10 лада фото: Фото Lada 2110 (2111,21112) — фотографии, фото салона Lada 2110 (2111,21112), I поколение — Автозапчасти для иномарок — Продажа и подбор автозапчастей на иномарки

Содержание

Составлен ТОП-10 самых редких автомобилей Lada

Эксперты «Autonews» составили ТОП-10 самых неожиданных спецверсий Lada, о которых, возможно, не знают даже на «АвтоВАЗе».

Фото: VK/Proektkarelia

Так, на первом месте оказалась «высокая» Lada Largus. В скором времени в РФ должны начаться продажи обновлённой Lada Largus с высокой крышей. Разработкой такой модификации занималась компания «ВИС-Авто». От обычного Largus новинка отличается крышей увеличенной высоты и высокими задними дверьми. Также машину оснастили большим вентиляционным люком, дополнительным кондиционером и 2-зонной климатической системой.

Фото: Telegram/Дептранс Москвы

Далее идёт беспилотная Lada Vesta. Научно-исследовательский институт «МосТрансПроект» вместе с инженерами МАДИ превратили универсал Lada Vesta в беспилотный медицинский авто. Машина уже поступила на службу в Первую градскую больницу в Москве, где на данный момент развозит анализы между корпусами.

Фото: НТИ «Атонет»

Третье место — «Lada-катафалк». Попытки переоборудовать машины Lada в беспилотники осуществлялись неоднократного. Так, студенты одного из сибирских вузов построили на базе Kalina автономный катафалк.

Фото: Zubr

На 4-й строчке данного ТОПа — внедорожный пикап Lada. В Германии тюнинг-компания Zubr решила, что Lada очень не хватает в модельной линейке внедорожного пикапа. Исправить это упущение специалисты ателье решили своими силами и выбрали автомобиль Lada Niva. Машина оборудована небольшой грузовой платформой, багажником на крыше, дополнительной задней оптикой, «кенгурятником» и затемнёнными боковыми стёклами. Под капотом — 1,7-литровый бензиновый движок мощностью 83 силы (129 Нм).

Фото: Autoscout24

Пятое место — Lada Niva из Италии. Итальянцы тоже решили превратить

Lada Niva в пикап. В результате у компании Auto-Cente получился небольшой грузовичок с однорядной кабиной, новой задней частью кузова и растянутой колёсной базой. Среди опций: кондиционер, электрические стеклоподъёмники и система крепления детского кресла Isofix. Запаску закрепили под капотом авто. Технические характеристики Niva остались без изменений. Стандартный 1,7-литровый движок у авто полностью соответствует экологическому стандарту Евро-6.

Фото: VK/Kubcar

На 6-й строчке расположилась Lada Granta для бригад скорой помощи. Еще одну необычную модификацию фургона «Гранта» подготовила фирма «Промтех». Автомобиль превратили в настоящую скорую помощь класса «В» с пластиковым модулем и распашными дверьми. Машина оснащена носилками, креслом для сопровождающего врача, а также дополнительными источниками питания. Также авто оборудован пневпомодвеской сзади и 87-сильным бензиновым агрегатом.

Фото: Instagram/Forward_cars

Седьмое место — секретная Lada 4×4 из Китая. На одной из парковок в Китае был замечен очень необычный внедорожник Lada 4×4. От стандартного авто тюнинговый внедорожник отличается контрастной чёрной крышей, затемнёнными фонарями и особой хромированной полосой вдоль всего кузова. Как этот автомобиль попал в Китай и существует ли он только в единственном экземпляре — неизвестно.

Фото: Instagram/MR-Motorsport

На 8-й строчке самых неожиданных спецверсий Lada оказалась полноприводная «Гранта» для ралли. Российская команда MR-Motorsport создала особую раллийную версию Lada Granta для участия в гонках. Машина комплектуется 1,75-литровым бензиновым движком мощностью 340 сил. Пару установке составляет 6-ступенчатая секвентальная МКПП Samsonas и системой полного привода. От обычной Granta ралли-кар отличается аэродинамическим обвесом, каркасом безопасности и гоночными креслами. Вес авто — 1254 кг.

Фото: Granta-furgon.ru

Девятое место — дом на колёсах на базе Lada 4×4. На базе внедорожника Lada 4×4 можно построить не только пикап, но и настоящий автодом. Так, необычный кемпер был разработан компанией Lux Form, которая специализируется на различных доработках авто Lada. Автодом укомплектован диваном-трансформером, раковиной, холодильником, санузлом и гардеробом. Также водителю и пассажирам доступны розетки на 220В и USB-разъемы.

Фото: Humenne.sk

Замыкает ТОП-10 — «Лада» для словацких полицейских. Машины Lada долгое время исправно пополняют автопарк полиции РФ. Как выяснилось, наши машины ценят и сотрудники правоохранительных органов других стран. Так, для полиции небольшого словацкого города Гуменне купили особую версию универсала Lada Vesta SW Cross. Машина оснащается рациями, системой доступа к базам данных полиции и специальной цветографической схемой. Сами сотрудники полиции объяснили, что авто идеально им подходит из-за высокого дорожного просвета и большого багажника.

Lada впервые за 10 лет стала лидером петербургского авторынка

По итогам первой половины 2021 года уровень роста продаж автомобилей в Петербурге достиг 55%. Лидером рынка за шесть месяцев стал российский производитель Lada.

За первое полугодие 2021 года в Санкт-Петербурге куплено более 84 тыс. автомобилей, этот показатель превосходит прошлогодний на 55%. Доля региона в общероссийском объеме продаж машин составила 9,6%, в 2020 году – 8,5%. Данные приводит агентство «Auto-Dealer-СПб». 

По объему продаж авто наилучший результат показал июнь. Петербургским дилерам удалось продать 15,2 тыс. новых машин – на 43% больше, чем за первый месяц лета прошлого года. 

Самым популярным производителем среди жителей Петербурга оказалась российская марка Lada, которая возглавила рейтинг впервые с 2011 года. Место отечественному бренду уступила Kia, которая теперь заняла второе место. 

Фото: Auto-Dealer-СПб

В сравнении с аналогичным периодом 2020 года свое положение по продажам в Петербурге улучшила Skoda, которой удалось обойти Volkswagen, и BMW – немецкий бренд поднялся с 10-го места на 9-е. Десятку лидеров покинул Mitsubishi, тогда как коммерческий Ford впервые оказался в числе лидеров.

«Объем продаж автомобилей в июне стал не только самым высоким в этом году, но и вторым за последние семь лет – он уступил только показателю декабря прошлого года, — отмечает ведущий эксперт «Auto-Dealer-СПб» Евгений Еськов. – Рост на 43% оказался возможен благодаря тому, что в прошлом июне автосалоны открылись после локдауна на второй неделе месяца, отсюда более низкая база годичной давности», – объяснил эксперт агентства Евгений Еськов. 

Также специалист отметил, что на лидерство брендов на рынке повлиял в большей степени дефицит. В рамках полугодия он наиболее заметно отразился на Kia, которая, потеряв первенство, может переместиться на третью строчку в ближайшие годы.

Ранее АБН сообщало, что южнокорейская компания Kia начала выпускать кроссоверы Sportage нового поколения. Первыми фотографиями новинки поделились блогеры.

2108821220410 Орнамент двери задка «LADA» ВАЗ-2108 Сызрань — 2108-8212204-10

2108821220410 Орнамент двери задка «LADA» ВАЗ-2108 Сызрань — 2108-8212204-10 — фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru Распечатать

16

1

Применяется: ВАЗ

Артикул: 2108-8212204-10

Код для заказа: 011646

50 ₽

В корзину

Способы оплаты:
Наличные при получении VISA, MasterCard Оплата через банк Производитель: СЫЗРАНЬ Получить информацию о товаре или оформить заказ вы можете по телефону 8 800 6006 966. Есть в наличии

Доступно для заказа>10 шт.Данные обновлены: 31.10.2021 в 06:30

Код для заказа 011646 Артикулы 2108-8212204-10 Производитель СЫЗРАНЬ Каталожная группа:
..Принадлежности кабины
Кузов
Ширина, м: 0.024 Высота, м: 0.027 Длина, м: 0.164 Вес, кг: 0.011

Отзывы о товаре

Где применяется

Обзоры

  • Орнамент двери задка «LADA» ВАЗ-2108 Сызрань Артикул: 2108-8212204-10 Код для заказа: 011646

    50 ₽

    или оформите заказ по телефону 8 800 6006 966
Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на 31.10.2021 06:30.

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Интернет-цена — действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону 8 800 6006 966. При условии достаточного количества товара в момент заказа.

Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

20e704a9447d1161af965fa026db49a7

Добавление в корзину

Код для заказа:

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Добавить

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Закрыть

Оформить заказ

Автомобиль Lada Vesta: Фото #10 из 10, размер изображения

Kia Venga

Если вы не любите больших автомобилей, но с семьёй любите выезжать за город, то вам как нельзя лучше подойдёт Киа Венга. Впервые мир её увидел на автосалоне во Франкфурте в 2009 году.

Toyota Crown Majesta

Автомобиль премиум-класса Toyota Crown Majesta название, которого переводится на русский язык как «Корона ее величества» дебютировал в 1991 году. Ненадолго оставив идею глобализации, компания Тойота произвела на свет этот шедевр.

УАЗ Пикап

Автомобиль УАЗ Патриот Пикап с заводским индексом УАЗ-23602 – одна из модификаций УАЗ Патриот. Машина предназначается для фермеров, а также любителей рыбалки и охоты.

BMW Z4 Roadster

В 2009 году в Детройте, во время Североамериканского Международного Автосалона компанией BMW было представлено второе поколение BMW Z4. Этот родстер отличается от других своим специфическим внешним видом: за счет того, что передняя часть его кузов слегка удлинена, автомобиль становится похожим на акулу.

Plymouth Acclaim

Машина является среднеразмерным переднеприводным седаном, который производит корпорация Chrysler и Toluca с 1989 по 1995 год. Автомобиль в некоторых странах еще называют Dodge Spirit.

Трое погибших. Под Саратовом столкнулись «Хендэ» и «Лада-Ларгус»

На трассе столкнулись автомобили «Хендэ» и «Лада-Ларгус». В результате аварии три человека погибли.

Сегодня, 29 октября 2021 года в Саратовской области произошло смертельное дорожно-транспортное происшествие. В Аткарском районе, в половине второго дня, на трассе столкнулись автомобили «Хендэ» и «Лада-Ларгус». В результате ДТП погибли три человека. Пятилетнюю девочку с травмами доставили в больницу. Известно, что ребенок сидел в автокресле.    
«Аткарский район, примерно в 13:30, на 199 километре автодороги «Тамбов — Саратов» произошло лобовое столкновение автомобилей «Хендэ» и «Лада-Ларгус». В результате ДТП водитель и пассажир женщина автомобиля «Лада-Ларгус», а также водитель автомобиля «Хендэ» от полученных травм скончались. Данные погибших устанавливаются. Несовершеннолетний пассажир автомобиля «Лада-Ларгус» — девочка пяти лет — с травмами доставлена в лечебное учреждение. Девочка находилась в автокресле», — рассказали корреспонденту телеканала «Саратов 24» в пресс-службе областной Госавтоинспекции.
Обновлено в 15:30
В аварии погибли 35-летний водитель и 29-летняя женщина-пассажир из автомобиля «Лада-Ларгус», а также 49-летний мужчина, который управлял иномаркой.
Обновлено в 17:45
Правоохранители провели осмотр места аварии, в настоящее время Аткарским межрайонным следственным отделом Следственного комитета выясняются все обстоятельства случившегося. Ход проверки контролирует Аткарская межрайонная прокуратура. 
По данному факту следственными органами проводится процессуальная проверка по статьям 144-145 Уголовно-Процессуального Кодекса РФ, ход которой находится на контроле межрайонной прокуратуры.
Фото: Пресс-служба Госавтоинспекции Саратовской области, инстаграм прокуратуры Саратовской области

Автор Анастасия Федотова

Подпишись на Инстаграм:  там публикуются самые интересные новости!

Призовых рисунков для лобзика. Орнаментальная серия Уильямса. №10 — цифровой файл из оригинала

Библиотека Конгресса не владеет правами на материалы в своих коллекциях. Следовательно, он не лицензирует и не взимает плату за разрешение на использование таких материалов и не может предоставить или отказать в разрешении на публикацию или иное распространение материала.

В конечном счете, исследователь обязан оценить авторские права или другие ограничения на использование и получить разрешение от третьих лиц, когда это необходимо, перед публикацией или иным распространением материалов, найденных в фондах Библиотеки.

Для получения информации о воспроизведении, публикации и цитировании материалов из этой коллекции, а также о доступе к оригинальным элементам см .: Коллекция Popular Graphic Arts Collection — Информация о правах и ограничениях

  • Консультации по правам : Нет известных ограничений на публикацию. Для получения информации см .: «Popular Graphic Arts», https://hdl.loc.gov/loc.pnp/res.248.pga.
  • Номер репродукции : LC-DIG-ppmsca-45451 (цифровой файл из оригинала)
  • Телефонный номер : ПАГА 7, вып.2051 (размер E) [P&P]
  • Консультации по доступу : Подается только по предварительной записи, так как материал требует особого обращения. Для получения дополнительной информации см. Материалы, обозначенные «Только по предварительной записи», https://www.loc.gov/rr/print/info/617_apptonly.html.

Получение копий

Если изображение отображается, вы можете скачать его самостоятельно. (Некоторые изображения отображаются только в виде эскизов за пределами Библиотеке Конгресса США по соображениям прав человека, но у вас есть доступ к изображениям большего размера на сайт.)

Кроме того, вы можете приобрести копии различных типов через Услуги копирования Библиотеки Конгресса.

  1. Если отображается цифровое изображение: Качество цифрового изображения частично зависит от того, был ли он сделан из оригинала или промежуточного звена, такого как копия негатива или прозрачность. Если вышеприведенное поле «Номер воспроизведения» включает номер воспроизведения, который начинается с LC-DIG…, то есть цифровое изображение, сделанное прямо с оригинала и имеет достаточное разрешение для большинства публикационных целей.
  2. Если есть информация, указанная в поле «Номер репродукции» выше: Вы можете использовать номер репродукции, чтобы купить копию в Duplication Services. Это будет составлен из источника, указанного в скобках после номера.

    Если указаны только черно-белые («черно-белые») источники, и вы хотите, чтобы копия показывала цвет или оттенок (при условии, что они есть на оригинале), обычно вы можете приобрести качественную копию оригинал в цвете, указав номер телефона, указанный выше, и включив каталог запись («Об этом элементе») с вашим запросом.

  3. Если в поле «Номер репродукции» выше нет информации: Как правило, вы можете приобрести качественную копию через Службу тиражирования. Укажите номер телефона перечисленных выше, и включите запись каталога («Об этом элементе») в свой запрос.

Прайс-листы, контактная информация и формы заказа доступны на Веб-сайт службы дублирования.

Доступ к оригиналам

Выполните следующие действия, чтобы определить, нужно ли вам заполнять квитанцию ​​о звонках в Распечатках. и Читальный зал фотографий для просмотра оригинала (ов). В некоторых случаях суррогат (замещающее изображение) доступны, часто в виде цифрового изображения, копии или микрофильма.

  1. Товар оцифрован? (Слева будет отображаться уменьшенное (маленькое) изображение.)

    • Да, товар оцифрован. Пожалуйста, используйте цифровое изображение вместо того, чтобы запрашивать оригинал. Все изображения могут быть смотреть в большом размере, когда вы находитесь в любом читальном зале Библиотеки Конгресса. В некоторых случаях доступны только эскизы (маленькие) изображения, когда вы находитесь за пределами библиотеки Конгресс, потому что права на товар ограничены или права на него не оценивались. ограничения.
      В целях сохранения мы обычно не обслуживаем оригинальные товары, когда цифровое изображение доступен. Если у вас есть веская причина посмотреть оригинал, проконсультируйтесь со ссылкой библиотекарь. (Иногда оригинал слишком хрупкий, чтобы его можно было использовать. Например, стекло и пленочные фотографические негативы особенно подвержены повреждению. Их также легче увидеть в Интернете, где они представлены в виде положительных изображений.)
    • Нет, товар не оцифрован. Перейдите к # 2.
  2. Указывают ли указанные выше поля Консультативного совета по доступу или Номер вызова, что существует нецифровой суррогат, типа микрофильмов или копий?

    • Да, существует еще один суррогат. Справочный персонал может направить вас к этому суррогат.
    • Нет, другого суррогата не существует. Перейдите к # 3.
  3. Если вы не видите миниатюрное изображение или ссылку на другого суррогата, заполните бланк звонка. Читальный зал эстампов и фотографий. Во многих случаях оригиналы могут быть доставлены в течение нескольких минут. Другие материалы требуют записи на более позднее в тот же день или в будущем. Справочный персонал может посоветуют вам как заполнить квитанцию ​​о звонках, так и когда товар может быть подан.

Чтобы связаться со справочным персоналом в Зале эстампов и фотографий, воспользуйтесь нашей Спросите библиотекаря или позвоните в читальный зал с 8:30 до 5:00 по телефону 202-707-6394 и нажмите 3.

Анализ изображений FRET на основе фазора, записанных с использованием спектрально разрешенных изображений времени жизни.

При возбуждении бинарной системы донорных и акцепторных молекул оба могут релаксировать в основное состояние через радиационные и неизлучающие пути распада.Донор, однако, может проявлять дополнительный процесс распада, когда он находится в непосредственной близости от акцептора: он может передавать энергию своего возбужденного состояния через дальнодействующее диполь-дипольное взаимодействие молекуле акцептора. Это приводит к совместному снятию возбуждения донора и возбуждению акцептора. Донор служит источником возбуждения, который переводит молекулу акцептора в возбужденное состояние. Этот источник имеет сложный временной профиль, продиктованный кинетикой распада системы.

Кинетика донора может быть описана как:

, где D ( t ) — это плотность молекул донора в момент времени t , σ D — сечение поглощения донора, I ( t ) — временной профиль возбуждения источника возбуждения, τ D — время жизни донора без акцептора, а k — эффективность передачи энергии.Последнее зависит от спектрального перекрытия между спектрами излучения донора и возбуждения акцептора, ориентации диполей донорного и акцепторного переходов и, что важно, расстояния R между донором и акцептором. Эффективность передачи энергии определяется как k = ( R 0 / R ) 6 , где R 0 — расстояние, на котором эффективность передачи энергии составляет 50%. Акцептор может быть возбужден непосредственно лазерным импульсом и передачей энергии от донора:

Обратите внимание на различие в знаке члена, содержащего скорость передачи в уравнениях (1) и (2).Решение скоростных уравнений для донора дает количество молекул донора во времени возбужденного состояния t :

, где ∗ обозначает оператор свертки. τ DA — сокращенное время жизни донора в присутствии акцептора и определяется как:.

Акцептор может непосредственно возбуждаться источником возбуждения, и, кроме того, донор может действовать как второй источник возбуждения. Теперь кинетика акцептора определяется сверткой экспоненциального распада акцептора с суммой профиля источника возбуждения и профиля распада донора:

И флуоресценция донора, и акцептора зависят от длины волны.Это можно включить, умножив уравнения (3) и (4) на спектрально разрешенные скорости переходов:

с f D спектрально-временное разрешенное флуоресцентное излучение донора, γ D скорость перехода для донора и нормированный профиль эмиссии донора D ( λ ). Аналогичным образом мы можем записать для акцептора:

, где снова f A — это спектральное и временное разрешенное флуоресцентное излучение акцептора, γ A — скорость перехода для акцептора и a A ( λ ) эмиссионный профиль акцептора.Добавление уравнений (5) и (6) и замена γ на Q / τ , где Q — квантовая эффективность, дает полное описание зависящего от времени и длины волны излучения флуоресценции:

Это уравнение содержит линейную суперпозицию донорной и акцепторной флуоресценции. Второй член в скобках нижней части уравнения отвечает за рост акцепторного сигнала; он наблюдается только в сигнале акцептора, потому что он умножается на спектр излучения акцептора.

Уменьшение времени жизни донора и врастание акцептора содержат ценную информацию о процессе FRET и стехиометрии донора-акцептора. Это включает соотношение донорных и акцепторных молекул, демонстрирующих FRET, и количество доноров и акцепторов, которые не участвуют в процессе передачи энергии.

Мы используем векторный подход для анализа изображений за время жизни с разрешенным спектром. Этот графический подход обеспечивает простой и быстрый способ анализа времени жизни и спектральных изображений.Подробное описание временного фазора можно найти в [13, 14]. Вкратце, действительная и мнимая части первой гармоники преобразования Фурье кривой затухания используются в качестве координат на диаграмме рассеяния. Влияние функции отклика прибора на затухание флуоресценции можно просто учесть либо путем поворота векторов на фиксированный угол, полученного при эталонном измерении красителя с известным сроком службы, либо путем прямого измерения отклика прибора. Векторный подход также может быть использован для анализа спектральных изображений.Этот подход к спектральному анализу был недавно введен нашей группой [15].

В пространстве Фурье свертка двух функций — это просто продукт преобразований отдельных функций, поэтому эффект функции отклика прибора можно устранить путем деления векторов на вектор функции отклика прибора.

Линейная суперпозиция донора и акцептора появляется в виде линии на спектрально разрешенной векторной диаграмме; временные векторы из спектральных каналов попадают на линию, соединяющую акцепторный временной вектор и донорский временной вектор.Нормализованные векторы спектрального времени жизни каналов F ( λ ) даются по формуле:

, где мы использовали преобразование фазора и ввели фактор роста. Уравнение (8) можно переписать как:

где: и. Последний определяет полукруг фазора как функцию времени жизни и частоты. Он создается путем сопоставления мнимой и действительной части r ( τ ). Частота вычисляется кратным целым числом 2 π / T , где T — ширина всего окна измерения.

Уравнение (9) может использоваться для вычисления временных векторов для различных спектральных каналов системы, демонстрирующей FRET. Это представление уменьшает количество подходящих параметров для анализа экспериментальных данных. Более того, σQ — это параметр, который можно легко измерить независимо и использовать для проверки точности соответствия данных FRET. Этот параметр обозначает отношение интегральных интенсивностей акцептора и донора, измеренных при одинаковых концентрациях и в одинаковых условиях эксперимента.На рисунке 1 (а) показано поведение векторов в экспериментах с моделированием спектрального времени жизни FRET для различных эффективностей передачи энергии с использованием уравнения (9). На рис. 1 (б) показаны спектры донора и акцептора, а также положение спектральных каналов. На этих графиках нормированное время жизни донора и акцептора равно τ D / T = 0,25 и τ A / T = 0,1 соответственно. Здесь мы использовали σQ = 0,045 и Q ‘= 2.Спектры моделируются для спектрографа с 7 каналами, который использовался в экспериментах. Здесь максимумы излучения донора и акцептора выбраны на 3-м и 5-м канале соответственно. Для обоих спектров мы использовали FWHM двух спектральных каналов. Когда эффективность FRET равна нулю, временные векторы из разных спектральных каналов попадают на линию, идущую от вектора чистого донора к фазору чистого акцептора. Это происходит из-за линейной суперпозиции донорного и акцепторного фазоров и различного соотношения вкладов донора и акцептора в зависимости от длины волны.Здесь мы предполагаем инвариантное время жизни как донорных, так и акцепторных молекул по их спектрам излучения. На рисунке 1 (а) также показано поведение вектора для ненулевой эффективности FRET в диапазоне от 10% до 50%. Опять же, векторы попадают на прямую линию, и пересечение этой линии с контрольной окружностью является прямой мерой эффективности FRET. Отметим, что это пересечение соответствует времени жизни донора в присутствии FRET, как измерено в обычном эксперименте FRET-FLIM.В случае увеличения эффективности FRET линия, содержащая точки фазора, вращается вдоль вектора чистого акцептора, то есть фазора акцептора в отсутствие FRET.

Увеличить Уменьшить Сбросить размер изображения

Рис. 1. (a) Вектор со спектральным разрешением для различных значений эффективности FRET в диапазоне от 0 до 50%, смоделированный для спектрографа с 7 спектральными каналами. Цвета на рисунке соответствуют номерам каналов.Низкие числа соответствуют коротким длинам волн (в основном, излучение доноров), а большие числа — более длинным длинам волн (в основном излучение акцепторов). (б) Спектры донора и акцептора, использованные при моделировании.

Загрузить рисунок:

Стандартный образ Изображение высокого разрешения

Из-за отрицательного знака перед A в уравнении (9) ненулевые векторы эффективности FRET из акцепторных каналов перемещаются за пределы эталонного полукруга. Наклон линии определяется эффективностью FRET, положение векторных точек на линии коррелирует с соотношением сечений поглощения и квантовой эффективностью молекул донора и акцептора.

Во многих случаях измеренная кривая затухания флуоресценции моделируется как моноэкспоненциальная функция. Однако часто флуорофоры имеют биэкспоненциальный распад; поэтому мы также рассматриваем систему FRET, которая демонстрирует биэкспоненциальные распады как для донора, так и для акцептора [16]. Предполагается, что каждый компонент донора независимо взаимодействует с каждым компонентом акцептора. Кроме того, мы предполагаем, что донорные компоненты имеют одинаковые спектральные свойства, и делаем то же предположение для акцептора.Это означает, что спектральное перекрытие и эффективность передачи энергии постоянны для всех возможных комбинаций донорных и акцепторных компонентов. Тогда уравнение (9) можно записать как:

, где

q и p пробегают количество компонентов; от 1 до 2 для биэкспоненциального распада α D и α A — это дробные вклады времени жизни донора и акцептора соответственно.

Для донорной молекулы с одноэкспоненциальным распадом траектория FRET попадает на опорный полукруг, но в случае двухэкспоненциального распада траектория FRET для донорной молекулы более сложна и выражается как:

где E — это КПД FRET, а E = k /1 + k .Здесь мы предполагаем, что обе компоненты распада донора обладают одинаковой эффективностью передачи энергии. Схематическое изображение случая, когда донор и акцептор демонстрируют двухэкспоненциальное поведение, показано на рисунке 2.

Увеличить Уменьшить Сбросить размер изображения

Рис. 2. Спектрально разрешенный вектор для донора и акцептора с двухэкспоненциальным распадом. Траектория FRET определяется уравнением (12).

Загрузить рисунок:

Стандартный образ Изображение высокого разрешения

На этом рисунке векторы как для чистого донора, так и для чистого акцептора попадают внутрь полукруга; это связано с биэкспоненциальным распадом этих молекул.Траектория FRET полосы излучения, содержащей только донорный сигнал, начинается с вектора чистого донора ( E = 0, обозначено зеленым треугольником) и заканчивается в координате (1, 0), соответствующей E = 100 % и нулевое время жизни донора. Эта траектория рассчитывается с использованием уравнения (11). Также показаны векторы каналов с различной длиной волны для ненулевой эффективности передачи энергии (рассчитанные по уравнению (10)). Снова все векторы для разных длин волн попадают на линию, начинающуюся от вектора чистого акцептора.Линия пересекает траекторию FRET чистого донорного сигнала, и пересечение дает эффективность FRET системы. Каналы с чистым донорным сигналом остаются на траектории, а каналы, которые включают как донорный, так и акцепторный сигнал, выталкиваются за пределы траектории из-за наличия отрицательной экспоненты в эмиссии акцептора.

Модель также можно модифицировать, чтобы учесть присутствие невзаимодействующего (чистого) донора, добавив дополнительный член, представляющий вектор чистого донора:

α представляет собой долю сигнала от чистого донора, которая добавлен в донорно-акцепторную конструкцию.

Уравнение включает три члена: один для взаимодействующего донора, который включает термин « A q » внутри скобки, один для взаимодействующего акцептора, который также включает термин « A q » и последний член, отвечающий за долю чистого донора. Это уравнение является результатом сложения уравнений (5) и (6) и преобразования Фурье. Это уравнение можно использовать для извлечения чистой донорной фракции и истинной эффективности FRET в растворе, который включает смесь чистого донора и донорно-акцепторной конструкции.

Эксперименты FRET проводятся с использованием инвертированного микроскопа, оснащенного сверхконтинуальным лазерным источником белого света, работающим на частоте 80 МГц. Лазер настроен на 532 нм для эффективного возбуждения Alexa 532. Лазерный луч сканируется в направлении XY с помощью зеркального сканера гальванометра (040EF, LSK, Stallikon, Швейцария) и фокусируется на образце с помощью объектива микроскопа. Эмиссия флуоресценции улавливается той же линзой объектива. Представленные здесь результаты получены с использованием водно-иммерсионного объектива с поправкой на бесконечность (CFI Fluor 60 × , NA = 1.2, Nikon, Япония). Излучение проходит через дихроичное зеркало (длина прохода 532 нм) и фильтруется эмиссионным фильтром (длина прохода 532 нм). Затем флуоресценция вводится в многомодовое волокно 900 мкм м, которое подключено к спектрографу на основе призмы, оборудованному линейным многоканальным ФЭУ с 32 анодами, из которых используются только 7 анодов. Выходной сигнал ФЭУ усиливается 8-канальным усилителем (Philips Scientific 774-s-50). Усиленные сигналы подключаются к мультиспектральной системе определения времени жизни (Lambda – Tau), описанной в [17].Спектральная ширина каждого канала составляет около 20 нм, а временные интервалы детектора Лямбда – Тау составляют 200 пс. Частота следования лазера 80 МГц дает полное временное окно измерения 12,5 нс. Все эксперименты проводились при комнатной температуре и размер записанных изображений 160 × 160 пикселей.

Короткие, 5′-меченные, комплементарные ДНК-олигонуклеотиды были приобретены у Invitrogen. Исходные материалы разбавляли до 1 мкл М в PBS как из меченой донором (Alexa 532, AAGCATGACCGCACAGAT), так и меченной акцептором (Alexa 647, ATCTGTGCGGTCATGCTT) ДНК.Последовательности были созданы с помощью генетического алгоритма с использованием самописной программы [18]. Олигомеры ДНК были отожжены медленно (5 ° ° С / 3 мин) с образованием четко выраженной двойной цепи.

Применение чувствительного к стимулу поведения FRET для обнаружения цианида в фотопереключаемом [2] псевдоротаксановом полимере, содержащем донор BODIPY и акцептор мероцианина

Мы разработали супрамолекулярный (близкая форма) [2] псевдоротаксановый полимер, содержащий зеленый-эмиссионный ( λ em = 523 нм) основанный на BODIPY pillar [5] арен-хозяин и неэмиссионный спиропиран (SP ) на основе циано-гостя (закрытая форма), который может быть преобразован в красный-излучающий ( λ em = 630 нм) гостевой на основе мероцианина (MC) (открытая форма) под воздействием УФ-излучения, а также в бифторофорный полимер-хозяин-гость с ратиометрическим ФЛ-излучением с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) в растворе ТГФ / вода (60% H 2 O, об. / об.).Равное молярное соотношение хозяин-гость и образование полимера [2] псевдоротаксана можно дополнительно проверить с помощью титрования 1 H ЯМР, анализа графика Джоба, экспериментов DOSY и ITC. Следовательно, бифторофорный полимер хозяин-гость (с открытой формой MC) обладал самым высоким красным излучением акцептора MC, что также было подтверждено измерениями TRPL и обладало самым коротким временем жизни 0,37 нс и лучшей эффективностью FRET 83,5 %. Поскольку блок MC может реагировать с CN , чтобы вызвать процесс гашения без эмиссии, монофторофорный гость будет демонстрировать поведение выключения PL и обнаруживать цианид-ионы с соответствующим значением предела обнаружения (LOD) 0. .94 мкМ. Для сравнения, оптимальное значение LOD 0,48 мкМ по отношению к аниону CN может быть достигнуто с помощью нашего бифторфорного полимера «хозяин-гость» с помощью процесса FRET-OFF. Таким образом, обнаружение цианидов и тесты жизнеспособности клеток с использованием открытой формы [2] псевдоротаксанового полимера предлагают полезные приложения для биовизуализации живых клеток.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

Введение

Подобно тому, как два магнита будут притягиваться друг к другу, только когда они находятся достаточно близко, энергия флуоресценции может также передаваться между флуоресцентными молекулами, если они находятся в очень близком расстоянии.Это принцип Förster Resonance Energy Transfer (FRET) , который представляет собой метод, используемый для определения того, находятся ли две флуоресцентные молекулы на определенном расстоянии друг от друга.

Предложенный Теодором Фёрстером в 1946 году и экспериментально подтвержденный Страйер и Хаугланд (1967), FRET использует принцип передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами флуорофора, что происходит только тогда, когда молекулы находятся в пределах определенного расстояние друг от друга.

Принцип FRET

FRET — это тип передачи энергии, который происходит между двумя флуорофорами, находящимися достаточно близко друг к другу. Этот процесс показан на энергетической диаграмме Яблонского на Рис.1 .

Рисунок 1: Принцип FRET в виде диаграммы Яблонского. Донорный флуорофор поглощает фотоны (синяя стрелка) и переходит из основного энергетического состояния (S0) в возбужденное состояние (S1) и излучает флуоресценцию (зеленая стрелка) при падении обратно в основное состояние.Передача энергии, которая происходит в FRET, показана пунктирными черными стрелками, вместо излучения флуоресценции донорная энергия передается и поглощается акцепторным флуорофором, который, в свою очередь, возбуждается и излучает флуоресценцию. Как видно на диаграмме, эти процессы происходят в чрезвычайно малом масштабе времени, а FRET происходит в пределах наносекунд. Изображение адаптировано из Alex M Mooney, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=23197114.

Как указано в Рис.2 , для успешного выполнения FRET необходимы три требования:

  1. Две флуоресцентные молекулы должны иметь перекрывающихся спектров , чтобы энергия одной могла возбуждать другую ( Рис. 2A, ). В классическом примере используется голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), поскольку эмиссия CFP достаточно близка в спектре света для возбуждения YFP, что позволяет использовать FRET.
  2. Две флуоресцентные молекулы должны находиться на расстоянии в пределах 10 нм и друг от друга, иначе передача энергии не будет ( Рис.2Б ). Это главная привлекательность FRET, поскольку с ее помощью можно определить, насколько близко друг к другу находятся определенные молекулы.
  3. Две флуоресцентные молекулы должны быть в правильной ориентации , а именно , а именно не перпендикулярно друг другу ( Рис. 2C, ). Только если два флуорофора расположены параллельно, они будут передавать энергию друг другу.
Рисунок 2: Три самых важных критерия, которые должны быть выполнены для выполнения FRET. а) Спектр излучения молекулы-донора должен перекрываться спектром возбуждения молекулы-акцептора.б) Если донор и акцептор FRET находятся на расстоянии более 10 нм друг от друга, FRET не возникает. (c) Если донор и акцептор перпендикулярны друг другу, то FRET не возникает. По материалам Broussard et al. (2013).

FRET использует флуоресцентную донорную молекулу в возбужденном состоянии для передачи энергии флуоресцентной акцепторной молекуле (Hussain, 2012), при этом сама передача энергии не вызывает флуоресценции. Что может быть обнаружено, так это снижение на флуоресценции молекулы донора и увеличение на флуоресценции молекулы акцептора .Эта передача энергии может происходить только тогда, когда молекулы находятся на расстоянии 1-10 нм друг от друга ( Рис. 2B, ).

FRET Приложения

По сути, FRET используется как «спектроскопическая линейка» , которая может измерять расстояние между молекулами, а FRET будет указывать, находятся ли молекулы слишком далеко друг от друга (без изменения флуоресценции) или в пределах 1-10 нм друг от друга (изменения во флуоресценции). Кроме того, скорость FRET прямо пропорциональна расстоянию, разделяющему две молекулы, что позволяет количественно определить это расстояние до тех пор, пока молекулы не достигнут расстояния разделения, на котором FRET больше не возникает.

Информация о расстоянии, полученная с помощью одномолекулярного FRET, делает его идеальным методом для приложений, которые исследуют структуру и динамику белков и нуклеиновых кислот. Прикрепляя флуорофоры к двум различным белкам, которые обычно связываются вместе, или оба флуорофора к одному белку, который меняет форму после связывания, FRET можно использовать в качестве элегантного маркера связывания белка, анализируя скорость и скорость взаимодействия белков. Дополнительные примеры приложений FRET можно увидеть на Рис.3 .

Рисунок 3: Приложения FRET. FRET может возникать только тогда, когда донор (синий ствол) и акцептор (желтый ствол) становятся ближе, чем на 10 нм друг к другу. Каждый флуорофор можно связать (зеленая линия) с субстратами для экспериментов. A) FRET, чтобы показать связывание белка с конкретным отдельным субстратом, B) FRET, чтобы показать связывание белка с прикрепленным субстратом, C) FRET, которое происходит, когда белок связывается с лигандом (оранжевый кружок) и претерпевает изменение формы (конформационное изменение ), D) FRET, который останавливается, когда ферменты (в данном случае протеаза) расщепляют связь между флуорофорами.Изображение от Zeiss Fluorescent Protein FRET Biosensors.

Недавние исследования с использованием FRET включают визуализацию конформационных изменений белков, в частности ферментов, во время их функционального цикла (Dyla et al. 2016) и мониторинг синтеза ДНК в режиме реального времени (Fijen et al. 2017). Дополнительные сведения о наследии FRET и его будущем развитии см. В обзоре Sun et al. 2011.

Популярные флуорофоры для использования с FRET: пары флуоресцентных белков, особенно голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), оба варианта классического зеленого флуоресцентный белок (GFP).Эти белки могут быть прикреплены к белкам через удобная генная инженерия, а CFP / YFP имеют перекрывающиеся спектры и идеально подходит для FRET, как показано на Рис.1 и Рис.2 , с оптимизированным CFP-YFP наиболее эффективное и широко используемое сопряжение для измерений FRET.

Некоторые методы могут использоваться для анализа FRET, например как флюоресцентная микроскопия для визуализации (FLIM) , который отслеживает экспоненциальную скорость распада флуорофора излучение в наносекундном масштабе времени, как количественная характеристика разные флуорофоры.Исследования FLIM могут дать значения эффективности FRET и эти биофизические методы могут сочетаться друг с другом в комбинированном FLIM-FRET измерения.

FRET также является мощным инструментом для визуализации передачи сигнала в живых клетках благодаря использованию флуоресцентных белков (может быть добавлен к живым клеткам с помощью генной инженерии) и чрезвычайно коротким временным шкалам. Это позволяет выполнять визуализацию кальция и другие исследования динамических быстродействующих процессов. Это показано на Рис. 4 и других работах Ниино и др. (2009 г.).

Рисунок 4: Одновременная визуализация цАМФ и цГМФ с использованием двойных датчиков FRET. На изображении показаны изображения с псевдоцветным соотношением в разные моменты времени Epac1-cAMP и красный cGES-DE5, совместно экспрессируемые в клетках PC12, с использованием пар CFP / YFP и Sapphire / RFP FRET. Масштаб 10 мкм. Изображение из Niino et al. (2009).

Камеры для FRET

Из-за того, что FRET происходит в столь короткие сроки, высокоскоростная камера жизненно необходима, чтобы не пропустить информацию, когда отображение быстро движущихся частиц или динамических процессов.Эти эксперименты с одной молекулой может находиться в небольшом поле зрения (FOV), поэтому камера sCMOS полезна для возможность ограничить полный FOV меньшей областью интереса (ROI), которая сохраняет полную ширину при резком увеличении скорости.

Из-за потенциально низких сигналов и высокого скоростных событий, малое время экспозиции будет обязательным, а это означает, что камеры также требуют высокой чувствительности и высокого отношения сигнал / шум. Лучшая камера технология для высоких скоростей и высокой чувствительности — sCMOS, это также приведет к меньшего фотообесцвечивания живых образцов из-за низкой освещенности.

Резюме

FRET — это мощный и широко используемый метод флуоресценции одиночных молекул, использование которого ограничено только воображением и требованиями, показанными на Рис.1 .

Список литературы

Förster T. (1946) Naturwissenschafien . ; 6: 166–175.

Страйер Л. и Хогланд Р. П. (1967). Передача энергии: спектроскопическая линейка. Proc Natl Acad Sci USA, 58 (2), 719–726.

Бруссард Дж.А, Раппас Б., Уэбб Д.И., Браун С.М. (2013) Флуоресцентная резонансная микроскопия с переносом энергии, продемонстрированная путем измерения активации серин / треонинкиназы Akt. Nat Protoc , 8 (2) 265-81.

Дила М., Андерсен Дж. Л., Кьергаард М., Биркедал В., Терри Д. С., Альтман Р. Б., Бланшар СК, Ниссен П., Кнудсен К. Р.. (2016) Разработка прототипической АТФазы P-типа Listeria monocytogenes Ca (2 +) — АТФазы 1 для исследований FRET одиночных молекул. Bioconjug Chem 21; 27 (9) 2176-87.

Fijen C, Montón Silva A, Hochkoeppler A, Hohlbein J.(2017) Одномолекулярный датчик FRET EA для мониторинга синтеза ДНК в режиме реального времени. Phys Chem Chem Phys . 8; 19 (6) 4222-4230.

Ниино Ю., Хотта К., Ока К. (2009). Одновременная визуализация живых клеток с использованием двойных датчиков FRET с одной лампой возбуждения . PLOS ONE 4 (6): e6036. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006036

Секар Р. Б. и Периасами А. (2003). Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET), визуализация локализации белков живых клеток. Журнал клеточной биологии, 160 (5), 629–633. https://doi.org/10.1083/jcb.200210140

Sun Y, Wallrabe H, Seo SA, Periasamy A. (2011) FRET-микроскопия в 2010 году: наследие Теодора Ферстера к 100-летию со дня его рождения. Chemphyschem . 12 (3): 462–474.

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart 43 .кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены с помощью сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) 43 и K206A (для Turquoise2-GL). Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно 19 . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP.Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan). Аналогичным образом, CFP в PicchuEV-x 19,44,45 и RaichuEV-Ras 19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 с образованием hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно.В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов. Варианты NanoLuc hyBRET-ERK также были получены реакцией In-Fusion. CeNL, гибридный белок Turquoise2 и NanoLuc, был описан ранее 22 .Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS 47 или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) 48 . Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки кДНК-кодирующих компонентов hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (геном устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP 49 . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК. Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, и кДНК для голубого нано-фонаря и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов.pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее 50 . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion. Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548-1020) или интер-Sh3-доменом p85 человека (aa 428-621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 51 .Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А. Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония).Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония). Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C.Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase 48 , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute. Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T были котрансфицированы вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида № 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком от Dr.Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Warrington, PA). Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее 14 .Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония). Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и фактор роста эпидермиса были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина.Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock).YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus). Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12.Полученные спектры флуоресценции и люминесценции использовались для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее 20 . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон).Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε c ( λ ex ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ C — квантовая эффективность CFP, f C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ Y — квантовая эффективность YFP, f Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε Y ( λ ex ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. ε Y ( λ ex ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε Y ( λ ex ) значение при 513 нм.

Предполагая, что внутрикадровое слияние RLuc8 на С-конце не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E RC — эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ R — квантовая эффективность RLuc8, а f R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E RC считается постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E RC было определено как 0,13. Наконец, E RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в таблице S1.

Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E NC — эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NY — эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ N — квантовая эффективность NanoLuc, а f N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E NC , был также оценен по формуле. 4, установка E NY и E CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. 52 .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см 2 в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для получения изображений BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума 53 . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать транслокацию через мембрану слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см 2 ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см 2 ) или светом 490 нм (180 мкВт / см 2 ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализ на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разбавленным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью считывающего устройства для микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $$

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтой / голубой люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее 26 . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантата и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 6 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 5 клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена 54 . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения времени жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому вентилятору MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг кг -1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Лояльных пользователей Instagram беспокоит охват Facebook

Instagram демонстрируется на iPhone в понедельник, 9 апреля 2012 года, в Нью-Йорке.Facebook тратит 1 миллиард долларов на покупку компании по обмену фотографиями Instagram, что является крупнейшим приобретением социальной сети за всю историю. Instagram позволяет людям применять фильтры к фотографиям, которые они делают на свои мобильные устройства, и делиться ими с друзьями и незнакомцами. (AP Photo / Карли Домб Садоф)

(AP) — Бедные пользователи Instagram. Во-первых, их любимое приложение для обмена фотографиями переходит от эксклюзивности только для iPhone к массам телефонов Android. Неделю спустя Facebook поглощает крошечный стартап, стоящий за приложением, за 1 миллиард долларов.Покупка вызвала опасения, что Facebook может закрыть Instagram или изменить его к худшему, собирая их личную информацию или помещая рекламу в свои тщательно отобранные фотопотоки.

«Я очень старался не быть частью экосистемы Facebook», — говорит Дарвин Поблете, архитектор из Бруклина, Нью-Йорк, который использовал Instagram с первых дней его существования. «Теперь я чувствую, что покупка меня затянула.Мне нужно будет посмотреть, как изменятся настройки конфиденциальности, чтобы решить, оставлю ли я их ».

Instagram привлек более 31 миллиона пользователей менее чем за два года. Его почти культовыми последователями были лояльные пользователи iPhone, которые стекались к приложению из-за его простоты использования, игривых фильтров, которые могут сделать даже скучные фотографии художественными, а также отсутствия рекламы, обновлений статуса и прочего беспорядка. Apple назвала Instagram приложением года для iPhone в 2011 году.

Честно говоря, и генеральный директор Facebook Марк Цукерберг, и генеральный директор Instagram Кевин Систорм стремились заверить людей в том, что приложение никуда не денется.По словам генеральных директоров, в отличие от всех других стартапов, купленных Facebook, Instagram останется доступным для людей, которые не используют Facebook или не хотят подключать его к своим учетным записям в самой густонаселенной социальной сети в мире.

«Миллионы людей во всем мире любят приложение Instagram и связанный с ним бренд, и наша цель — помочь распространить это приложение и бренд среди еще большего числа людей», — написал Цукерберг на своей странице в Facebook, объявив о покупке в понедельник.

Однако трудно сказать, что Facebook может сделать через год или два.В конце концов, постоянная эволюция сайта стала большой причиной его успеха. Делать что-то по-старому только потому, что несколько пользователей жалуются, — это не то, что нравится в Facebook.

Для Саманты Хатмахер перемены не обязательно плохо. Студент колледжа, который использует и Facebook, и — с прошлой недели — Instagram, говорит, что если Facebook настроит приложение, «я полагаю, оно будет более креативным».

В то время как многие люди жалуются, когда Facebook вносит изменения в свой сайт, Хутмахер говорит, что она «не может указать конкретное время», когда ей хотелось бы, чтобы на ее странице в Facebook не было новых функций, которые компания добавила за эти годы.

«Это как бы растет на вас», — говорит Хатмахер, изучающий начальную школу в Университете штата Миссури в Колумбии, штат Миссури.

Instagram уже немного похож на Facebook, но без шума обновлений статуса, ссылок, рекламы, видео и игр. Это часть его привлекательности и большая часть того, почему Facebook посчитал его настолько серьезной угрозой, что заплатил 1 миллиард долларов за его покупку.

«Они безумно растут на мобильных устройствах, а мобильная платформа Facebook (включая ее приложение) в лучшем случае посредственна», — написал технический блоггер Ом Малик во вторник на GigaOm. «Facebook не ориентирована на мобильные устройства, и они не думают с точки зрения мобильных устройств. Внутренняя идеология Facebook — это интернет-компания, ориентированная на настольные компьютеры».

Instagram — это социальная сеть только для фотографий, но даже они разные. Пользователи, кажется, больше думают и заботятся о фотографии в Instagram, чем о типичном снимке с Facebook.Это не ваши групповые снимки, помеченные именами всех присутствующих, и не бесконечно пересылаемые фотографии котят с прикрепленными к ним забавными цитатами. Вместо этого пользователи с большей вероятностью поделятся, скажем, фотографией чашки чая с наложенным на нее фильтром, поэтому похоже, что она была сделана пленочной камерой 30 лет назад. Дети — тоже популярные предметы, как тюльпаны и пасхальные яйца в сезон.

Деб Джонсон из Лонг-Бич, Калифорния, любит публиковать фотографии своих собак, двух родезийских риджбеков.Она также публикует снимки еды, которую она ест, совсем недавно блюдо из шотландского лосося, которое она ела в ресторане. По ее словам, чтобы ценить Instagram, «вам действительно нужно ценить визуальный опыт».

«Сегодня я сфотографировал какую-то глупость», — говорит Джонсон, который работает в сфере информационных технологий, тестируя системы для страховых компаний. Кто-то в ее доме поместил маленький диспенсер Cookie Monster Pez внутрь большего диспенсера Cookie Monster Pez, сделав своего рода диспенсер-диспенсер Pez.Итак, Джонсон сделал фото. Instagram настолько прост в использовании, что появляются именно такие изображения. Чтобы опубликовать изображение в Instagram, достаточно всего трех касаний пальцем.

«Существуют сотни тысяч приложений. Не нужно создавать приложения, и они появятся», — говорит Ребекка Либ, аналитик Altimeter Group. «Ценник говорит о том, что в Instagram не обошлось и без других ухажеров».

Другими словами, Facebook не просто купил какую-либо компанию.

«Если бы кто-то мог разлить в бутылки свой рецепт успеха, я гарантирую, что они это сделают.Он прост в использовании, работает очень хорошо и добавляет дополнительный уровень функциональности (с фильтрами), — говорит Либ. — Все это вместе создает моджо, которым является бренд. Почему не каждый безалкогольный напиток Кока-Кола? Потому что это не так ».

Мгновенный успех

Instagram напоминает другое элегантное, простое в использовании приложение, которое быстро привлекло множество пользователей — Pinterest. Обе компании используют желание людей делиться маленькими жизненными моментами по мере их появления. И оба предоставляют пользователям более простую и менее шумную социальную сеть, чем Facebook.

«Есть много интересных социальных сетей, — говорит аналитик Gartner Брайан Блау. «И это конкуренты Facebook. Один вокруг фотографий, (это) одна из самых популярных вещей, которые мы делаем. Это идеальное дополнение к Facebook».

Задача

Facebook будет заключаться в том, чтобы сделать лояльных пользователей Instagram счастливыми, даже если сервис расширяется и включает гораздо больше людей.

«Мы уже видели, как это происходило раньше, когда Facebook открывал свою членскую базу от (студентов) для всех», — говорит Либ.

Люди ворчали в то время, что это был конец Facebook. Это было не так.

«Людям не нравятся перемены, но поведение пользователей указывает на то, что люди примут изменения», — говорит она.


Фото-приложение Instagram запускается на телефонах Android

© 2012 Ассошиэйтед Пресс.Все права защищены. Этот материал нельзя публиковать, транслировать, переписывать или распространять.

Цитата : Лояльные пользователи Instagram обеспокоены охватом Facebook (2012, 10 апреля) получено 31 октября 2021 г. с https: // физ.org / news / 2012-04-loyal-instagram-users-fret-facebook.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

AccPbFRET: плагин ImageJ для полуавтоматического, полностью скорректированного анализа изображений FRET с фотообесцвечиванием акцептора | BMC Bioinformatics

Плагин написан на Java v1.6 и протестирован с ImageJ версии 1.38 ×.

Эффективность FRET E ( i , j ) получается попиксельно согласно

E (i, j) = 1− (1 − α) (FD1 (i, j) — δFA1 (i, j)) γ (FD2 (i, j) — (αδ + (1 − α) ε) FA1 (i, j)) — α (FD1 (i, j) −δFA1 (i, j)) MathType @ СПР @ 5 @ 5 @ + = feaagaart1ev2aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi = xI8qiVKYPFjYdHaVhbbf9v8qqaqFr0xc9vqFj0dXdbba91qpepeI8k8fiI + FSY = rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr = XFR = xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemyrau0aaSbaaSqaaiabcIcaOiabdMgaPjabcYcaSiabdQgaQjabcMcaPaqabaGccqGH9aqpcqaIXaqmcqGHsisljuaGdaWcaaqaaiabcIcaOiabigdaXiabgkHiTGGaaiab = f7aHjabcMcaPiabcIcaOiabdAeagnaaBaaabaGaemiraqKaeGymaeJaeiikaGIaemyAaKMaeiilaWIaemOAaOMaeiykaKcabeaacqGHsislcqaH0oazcqWGgbGrdaWgaaqaaiabdgeabjabigdaXiabcIcaOiabdMgaPjabcYcaSiabdQgaQjabcMcaPaqabaGaeiykaKcabaGaeq4SdC2aaeWaaeaacqWGgbGrdaWgaaqaaiabdseaejabikdaYiabcIcaOiabdMgaPjabcYcaSiabdQgaQjabcMcaPaqabaGaeyOeI0IaeiikaGIae8xSdeMae8hTdqMae8hiaaIae83kaSIae8hiaaIaeiikaGIaeGymaeJaeyOeI0Iae8xSdeMaeiykaKI aeqyTduMaeiykaKIaemOray0aaSbaaeaacqWGbbqqcqaIXaqmcqGGOaakcqWGPbqAcqGGSaalcqWGQbGAcqGGPaqkaeqaaaGaayjkaiaawMcaaiabgkHiTiab = f7aHnaabmaabaGaemOray0aaSbaaeaacqWGebarcqaIXaqmcqGGOaakcqWGPbqAcqGGSaalcqWGQbGAcqGGPaqkaeqaaiabgkHiTiab = r7aKjabdAeagnaaBaaabaGaemyqaeKaeGymaeJaeiikaGIaemyAaKMaeiilaWIaemOAaOMaeiykaKcabeaaaiaawIcacaGLPaaaaaaaaa @ 8B7F @

, где F D 1 ( я , J ) и F D 2 ( я , J ) являются донор значения флуоресценции пикселя ( i , j ) до (1) и после (2) фотообесцвечивания акцептора и F A 1 ( i , j ) флуоресценция акцептора для того же пикселя до фотообесцвечивания.Все значения F полностью скорректированы по фону. α , γ , δ и ε — это поправочные коэффициенты, которые описаны ниже.

В некоторых случаях фотообесцвечивание акцептора не полное. Как показали van Munster et al. [25], средняя эффективность FRET прямо пропорциональна количеству доступных акцепторных молекул, предполагая, что фотообесцвечивание происходит без разбора для всех акцепторных молекул, и присутствует не более одного акцептора на одну донорную молекулу.Чтобы исправить неполное обесцвечивание акцептора, поправочный коэффициент

α рассчитывается как α = ⟨ F A 2 ( i , j ) / F A 1 ( i , j )

где F A 2 ( i , j ) и F A 1 ( i 90 j5375) — интенсивности в акцепторном канале в пикселях выше порога меченного донором и акцептором образца до (1) и после (2) фотообесцвечивания.

Поправочный коэффициент γ для нежелательного фотообесцвечивания донора во время процедуры получения изображения [4, 26] можно рассчитать как

γ = ⟨ F Dd 1 ( i , j ) ⟩ / ⟨ F Dd 2 ( i , j )

или

γ = ⟨ F Dd i 1 j ) / F Dd 2 ( i , j )

где F Dd 1 ( i , j 1 F Dd 2 ( i , j ) — интенсивности флуоресценции донора только донора (Dd) образцов в пикселях выше порога до (1) и после (2) фотообесцвечивания акцептора и Знаки ⟨⟩ обозначают среднее значение.Поскольку FRET защищает донора от фотообесцвечивания [14], этот фактор, рассчитанный на основе образца, помеченного только донором, не совсем точен. Однако на практике разница составляет 10–20% от 1–2%, что может не вызывать больших ошибок при определении FRET. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание донора во время измерения.

Программа предлагает (в том числе для поправочных коэффициентов δ и ε ) возможность вычислять коэффициент на попиксельной основе, а затем усреднять пиксели выше порогового значения для необработанных данных или, в качестве альтернативы, усредните необработанные данные для этих пикселей, а затем вычислите средний поправочный коэффициент.

В случае, если акцепторный краситель также флуоресцирует в донорном канале, FRET будет недооценен без поправки на перекрестные помехи [26]. Соответствующий поправочный коэффициент рассчитывается как

δ δ = ⟨ F Da 1 ( i , j ) ⟩ / ⟨ F Aa 1 ( , j ) ⟩

или

δ = ⟨ F Da 1 ( i , j ) / F Aa i j )

где F Da 1 ( i , j ) и F Aa 1 ( i , j ) — это сигналы донора и акцепторные каналы в пикселях выше порога образца, меченного только акцептором, до фотообесцвечивания акцептора (1) .

В некоторых случаях фотообесцвечивание акцептора может дать фотопродукт с отчетливыми абсорбционными и эмиссионными свойствами, которые могут вносить вклад в сигнал донора после отбеливания, что приводит к завышенной оценке эффективности FRET [4]. Поправочный коэффициент ε для такого акцепторного фотопродукта рассчитывается как

ε = ⟨ F Da 2 ( i , j ) ⟩ / ⟨ F Aa ( i , j )

или

ε = ⟨ F Da 2 ( i , j ) / F 90a110 i , j ) ⟩

где F Da 2 ( i , j ) и F Aa 1 ( i , j интенсивности в донорных и акцепторных каналах в пикселях выше порога помеченного образца только акцептором, до (1) и после фотообесцвечивания (2) .

Расчет констант γ , δ и ε требует получения изображений с одним и тем же протоколом фотообесцвечивания на образцах, помеченных только донором и только акцептором, которые обычно необходимо делать в любом случае.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *