ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Рисунок 9 — Архитектурные особенности флуоресцентного белка

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен на конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локальная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут давать сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация в белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченых клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков с помощью хромофорной световой инактивации ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов пригодны для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. Таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко отображены в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP под названием CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ) был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход MiCy придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET
Белковая пара Максимум возбуждения донора
(нм)
Максимум эмиссии акцептора
(нм)
Квантовый выход донора Коэффициент молярной экстинкции акцептора Яркость акцептора
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57,500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83,400 4,9 1: 4 528 0,62 92,200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51,600 492 528 0.85 92,200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104,000 5,1 1: 4,5 610 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
Venus-mCherry 528 610 0,57 72,000 528 581 0.57 138,000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41,000 5,2 13: 1 13: 1
905 905 2 2

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из наиболее универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации слитых тегов, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом из когда-либо созданных и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в ​​разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем внесения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, подобное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) со значительно увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самым ярким флуоресцентным белком в любом спектральном классе является тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (в два раза больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего в красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияний, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, которые представляют собой первые генно-инженерные зонды истинного дальнего красного цвета. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рис. 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум эмиссии 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, области, которая важна для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к образованию мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое возбуждение акцептора. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают намного быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скоростей созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему представляют собой наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET с использованием флуоресцентных белков должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут в дальнейшем революционизировать этот новый подход к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Для чего нужны маркеры ладов? [Руководство по накладкам ладов / маркерам положения]

В сегодняшней статье мы более подробно рассмотрим маркеров ладов (также называемых вставок на грифе , маркеров положения ), для чего они используются, почему они видны на определенных ладах, а не на других, из каких материалов они используются. сделаны из, и почему на некоторых гитарах вообще нет ладовых маркеров.Итак, если вам интересно, почему на грифе есть точки:

Маркеры ладов служат ориентирами на грифе, помогая гитаристу более эффективно ориентироваться на грифе. Обычно они расположены на 3-м, 5-м, 7-м, 9-м, 12-м, 15-м, 17-м и 19-м ладах акустической гитары. На электрогитаре также присутствует 21 лад.

Итак, как мы видим, маркеры ладов — полезный инструмент для навигации по грифу, позволяющий гитаристу ориентироваться без необходимости считать лады.

В некоторых случаях маркер лада также будет виден на 1-м ладу (чаще встречается на гитарах с блоком или разделенным параллелограммом маркеров ладов, например, The Gibson Hummingbird) в некоторых случаях маркер лада может отсутствовать на все на 3-м ладу.

Некоторые Selmers (гитары Gypsy Jazz) имеют маркер ладов на 10-м ладу, а не на 9-м ладу (таким образом, указывая ноты шкалы минорной пентатоники, если считать открытую струну), и, хотя реже, могут вообще пропустить 12-й лад. как показано на изображении ниже.

Независимо от этих небольших вариаций, важно, чтобы по большей части положение маркеров ладов было стандартизировано, в противном случае может быть трудно приспособиться к игре на разных гитарах, когда вы ознакомитесь с положением маркеров ладов.

Это явно полезно для игры в тональности, например. если вы знаете, что третий лад на вашей струне E — это G (маркер первого лада) или 5-й лад A (маркер второго лада), гораздо легче ориентироваться на грифе, что упрощает воспроизведение аккордов barre, пауэр-аккордов и справочника разные масштабы.

Но это все еще оставляет вопросы. Например:

Почему на 12-м ладу две точки?

Две точки обозначают октаву .

Например, 12-й лад гитары (независимо от струны) — это всегда та же нота, что и открытая струна на 12-м ладу, только на октаву выше. Это наиболее полезный маркер лада на грифе, так как именно здесь ноты начинают повторяться.

Это также полезно, если вы работаете на своей гитаре.Например, при измерении длины шкалы важно знать, где снова начинается октава. На 24-ладовых электрогитарах часто есть две точки на 24-м ладу, которые также обозначают вторую октаву.

Почему маркеры ладов размещены на одних ладах, а на других нет?

Хотя не существует правил, определяющих положение маркеров ладов, часто обсуждается, почему они появляются на одних ладах, а не на других. Есть ряд теорий, некоторые простые, некоторые немного более сложные.

В некоторых случаях теория почти объясняет положение маркера лада, но есть одно или два исключения.Например, некоторые считают, что положение маркеров свободно основано на интервалах идеального 4-го (5-й лад), идеального 5-го (7-го) и октавы (12-й лад), но это не может объяснить 3-й лад (второстепенная треть) и лады 9-го лада (мажорный шестой). Другие считают, что это основано на порядке естественных гармоник, но опять же это не объясняет, почему 3-й и 9-й лады имеют вставки.

Хотя маловероятно, что кто-то сможет дать окончательный ответ, на мой взгляд, почти наверняка традиция сыграла свою роль наряду с балансом и эстетикой.

Например, самый важный лад, который нужно отметить, — это 12-й лад, поскольку он делит октаву. Оттуда положение маркеров ладов выглядит как можно более равномерно распределенным с учетом того, как лады разделены, чтобы сформировать октаву. Например. Размещение маркеров ладов на любых других ладах, кроме 3-го, 5-го, 7-го и 9-го, приведет к менее равномерному расстоянию (поскольку лады становятся более узкими, чем выше гриф), и будет выглядеть несбалансированным.

Хотя невозможно идеально распределить вкладки из-за относительной ширины ладов при подъеме по грифу, это достойный компромисс.

Маркеры ладов всегда отображаются в виде точек?

Нет. В моем предыдущем бизнесе мы предлагали несколько различных вариантов, когда дело касалось маркеров ладов, в том числе отсутствие маркеров ладов вообще (если это было вашим предпочтением), точек , вставок в блоки , акульих плавников ( выглядит именно так, как звучит), трапеции, и разделенных параллелограммов, вставок.

В большинстве случаев акустические гитары будут иметь точечные вставки, но есть исключения, включая PRS, которые используют их мгновенно узнаваемые вставки с птицами как на электрических, так и на акустических гитарах.В других случаях, например, в мире электрогитары, Ibanez Jem имеет потрясающую инкрустацию из виноградной лозы, известную как древо жизни, которая, хотя, возможно, немного менее функциональна, чем традиционные маркеры ладов, выглядит невероятно и требует много навыков и дополнительной работы, если работа выполняется вручную.

Из чего сделаны маркеры ладов?

Большинство гитар начального уровня имеют пластиковые вставки ( Pearloid , Celluloid ) или faux Mother of Pearl или Abalone (сделанные из полимерной глины).Более дорогие гитары обычно имеют оригинальные Abalone или Mother of Pearl (оба взяты из ракушек) или могут также иметь инкрустацию из полудрагоценных драгоценных камней. Время от времени дерево также использовалось вместе с наклейками для ладов , о которых мы вскоре поговорим.

Влияют ли маркеры грифа на тон?

Серьезно? могут ли форма, размер и материал повлиять на тон?

Теоретически можно было бы привести доводы в пользу того, что это возможно e.грамм. Грифы из розового дерева часто описываются как звучащие темнее, чем клен, что часто приписывают более ярким и четким верхним частотам. Таким образом, естественно, что вкладки, особенно вкладки больших блоков, встроенные в гриф из розового дерева, также могут влиять на тон.

По правде говоря, вкладки очень тонкие (примерно 2 мм в зависимости от используемого материала) и, если серьезно, вряд ли изменят тембр гитары каким-либо заметным образом. Даже в этом случае разница будет настолько незначительной, что большинство из нас не заметят никакой разницы.

Почему на некоторых гитарах нет маркеров грифа?

Почему у классических гитар нет маркеров ладов?

Классические гитары (как правило) обычно не имеют маркеров на грифе. То же самое и с другими струнными инструментами, используемыми в классической музыке, такими как скрипка и альт.

Подобно дискуссии о положении маркеров ладов, нет доказанной причины, по которой маркеры ладов не появляются на классических гитарах, но возможно, что из-за того, что классические музыканты должны читать с листа, они редко смотрят на ладонную руку и поэтому маркеры на грифе не требуются, хотя многие из них имеют боковые точки.

Что такое боковые точки?

Боковые точки — это еще одна точка отсчета для ладонной руки и единственная точка отсчета на большинстве классических гитар. Вы можете увидеть их пример на изображении классической гитары выше.

Они размещаются на тех же ладах, что и маркеры грифа (если на гитаре есть маркеры ладов), и обеспечивают визуальный ориентир для игры в положении стоя, поскольку гриф труднее увидеть при игре стоя.

Что такое наклейки-вкладыши на грифе?

Наклейки на накладку грифа — это наклейки (декоративные наклейки), которые можно наклеить на накладку грифа (если на вашей гитаре нет маркеров на накладке грифа) или вы хотите добавить некоторые дополнительные элементы дизайна в дополнение к стандартным вставкам из точек.

Они бывают разных вариантов — от базовых точечных и блочных узоров до более замысловатых узоров с черепами и цветочными элементами. Они также доступны для покрытий анкерных стержней и подголовников и иногда даже используются для обучения нотам на грифе.


Сводка

Большинство гитаристов, вероятно, не уделяют много внимания маркерам на грифе. Но, как вы можете видеть, они служат полезной цели для навигации по грифу, и я подозреваю, что многие из нас (всегда есть исключения) могут немного потеряться без них. А почему именно их ставят на определенные лады, а не на другие? Я хотел бы услышать ваше мнение в разделе комментариев ниже.

Введение в технологию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Пол Хелд, Ph.D, Отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все чаще используется в биомедицинских исследованиях и открытии лекарств. FRET основан на зависящей от расстояния передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору.Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные расстояния, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул. Передача энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни возбужденного состояния, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пару молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор / акцептор.

Несмотря на то, что на FRET влияет множество факторов, основных условий, которые должны быть соблюдены для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10–100 Å). Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора (рис. 1). Степень их перекрытия называется спектральным интегралом перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть примерно параллельны.Если предположить, что донорно-акцепторные пары совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (E) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. Уравнение 1). [1]

Уравнение 1. E = Ro 6 / (Ro 6 + r 6 )

Где Ro — расстояние Ферстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором.Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Ферстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояние Ферстера от 20 до 90 Å наиболее полезно для изучения биологических макромолекул. Эти расстояния сопоставимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на мультисубъединичных белках. Любой процесс, который влияет на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить процесс.В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), дипольную угловую ориентацию каждой молекулы. (k2) и спектральный интеграл перекрытия донора и акцептора (J). См. Уравнение 2.

Уравнение 2. Ro = 9,78 x 10 3 (n -4 * fd * k 2 * J) 1/6 Å

Рисунок 1.Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать некоторые произвольные числа для расстояния Ферстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно установлен на 1 (Ro = 1), и расстояние между донором и акцептором также равно 1, тогда r = Ro, и уравнение для эффективности будет E = 1 6 / (1 6 + 1 6 ), что равно 0.5 (т.е. 50%). Эта половина максимального значения и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 6 / (1 6 + 0,1 6 ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором на 10 раз больше (т.е. r = 10Ro), то E = 1 6 / (1 6 + 10 6 ) = 0,0000001. Эта чрезвычайная чувствительность к расстоянию — это то, что позволяет использовать FRET для экспериментов с приближением.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению донорной флуоресценции. Зонд-донор всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении своего излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Эти электроны очень быстро (в течение пикосекунд) распадаются на самые низкие колебательные уровни (S1) и, в конечном итоге, распадаются (в течение наносекунд) обратно в состояние So, и излучается фотон света.Когда выполняются условия для возникновения FRET, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за спад энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ испускается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. При последующем возврате в основное состояние излучается фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение состояний колебательной энергии электрона, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественное определение FRET, безусловно, может быть выполнено различными способами. Поскольку FRET может приводить как к уменьшению флуоресценции молекулы донора, так и к увеличению флуоресценции акцептора, может быть выполнено определение метрики соотношения двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что измерение взаимодействия не зависит от абсолютной концентрации датчика.Поскольку не все акцепторные части являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средств для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула приближается к такой молекуле, могут привести к потере сигнала. И наоборот, реакции, которые устраняют близость флуоресцентного донора и тушителя, могут привести к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров могут быть анализы протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентный фрагмент на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечивают способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохранять свою флуоресцентную способность. Эти красители могут быть генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами с образованием химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или связанный с ним флуоресцентный белковый элемент) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только тогда, когда пары донор / акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, возникает FRET. (Рисунок 3)

Рис. 3. Схематическое изображение взаимодействия двух различных флуоресцентных белковых химер. Белок-белковые взаимодействия между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок находятся на достаточно близком расстоянии, чтобы позволить FRET возникать.В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, которые излучают в красном диапазоне (> 550 нм), обладают рядом преимуществ. Их диапазон излучения таков, что часто снижается фоновая флуоресценция. Кроме того, большие расстояния (> 100 Å) могут быть измерены в результате высоких коэффициентов экстинкции и хороших квантовых выходов. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который излучает максимум на 570 нм, и Cy5, который излучает на 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть напрямую связаны с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

В примере, изображенном на фиг. 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отожжены (рис. 4A), возбуждение РНК-олигонуклеотида, меченного Cy3, светом с длиной волны 540 нм приводит только к испусканию света Cy3 с длиной волны 590 нм, в то время как комплементарный олигонуклеотид РНК, меченный Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам позволяют отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет происходить переносу FRET. Это приводит к испусканию света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не все излучение Cy3 на длине волны 590 нм теряется, но значительная его часть теряется.

Рис. 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой ВСП

Зонды с датчиками напряжения

(VSP) — это технология анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокопроизводительным ионным каналом.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой мобильный, отрицательно заряженный, гидрофобный оксонол [либо DiSBAC 2 (3), либо DiSBAC 4 (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). В ВСП используется зависимость от расстояния. Только когда акцептор DISBAC 2 (3) расположен на внешней стороне клеточной мембраны, FRET может иметь место.Покоящиеся клетки обладают относительно отрицательным потенциалом, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от зонда-акцептора оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксонольный зонд быстро перемещается (в субсекундном временном масштабе) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксонольный зонд «чувствует» и реагирует на изменения напряжения в ячейке.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный синий сигнал флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Ожидается, что деполяризация клетки, которая заставляет DISBAC 2 (3) перемещаться на внутреннюю сторону мембраны, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно используются в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал / шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик.Эмиссия этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начать измерение после прекращения возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мсек) позволяет рассеяться фоновой флуоресценции от молекулы органического акцептора с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, при соответствующей задержке измеряется только донорно-акцепторная эмиссия.

Донорная молекула не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы излучают фотоны очень похоже на флуоресценцию. Основное различие состоит в том, что электронное возбуждение не является результатом поглощения фотона, а скорее является результатом высвобождения химической энергии, содержащейся в молекуле. Когда возбужденные электроны возвращаются к своему основному состоянию, энергия может быть высвобождена в виде фотона света или передана через RET молекуле-акцептору, если условия верны. Хотя количество молекул, которые можно использовать, более ограничено, эта технология имеет то преимущество, что отсутствует внешнее возбуждение молекулы акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от схемы анализа, непосредственная близость будет либо установлена, либо устранена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор / акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Фильтр возбуждения для донора должен иметь возможность избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязняющее прямое возбуждение акцепторной молекулы может быть учтено с помощью соответствующих контролей, но большие количества затрудняют интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, минимизировали возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если присутствуют большие количества донорных и акцепторных молекул, но они не взаимодействуют, количество происходящего FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя донорные и акцепторные молекулы могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактического количества активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор / акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны иметь достаточную концентрацию для того, чтобы FRET имел место. Большинство связывающих событий — это динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет естественно низким. Например, временные трансфекции с двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не эффективно транслируется в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может иметь значение.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая — в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждой из них.

Приложения FRET

  • Структура и конформация белков [3]
  • Пространственное распределение и сборка белков [4]
  • Взаимодействия рецептор / лиганд [5]
  • Иммуноанализы [6]
  • Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
  • ПЦР в реальном времени и обнаружение SNP [8,9]
  • Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
  • Распределение и транспорт липидов [11]
  • Анализы слияния мембран [12]
  • Определение потенциала мембраны [13, 14]
  • Анализы флуорогенных протеаз [15]
  • Индикаторы циклического AMP [16]

Узнать больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Ссылки

  1. Förster, T.(1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Phys 2: 55-75.
  2. Tsien, R. (1998) Ann. Обзор Biochem, 67: 509-544
  3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные отношения свободной энергии в разворачивании репрессора дуги подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания. «. Biochemistry 35: 4795-4802.
  4. Watson BS, Hazlett TL, Eccleston JF, Davis C, Jameson DM, Johnson AE. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации Tu.GTP тройной комплекс. Исследование передачи энергии флуоресценции. Биохимия 34: 7904-7912
  5. Бергер В., Принц Х., Стриссниг Дж., Канг Х.С., Хаугланд Р., Глоссманн Х. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca (2 +) — каналами L-типа, выявленный с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
  6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4 ‘, 5’-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый диполь-дипольный акцептор переноса энергии флуоресценции, пригодный для флуоресцентных иммуноанализов.Анал Биохим 108: 156-161.
  7. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура решения четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys J 66: 99-109.
  8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Вуденберг TM. (1999) Семицветное, гомогенное обнаружение шести продуктов ПЦР. «Biotechniques 27: 342-349.
  9. »
  10. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфической ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Genome Res 11: 163-169.
  11. Parkhurst KM, Parkhurst LJ. (1995) Кинетические исследования резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и одноцепочечной ДНК. Биохимия 34: 285-292.
  12. Николс JW, Пагано RE. (1983) Анализ резонансной передачи энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258: 5368-5371.
  13. Uster PS (1993) Микроскопия резонансного переноса энергии in situ: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221: 239-246.
  14. Hoffman, R. и Held, P. Примечание по применению BioTek.
  15. Gonzalez JE, Tsien RY. (1995) Измерение напряжения путем резонансного переноса энергии флуоресценции в отдельных клетках. Biophys J 69: 1272-1280.
  16. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз с помощью резонансной передачи энергии ». Science 247, 954-958.
  17. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического AMP, флуоресцентные и люминесцентные зонды для определения биологической активности, Mason W.T., Ed.С. 133-149.

Расстояние между белками и динамические характеристики, полученные в результате эксперимента FRET с одной молекулой: Scilight: Vol 2018, No 7

Составляя примерно одну треть всех белков, обнаруженных в организме человека, внутренне неупорядоченные белки (IDP) играют жизненно важную роль во многих функции, включая передачу сигналов и транскрипцию. Однако эти белки не имеют определенной структуры, что ограничивает доступные методы их характеристики.

Одним из эффективных методов описания того, как складываются и функционируют IDP, является резонансная передача энергии Фёрстера (FRET). Эффективность этого процесса передачи энергии между донорными и акцепторными хромофорами указывает расстояние, на котором происходит передача. Однако точная интерпретация расстояний и динамики из данных FRET остается сложной задачей. Международное сотрудничество описывает в The Journal of Chemical Physics новый, более простой метод, который они разработали для определения расстояния между концами, а также показателя Флори и радиуса инерции белка из одного эксперимента FRET.

Подход использует распределение расстояний с переменным масштабным коэффициентом, называемым масштабным показателем Флори. Это позволяет определить распределение на основе эксперимента, а не предполагать вначале, но требует только информации о средней эффективности FRET или времени жизни флуоресценции. Показатель масштабирования может изменяться в зависимости от условий раствора, в котором исследуется белок.

Неявное и явное моделирование растворителя для 30 различных белковых последовательностей подтвердило этот подход.Получив радиусы инерции в пределах 10 процентов от истинных значений, метод команды оказался не только более точным, чем обычно используемые модели полимеров, но и вернул показатель масштабирования, который согласуется с показателями, определенными непосредственно из молекулярных ансамблей. При использовании аналитического распределения расстояний отпадает необходимость в сложных вычислениях молекулярного моделирования.

Авторы намерены исследовать аналогичный подход для малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, другого метода, который предоставляет структурную информацию о IDP.

Источник: «Вывод свойств неупорядоченных цепей на основе эффективности передачи FRET», Вэньвэй Чжэн, Гюль Х. Зерце, Алессандро Борджиа, Джитейн Миттал, Бенджамин Шулер и Роберт Б. Бест, The Journal of Chemical Physics (2018 ). Статью можно найти по адресу https://doi.org/10.1063/1.5006954.
  1. © 2018 Автор (ы). Опубликовано AIP Publishing (https://publishing.aip.org/authors/rights-and-permissions).
Опубликовано AIP Publishing (https: // publishing.aip.org/authors/rights-and-permissions).

Какую древесину грифа выбрать?

Хотя это легко принять как должное, разные породы дерева, из которых состоит ваша гитара, были объединены вместе по определенным причинам.

Например, древесина грифа, безусловно, может повлиять на тон инструмента, а некоторые породы дерева могут больше подходить определенным исполнителям и стилям, чем другие. Одна и та же гитара может звучать по-разному в руках двух разных гитаристов.

Помимо этого, есть определенные тональные качества, с которыми могут согласиться все гитаристы. У этих грифов не только тональная разница, но и дерево также имеет значение с точки зрения игровых возможностей и ощущений. Каждая древесина имеет свои свойства и по-разному реагирует на прикосновение и годы использования, поэтому некоторые гитаристы предпочитают одно другому. Основываете ли вы свое решение на этих различиях или просто на том, что вы считаете более эстетичным, выбор древесины грифа в основном сводится к трем основным вариантам: Rosewood, Maple или Ebony .

В этом блоге мы рассмотрим эти три наиболее распространенных типа древесины, используемых для изготовления грифов, и обсудим их ключевые свойства, что позволит вам принять более правильное решение при выборе идеальной гитары.

Грифы из розового дерева

Если вы когда-нибудь видели гитару, независимо от того, играли вы на ней или нет, вы наверняка видели гриф из розового дерева. Если нет, то на картинке ниже изображен Fender American Elite Strat Shawbucker в цвете Olympic White с грифом из розового дерева.

Очень велика вероятность, что у вашего любимого гитариста есть гриф из палисандрового дерева на одной из гитар, так как это наиболее часто используемый гриф в мире. В первую очередь это связано с их теплыми, насыщенными тонами и способностью сглаживать высокую резкость. Они также очень прочные, что важно для музыкантов в долгосрочной перспективе.

Два вида розового дерева, о которых вы, вероятно, услышите, — это индийский палисандр и более редкий, высококачественный бразильский палисандр. Индийский палисандр имеет ровную текстуру и часто имеет насыщенный темный цвет, похожий на шоколад или кофе — его также довольно легко найти и он присутствует на большинстве современных гитар.

Бразильский палисандр, однако, встречается крайне редко из-за того, что в настоящее время запрещено экспортировать его, если только он не был собран до заключения договора СИТЕС или не упал естественным путем. Гитары до 1960-х годов часто имеют этот тип дерева, добавляя загадочности (и ценности) старых гитар. Если у вас есть гитара из бразильского палисандра — считайте, что вам повезло.

Цвет этого палисандра может варьироваться от очень темного карамельно-коричневого до более светлых тонов. Палисандр естественно маслянистый, поэтому не требует отделки.Это естественное ощущение часто является основной причиной, по которой гитаристы выбирают эту древесину, поскольку лак, используемый для таких покрытий, как клен, иногда может казаться «неестественным».

Палисандр также более пористое дерево по сравнению с подобными черному дереву и клену, поэтому обеспечивает более теплый и мягкий звук. Вы часто обнаруживаете, что новые струны не будут звучать так резко с грифом из розового дерева — он хорошо приживается. Грифы из палисандра со временем начинают проявлять признаки использования и образовывать бороздки (но мы говорим о десятках лет), однако иногда это может привести к тому, что гитара станет более индивидуализированной в соответствии с вашим стилем игры и может чувствовать себя очень комфортно.

ВЕРДИКТ: Если вам нужен более теплый тон и мягкость на ощупь, то гриф из розового дерева — лучший выбор.

Гриф из клена

Ключевое различие, помимо внешнего вида, между грифом из клена и палисандра состоит в том, что весь кусок клена составляет гриф, а также гриф, тогда как гриф из палисандра обычно приклеивается к другому куску дерева, чтобы образовать гриф. шея. Вы часто увидите кленовый гриф на Fender Telecaster или Stratocaster, а также на некоторых бас-гитарах.

Клен, изображенный здесь на Fender American Elite Telecaster, представляет собой более светлую древесину с меньшими порами и более тонкими линиями волокон, и его часто можно охарактеризовать как имеющий «пламя» или «птичий глаз». Клен — чрезвычайно плотная древесина твердых пород, произрастающая на севере США и в Канаде. Он может казаться почти белым, в зависимости от дерева, с которого был собран, что с эстетической точки зрения действительно помогает ему выделиться в сочетании с более темным телом.

Пожалуй, самое интересное в кленовом грифе и то, что разделяет гитаристов, — это его способность тускнеть со временем.Хорошо сделанный гриф из клена в конечном итоге покажет серьезные признаки износа, истирания покрытия и впитывания грязи в дерево. Для некоторых гитаристов это желанный эффект и повод для некоторой гордости, но для других это будет просто сочтено грязным и нечистым.

Возможно, вас заинтересует …

Таким образом, клен демонстрирует больший износ, чем гриф из розового или черного дерева, что необходимо учитывать при покупке гитары. Однако мы снова говорим о годах игры, прежде чем начнут появляться какие-либо признаки.Некоторые гитаристы стараются избегать кленовых грифов из-за того, что покрытие, которое применяется для предотвращения деформации, может казаться менее естественным, чем грифы из черного или розового дерева.

Однако те, кто хочет более яркий и пикантный тон с большим сустейном, часто выбирают клен. Из трех видов древесины грифа клен часто описывается как имеющий более плотную верхнюю часть. Опять же, многие игроки просто выберут кленовый гриф из-за того, что они предпочитают его внешний вид, но мастера и музыканты все равно скажут, что кленовый гриф с его лакированной отделкой будет предлагать другой тон с более отражающим звуком.

ВЕРДИКТ: Если вы хотите гитару с более ярким звучанием и более «яркими» высокими частотами, то клен может быть для вас. Он также предлагает визуально привлекательный вариант в долгосрочной перспективе, поскольку чем больше вы используете гитару, тем больше она будет выглядеть как реликвия рок-н-ролла.

Гриф из черного дерева

Наконец, у нас есть гриф из черного дерева, распространенный выбор для гитаристов металла или хард-рока, которые предпочитают, чтобы их гитары выглядели так же мрачно, как и их музыка! Его также можно найти на широком спектре акустических гитар из-за его пористых свойств.Чаще всего используются грифы из черного дерева африканского или азиатского происхождения.

Древесина африканского эбенового дерева преимущественно полностью черная, отсюда и связь с металлическими гитаристами, в то время как азиатское эбеновое дерево может иметь коричневые полосы, проходящие через древесину — опять же, это зависит от личных предпочтений, поскольку оба типа имеют почти идентичные тональные качества. Фактически, многие гитаристы могут даже сказать, что грифы Ebony и Rosewood выглядят одинаково — я уже слышу, как гитаристы кричат ​​от возмущения!

Эбеновое дерево, изображенное здесь в Ibanez AR620-BK, имеет те же качества, что и палисандр, поскольку оно не требует отделки из-за высокого содержания натурального масла.Игроки не будут чувствовать, что гриф «липкий», как это было бы с грифом из клена, поэтому игра на гитаре — это приятный опыт. Он от природы более вынослив и прослужит долгие годы даже при повседневном использовании, в большей степени, чем грифы из палисандра или клена, которые в конечном итоге могут нуждаться в ремонте или полной замене.

Часто говорят, что гриф из черного дерева — лучшее из обоих миров. Они извлекают выгоду из темного цвета и натуральных масел, содержащихся в палисандре, поэтому им не потребуется отделка или лак для защиты.Однако из-за плотности он также обладает яркими и яркими тонами кленовой шейки.

ВЕРДИКТ: Грифы из черного дерева предлагают музыкантам качество звука, аналогичное кленовым, но обычно известны как более прочные и долговечные, чем грифы из розового дерева. Тем, кто хочет более темную шею с более ярким тоном, черное дерево для вас. Кроме того, если вам нужен более темный вид, вам, скорее всего, понравится черное дерево.

Итак, что мне выбрать?

Когда дело доходит до выбора гитары, тональные качества грифа не должны быть основным фактором при выборе гитары.Да, древесина грифа МОЖЕТ иметь значение, но в основном тональные качества корпуса и грифа определяют тональные качества, поэтому лучше всего выбрать гитару, которая удобна для ваших рук

Тон в основном находится в пальцах — гитара, на которой играет Эрик Клэптон, совершенно иначе звучала бы в руках Джима Рута из Slipknot. Я всегда советую выбирать гитару, которая хорошо лежит в ваших руках, потому что то, как вы взаимодействуете с инструментом, является решающим фактором.

Внешний вид тоже играет важную роль.Вам будет неудобно носить футболку или джинсы, которые вам не очень нравятся, поэтому вы не будете чувствовать себя великолепно на сцене с гитарой, которую считаете уродливой. Часто внешний вид гитары является причиной того, что вы хотите играть на ней больше — тон — это одно, но на самом деле это не имеет значения, если вы вообще не берете гитару в руки!


Возьми и играй!

Независимо от того, начинаете ли вы свое музыкальное путешествие или имеете значительный игровой опыт за плечами, мы хотим воодушевить и вдохновить всех на позитивные действия с их стремлениями к инструментам.

Если вам всегда нравилось играть на музыкальном инструменте, заниматься диджеингом или совершенствовать свои знания о выбранном вами инструменте, у нас есть все, от наборов инструментов и аксессуаров до блогов и обучающих видео, в которых есть все необходимое для повышения уровня!

Нажмите Pick Up & Play , чтобы вдохновиться!


Возможно, вас заинтересует …

Какая древесина грифа для гитары лучше всего? Клен, черное дерево или палисандр?

Грифы гитары (или грифы!) Чаще всего изготавливаются не из трех основных пород дерева — черного дерева, палисандра и клена.

Но каковы различия между 3 по тону, ощущениям и внешнему виду? В этой статье мы сравним все качества этой древесины, чтобы определить, какая из них лучше всего подходит для вас!

Различные породы дерева, из которых складывается ваша гитара, влияют на общий звук. Игроки часто сосредотачиваются на древесине, используемой в корпусе, и, в меньшей степени, на грифе, пытаясь определить звук, издаваемый их гитарой. Но не менее важным, чем композиция корпуса и грифа, является древесина, использованная для накладки грифа.

Содержание

  1. Влияет ли дерево грифа на тон?
  2. Из какого дерева делают грифы?
  3. Какая древесина для грифа лучше всего?
  4. Грифы из клена
  5. Грифы из палисандра
  6. Грифы из черного дерева
  7. Заключение

Влияет ли дерево грифа на тон?

Гриф гитары, возможно, не играет такой большой роли, как древесина корпуса в определении вашего звука, но он, безусловно, окажет на него ощутимое влияние.И не только с точки зрения воспроизводимого звука — накладка грифа также повлияет на ощущение вашей гитары во время игры, а также изменит ее внешний вид.

Что касается тембра, гитара с цельным кленовым грифом может иметь яркий звук с сильной атакой. Если бы вы сочетали его с грифом из розового дерева, звук был бы округлен до более теплого тона до верха. Если бы вы добавили гриф из черного дерева, звук, вероятно, стал бы еще ярче!

Поэтому важно выбрать наиболее подходящий для вас вариант.

Если вы понимаете основные тональные цвета, ощущения и внешний вид каждого дерева, вам будет намного легче сузить выбор гитар, которые вы рассматриваете для своей конкретной ситуации.

Из какого дерева сделаны грифы?

Несмотря на то, что для изготовления гитарных накладок используется огромное количество видов древесины (и других материалов!), Вы, скорее всего, найдете один из трех основных видов на большинстве гитар: Maple , Rosewood, и Ebony .

Какая древесина лучше всего подходит для грифа гитары?

Грифы из черного дерева, клена и палисандра демонстрируют уникальные тональные и визуальные характеристики, а также особые ощущения при игре. Таким образом, лучший выбор дерева для грифа будет зависеть от звука, эстетики или ощущений, которые вы ищете.

Иногда вам может понадобиться качество двух или трех разных пород древесины, поэтому, возможно, потребуется взвесить, какой из этих трех факторов является для вас наиболее важным.

Давайте посмотрим на характеристики каждого из них, чтобы помочь вам решить, какой из них лучше всего подходит для вас.

Кленовые накладки на гриф

Клен: тон, ощущение и внешний вид

Клен тонально похож на черное дерево в том, что он дает четко определенный, четкий и яркий звук с хорошим сустейном. Это очень плотная и прочная древесина с меньшими порами и более плотной текстурой, которая очень часто встречается в гитарах Fender.

Однако, в отличие от черного дерева и палисандра, клен требует отделки для защиты от воздействия влажности (если вы не выберете жареный клен, см. Ниже!).Таким образом, вы фактически играете накатом, покрывающим гриф, а не саму древесину! Это означает, что любая кленовая накладка грифа с глянцевой поверхностью может казаться некоторым музыкантам слишком липкой или неестественной — однако сатинированная отделка также доступна.

Положительным моментом является то, что благодаря отделке вам не нужно регулярно обрабатывать грифы из клена. Это не похоже на доски из розового и черного дерева, которые иногда нужно обрабатывать.

Клен может иметь цвет от почти белого до более желтоватого оттенка с золотистым оттенком.

Пачкаются ли накладки на гриф из клена?

Благодаря более светлому цвету клен имеет тенденцию приобретать грязный вид из-за того, что масло от пальцев и грязь проникают в дерево. Однако это произойдет только в тех областях, где покрытие изношено после долгих лет игры!

Это, пожалуй, довольно крутой вид, и в последние годы гитары « relic », имитирующие грязь и звон старого инструмента, стали очень популярными, поскольку игроки стремятся подражать этой устаревшей эстетике.

Почему стоит выбрать гриф из клена?

Грифы из клена обычно предпочитают музыканты, которые хотят иметь четко определенные верхние частоты с хорошим резонансом или использовать их для придания теплой звучащей гитаре более яркого тона.

Клен Тонвуд Сводка характеристик

  • Тон : Яркий, резкий, хороший сустейн
  • Цвет : От почти белого до кремово-желтого
  • Отделка : Требуется, если не жареный
  • 9000 Не требуется, если только не жареный
  • Прочность : Износостойкий, но с большей вероятностью окрашивается со временем

Типы клена, используемые в гитарах

Есть два основных варианта клена, которые используются в гитарных постройках — Western Maple ( также известный как мягкий клен или крупнолистный клен) и Eastern Hard Rock Maple .У каждого из них есть небольшая разница в тональном цвете.

Eastern Hard Rock Maple дает очень яркий, четкий звук с великолепным резонансом и сустейном. Из-за своей прочности он чаще используется в грифах и грифах.

В то время как немного менее плотный Western Maple звучит не так ярко и чаще используется для корпусов и топов гитар.

Клен хард-рок более долговечный и дорогой, чем более распространенный клен западный.

Типы фигурного клена

Клен также доступен в большом разнообразии экзотических зерен и с глубокими рисунками. Хотя различные вариации фигурного клена на самом деле не повлияют на тон, они определенно повлияют на внешний вид вашей гитары.

Обычно редко можно увидеть, чтобы они использовались для грифов на чем-либо, кроме гитар более высокого класса. Это связано с тем, что с узорами текстуры этих более экзотических кленов очень трудно работать, что делает их непопулярным вариантом для гитар массового производства, где машины с большей вероятностью сделают работу.

Вот четыре наиболее распространенных типа накладки на гриф.

Клен «птичий глаз»

Клен «птичий глаз» — это разновидность фигурного клена с характерными узорами или завитками, напоминающими глазки. Хотя существует множество теорий, окончательно не известно, что вызывает этот уникальный стиль изображения на дереве.

Flame Maple

Flame Maple имеет почти трехмерные узоры визуальных волн и полос, которые могут варьироваться от узких и узких до широких и волнистых.Фигурка не является результатом текстуры древесины, а, скорее, вызвана феноменом, называемым изменчивостью.

Он также известен как клен с полосатым тигром, клен вьющийся или кленовый клен.

Стеганый клен

В стеганом клене рисунок напоминает лоскутное одеяло или рябь на воде, особенно когда дерево окрашено. Это результат неровностей годичных колец дерева.

Сколотый клен

Сколотый клен — это древесина мертвого дерева, а иногда и живого дерева, подвергшегося сильному стрессу, которое было заражено грибком.В результате он довольно часто имеет необычные расцветки и щеголяет интересными узорами из черных линий.

Грифы из жареного клена

Помимо различных рисунков, которые мы рассмотрели выше, есть еще одна новая опция — грифы из жареного клена !

Что такое жареный клен?

Жареный клен, также известный как карамелизированный, запеченный или жареный клен, обжаривается до тех пор, пока древесина не достигнет оптимального уровня сухости.В результате получается древесина, которая намного более устойчива к влажности и перепадам температуры по сравнению с обычным кленом.

Эта дополнительная стабильность делает жареный клен идеальным вариантом, если вы часто путешествуете или испытываете сильные колебания влажности и температуры в месте проживания.

Узнайте больше о пагубном воздействии влажности на вашу гитару (и о том, как их предотвратить!) В моем обширном руководстве по влажности для гитары.

Поскольку древесина теперь полностью высохла, она не требует отделки, поэтому ощущение будет намного ближе к палисандровому или эбеновому дереву.

Он также обладает дополнительным преимуществом, заключающимся в улучшении цвета и рельефности дерева, типичными примерами которого являются гораздо более темный и насыщенный карамельный оттенок.

Вот отличное видео от Warmoth, в котором сравнивается звук обычного кленового грифа и жареного кленового грифа на той же гитаре. Да, это видео, в котором сравниваются гривы, но если вы выберете гриф из жареного клена, он почти наверняка будет сочетаться с тем же деревом грифа!

Нужно ли смазывать гриф из жареного клена маслом?

Да.Так как накладка грифа из жареного клена не герметична, вам иногда нужно применять кондиционирующее масло, чтобы защитить ее от воздействия влажности и температуры. Дважды в год должно быть достаточно употребления специального продукта для гитары, такого как лимонное масло или салфетки Wonder Wipes.

Гриф из розового дерева

Палисандр: тон, ощущение и внешний вид

В то время как черное дерево и клен славятся своими яркими и четкими тонами, розовое дерево известно своими богатыми, теплыми тонами с менее высокой резкостью.

Палисандр — это натуральная маслянистая древесина, которая дает более богатый основной тон, чем клен, из-за того, что нежелательные обертоны поглощаются масляными порами.

Маслянистая природа палисандра также означает, что ему не требуется отделка (на самом деле, это совсем не так!), Которую предпочитают многие игроки из-за естественной гладкости. Некоторые гитаристы на самом деле называют его « Crackwood », потому что, как только вы попробуете необработанный гриф, ничто другое не будет так хорошо.

Один небольшой недостаток незавершенной отделки грифов из розового дерева заключается в том, что их иногда нужно кондиционировать. Большинство игроков будут использовать специальный продукт, например, лимонное масло для гитары, чтобы поддерживать свои грифы в хорошем состоянии. Однако это займет всего пару минут, и рекомендуется делать это каждые 6 месяцев или около того. Для удобства я использую салфетки Ernie Ball Wonder Wipes.

Интересный факт — его называют палисандром, потому что свежесрезанное дерево имеет аромат, похожий на аромат розы!

Что касается эстетики, палисандр не такой темный, как черное дерево, обычно приобретая насыщенный оттенок темного шоколада.Однако распространены и более светлые оттенки коричневого.

Почему стоит выбрать гриф из розового дерева?

Грифы из палисандра обычно нравятся музыкантам, которые ищут теплое звучание, или тем, кто хочет приручить резкие высокие частоты на ярко звучащей гитаре. Еще одна причина выбрать палисандр — это приятная игра, поскольку она не требует ощущения липкости.

Палисандр Характеристики тонкого дерева

  • Тон : теплый, насыщенный, менее резкий
  • Цвет : насыщенный коричневый с оттенками красного / пурпурного
  • Отделка : не требуется 39
  • Требуется каждые 6 месяцев
  • Долговечность : Очень износостойкая

Типы розового дерева, используемые в гитарах

Палисандр образует большое семейство деревьев Dalbergia , которое включает более 300 подвидов.Ниже я перечислил несколько наиболее распространенных вариантов, используемых в качестве гитарного грифа.

  • Черное дерево африканское происходит из Восточной Африки и имеет цвет от пурпурного до почти черного, иногда с темными или желтыми полосами. Он очень плотный, и работать с ним мастерам довольно сложно.
  • Африканский палисандр , также известный как Bubinga , представляет собой прочную древесину, которая демонстрирует более яркий и сбалансированный тон. Обычно используется на грифах Rickenbacker.
  • Боливийский палисандр , также известный как Pau Ferro или Santos Rosewood , представляет собой маслянистую древесину, которая технически не является настоящим розовым деревом. Он предлагает тон и ощущение чего-то среднего между черным деревом и розовым деревом.
  • Бразильский палисандр — одна из самых ценных пород дерева в гитарном производстве благодаря превосходному резонансу и богатой тональности. Визуально это темно-коричневый цвет с более темными прожилками. Имейте в виду, что из-за того, что гитара находится под угрозой исчезновения, вам потребуются определенные сертификаты при поездке за границу или при транспортировке гитары, содержащей бразильский палисандр (см. Ниже).
  • Cocobolo — это палисандр из Центральной Америки, обеспечивающий теплый и резонансный тон. Он очень жирный, иногда вызывая окрашивание кожи или аллергические реакции. Некоторые кокоболо настолько плотные, что они фактически тонут, а не плавают в воде!
  • Восточно-индийский палисандр , также известный как Sonokeling , представляет собой более доступный вид палисандра. Он имеет узор с прямым зерном, который может включать оттенки фиолетового, серого и красного цветов.Он имеет аналогичные характеристики с находящимся под угрозой исчезновения бразильским палисандром, и в результате теперь является его обычным заменителем.
  • Мадагаскарский палисандр также очень похож по тону на бразильский палисандр. Цвет древесины варьируется от светлого до темно-пурпурного, а также могут отображаться желтые и темные полосы.

Палисандр Правила СИТЕС

Палисандр — это немного более сложная тема из-за недавних законов и ограничений, введенных для защиты этого вида. Подробнее об этом читайте здесь.

Короче говоря, еще в 2017 году были наложены жесткие ограничения на товары, содержащие любых форм палисандра . Это привело к тому, что многие гитарные бренды изо всех сил пытались найти подходящую альтернативу палисандру из-за дополнительных головных болей, связанных с использованием дерева.

Однако с ноября 2019 года все музыкальные инструменты освобождены от этих правил, за исключением тех, которые содержат бразильский палисандр, находящийся под угрозой исчезновения. Теперь для этих инструментов потребуются специальные сертификаты во время путешествий или при международной доставке, чтобы доказать, что они соответствуют правилам.

В то время как некоторые бренды продолжали использовать заменители палисандра после смягчения правил, многие вернулись к его использованию в своих гитарных конструкциях.

Ebony Fretboards

Ebony: тон, ощущение и внешний вид

Ebony известен своей чистой, четкой атакой, которая часто даже ярче, чем клен. Обычно описывается как сочетание лучших характеристик как клена , так и розового дерева .

Как и клен, это чрезвычайно плотная древесина с ярким оттенком, но похожая на палисандр, более темная и имеет более маслянистые поры.

Благодаря очень плотным зернам и натуральным маслам в древесине, черное дерево не требует отделки, и это придает грифу очень гладкую и быструю игру, которую предпочитают многие игроки.

Как правило, гриф из черного дерева, например палисандр, требует кондиционирования примерно раз в 6 месяцев. Будьте осторожны, чтобы не перенасыщать дерево маслом, так как это может действительно повредить его!

Он также известен тем, что он довольно тяжелый и очень прочный, поэтому он обычно более износостойкий и долговечный, чем клен или палисандр.

С точки зрения эстетики, грифы из черного дерева могут иметь цвет от светло-коричневого с темными прожилками до глубоко черного, часто с желтоватыми, коричневыми или красноватыми прожилками.

Хотя существует множество вариантов, черное дерево, как правило, является самым темным деревом грифа, которое вы найдете на большинстве гитар, что делает его очень популярным на гитарах, предназначенных для более тяжелой музыки, где все должно быть черный ! Палисандр можно также окрасить , чтобы придать им более темный оттенок, но разницу между двумя видами древесины легко заметить из-за размера волокон, который намного больше у палисандра.

Почему стоит выбрать гриф из черного дерева?

Грифы Ebony обычно нравятся гитаристам, которые предпочитают очень яркие, острые, как бритва, верхние частоты или очень плотные, четко определенные низкие частоты. Это также отличный выбор, если вам нравится более четкий звук кленовой доски, но без липкой поверхности.

Ebony Tonewood Краткое описание характеристик

  • Тон : Яркий, резкий, хороший сустейн
  • Цвет : От светло-коричневого до глубокого черного
  • Отделка : Не требуется
  • Требуется каждые Кондиционирование Месяцы
  • Долговечность : Сверхпрочная

Типы черного дерева, используемого в гитарах

  • Gaboon Ebony (также известное как African ebony ), называется так, потому что раньше в основном экспортировалось из страны. Габона.Из-за того, что в настоящее время он находится под угрозой исчезновения, он коммерчески доступен только в Камеруне (информацию см. В следующем разделе). Он известен своим богатым характером с звонкими оттенками.
  • Macassar Ebony экспортируется из Юго-Восточной Азии. Он имеет высокую плотность, эффектный полосатый вид и воспроизводит чистый и громкий звук с хорошим динамическим диапазоном.

Находится ли черное дерево под угрозой исчезновения?

Эбеновое дерево настолько сильно перегружено, что единственной оставшейся страной, которая до сих пор занимается коммерческими поставками, является Камерун.Его статус в Красном списке МСОП находится под угрозой исчезновения после сокращения популяции более чем на 50% за последние три поколения.

В течение многих лет производители гитар использовали только более желанное чистое черное черное дерево. Но, к сожалению, , в среднем нужно срубить 10 деревьев, прежде чем будет найдено одно черное дерево ! Не черные деревья останутся позади, потому что никто не хотел бы разнообразия с прожилками — невероятная трата древесины!

Но, к счастью, такой практики больше нет, и упомянутое выше полосатое черное дерево теперь также очень часто используется в гитарном строительстве.Это благодаря Taylor Guitars, которая в настоящее время поставляет большую часть черного дерева в мире, используемого в производстве гитар.

Если у вас есть 10 минут, посмотрите видео ниже, чтобы узнать, как Бобу Тейлору удалось оказать такое огромное положительное влияние на поставку и защиту черного дерева. Это трогательные часы, чтобы увидеть, насколько Тейлор заботится об окружающей среде.

Заключение

Подводя итог, я собрал следующую инфографику, которая дает вам (упрощенное!) Представление обо всех характеристиках каждой древесины грифа.

Когда все сказано и сделано, тональный вклад древесины грифа может быть настолько мал, что он будет незаметен для вас.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

Белковая пара Максимум возбуждения донора
(нм)
Максимум эмиссии акцептора
(нм)
Квантовый выход донора Коэффициент молярной экстинкции акцептора Яркость акцептора
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57,500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83,400 4,9 1: 4 528 0,62 92,200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51,600 492 528 0.85 92,200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104,000 5,1 1: 4,5 610 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
Venus-mCherry 528 610 0,57 72,000 528 581 0.57 138,000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41,000 5,2 13: 1 13: 1